Pada tahun 1341 Raja John dari Bohemia mengizinkan keluarga Yahudi untuk tinggal di dalam tembok kota, dan sinagoga pertama dibangun pada tahun 1380; namun beberapa pogrom terjadi pada akhir abad ke-15 dan awal abad ke-16. Sejak Perang Hussite
, kota ini secara tradisional menjadi benteng Gereja Katolik selama konflik agama yang berlangsung lama di Kerajaan Bohemia. Sebagai bagian dari Monarki Habsburg dari tahun 1526, Budejovice tetap menjadi pendukung setia Kaisar Ferdinand II dalam Perang Tiga Puluh Tahun. Budějovice mengalami pendudukan singkat oleh Prusia selama Perang Silesian, dan perang antara Habsburg dan tentara Prancis pada tahun 1742.