Mascherano membuat 147 penampilan untuk tim nasional Argentina dan merupakan pemain kedua yang paling banyak mencetak gol dalam sejarah negara itu (setelah Lionel Messi). Dari debutnya pada tahun 2003 hingga pensiunnya pada tahun 2018, ia mewakili negara di lima turnamen Copa América, menempati posisi runner-up pada tahun 2004
, 2007, 2015, dan 2016, dan empat Piala Dunia FIFA, mencapai final 2014. Dia dua kali memenangkan medali emas di Olimpiade Musim Panas, pada tahun 2004 dan 2008, menjadi pemain sepak bola pria pertama yang mencapai prestasi ganda ini sejak bek Hongaria Dezső Novák pada tahun 1968. Antara 2008 dan 2011, Mascherano menjabat sebagai kapten Argentina.