Den 5. december 1941 forlod I-66 Samah for at påbegynde sin første krigspatrulje. Da den japanske invasion af Malaya
I-66 var i det sydkinesiske hav ud for Trengganu, Britisk Malaya, opererende på en patrulje linje med ubåderne,,, og. Den 15. december 1941 blev "I-66" og "I-65" løsrevet fra denne pligt til at udføre en rekognoscering af indgange til Kuching til støtte for invasionen af Sarawak i britisk Nordborneo, som begyndte den 16. december 1941. De to ubåde modtog en advarsel om, at allierede ubåde opererede ud for Kuching. Mens I-66 forberedte sig på at komme op til overfladen for at genoplade sine batterier nordvest for Kuching den 24. december 1941, opdagede den hollandske Royal Navy ubåd på overfladen på sin styrbordbuer på en rækkevidde af. Efter en undervandstilnærmelse affyrede "I-66" en enkelt torpedo kl. 10:28. Den ramte "K XVI", som brød i to og sank med tabet af hele besætningen på 36 mand. Den 4. oktober 2011 fandt australske dykkere vraget af "K XVI", brudt i to og på en dybde af.