I februar 1567 blev Darnleys bolig ødelagt af en eksplosion, og han blev fundet myrdet i haven. James Hepburn, 4. jarl af Bothwell, blev generelt anset for at have orkestreret Darnleys død, men han blev frikendt for anklagen i april 1567, og den følgende måned giftede han sig med Mary. Efter et oprør mod parret blev Mary fængslet i Loch Leven Castle. Den 24. juli 1567 blev hun tvunget til at abdisere til fordel for sin etårige søn. Efter et mislykket forsøg på at genvinde tronen flygtede hun sydpå og søgte beskyttelse af sin første fætter, Elizabeth I af England. Mary Elizabeth havde engang hævdet tronen som sin egen og blev betragtet som den legitime suveræn i England af mange katolikker, herunder deltagere i et oprør, der blev kendt som Rotting of the North Elizabeth?
Maria