I oktober 1566, mens hun opholdt sig i Jedburgh i de skotske grænser, Mary foretog en rejse på hestehjul af mindst fire timer hver vej for at besøge jarlen af Bothwell på Hermitage Castle, hvor han lå syg af sår, der blev pådraget i et skirmish med reivers. Ride blev senere brugt som bevis af Marys fjender, at de to var elskere, selv om der ingen mistanke blev udtalt på det tidspunkt, og Mary var ledsaget af hendes rådsherre og vagter.
Natten mellem den 9. og 10. februar 1567