Da Vladislas' eneste søn Ludvig blev dræbt i slaget ved Mohács i 1526 og sluttede Jagiellon-dynastiets herredømme i Bøhmen, valgte en konvent af bøhmiske adelsmænd hans svoger, Habsburgernes ærkehertug Ferdinand I af Østrig, som den nye konge af de bøhmiske kronlande. Sammen med Østerrig og Ungarns kongerige dannede de Habsburgmonarkiet, som i de følgende århundreder voksede ud af Det Hellige Romerske Rige til en separat europæisk magt. De bøhmiske protestantiske reformatorers forsøg på at opbygge et selvstændigt forbund blev forpurret ved Slaget ved Det Hvide Bjerg i 1620
, hvorefter administrationen blev centraliseret i Wien. Desuden mistede Habsburgherskerne Lusatias til Kurfürstendømmet Sachsen efter Trediveårskrigen i 1635 Freden i Prag, og også det meste af Schlesien med Kladsko til Kongeriget Preussen efter den første schlesiske krig i 1742 Breslau-traktaten.