Cách tiến hành phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?
"6.2 Phương pháp RT- nested PCR
...
6.2.3 Cách tiến hành
6.2.3.1 Tách chiết RNA
Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.9) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ Dụ: Sử dụng kít chiết tách InviMAG®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96 Cat hoặc Taco RNA/DNAkit hoặc Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA (Phụ lục B).
6.2.3.2 Chuẩn bị mồi
Phương pháp RT- nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/SVC R2 ở bước 1 và cặp mồi SVC F1/ SVC R4 ở bước 2 để phát hiện vi rút SVC, (xem phụ lục E, Bảng E.1).
Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 pmol/µL làm gốc.
Mồi (3.2.1) được sử dụng ở nồng độ 20 µmol/pL: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (20 µl mồi gốc và 80 µl nước).
6.2.3.3 Tiến hành phản ứng RT-nPCR
Bước 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR sử dụng cặp mồi SVC F1 /SVC R2, (xem phụ lục E).
Bước 2: Thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/ SVC R4, (xem phụ lục E).
6.2.2.3 Chạy điện di
6.2.2.3.1 Chuẩn bị bản gel
Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose (3.2.2) bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) trong bình thủy tinh, lắc đều rồi đun sôi.
Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.
Tiến hành đổ thạch vào khuôn (4.2.6) đã được cài lược, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm. Khi bản thạch đông, gỡ lược khỏi bản thạch.
Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.7) đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.
CHÚ THÍCH: có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain[1]) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.
6.2.2.3.3 Điện di
Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) vào một giếng trên bản gel.
Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.7), ở hiệu điện thể 100 V trong thời gian 20 đến 30 min.
6.2.2.3.4 Đọc kết quả
Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.2.8).
Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:
- Đối chứng âm có kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại);
- Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vệt sáng rõ có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp.
Với điều kiện phản ứng trên
Mẫu xét nghiệm âm tính khi:
- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);
- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.
Mẫu xét nghiệm dương tính khi:
- Tại giếng của mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp;
- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.
CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể chỉ phát hiện được sản phẩm của bước hai 606 bp.