Thực hiện gây nhiễm vi rút bằng phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào ra sao?
"6.4.4 Gây nhiễm vi rút từ mẫu trên tế bào một lớp EPC
Loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trong đĩa 24 giếng (4.3.1).
Gây nhiễm vi rút với 02 nồng độ (1/10; 1/100) lên tế bào một lớp EPC (3.3.8) đã được nuôi cấy trên đĩa 24 giếng (4.3.1), lượng dung dịch vi rút được gây nhiễm là 150 µl/giếng với từng nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ được lặp lại 02 lần. Tiến hành ủ 1 h ở nhiệt độ 15 °C sau đó bổ sung vào mỗi giếng 1,5 ml môi trường phân lập vi rút (Lưu ý: thực hiện với giếng chứa hệ thống đối chứng âm trước, tiếp theo từ giếng có nồng độ vi rút thấp đến nồng độ cao). Nồng độ pha loãng vi rút cuối cùng là 1/100; 1/1000.
Chuyển đĩa 24 giếng đã nhiễm vi rút vào tủ ấm lạnh (4.3.4) và ủ ở nhiệt độ 22 °C đến 25 °C.
Theo dõi sự xuất hiện bệnh lý tế bào (cytopathic effect -CPE) sau 2 ngày gây nhiễm dưới kính hiển vi soi ngược (4.3.5) với vật kính 4X và 10X.
CPE do SVCV trên môi trường tế bào EPC: lúc đầu tế bào co cụm sau đó phồng to hơn và bong khỏi lớp tế bào.
Tiếp tục theo dõi bệnh lý tế bào đến 10 ngày sau khi gây nhiễm, nếu xuất hiện bệnh lý tế bào (CPE) tiến hành thu dịch tế bào có chứa vi rút đem ly tâm 2.000 đến 4.000 g (4.1.6) trong 15 min, ở 4°C.
Thu dịch trong, tách chiết RNA và thực hiện phản ứng RT-PCR hoặc Realtime RT-PCR để xác nhận sự hiện diện của vi rút.
Nếu không xuất hiện CPE, thu hồi huyễn dịch tế bào bằng cách hút dịch tế bào và tế bào đơn lớp bám ở đáy giếng ở các nồng độ (1/10; 1/100) của cùng 1 mẫu vào ống ly tâm 15 ml ly tâm 2.000 đến 4.000g (4.1.6) trong 15 min. Hút dịch trong sau ly tâm (nồng độ gốc) tiến hành pha loãng tạo nồng độ (1/10) rồi tiếp tục nhiễm lên tế bào một lớp EPC (3.3.8) mới trên đĩa 24 giếng (4.3.1). Có thể nhiễm 1 đến 2 lần cấy truyền từ huyễn dịch tế bào của lần cấy truyền thứ nhất. Nếu không có CPE sau 3 lần cấy truyền mẫu được xem là âm tính.
CHÚ THÍCH: Với điều kiện nhiệt độ tại nước ta nên thay môi trường phân lập tế bào định kỳ, điều này sẽ tránh sự phát triển quá mức của tế bào trong quá trình phân lập."