Sử dụng mẫu ADN sau khi tách chiết để thực hiện phản ứng PCR chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư do ký sinh trùng Perkinsus olseni gây ra như thế nào?
Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
...
6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
...
6.2.4. Cách tiến hành
...
6.2.4.2. Chuẩn bị mồi
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của Perkinsus olseni sử dụng cặp mồi PolsITS-140F và PolsITS-600R (3.2.4). Trình tự cặp mồi được nêu trong Bảng 1.

Cặp mồi PolsITS-140F và PolsITS-600R dùng để khuếch đại đoạn gen của Perkinsus olseni có kích thước 450 bp.
Mồi được chuẩn bị như sau:
Chuẩn bị mồi gốc:
- Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.10) được mồi ở nồng độ 200 mM làm mồi gốc;
Chuẩn bị mồi sử dụng:
- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.5) (10 ml mồi gốc và 90 ml nước (3.2.5)).
6.2.4.3. Tiến hành phản ứng PCR
Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (6.2.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)2)
Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 2

Chuyển 22,5 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:
- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 ml mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Perkinsus marinus chuẩn vào ống phản ứng;
- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 ml nước (3.2.5) vào ống phản ứng:
- Mẫu thử: Cho 2,5 ml mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong bảng 3.

CHÚ THÍCH
- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;
- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
...