Tiến hành phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn được thực hiện như thế nào?
...
B.3. Tách chiết DNA
Các vi chuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.
B.4. Phản ứng PCR
Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:
- Taq PCR Master Mix Kit 12,5 μl
- Mồi xuôi 20 μM 1 μl
- Mồi ngược 20 μM 1 μl
- Nước không có nuclease 8,5 μl
- Mẫu DNA 2 μl
	Tổng thể tích 25 μl
Chu trình nhiệt trong Bảng 2.
Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Salmonella (xem B.2).
Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn.
B.5. Chạy điện di
Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.
Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.
Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.
Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).
...