Quá trình tách chiết DNA để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm trong phương pháp PCR được thực hiện như thế nào?
"3. Phương pháp chẩn đoán
...
3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
...
3.2.1.5.1. Tách chiết DNA
CHÚ THÍCH: Hiện nay có nhiều thuốc thử và bộ kít thương mại tiện lợi cho việc tách chiết DNA (QiaGen, Promega, IQ,…). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Ví dụ về quy trình tách chiết DNA bằng dung dịch đệm DTAB-CTAB (kít IQ 2000):
Cho mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml, nếu mẫu cố định trong etanol 95 % cần làm khô etanol bằng cách đổ etanol và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.
Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl dung dịch tách chiết DTAB, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 400 µl đến 500 µl dung dịch tách chiết DTAB và nghiền tiếp đến khi nhuyễn.
Ủ mẫu ở 75 °C trong 5 min, sau đó làm lạnh xuống nhiệt độ phòng.
Trộn đều bằng máy trộn vortex và làm lắng hỗn hợp trên, sau đó cho 700 µl cloroform, trộn đều trong 20 s và ly tâm ở 12 000 g trong 5 min.
Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang ống Eppendorft 1,5 ml mới, thêm 100 µl dung dịch CTAB và 900 µl nước, trộn đều, sau đó ủ ở 75 °C trong 5 min.
Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm ở 12 000 g trong 10 min. Gạn bỏ dịch nổi, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl dung dịch hòa tan, ủ ở 75 °C trong 5 min, sau đó làm lạnh xuống nhiệt độ phòng.
Ly tâm ở 12 000 g trong 5 min. Chuyển dung dịch sạch sang ống Eppendorft 1,5 ml cùng 300 µl etanol 95 %.
Trộn đều, ly tâm ở 12 000 g trong 5 min, sau đó rửa viên cùng 200 µl etanol 75 %, làm lắng xuống, làm khô viên và hòa tan viên bằng nước hoặc đệm TE.
..."