Phương pháp ELISA được tiến hành theo trình tự như thế nào?
Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
...
6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Gumboro
...
6.3.4. Cách tiến hành
VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Gumboro (Infectious Brusal disease test kit) của hãng IDEXX3)
6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu
- Các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đến 26 °C);
- Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu (Lấy 1 ml huyết thanh pha với 500 ml dung dịch pha loãng mẫu);
- Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 10 lần (Wash Concentrate 10 X): lấy 1 phần nước rửa đậm đặc pha với 9 phần nước cất;
- Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 ml/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;
- Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC).
6.3.4.2. Tiến hành phản ứng
Bước 1: Nhỏ huyết thanh
- Nhỏ 100 ml dung dịch pha loãng mẫu vào giếng có mẫu trắng (Blank);
- Nhỏ 100 ml kiểm chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm;
- Nhỏ 100 ml kiểm chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối chứng dương;
- Nhỏ 100 ml huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng vào các giếng thích hợp;
- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;
- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;
- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.
Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể (conjugate)
- Nhỏ 100 ml dung dịch kháng kháng thể vào các giếng;
- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;
- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;
- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.
Bước 3: Nhỏ cơ chất
- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất TMB vào các giếng;
- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 15 min.
Bước 4: Dừng phản ứng
- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào các giếng;
Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm.
6.3.5. Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được công nhận khi:
- Giá trị OD của đối chứng dương trừ giá trị OD của đối chứng âm phải lớn hơn 0,075;
- Giá trị OD của đối chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.
Tính kết quả:
- Trung bình của đối chứng âm: [NC1 A (650) + NC2 A(650)] / 2 = NC x tb
- Trung bình của đối chứng dương: [PC1 A (650) + PC2 A (650)] / 2 = PC x tb
- Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu - NC x tb) / (PCx tb - NC x tb)
- Hiệu giá của mẫu: log10 Titer = 1,09 (log10 S/P) + 3,36
CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.
Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:
- Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Gumboro có S/P lớn hơn hoặc bằng 0,20;
- Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Gumboro có S/P nhỏ hơn 0,20.