Cách tiến hành phương pháp Realtime PCR để tiến hành chẩn đoán bệnh khi tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng ra sao?
"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
...
6.2 Phương pháp Realtime PCR
6.2.1 Lấy mẫu (Theo 6.1.1)
6.2.2 Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)
6.2.3 Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)
6.2.4 Cách tiến hành
6.2.4.1 Tách chiết ADN
Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN: DNeasy®Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)[4]) (xem phụ lục B).
6.2.4.2 Chuẩn bị mồi
Phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2) để phát hiện vi rút đốm trắng. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).
Mồi được chuẩn bị như sau:
- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.
- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).
- Đoạn dò WSSV-p sử dụng nồng độ 6 µM: pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (3 µl mồi gốc và 47 µl nước tinh khiết không có nuclease)
6.2.4.3 Tiến hành phản ứng realtime PCR
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2), sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục D).
6.2.4.4 Đọc kết quả
Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:
- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).
- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2
Với điều kiện phản ứng như trên:
- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính
- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính
- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.
CHÚ Ý: - Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.
- Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;
- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
7 Kết luận
Mẫu tôm được xác định mắc bệnh đốm trắng khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh đốm trắng và:
- Có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Nested PCR, hoặc:
- Có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Realtime PCR."