Phương pháp PCR được thực hiện theo các bước như thế nào để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà?
...
C.3 Tách chiết ADN
Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết ADN bằng các kit thương mại hoặc bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa các enzym Rnase và se (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (4.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.
C.4 Tiến hành
Có thể sử dụng các kit thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nên sử dụng Multiplex PCR kit.
Sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt trong Bảng 3.
Đối chứng dương: tách chiết từ vi khuẩn Clostridium perfringens (xem mục C.3).
Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có ADN của vi khuẩn.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.5).
C.5 Chạy điện di
Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.
Cho 2 µl dung dịch loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 µl thang chuẩn (marker) vào một giếng.
Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 min đến 40 min, ở 100 V.
Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg / 100ml.
Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ như SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.
...