Phát hiện kháng nguyên trong việc chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt thế nào?
"7.2.3.2 Phương pháp realtime PCR
- Sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò (tham khảo Bảng E.1, Phụ lục E) với nồng độ thích hợp (mồi ở nồng độ 20 µM, đoạn dò ở nồng độ 5 µM) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG 2), Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi thành phần Master mix cho phù hợp với tên trong Bảng E.2, Phụ lục E).
- Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng (tham khảo Bảng E.2, Phụ lục E).
- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:
+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.
+ Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút DVE có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương.
+ Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm
+ Cho 5 µl ADN của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR
+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR.
CHÚ THÍCH:
1) Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.
2) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị.
- Chu trình nhiệt chạy phản ứng tham khảo Bảng E.3, Phụ lục E.
- Kết quả của phản ứng realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).
- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
- Đánh giá kết quả:
+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40
+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct
+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.
- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh dịch tả vịt khi kết quả realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.
7.2.3.3 Phương pháp PCR
- Chuẩn bị mồi cho phản ứng PCR: Trình tự mồi phát hiện vi rút dịch tả vịt (tham khảo Bảng F.1, Phụ lục F).
CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn mồi phù hợp.
- Sử dụng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Hot Start Taq Gold DNA polymerase 3) với nồng độ và thể tích tham khảo Bảng F.2, Phụ lục F.
- Tiến hành phản ứng PCR (tham khảo Phụ lục F)."