Phân lập vi rút để tiến hành chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn bằng phương pháp phân lập vi rút như thế nào?
Cách tiến hành
...
5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
...
5.2.4.2. Tiến hành phân lập
Sử dụng 200 ml dịch ngoáy (gồm cả môi trường bảo quản) hoặc dịch nghiền phủ tạng (dịch nổi thu được sau ly tâm) cho nhiễm vào tế bào PK15 (xem phụ lục D). Theo dõi trong 7 ngày.
... Chuẩn bị tế bào PK15 để phân lập vi rút
D.1. Khôi phục tế bào
- Lấy ống tế bào được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ra và rã đông nhanh chóng bằng cách đặt vào nước ấm 35 °C đến 39 °C trong 1 min.
- Chuẩn bị chai nuôi cấy với 10 ml môi trường nuôi dưỡng (EMEM + FCS 10 % (xem 3.4) + kháng sinh 100 IU/ml penicillin và 100 mg/ml hoặc 50 mg/ml gentamycin).
- Khi tế bào đã rã đông, nhanh chóng dùng pipet hút dung dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml và cho tiếp vào 10 ml môi trường nuôi dưỡng, trộn đều bằng pipet hút nhả nhẹ nhàng để tránh bọt.
- Ly tâm ở 1000 g (xem 4.1) trong 5 min.
- Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 2 ml môi trường nuôi dưỡng tế bào EMEM + FCS 10 % (xem 3.4). Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào (25 cm2) (xem 4.3) đã có 15 ml môi trường nuôi dưỡng FCS 10 % (xem 3.4). Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO2 (xem 4.4).
- Qua 1 ngày, loại bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường nuôi dưỡng mới có FCS 10 % (xem 3.4). Ủ chai nuôi tế bào ở tủ ấm 37 °C có CO2 5 % (xem 4.4) để tế bào phát triển.
D.2. Chuyển đời tế bào
- Hút bỏ môi trường nuôi dưỡng (xem 3.2) cũ trong chai 25 cm2, cho 10 ml dung dịch PBS vào để rửa sạch lớp tế bào sau đó hút bỏ dung dịch rửa này đi.
- Cho 2 ml đến 3 ml dung dịch Trypsin/ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 0,25 % (xem 3.3) vào và ủ ở 37 °C từ 5 min đến 10 min để cho tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ vào thành chai nuôi cấy để tế bào bong ra.
- Cho thêm 5 ml môi trường nuôi dưỡng EMEM + FCS 5 % (xem 3.4) (huyết thanh trong môi trường tăng trưởng sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm 50 ml. Ly tâm bằng máy (xem 4.1) ở 1000 g trong 5 min.
- Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 10 ml môi trường nuôi dưỡng tế bào EMEM + FCS 5 % (xem 3.4). Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả nhiều lần.
- Chia đều dung dịch tế bào này sang các chai nuôi cấy có chứa môi trường nuôi dưỡng mới với lượng 5 x 104 tế bào/ml. Ủ đĩa ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO2 (xem 4.4) từ 5 ngày đến 7 ngày. Theo dõi tế bào phát triển hàng ngày và loại bỏ ngay những chai tế bào bị nhiễm khuẩn.
- Chuyển đời tế bào theo tỷ lệ 1:5. Lượng tế bào từ 01 chai 25 cm2 (xem 4.3) đạt 100 % diện tích nuôi cấy có thể chuyển đời sang 5 chai 25 cm2 (xem 4.3) khác.
- Nếu tế bào phát triển kém, hút bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ, rửa thảm tế bào bằng dung dịch đệm PBS rồi đưa môi trường nuôi dưỡng mới vào.
- Tế bào phát triển tốt sau khi được chuyển đời và đạt khoảng 90 % diện tích nuôi cấy thì đem sử dụng để lây nhiễm vi rút (phân lập vi rút).
D.3. Đông lạnh tế bào
- Đối với tế bào được nuôi trong chai 25 cm2, hút bỏ môi trường cũ, cho 10 ml dung dịch PBS vào để rửa lớp tế bào, sau đỏ hút bỏ dung dịch rửa này đi.
- Cho 2 ml đến 3 ml dung dịch Trypsin/ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 0,25 % (xem 3.3) vào và ủ ở 37 °C từ 5 min đến 10 min để cho tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ vào thành chai nuôi cấy để tế bào bong ra.
- Cho thêm 10 ml môi trường nuôi dưỡng EMEM + FCS 5 % (xem 3.4) (huyết thanh trong môi trường tăng trưởng sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm 50 ml.
- Ly tâm bằng máy (xem 4.1) ở 1000 g trong 5 min.
- Đổ bỏ phần dung dịch nổi, hòa phần tế bào lắng cặn trong 1 ml môi trường không có huyết thanh (Glasgow Eagle’s) và dùng pipet hút nhả nhiều lần để trộn đều.
- Cho 3 ml chất bảo vệ đông lạnh (huyết thanh bò 90 % + DMSO 10 %) vào trộn đều, nhẹ bằng pipet để tránh bọt.
- Chuyển 4 ml dung dịch tế bào vào ống đông lạnh cryotube (4,5 ml). Bọc ống đông lạnh trong bông vô trùng hoặc giấy vệ sinh vô trùng để làm chậm quá trình đông lạnh. Đặt ống đông lạnh vào tủ lạnh đông (xem 4.5) -50 °C đến -80 °C qua đêm, sau đó chuyển vào giữ ở nitơ lỏng.