Quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thực hiện như thế nào?
"B1. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy® Blood & Tissue Kit (250)
Nhỏ 20 µl proteinase K vào ống ly tâm 1,5 ml.
- Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống ly tâm đã có proteinase K.
- Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer).
- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).
- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).
- Thêm 200 µl etanol (từ 96 % đến 100 %) (3.1.1) vào ống ly tâm.
- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).
- Hút 420 µl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới.
- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.
- Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới.
- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.
- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm.
- Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới.
- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng.
- Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml.
- Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min.
- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min.
- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác.
CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện ký sinh trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây bệnh trên tôm."