Phương pháp Realtime RT PCR được tiến hành như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1?
Cách tiến hành
...
5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
...
5.2.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR
...
b) Tiến hành phản ứng
Phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen M, H5 và N1 được thực hiện như sau:
Lựa chọn mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR: cần tham khảo các báo cáo giám sát để biết để lựa chọn mồi và mẫu dò phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành. Các bộ mồi và mẫu dò để phát hiện các chủng vi rút H5N1 lưu hành được liệt kê trong Bảng E.1 phụ lục E.
Chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM và mẫu dò ở nồng độ 6 μM với nước sạch Dnase/Rnase.
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng Realtime RT-PCR phát hiện các đoạn gen M, H5, N1 theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng (Bảng E2 và E3 phụ lục E).
c) Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) có giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct.
Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu không có Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.
...