Phản ứng Nested RT PCR trong phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá có bao nhiêu bước thực hiện?
C.2 Thực hiện phản ứng Nested RT - PCR
Kỹ thuật nested RT- PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước):
Giai đoạn 1 (bước 1): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F2/R3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng C.2).
VÍ DỤ: Kit nhân gen SuperScript" III One-Step RT-PCR with Platinum" Taq. Cat: 12574-0263)

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:
Mẫu đối chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VNN chuẩn.
Mẫu đối chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease.
Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Sau đó, lấy sản phẩm bước 1 ra để chuẩn bị cho phản ứng bước 2 - Nested RT - PCR
Giai đoạn 2 (bước 2): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F’2/R’3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) Cat K0171)4)
Thành phần cho 1 phản ứng bước 2 (xem Bảng C.4).

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:
Mẫu đối chứng dương: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.
Mẫu đối chứng âm: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.
Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới
Tiến hành phản ứng Nested RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.5).

Sau khi kết thúc chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT - PCR tiến hành điện di theo mục (6.1.3.4)