Quy trình tách chiết ARN khi thực hiện phương pháp RT- nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?
"B.2 Tiến hành
1. Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml.
2. Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K.
(Nếu thể tích mẫu <200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch đệm phosphat PBS hoặc 0.9% NaCl).
3. Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier ARN vào ống chứa mẫu, đóng nắp ống và vortex 15 s.
4. Ủ mẫu ở 56°C trong 15 min.
5. Cho thêm 250 µL cồn 96 - 100 % vào ống mẫu, đóng nắp và vortex 15s.
6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min.
(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).
7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc.
8. Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.
9. Cho 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc, ly tâm 12.000 vòng trong 2 đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.
10. Lặp lại bước 9 với 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa.
11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới.
12. Ly tâm khô 12000v trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5.
13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL.
14. Cho 10 đến 50 µL nước ARNse-free (E3) (có sẵn) vào cột lọc.
15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min, ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong 1 đến 2 min.
16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc, Bảo quản ARN ở nhiệt độ âm 80 °C.
CHÚ THÍCH: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh SCV."