Phương pháp RT PCR được tiến hành như thế nào để chẩn đoán bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà?
Cách tiến hành
...
5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
...
5.2.2.2.2. Cách tiến hành
Mẫu bệnh phẩm sau khi được xử lý (xem 5.2.2.1) đem chiết tách ARN, việc chiết tách có thể bằng kít thương mại (xem phụ lục A mục A.1).
a) Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt
Công thức pha hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt có thể được thay đổi cho phù hợp với từng loại mồi và từng loại kít RT-PCR khác nhau (xem A.2 và A.3 phụ lục A).
b) Tiến hành phản ứng
Sau khi chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, đưa mẫu vào máy PCR (4.5) và chạy chương trình (chu trình nhiệt) đã được cài đặt (xem A.3 phụ lục A)
Mỗi một lần chạy phản ứng, ngoài mẫu xét nghiệm, cần có một đối chứng dương và một đối chứng âm. Đối chứng dương là mẫu ARN của vi rút IB đã biết, đối chứng âm là nước tinh khiết không có nuclease (xem 3.3).
c) Điện di và hiển thị sản phẩm PCR
Sau khi chạy phản ứng RT-PCR, tiến hành điện di sản phẩm PCR (xem A.4 phụ lục A)
d) Đọc kết quả
Đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV(xem 4.6) (UV transilliuminator) có bước sóng 590 nm. Các mẫu có hiển thị sản phẩm giống như đối chứng dương và có kích thước 700 bp là âm tính. Mẫu âm tính không có vạch sản phẩm xuất hiện.
Nếu sản phẩm hiện lên mờ hoặc không rõ nét (trường hợp nghi ngờ) thì tiến hành lặp lại phản ứng RT- PCR một lần nữa.
...