Sau khi chiết tách ARN thì tiến hành phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 như thế nào?
Cách tiến hành
...
5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
...
5.2.2. Phát hiện kháng nguyên
...
5.2.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR
...
b) Tiến hành phản ứng
Tương tự phản ứng Realtime RT-PCR, phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen M, H5 và N1 và được thực hiện như sau:
Chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM với nước sạch Dnase/Rnase (trình tự mồi xem Bảng E1 phụ lục E)
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT-PCR để phát hiện mỗi loại gen của vi rút cúm gia cầm theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng (xem Bảng E2 và E3 phụ lục E).
Sản phẩm thu được sau phản ứng RT-PCR đem điện di để đọc kết quả.
c) Điện di sản phẩm RT-PCR:
Pha 1,5 g bột agarose (xem 3.4) với 100 ml dung dịch 1xTAE (xem 3.5), rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 °C đến 60 °C), cho tiếp 2 μl etidi bromua (xem 3.6). Sau đó đổ vào khay và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.
Đổ đầy dung dịch 1xTAE (xem 3.5) vào bể điện di (đến vạch full level), đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di. Pha 2 μl loading dye với 4 μl 100 bp ladder rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel. Pha 2 μl loading dye với 8 μl mẫu (đối chứng âm và dương), đưa vào các giếng còn lại của miếng gel.
Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đến 40 min.
Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV có bước sóng 590 nm để đọc kết quả.
d) Đọc kết quả:
Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR phát hiện các gen M, H5 hoặc N1 được đọc như sau:
Phản ứng RT-PCR phát hiện gen M dương tính hiển thị vạch sản phẩm 201 bp (cặp mồi: M52F và M253R).
Phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5 dương tính hiển thị vạch sản phẩm 363bp (cặp mồi: H5F 936 và H5R 1299).
Phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 dương tính hiển thị vạch sản phẩm 150 bp (AI N1-F6 và AI N1-595).
Các phản ứng RT-PCR không hiển thị vạch sản phẩm như xác định ở trên là phản ứng âm tính.