Quy trình tách chiết RNA trong phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm thực hiện như thế nào?
"3. Phương pháp chẩn đoán
...
3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược)
...
3.2.1.5. Cách tiến hành
3.2.1.5.1. Tách chiết RNA
CHÚ THÍCH: Có nhiều quy trình tách chiết RNA từ mô động vật theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hiện nay có rất nhiều các thuốc thử và bộ kit thương mại hữu ích cho việc tách chiết RNA…) Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phương pháp tách chiết RNA bằng trizol:
Cho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml. Nếu mẫu được cố định trong etanol 95 %, cần làm khô etanol bằng cách đổ etanol và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.
Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 l đến 200 l dung dịch trizol (lượng mẫu không quá 10 % trizol).
Nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 550 l đến 650 l dung dịch trizol và nghiền tiếp đến khi nhuyễn. Giữ ở nhiệt độ phòng đến 5 min.
Ly tâm 12000 g trong thời gian 10 min, sau đó chuyển dịch trong sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 150 l cloroform. Lắc cẩn thận bằng tay trong 15 s.
Ủ 15 oC đến 30 oC từ 2 min đến 3 min.
Ly tâm 12000 g từ 2 oC đến 8 oC trong 15 min, sau đó chuyển phần trong phía trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
Thêm 375 l dung dịch isopropanol, ủ ở 15 oC đến 30 oC trong 10 min.
Ly tâm 12000 g tại 4 oC trong 10 min, sau đó rút bỏ isopropanol.
Rửa phần viên bằng 750 l etanol 75 %.
Trộn đều bằng máy vortex và ly tâm ở 7500 g trong 5 min ở 4 oC, sau đó rút bỏ etanol. Làm khô phần viên.
Hòa tan RNA bằng nước tinh khiết hoặc DEPC (dietyl pyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50 l đến 100 l tùy thuộc vào lượng RNA tách chiết được.
CẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này."