Phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn được thực hiện ra sao?
Phương pháp trung hòa vi rút trên tế bào động vật (VNT)
Mẫu huyết thanh phải được xử lý nhiệt ở 56 °C trong 30 phút trước khi xét nghiệm.
Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng với 100TCID50/ 50 µl.
H.1 Thực hiện trên đĩa phản ứng: Huyết thanh pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512.
- Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.
- Cho 50 µl dung dịch vi rút với 100 TCID50 /50 µl vào các giếng.
- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút
- Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (106 tế bào/ml trong môi trường chứa 10 % FBS) vào tất cả các giếng
- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 48 giờ.
Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược (5.4.4) để ghi nhận bệnh tích tế bào.
H.2 Thực hiện trên đĩa đối chứng
- Đối chứng huyết thanh: Huyết thanh đối chứng âm và dương tính (đã biết trước hiệu giá kháng thể) pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512.
+ Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.
+ Cho 50 µl dung dịch vi rút với 100TCID50 / 50 µl vào các giếng.
+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút
+ Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (106 tế bào/ml) vào tất cả các giếng
+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 48 giờ
- Đối chứng tế bào
+ Cho 100 µl môi trường vào giếng A6 đến D6 và A7 đến D7.
+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút
- Đối chứng môi trường
+ Cho 150 µl môi trường vào giếng E6 đến H6 và E7 đến H7.
+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút
H.3 Chuẩn độ lại vi rút sử dụng
- Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng: từ 10-1 đến 10-4
- Cho 50 µl môi trường vào các giếng từ A9 đến H12.
- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-1 và các giếng từ A9 đến H9.
- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-2 và các giếng từ A10 đến H10.
- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-3 và các giếng từ A11 đến H11.
- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-4 và các giếng từ A12 đến H12.
- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút
Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (106 tế bào/ml) vào tất cả các giếng từ A1 đến H4, từ A6 đến D6, từ A7 đến D7 và từ A9 đến H12
- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút
- Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược (5.4.4) để ghi nhận bệnh tích tế bào.
...