植物甾醇(酯)的研究与应用前景
王小康，陈文，张太军，尹志刚，古玉龙，李 涛(1.郑州轻工业大学 材料与化学工程学院；2.文生生物科技(广州)有限公司；3.广州荃智美肤生物科技研究院；4.金发拉比妇婴童用品股份有限公司)植物甾醇，又称植物固醇，是一种甾体类化合物。广泛存在于蔬菜、水果、豆类、坚果、谷物等植物。它具有突出的降脂、抗氧化、抗炎、抑制癌细胞增殖、修复皮肤屏障、舒缓肌肤等功能，常应用于食品保健、化妆品、医药、农业和畜牧业。然而植物甾醇水溶性和脂溶性都很差，这极大地限制了它的应用。因此研究人员普遍选择将植物甾醇合成为更易溶于油相的植物甾醇酯后，再进行应用。例如，柯炜昌等人研究了不同植物甾醇酯的溶解度，结果表明在大豆色拉油中的植物甾醇油酸酯的脂溶性更好。截止到2020年，现已发现约250种植物甾醇及其衍生物并加以应用。本文简述植物甾醇及其酯的基本信息，对它的合成，功能和应用等方面的科学前沿成果，尤其是与化妆品相关的内容，进行较为全面地总结，并分析其未来的发展趋势，以期帮助学者进行更加深入的后续研究。1植物甾醇酯的合成研究进展目前，植物甾醇酯的合成方法主要分为两类，化学合成方法和酶催化方法。化学合成方法主要有德国Cognis公司的直接酯化方法和芬兰Raisio公司的酯交换方法。酶催化方法则选择合适的脂肪酶进行催化，主要是假丝酵母脂肪酶。有学者以β-谷甾醇为原料，研究了饱和和不饱和植物甾醇酯的相行为和多态性。得出脂肪酸碳链长短和不饱和程度影响熔化温度，熔化焓，成核速率，晶体尺寸，晶体形态的一系列规律性结论。这对于选择何种脂肪酸进行植物甾醇酯化具有指导意义。酯化方法中，一般以植物甾醇和脂肪酸为原料，浓硫酸为催化剂；该方法的技术工艺上存在着五大缺陷：①植物甾醇和硫酸容易形成硫酸酯，该硫酸酯不易水解而残留在产品中给产品的进一步应用带来麻烦；②反应位点不完全在羟基上，也可能发生在双键，甚至产生碳骨架重排，因此产品杂质多，成分复杂；③由于植物甾醇分离量较大，醇羟基活性相对较低，因此需要进行长时间反应，且目标分子得率低，杂质难以除去，而且长时间反应往往造成产品色泽(变深)较差，气味难闻；④产品中含有双键，易于氧化产生酸败；⑤由于反应过程使用硫酸催化，产品后处理必然涉及大量污水排放问题。为解决这些难题，国内外相关企业摒弃了浓硫酸为催化剂的传统制备方法，开发了酯交换方法，该方法以植物甾醇和脂肪酸甲酯为原料，在碱性催化剂甲醇钠存在下进行。虽然酯交换方法比酯化反应选择性有所提高，副产物有所减少，但是同样存在产品杂质多、褐变、酸败、污染重等问题。于是人们尝试吡啶、硫酸盐、无机酸碱、氧化铝、氧化镧、氧化锌、氧化镁、氧化铜-纳米羟基磷灰石等不同催化剂试图改善上述工艺技术过程中反应产物的品质。但实验事实证明，上述化学催化法并不能彻底改变产品褐变，杂质多，污染重等问题。于是，研究者又进一步开发了离子液体催化法，深共熔溶剂催化法，无溶剂直接酯化法等在解决上述问题中有一定进展。这三种合成方法更符合绿色化学，都解决了溶剂上的问题，与传统方法相比，污染问题得到很好的解决。然而它们目前仍不能够完善的解决化学合成的那些缺点。反应选择性一般、最终酯化率较低和适用范围有限这些都是制约其发展的主要原因。因此将其应用于工业生产的企业不多，相关的研究报道还需进一步探索和发展。例如：深共熔溶剂催化法能否提高反应酯化率90%以上；无溶剂直接酯化法能否针对其他较低沸点，熔点的脂肪酸和植物甾醇在高温，无溶剂情况下合成，扩大应用范围。在未来，这些问题如果能够解决，那么用于工业生产上将是有优势的。生物酶催化法所用到的生物酶是一种脂肪酶，其主要来源是假丝酵母，如南极假丝酵母等。这类反应对比于其他合成方法，它成本相对较高，有些反应时间也较长。但却是目前研究最多的一种合成方法，原因在于这种方法具有大多数酶可以循环使用；脂肪酶专一定向催化，副反应、副产物少；零排放、无污染；无化学催化剂添加；无溶剂残留；高纯度低残留；产品收率高等优点。有关生物酶催化的研究主要围绕酶的筛选以及反应体系的优化。有许多脂肪酯如：Carica papaya、Ricinus Communis、Rhizomucor miehei、Candida antarctica B和C. rugosa等。对于不饱和植物甾醇油酸酯的合成来说，Novozym®435和皱褶假丝酵母脂肪酶(C. rugosa lipase，CRL)是被证明很有效的脂肪酶。筛选出合适的酶后，如何保证生物酶在反应体系中的稳定性是确保反应效率的关键。溶剂对生物酶的影响是显而易见的，因此通常采用无溶剂体系，保持生物酶稳定性的，但在无溶剂体系中进行催化反应，体系的黏度会很大，这就不得不提高搅拌速度。高搅拌速度和高黏度会导致体系剪切力增大，破坏酶的结构，降低反应效率。因此游离的生物酶是需要进行固定化加强稳定性的。固定化的方式有很多，工业生产上常常采用载体结合，如吸附于二氧化硅纳米孔、大孔树脂，共价偶联，包埋等方法将脂肪酶固定化。湖南禾益元生物科技有限公司(原湖南贸翔生物科技有限公司)通过与北京化工大学的谭天伟院士和陈必强教授合作，以“一种无溶剂体系中合成植物甾醇酯的方法和装置”为核心专利，围绕酶法生产植物甾醇酯的各个环节使用了三项发明专利和六项实用新型专利，年产2000吨甾醇酯，实现了酶法工艺产业化。以植物甾醇油酸酯为例，其生产步骤主要包括：制备改性脂肪酶，脂肪酶固定化，粉碎植物甾醇，定量添加植物甾醇和葵花油油酸酯，循环发酵，初级滤液通过分子蒸馏分离出目标产物。目前国内外企业生产植物甾醇酯，仍多采用化学催化法。然而随着生物催化法的产业化和其高品质的特点，在未来必将逐渐淘汰化学催化，成为行业主流。2植物甾醇(酯)的结构特点与性质植物甾醇(酯)是一类有多个脂肪族六元环与五元环组成的桥环化合物，主体骨架结构是环戊烷并八氢菲骨架，又称“甾体骨架”(Sterol backbone)。甾体化合物通常以甾醇、烷酸甾醇或糖苷等三种形式存在。其中在皂化条件下，烷酸酯和糖苷形式会分解为游离的植物甾醇。由图1可见，甾醇的3号碳连接着醇羟基17号碳连接着不同的取代基R，它会因醇羟基碳原子立体异构差异和取代基R2不同形成多种类型，其中5号碳是否饱和决定是甾醇还是甾烷醇。常见的5种甾醇分别为β-谷甾醇(Sitosterol，图1A)、豆甾醇(Stigmasterol，图1B)、菜油甾烷醇(Campestanol，图1C)、菜油甾醇(Campesterol，图1D)和胆甾醇(Cholesterol，图1E)。其中，前四种为植物甾醇，第五种是胆甾醇又名胆固醇。当3号碳的醇羟基与脂肪酸发生酯化反应，形成对应的植物甾醇酯。如与油酸结合形成植物甾醇油酸酯。图1 植物甾醇的结构降低胆固醇：大量的医学临床实验，高血脂小鼠实验和志愿者人体试验，均表明植物甾醇(酯)具有降低胆固醇、降血脂效果。相关机制研究表明植物甾醇通过与胆固醇在肠胃中竞争吸收，减少人体对胆固醇的摄入。抗炎作用：2019年Vilahur Gemma等人编写了一篇《植物甾醇酯与炎症》的文章，记载了许多植物甾醇酯抗炎的体外研究和实验动物模型。表明植物甾醇能够有效降低炎症因子的分泌。降低结肠癌风险：Araceli Urquiza-López等人发现一种植物细胞的代谢产物能够有效抑制人类HT-29结肠癌细胞的增殖，对其进行物质分析，表明植物甾醇酯在其中发挥着作用。高熔点、低溶解度：为解决应用难度，研究人员对植物甾醇进行了各种物理和化学改性修饰。物理改性修饰包括微乳化和自乳化，微胶囊化，基于生物聚合物、基于表面活性剂和基于脂质的纳米载体等。化学改性修饰包括酯化、乙氧基化和聚乙二醇(PEG)修饰等，分别提高植物甾醇的脂溶性和水溶性。安全性：植物甾醇对人体是安全的，然而改性植物甾醇的安全性却并非绝对安全，针对上述各种物理和化学改性，Feng等人研究了它们的安全性，得到结论如下：植物甾醇酯被认为是安全的，但合成过程中可能产生的植物甾醇氧化物在动物模型显示出毒性。纳米载体的毒性则还需要进一步研究。3植物甾醇(酯)在化妆品中的应用与发展前景化妆品成分审查(Cosmetic Ingredient Review，CIR)报道了26种植物甾醇和植物甾醇酯成分用于化妆品。这些成分作为皮肤调理剂、头发调理剂、粘度增加剂、皮肤保护剂、抗氧化剂、药物防腐剂和香料应用于化妆品。相关的毒理学数据显示植物甾醇(酯)是安全的。美国食品药品监督管理局(U.S. Food and Drug Administration，FDA)在化妆品应用植物甾醇(酯)的报道如下：除婴儿产品外，所有化妆品类别都使用植物甾醇(酯)。最大使用浓度为0.000 001%～8%。在已使用化妆品原料目录(2021年版)中能够检索到66种甾醇类原料被使用。其中植物甾醇类原料约有36种，其余为胆甾醇(胆固醇)类原料。胆固醇是人体必不可少的物质，同时在维持皮肤健康方面起着重要的作用。然而，当它被直接应用到皮肤上时，它可能会导致炎症和痤疮。相比之下，植物甾醇及其酯类的皮肤耐受性良好，同时可以模仿胆固醇的功能。另一个值得关注的问题是，胆固醇只存在于动物体内并且它的合成过程相当复杂有近30步的反应，因此从牛的脊髓中提取或从羊毛脂中提取，是获得商业胆固醇的最常见途径。从来源上讲，不如植物甾醇安全、环保、可持续。表1展示了植物甾醇与化妆品相关的作用研究。对成纤维细胞的增生效果，促进胶原蛋白的产生，对黑色素细胞具有抑制作用，紫外线保护，保湿，抗氧化，抗炎，生发等作用意味着它对皮肤健康有着显著影响：抑制皮肤炎症，修复皮肤屏障，减缓皮肤瘙痒，防止皮肤老化，改善皮肤弹性，降低皮肤粗糙度。因此植物甾醇最好用于抗衰老的乳霜和防晒乳液。此外，它们的抗炎作用使其成为一种可以用来治疗特应性湿疹和保护婴儿皮肤的产品的理想成分。表1 植物甾醇与化妆品相关的作用研究由表1可知，植物甾醇可应用于化妆品的作用包括促进细胞增殖，促进胶原蛋白生成；抑制紫外线引起的细胞凋亡；抑制黑色素细胞活性；保湿；抗氧化；抗炎；生发等。依据上述对植物甾醇的功能总结，其在化妆品中的应用如下：应用于护肤品类：植物甾醇（酯）对皮肤健康有着显著影响：抑制皮肤炎症，修复皮肤屏障，减缓皮肤瘙痒，皮肤抗敏修复，抗衰老，抗光老化改善皮肤弹性，降低皮肤粗糙度。其中修复皮肤屏障功能的机理如下：细胞膜含有磷脂、糖脂、甾醇和一些蛋白质。当细胞膜内甾醇含量大于10%，鞘脂类和甾醇通过蛋白质和脂质的作用会形成脂筏(Lipid rafts)结构。脂筏影响着膜稳定性、膜流动性和膜蛋白运输等功能。植物甾醇能够与皮质醇交换位置，替代皮质醇；或补充因生理衰退而出现空缺位置，从而恢复皮肤应有的稳定状态。应用于洗护品类：加入洗发水和护发素后，植物甾醇可以提供柔软的光泽，减少头发干燥，甚至防脱育发。然而植物甾醇防脱发的研究其实并不多，但从理论上讲植物甾醇具备防止脱发的潜力，理论依据如下：造成头发脱落的因素有很多如雄激素，转化生长因子TGF-β2，前列腺素D2等，其中最大影响因素就是雄激素。雄激素是由胆固醇通过酶转化而来的。睾酮通过5α-还原酶形成双氢睾酮，已知其造成脱发作用机理有：1)双氢睾酮结合雄激素受体，影响转录过程。2)双氢睾酮会上调真皮乳头中TGF-β2的合成，TGF-β2诱导半胱天冬酶的合成和激活，造成细胞凋亡，使头发退行期提前，缩短头发生长周期。3)双氢睾酮与雄激素受体结合会与Wnt/β-连环蛋白发生分子串扰，阻碍真皮乳头细胞释放Wnt 10b等有益头发生长的因子，并释放白细胞介素6等免疫炎症因子，影响毛囊周边的角质细胞和成纤维细胞的生长和交流。植物甾醇具有降低胆固醇含量和减轻炎症的功能，同时也有益于毛囊周围的成纤维细胞的增殖。这些给予了植物甾醇能够防脱发的理论可能。目前报道了许多含有植物甾醇(酯)的草本植物具有防脱效果，但植物甾醇在其中起到多少作用还没人进行深入研究。应用于彩妆品类：植物甾醇及其酯类可以为彩妆增加质地和光泽，常用于口红、散粉和睫毛膏等。依据美业颜究院选取2021年胆甾醇、植物甾醇类和植物甾醇油酸酯应用品类占比的数据统计，护肤品类备案产品数为14188款，占比82%；彩妆品类备案产品数为2191款，占比13%；洗护品类备案产品数为946款，占比5%。由此可见植物甾醇(酯)在化妆品中应用范围广泛。根据美业颜究院2022年1月5日的大数据，对甾醇类原料的备案情况进行分析。表2显示了前10种原料近八年的备案情况，其中胆甾醇、植物甾醇类和植物甾醇油酸酯分列前三。数据显示2021年备案产品数排行中胆甾醇位居第一，但紧随其后的第2～10名则均是不同种类的植物甾醇(酯)，整体来看植物甾醇类比胆甾醇类备案产品更多，具有取代胆甾醇的趋势。其中植物甾醇油酸酯表现相当突出，作为植物甾醇“最好”的衍生物，大势所趋下，发展前景可期。表2 2014年—2021年各甾醇类化妆品原料的备案产品数4植物甾醇(酯)的其他应用食品行业：基于植物甾醇(酯)降低胆固醇的功效，早在1950年欧美国家便形成了一股植物甾醇的健康热潮。为预防慢性病，人们寻找并食用含有植物甾醇的食物，增加植物甾醇摄入量。后来渐渐开始在食物中添加植物甾醇、开发高植物甾醇含量的食品。由此植物甾醇在食品领域的应用和研究越来越多。如高甾醇含量植物油；降血脂养生粥；奶酪、奶粉、牛奶等乳制品；饮料；烘焙食品等。保健品行业：围绕着降血脂，守护血管，血管清除等功能，目前已开发了蛋白粉，胶囊，药片等不同形式的健康保健品。而若基于改善皮肤状态的功能，也可以开发美容保健品。医药行业：医药领域对于植物甾醇的应用开发主要集中于调节血脂，抗消化道肿瘤，甾体激素的合成，医药脂质体这四个方面。治疗非酒精性脂肪性肝病。保护胃黏膜，抗消化道肿瘤。甾体激素药物是仅次于抗生素的一类药物，在工业生产上通过对具有甾体骨架的天然物质进行结构改造获得目标产物。脂质体具有生物降解，相容性，靶向性，降低毒性的特点被广泛应用于各种医药载体。植物甾醇能够提高脂质体膜稳定性和靶向性，因此常被应用于医药脂质体的制备。饲料行业：在猪鸡牛羊鱼虾蟹蚕鸟等畜禽养殖生产中，植物甾醇被广泛添加于饲料中。作为功能性饲料添加剂植物甾醇能够降低畜禽类肉蛋奶产品的胆固醇含量，促进动物生长，帮助动物健康，提高产量。植物生长调节剂，芸苔素内酯，化学式为C28H48O6，是一种新型绿色环保植物生长调节剂，其通过适宜浓度浸种和茎叶喷施处理，可以促进蔬菜、瓜类、水果等作物生长，可改善作物品质，提高作物产量，使作物色泽艳丽、叶片更厚实，也能使茶叶的采叶时间提前、瓜果含糖份更高、个体更大、产量更高、更耐储藏。目前，芸苔素内酯的主要来源是以豆甾醇为主体原料，经过磺酰化、骨架重排、氧化、双键重排、双羟基化与扩环等反应合成获得。5总结与展望植物甾醇天然存在于自然界植物中，对人体安全且具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌等有益健康的功能，因此植物甾醇被健康人士所热爱。同时它也被广泛应用于化妆品，食品保健品，医药，农业和畜牧业等领域。但是这类物质溶解性差，熔点高，限制了它的生物利用度和实际应用。所以人们对其进行了各种物理和化学改性修饰，其中将其酯化是最常用的手段。植物甾醇酯的合成主要有化学催化法和生物酶催化法，其中生物酶催化法是研究热点和未来的发展趋势。随着国内酶法制备植物甾醇酯的产业化，国产质量有了很大进步。仅以化妆品行业来看，可以预见植物甾醇发展前景很大，而植物甾醇油酸酯作为其中的代表性物质更是潜力巨大。