文献分享《AR mRNA翻译的调控响应急性AR通路抑制》
研究背景 雄激素受体(AR)通路抑制(ARPI)在晚期前列腺癌(PCA)中有重要和持续的作用。复发是不可避免的，与AR的再激活和发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)有关，这可归因于AR的基因组和代谢再激活，并得到应激反应、激酶信号转导和发育通路的环境依赖性激活的支持。这些机制协同工作，并强调AR是PCA进展和治疗耐药性的核心致癌驱动因素。事实上，ARPI诱导的AR基因扩增和突变是CRPC中最常见的基因组改变，并且ARPI在临床前模型和人类PCA中诱导AR全长和AR变体mRNA的表达。虽然支持克隆进化的适应性反应强调转录、表观遗传和突变变化，但新出现的证据包括通过mRNA转运和翻译的急性变化来适应应激。此外，基因组和转录组的变化不能充分预测生物学，mRNA和蛋白质表达水平通常不相关。癌细胞可以选择关键的稳态应激反应，包括有助于细胞生存和治疗耐药性的mRNA翻译的适应性变化，但我们对ARPI应激期间AR mRNA的作用及其翻译的调节知之甚少。  一种高度保守的应激翻译调节机制涉及应激颗粒(SGs)中mRNA的隔离和保护。SGs是一种无膜核糖核蛋白(RNP)复合物，由本质上无序的蛋白质和RNA的液相分离(LLPS)形成，由mRNA、核糖体成分(40S)、RNA结合蛋白(RBPs)和信号因子组成。SGs隔离翻译抑制的mRNA，并允许选择性翻译SGs排除的细胞保护mRNA子集。作者最近的研究表明，在SG形成过程中，G3BP1指导转录本分割以重编程mRNA翻译并支持PCA中的细胞保护。这些研究暗示了这些新型RNA-蛋白复合物的功能作用，靶向SG的形成可能是一种可利用的治疗策略。  mRNA稳态的一个重要调节因子涉及RNA外延转录组修饰(ETMs)。腺苷n6位置的甲基化(m6A)是一种丰富而多功能的RNA ETM。writer、reader和erasers协同调节RNA m6A ETMs和RNA代谢的各个方面，包括剪接、核输出、定位、翻译和稳定性。writer是将m6A添加到RNA上的甲基化酶(例如，METTL3, METTL14, WTAP, KIAA1429)，reader主要是与m6A修饰的RNA结合的RBP(例如，YTHDF1-3, YTHDC1)，而erasers是从RNA中去除m6A的去甲基化酶(例如，FTO, ALKBH5)。RNA ETM调控writer、reader和erasers的紊乱与多种疾病有关，包括肥胖和癌症。  在本研究中，作者研究了急性ARPI应激环境下的AR mRNA调控，以确定在治疗应激下支持生存的快速适应性变化。YTHDF3和G3BP1 RBPs根据其m6A状态协调调节AR mRNA的翻译。在环境条件下，YTHDF3在多体(PSs)中结合m6a修饰的、翻译活跃的AR mRNA部分，而G3BP1结合m6a未修饰的、翻译不活跃的AR mRNA部分。当AR调节的PCA细胞暴露于ARPI应激时，ARmessages从PSs转移，AR mRNA的翻译减少。翻译抑制的AR mRNA在细胞质中的SGs的组装，并与YTHDF3和G3BP1以不同的簇相关联。通过沉默YTHDF3或G3BP1来阻断这种适应性反应，使PCA细胞对ARPI应激敏感。有趣的是，AR沉默也阻止了前列腺癌细胞在ARPI应激后SG的形成，突出了ARmRNA在其受体拮抗时触发SGs的作用。作者的研究定义了一种由m6A修饰介导的AR mRNA翻译的新机制，其调控RBPs和SG的形成。核心结论1.PCA细胞和肿瘤组织在ARPI应激下形成SGs  由于ARPI对AR反应性PCA细胞有应激作用，作者探索了这种治疗诱导SG形成的条件。当用AR拮抗剂enzalutamide (ENZA)预处理LNCaP细胞时，当与轻度应激结合时，包括氧化应激[亚砷酸盐(ARS) 20uM1h]，内质网(ER)应激[thapsigargin (TGN) 0.1 uM 1 h]，或渗透应激[山梨醇(SBL) 50 uM 1h]，SGs有效形成。SG标记蛋白G3BP1和YTHDF3共定位染色可见SGs。作者将这种联合应激，即轻度细胞应激加上ARPI的治疗定义为“ARPI应激”，其目的是在应激肿瘤微环境中模拟抗癌治疗。仅轻度应激或仅ARPI不会诱发SGs。作者还观察到与轻度氧化应激共同治疗的其他AR拮抗剂，包括darolutamide (ODM-201)、VPC-14449和EPI-001(49-51)，增强了SG的形成。作者测试了另外一个AR敏感的PCA细胞株V-16-D，发现类似的SGs对ARPI应激的诱导反应。AR阴性的PC-3细胞对ARPI应激不敏感，不形成SGs，提示在ARPI应激细胞中，活跃的AR通路是形成SGs的必要条件。AR拮抗剂比卡鲁胺也诱导了类似于enzalutamide的SGs，但有趣的是，在晚期PCA中批准的其他治疗药物，包括微管抑制剂多西他赛和PARP抑制剂奥拉帕尼，当与低剂量亚砷酸盐联合使用并以降低细胞存活的浓度使用时，并未诱导SG形成。与未接受治疗的癌症相比，新辅助ARPI后有更多明显的SGs。总的来说，这些结果表明ARPI应激后AR阳性PCA细胞系和临床PCA肿瘤中有以AR为中心的环境依赖性SGs诱导。2.ARPI应激后，AR mRNA转录本被招募到SGs  ARPI后AR蛋白水平下降，AR总转录水平或AR蛋白降解率不受ARPI应激的影响。然而，通过蔗糖梯度多聚体(PS)分离，作者发现ARPI应激细胞的PSs中AR mRNA明显低于非应激细胞，这表明AR蛋白水平的降低与其与PSs mRNA关联的降低有关。通过监测AR mRNA在蔗糖梯度上的相对分布，作者发现在ARPI应激细胞中，AR mRNA从未处理细胞中的可翻译PS部分重新分布到不可翻译的非PS部分。由于SGs可以在应激反应中相分离翻译停滞的mRNA，作者测试了在ARPI应激后，PSs中停滞的AR mRNA是否被招募到SGs。利用AR信号对应的寡核苷酸进行原位杂交(ISH)，发现ARPI应激后，其在SGs中与G3BP1和YTHDF3共定位。总之，这些结果表明，急性ARPI应激诱导AR mRNA从PSs分解并募集到SGs，减少AR蛋白的合成。3.YTHDF3结合m6A修饰的AR mRNA，G3BP1结合m6A未修饰的AR mRNA 据报道，m6A修饰的mRNA可以结合YTHDF3而不是G3BP1。由于ARPI应激细胞SGs中的AR mRNA转录本与YTHDF3或G3BP1共存，作者开始定义m6A修饰对AR mRNA与这些RNA结合蛋白(RBPs)相互作用的影响。在m6A预测中鉴定出AR mRNA中m6A修饰的残基。为了确定AR mRNA的m6A修饰，作者使用两种不同的抗m6A抗体，并用qRT-PCR对AR mRNA进行定量分析。在基础条件下，AR mRNA被m6a修饰，ARPI应激后，m6a修饰的AR mRNA水平下降。为了确定AR mRNA与YTHDF3和G3BP1在细胞中的相关性，作者从未处理或ARPI应激的LNCaP细胞中使用核糖免疫沉淀(核糖- ip)提取这两种蛋白，并通过qRT-PCR分析相关的AR mRNA。作者发现G3BP1和YTHDF3在未处理的细胞中都能结合AR mRNA。应激后AR mRNA-YTHDF3的相互作用保持不变，而应激后AR mRNA-G3BP1的相互作用增加。为了描述AR mRNA与YTHDF3和G3BP1的直接相互作用，作者克隆了YTHDF3和G3BP1的开放阅读框(ORF)，融合His-tag，表达并纯化重组蛋白。使用RNA电泳迁移率漂移试验(EMSA)测定重组蛋白YTHDF3或G3BP1与m6a修饰或未修饰的AR mRNA对应的RNA探针的结合。首先，作者设计了带有或不带有m6A修饰的生物素标记mRNA探针(30个核苷酸)，对应于具有较高m6A预测评分的AR mRNA的两个不同区域。所选区域包含两个最丰富的m6A一致性序列。两种m6a修饰探针8953-m6A和6908-m6A都与YTHDF3特异性相互作用。相比之下，未修改的探针8953UM和6908-UM均未与YTHDF3结合。与m6a修饰的探针相比，G3BP1与未修饰的探针的结合亲和力更高。 作者选择了一个额外的m6A预测区域(位置7301)。与之前的观测相似，位置7301对应的m6a修饰探针与YTHDF3有强相互作用。G3BP1与未修饰探针的结合亲和力高于m6a修饰探针探针。这些结果表明，虽然YTHDF3和G3BP1基于AR mRNA的m6A状态差异结合，但AR mRNA与G3BP1或YTHDF3的结合亲和力可能不是由特定残基决定的;相反，它可能是由AR mRNA中多个m6A的净效应决定的。4.m6A RNA修饰影响AR mRNA与YTHDF3和G3BP1的相分离 重组YTHDF3或G3BP1在体外可形成液滴。fitc标记的AR mRNA探针用YTHDF3或G3BP1滴定，并进行LLPS处理。m6a修饰的AR mRNA探针易于相分离到YTHDF3液滴中，形成强烈的绿色荧光液滴，表明m6a修饰的AR mRNA寡核苷酸可以在YTHDF3液滴中相分离。相比之下，未修饰的低聚物与YTHDF3液滴的相分离较弱。另一方面，G3BP1液滴与未修饰的寡聚物相分离较强，与m6a修饰的寡聚物相分离较弱。随着时间的推移，YTHDF3和G3BP1形成的液滴润湿了表面，证实了这些液滴具有类液体性质。这些结果表明YTHDF3和G3BP1相根据其m6A状态分离AR mRNA寡核苷酸。 接下来，作者分析了YTHDF3和G3BP1液滴中全长AR mRNA的相分离。在体外将YTHDF3或G3BP1重组蛋白与从LNCaP细胞中提取的总RNA混合，诱导LLPS形成液滴。经RNase A处理后，与RNA混合的YTHDF3或G3BP1没有形成液滴，证实了YTHDF3或G3BP1在LLPS和液滴形成中需要RNA。  为了确定AR mRNA是否富集于上述RNA诱导的YTHDF3或G3BP1液滴中，将相分离的部分短暂离心，以将“液滴”部分与周围的“液体”部分分离。当用TRIzol分别提取“液滴”和“液体”部分中的RNA并进行qRT-PCR时，作者发现与周围的“液体”部分相比，YTHDF3和G3BP1“液滴”部分中AR mRNA的水平更高，这表明YTHDF3或G3BP1液滴中AR mRNA的富集。接下来，为了确定在YTHDF3或G3BP1液滴中分离的m6A修饰或未修饰的AR mRNA相的差异，使用抗m6A抗体从YTHDF3或G3BP1的“液滴”和“液体”部分中提取m6A修饰的信息，并进行qRT-PCR来量化AR mRNA水平。与“液体”组分相比，m6a修饰的ARmRNA在YTHDF3“液滴”中富集，这表明YTHDF3液滴主要是相分离的m6a修饰的ARmRNA。相比之下，在G3BP1中，m6A未修饰ARmRNA在“液体”中富集，而在“液滴”中富集，这表明在G3BP1液滴中分离的AR mRNA相主要是m6A未修饰mRNA。这些实验表明，YTHDF3液滴与相分离的m6a修饰的ARmRNA具有较高的亲和性，而m6A未修饰的ARmRNA与G3BP1相分离。5.ARPI应激细胞中AR mRNA支持SG的形成  作者发现AR沉默最初延缓了ARPI应激细胞中SG的形成，但随着处理时间的延长，这种作用逐渐丧失。此外，当亚砷酸盐浓度增加到>100 uM时，AR KD延缓SG形成的作用消失，说明这种作用是针对ARPI应激(低浓度亚砷酸盐和ENZA)条件的。AR沉默不影响主要SG蛋白的水平，包括G3BP1、YTHDF3、YB-1和CAPRIN1，排除了对延迟SG形成的影响。这些数据表明，虽然AR mRNA对SG的形成不是必需的，但它可能通过与G3BP1和YTHDF3等RBPs的相分离来支持SG的形成。为了进一步确定AR mRNA(而非蛋白质)在这一过程中的作用，用AR降解剂ARD-61 (50 nM, 6 h)处理LNCaP细胞。当ARD-61处理的细胞暴露于ARPI应激时，SGs形成与未处理的对照细胞相似。ARD-61处理使AR蛋白水平降低>99%，而AR mRNA水平没有任何显著变化。总之，这些观察结果表明AR mRNA siRNA减少了SG的形成，AR蛋白降解不影响SG的形成，表明AR mRNA(而不是蛋白质)支持ARPI应激诱导的SG的形成。这一观察促使我们测试其他致癌转录因子是否与AR mRNA有类似的作用。总之，这些结果表明，当AR对应的配体结合蛋白被拮抗或降解时，它们的mRNA转录本可能支持SG的形成。6.YTHDF3和G3BP1定位在SGs内部空间上独立的簇中  SGs是由数百个RBP组成的复合物，由一个密集的核心连接着被称为壳层的松散填充区域。SG核心区域大多是不活动的，含有G3BP1和TIA1等蛋白质，这对SG的形成至关重要。相比之下，壳区大多是动态的，包含像YTHDF家族成员这样的蛋白质，它们的功能是促进SG组装。由于YTHDF3和G3BP1都存在于SGs中，作者的结果提高了SGs分别通过与YTHDF3或G3BP1结合来招募m6a修饰和未修饰的AR mRNA的可能性。如果是这样，两个m6a修饰和m6a未修饰的AR mRNA信息池可能作为SGs中两个独立的YTHDF3和G3BP1集群共存。作者使用体外液滴试验、刺激发射耗竭显微镜(STED)细胞SG成像和接近连接试验(PLA)来确定G3BP1和YTHDF3的差异聚类，以及它们与m6修饰mRNA的关联。YTHDF3与绿色荧光蛋白(GFP)融合克隆，G3BP1与红色荧光蛋白(RFP)融合克隆。两种蛋白均在细菌中表达，纯化为重组蛋白，与总RNA混合进行相分离。相分离的YTHDF3和G3BP1液滴混合时不完全混溶，在同一络合物中形成单独的簇。这些结果支持了G3BP1和YTHDF3作为单独的集群存在的观点。在非应激和ARPI应激的PCA细胞中使用STED显微镜免疫染色YTHDF3和G3BP1也发现了非应激细胞中YTHDF3和G3BP1蛋白的明显聚类，在ARPI应激后聚集形成大的SGs。YTHDF3和G3BP1是不混溶的，在SGs内部仍然是不同的集群。在非应激或ARPI应激细胞中，使用抗m6A和YTHDF3或G3BP1抗体的接近连接试验(PLA)显示YTHDF3-m6A关联阳性，而G3BP1-m6A关联为阴性。总的来说，作者的结果表明，m6a未修饰的ARmRNA在SG核中与G3BP1相分离，而m6a修饰的ARmRNA在更动态的SG壳中与YTHDF3相分离。7.m6a修饰的AR mRNA调控其翻译 G3BP1与m6A未修饰的AR mRNA结合可能构成一个不可翻译的AR mRNA库。G3BP1在PS部分中几乎检测不到，主要积聚在未翻译的非PS部分中。由于G3BP1与PSs无关，且富集在未翻译的部分，G3BP1 KD不影响点击化学测量的AR蛋白合成速率。另一方面，在未经处理的细胞中，YTHDF3在PS和非PS组分中都被富集，在ARPI应激后，YTHDF3从PS组分重新分布到未翻译的非PS组分。因此，与G3BP1 KD相反，YTHDF3沉默降低了PSs中的AR蛋白水平和mRNA水平，而不影响AR mRNA总量或AR蛋白降解率。利用核免疫沉淀(RIP)对YTHDF3相关mRNA的下拉证实了PSs中AR mRNA与YTHDF3的相互作用。此外，使用抗m6A抗体下拉m6A修饰的mRNA表明非应激细胞中PSs中m6A修饰的AR mRNA富集。ARPI应激后，PSs中m6A修饰的AR mRNA水平降低，并从PSs重新分布到非ps组分。总之，这些数据表明，在非应激细胞中，YTHDF3与m6A修饰的AR mRNA结合，并刺激其在ps中的翻译。8.G3BP1和YTHDF3在ARPI应激细胞中具有细胞保护作用  在ARPI应激后，SGs会迅速形成，当应激消除时，SGs会解体。同样，ARPI应激后AR蛋白表达的下降在细胞从应激中恢复后24小时内恢复到基线。在急性ARPI应激条件下，当诱导SGs和AR蛋白水平降低时，作者没有检测到明显的凋亡。这些结果表明，急性ARPI应激诱导的SG形成是由AR mRNA触发的动态应激依赖过程，可能激活细胞保护通路。作者和其他人将G3BP1和YTHDF3定义为癌症的生存因子。与这一前提一致，与ARPI应激对照细胞相比，G3BP1或YTHDF3沉默的LNCaP细胞对急性ARPI应激(8小时)有增强的PARP裂解和BAX激活(通过2D2抗体检测寡聚的BAX)。随着慢性ARPI应激时间延长(48小时)，对照细胞也受到影响，并表现出增强的PARP处理和BAX激活。当停止应激处理时，siControl细胞恢复了与从未受到应激的细胞相似的生长，这与作者的发现相一致，即ARPI应激诱导的变化是动态和可逆的。值得注意的是，siG3BP1或siYTHDF3细胞的生长曲线没有逆转，表明这两种RBPs在应激下都具有细胞保护作用，因此可能支持对ARPI应激的治疗抗性。G3BP1在ARPI治疗后、CRPC和神经内分泌前列腺癌(NEPC)患者样本中表达水平较高。YTHDF3蛋白表达在短期ARPI后略有下降，但在CRPC和NEPC组织中显著升高。这些结果将ARPI诱导的G3BP1和YTHDF3的增加与细胞保护和治疗耐药性联系起来，并支持进一步针对这些RBPs使PCA细胞对ARPI敏感的研究。总结  在PCA细胞系和组织中，急性ARPI应激后形成了细胞保护性SGs。RBPs YTHDF3和G3BP1协调调节AR mRNA的翻译，在PSs中，YTHDF3结合m6a修饰的、翻译活性的AR mRNA，G3BP1结合m6A未修饰的、翻译抑制的AR mRNA。  在急性ARPI应激下，AR mRNA支持相分离和SG的形成，m6A未修饰的 AR mRNA结合到G3BP1相分离成SGs的核心簇，而YTHDF3结合的m6A修饰的AR mRNA定位为位于SG核心周围的独特的壳簇。ARPI诱导的SG形成减少了整体翻译，同时激活了适应性细胞保护途径；通过G3BP1或YTHDF3沉默使PCA细胞对ARPI应激敏感来阻断这种适应性反应。