重组PCR
重组PCR (recombinant PCR) 是指把两个不相邻的DNA 片段重组在一起的PCR 法、在分子遗传学研究中，要求引入的点突变、插入或缺失的DNA 片段往往并不处于DNA 末端。
将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。
在 PCR 反应的退火过程中 , 具有 3 ′末端同源序列的异源 DNA ( 不完全延伸的引物或模板碎片等 ) 可能产生链间退火并各自 提供 3 ′羟基作为引 物沿另一 DNA 链延伸 。 这类体外反应中的“模板转辙 ”的结果是产生嵌合的 DNA 分子 (chimeric DNA), 因 此形成了 重组 PCR 的概念 , 并用于人为制造重组体的实验中 。
重组 PCR 策略大致可以分为三类 : 重叠延伸拼接 (splicing by overlap extension, SOE) 、 跳 跃 PCR(jumping PCR, JPCR) 和 DNA 重排 (DNA shuffling) 。 SOE 通过重叠延伸引 物 ( 上游片段的 3 ′端碱基序列和下游片段 5 ′端碱基序列的共线化形式 ) 人为地在不同的靶基因片段上引 入重叠互补区 , 引 导这些片段顺序连接。 JPCR 策略的关键是产生中止于序列同源区的一系列不完全延伸的片段 , 这些片段以其同源的 3 ′尾巴退火至另一基因片段上的同源区继续延伸。 DNA
shuffling 这个名称本身就十分形象。 它是将完整靶基因打成随机碎片 , 成分混杂的碎片在热循环过程中互为引物相互延伸 , 并倾向于以随机重排来恢复原基因 。
根据上述三个策略可以归纳出重组 PCR 的三个阶段 :(1) 制备用于重组的 DNA 组件 ;(2) 组件分子作为巨引物互为模板延伸 ( 无引物的热反应 );(3) 克隆和定向筛选重组产物。 图 1 分别描绘了三种策略产生嵌合分子的过程。
三种重组 PCR策略原理示意图