小小的亚磷酰胺，大大的RNAi药物世界
小核酸药物又称RNAi（RNA interference）技术药物。所谓RNAi，是指长链双RNA（dsRNA）被剪切为siRNA（小干扰RNA）后，与蛋白质结合形成siRNA诱导干扰复合体（RISC），RISC再与互补的mRNA（信使RNA）结合，使靶基因mRNA降解，最终沉默特定基因表达。图1 RNAi干扰机制狭义的小核酸是指介导RNAi的短双链RNA片断，即siRNA；广义的小核酸范围则涵盖了siRNA、miRNA（微小RNA）和反义核酸（ASO）等。图2 小核酸药物作用机制与位置代表性的作用机制和细胞内定位(1)gapmer和mRNA降解, (2)适配体, (3)核空间阻滞剪接开关, (4)阻断RNA结合因子的组装, (5) TLR激活先天免疫，(6) miRNA和Antagomir，空间阻滞，翻译上调，(7) Agomir，翻译抑制，(8)siRNA、RISC, RNAi沉默ONs。RNAi技术研究于2006年获得诺贝尔奖，堪称人类科学史上的重大发现和技术革新。目前已有16款小核酸药物上市，包括10款ASO，5款siRNA，1款aptamer。多款小核酸药物的开花结果以及商业化，引燃了国内外众多药企的研发热情。小核酸药物因设计和开发不受限于蛋白质的可成药性及靶点的发现，被寄希望成为“第三次制药浪潮”。作用靶点丰富不受靶点成药性限制，理论上各种由特定基因过表达引起的疾病都可以通过小核酸药物进行治疗，并且可以及时响应靶基因的突变以进行调整；设计开发简单小核酸药物直接针对靶基因mRNA序列进行设计，仅需知道碱基序列即可进行，从而避免了传统药物开发中的大规模设计、优化、筛选周期，药物设计得以主动进行，研发成功率得以提高；靶向特异性强小核酸药物作用于靶基因转录的mRNA，在疾病上游进行调控，并且可以达到单碱基水平上的序列特异性，具有“有的放矢”及“治标治本”的特点。随着递送系统的不断更新，药物靶向性不断优化；药物作用长效小核酸药物以mRNA为目标，在体内可以通过多次循环工作持续起效。此外，核酸药物的化学修饰技术不断革新，可提高核酸药物的稳定性和半衰期，使药物作用更长效，大大提高患者治疗的依从性。图3 小核酸药物化学修饰经过不断地探索，上世纪80年代，已经实现了小核酸药物（寡核酸药物）的自动化合成和商品化。寡核苷酸的基本组成单位是亚磷酰胺单体，它的合成是一个多步连续的反应，常用的合成方法是固相亚磷酰胺三酯法，其具体过程包括四个循环步骤：去保护、偶联、氧化、加帽，合成路线如图所示：图4 寡核苷酸合成示意图01去保护&lt;&lt;&lt;&lt;    用三氯乙酸(TCA)脱去连接在固相载体CPG上的核苷酸保护基团DMT，从而产生5&#39;-OH活性基团，使得接下来的偶联得以进行；02偶联&lt;&lt;&lt;&lt;       下一个核酸的亚磷酰胺单体与四唑反应生成活性中间体（此步骤也被称为活化）。去保护中形成的5&#39;-OH会与活性中间体结合，形成新的磷氧键，并脱去四唑，核苷酸链得到延伸；03氧化/硫化&lt;&lt;&lt;&lt;偶联反应生成的亚磷酯键，易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化（硫化）为五价的磷；04加帽&lt;&lt;&lt;&lt;        为了防止CPG上未参与反应的5&#39;-羟基在随后的循环反应中被延伸，常用乙酰化试剂来封闭此端羟基，形成酰化物，防止非目标寡核苷酸产物的形成。当寡核苷酸链经过多次循环达到所需的长度时，将合成好的寡核苷酸链从固相载体上切割下来，通常使用浓氨水将固体载体与初始核苷之间的酯键断裂，之后通过延长时间处理或加热，脱去磷酸二酯键上的2-氰乙基保护和碱基上的保护基团。RNA链则需要额外使用TBAF（氟化物）对 2’位羟基上的TBDMS脱保护，之后，对样品进行脱盐以及纯化，最终获得合格的寡核苷酸。从以上固相合成过程中可知，亚磷酰胺单体是寡核苷酸合成中的核心原料，因此，符合质量要求的亚磷酰胺单体及时供应是小核酸药物商业化的关键因素。目前，已有很多针对高血脂、高血压、非酒精性肝炎、乙肝等适应症的小核酸药物正在进行晚期临床研究，包括许多针对罕见病的小核酸产品在国外未来也会陆续上市，此为市场快速增长的关键驱动因素。为了更好的助力核酸药物研发以及商业化，申基生物可提供小核酸药物合成过程中所需的各类核苷、亚磷酰胺单体（DNA、RNA、2&#39;-O-Me、2&#39;-O-MOE、2&#39;-Fluoro、2&#39;-O-Propargyl等修饰单体）以及寡核苷酸合成服务，从而满足各类核酸药物研发企业及生产企业的不同需求，为全球核酸药物发展“添砖加瓦”！参考文献：【1】Yale J Biol Med. 2012 Jun;85(2):187-200. Epub 2012 Jun 25.【2】EMBO Mol Med. 2021 Apr 9;13(4):e13243. doi: 10.15252/emmm.202013243.【3】J Org Chem. 2021 Jan 1;86(1):49-61. doi: 10.1021/acs.joc.0c02291. Epub 2020 Nov 30.