中药抗Ⅱ型糖尿病体外活性评价及相关活性成分研究
摘要:Ⅱ型糖尿病及相关并发症占据糖尿病发病率的90%-95%，其主要特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌不足和/或胰岛素作用缺陷引起的糖脂代谢和蛋白质代谢紊乱。
由于Ⅱ型糖尿病的发病机制复杂，目前还没有十分有效的治疗方法。
研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors，PPARs)参与调节胰岛素敏感、脂质代谢和炎症反应等重要过程，与Ⅱ型糖尿病、肥胖等代谢疾病的治疗密切相关，PPARs是治疗Ⅱ型糖尿病的重要靶标。
目前，对PPARγ/β双重激动剂的研究还比较缺乏，而PPARγ/β双重激动剂不仅可以改善胰岛素抵抗和胰腺功能，对葡萄糖刺激的胰岛素分泌有积极的影响，还可以改善与Ⅱ型糖尿病相关的代谢疾病如动脉粥样硬化，减少单重合成激动剂的副作用。
因此，用PPARγ/β作为靶点筛选和开发新型的抗Ⅱ型糖尿病药物，具有重要的科研价值。
本论文旨在评价29种中药和41种单体化合物对PPARγ/β的激活活性，对高活性中药的抗Ⅱ糖尿病作用机制进行初步探索，为抗Ⅱ型糖尿病中药的开发提供参考;论文还借助新型的方法(包括分子印迹-固相萃取，分子印迹-固相微萃取)，对活性成分进行分离富集及代谢研究，为活性成分的开发打下基础。
围绕上述研究内容，本论文主要包括以下七个部分。
本章主要介绍了与Ⅱ型糖尿病相关的PPARs的药理作用，激动剂的研究现状及分子印迹技术在中药活性成分分离富集中的应用。
第二章为中药提取物对PPARγ/β的激活活性评价研究。
中药能有效预防和缓解Ⅱ型糖尿病及其并发症，具有毒副作用小、适合长期服用等特点。
因此，本文选取文献报道或民间使用的具有潜在抗Ⅱ型糖尿病作用的29种中药作为研究对象，采用溶剂回流提取法，对29种中药进行提取，制得145个提取物。
在前期课题组构建的PPARγ和PPARβ细胞筛选模型的基础上，对145种提取物进行了PPARγ和PPARβ激活活性评价。
结果表明，46种提取物对PPARγ有较好的激活作用(激活倍数>1.5倍)，其中，绿萝花EB1、地骨皮EB1、金线莲EA、芦根EB1、黄精EA、淫羊藿EA、桑白皮EA和黄芪EA提取物对PPARγ激活倍数大于或等于阳性药(0.5μg/mL罗格列酮)的激活倍数。
30种提取物对PPARβ有较好的激活活性(激活倍数>1.5倍)，其中，绿萝花EB1、EA和芦根EB1提取物对PPARβ的激活倍数大于或等于同批次实验阳性药(0.5μg/mL L-165041)的激活倍数。
第三章为林檎叶总黄酮及41种单体化合物对PPARγ/β的激活活性评价研究。
对林檎叶总黄酮以及从绿萝花、林檎叶、雾水葛、酸蔹藤、绞股蓝和杭白菊中获得的共计41个单体化合物的PPARγ/β激活活性进行了评价，以期找到PPARγ/β的双重激动剂。
结果表明，林檎叶总黄酮对PPARγ有一定的激活作用，最大激活倍数为1.69倍，而对PPARβ几乎无激活作用。
41个单体化合物中木犀草素、N--3-(4methoxyphenyl)-prop-2-enamide，3，4-dihydro-5，7-dihydroxy-4-(4hydroxyphen-yl)coumarin对PPARγ/β表现出一定的激活活性，是PPARγ/β的潜在双重激动剂。
第四章为绿萝花EB1提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化影响、相关分子机制及主要活性成分分析的研究。
前述两章的研究结果发现，绿萝花EB1提取物在145种提取物中表现出最为显著的PPARγ/β激活活性，其可能具有通过激活PPARγ/β起到治疗Ⅱ型糖尿病的作用。
对于Ⅱ型糖尿病相关肥胖症的治疗可能是改善胰岛素抵抗、治疗Ⅱ型糖尿病的有效途径。
因此，本文以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象，考察了绿萝花EB1提取物对脂肪细胞分化过程中与脂代谢相关的生理参数及各种蛋白表达的影响;并采用HPLC法分析了绿萝花EB1提取物中可能起作用的活性成分。
结果显示，绿萝花EB1提取物能够部分通过激活AMPK信号通路，下调肥胖转录因子PPARγ、C/EBPα的表达，抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。
HPLC分析表明银锻苷为绿萝花EB1提取物中的主要成分，结合文献研究结果，可以推断出银锻苷可能是绿萝花EB1提取物中起到治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖的活性成分之一。
第五章为分子印迹-固相萃取用于绿萝花中银锻苷的分离富集的研究。
为了有效地从绿萝花中分离富集活性成分银锻苷，本章研究中将分子印迹材料(MIPs)与固相萃取技术(SPE)结合，首次用于从绿萝花EB1提取物中分离富集银锻苷，并对银锻苷进行了血液代谢分析，以了解银锻苷在体内的变化。
结果显示，采用银锻苷MIPs-SPE可以成功地分离富集绿萝花EB1提取物中的银锻苷。
将银锻苷进行血液代谢分析，可以从血液中检测到代谢物肉桂酸、紫云英苷和山奈酚，其中，山奈酚在血液中的含量最高，说明山奈酚可能是银锻苷在体内的主要活性形式。
第六章为分子印迹-固相萃取/固相微萃取用于杭白菊中木犀草素的分离富集及活体代谢的研究。
来源于杭白菊中的木犀草素具有较好的治疗Ⅱ型糖尿病的药理活性，能够有效地激活PPARγ/β，是PPARγ/β的潜在双重激动剂。
但木犀草素在中药杭白菊中含量较低，为了有效地从杭白菊中分离富集木犀草素，采用木犀草素MIPs-SPE分离富集杭白菊中的木犀草素。
进一步研究中以不锈钢针作为支撑材料，采用原位聚合的方法首次合成了木犀草素MIPs-SPME不锈钢萃取针，并用于活体萃取SD大鼠肝脏中的木犀草素及其结构类似的代谢产物。
结果表明，基于木犀草素的MIPs-SPE可以有效地分离富集杭白菊甲醇提取物中的木犀草素。
而MIPs-SPME萃取针也可以有效地从SD犬鼠肝脏中萃取木犀草素及其结构类似的代谢产物。
UPLC-MS/MS鉴定出芹菜素(apigenin)、金圣草黄素(chrysoeriol)和香叶木素(diosmetin)是木犀草素在肝脏中的三种主要代谢产物。
第七章为总结与展望。
综上所述，本文通过构建的PPARγ和PPARβ激活活性细胞筛选模型，对29种中药的不同极性提取物及41个单体化合物的PPARγ和PPARβ激活活性进行了评价，并对具有高活性的绿萝花EB1提取物进行了深入的抗Ⅱ型糖尿病及肥胖的药理机制研究，为后续中药及活性成分抗Ⅱ型糖尿病的研究提供参考。
成功地将MIPs与SPE进行了有效结合，用于分离富集复杂中药中的活性成分，并应用于分离富集绿萝花和杭白菊中的活性成分银锻苷和木犀草素。
此外，成功制备了MIP-SPME不锈钢萃取针并应用于活性成分木犀草素的活体代谢研究，该方法可以进一步拓展到其他活性成分的活体代谢研究。