NAR︱李根喜/张娟团队研发腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统用于细菌分析
撰文︱生安志
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）是一种常见的环境细菌，可以通过动物的粪便、食物和水迅速传播，引起感染性疾病，如肺炎、耳炎、角膜炎、败血症和心内膜炎[1]。现有的微生物检测方法主要包括菌落培养和计数[2,3]。然而，这些常规方法总是劳动密集型和耗时的[4]，大大限制了它们的应用。因此，迫切需要研发新的方法。
2022年9月26日，上海大学、南京大学李根喜/张娟教授团队在Nucleic Acids Research（NAR）上发表了题为“Hydrazone chemistry-mediated CRISPR/Cas12a system for bacterial analysis”的研究成果。该研究工作通过采用腙化学和巧妙的核酸序列设计，利用互补碱基配对引起的邻近效应加速整个激活链的形成，从而快速有效地激活CRISPR/Cas12a系统，并进而提出了一种简单而灵敏的铜绿假单胞菌分析方法。
Cas12a是一种来自V-A型CRISPR系统的核酸内切酶，通过识别其靶位点，激活内源性核酸酶活性后，可以不加区分地切割单链DNA（ssDNA），已被用于核酸检测[5]。然而，该系统不适合区分非常相似的单链DNA序列[6]；并且，相似单链DNA序列之间的干扰可能会发生交叉反应，影响分析的灵敏度和特异性[7]。由于CRISPR/Cas系统的可编程性依赖于导链RNA和核酸的相互作用[8]，研究团队设想可以在系统的启动序列中引入腙化学，从而更灵活地激活CRISPR/Cas12a系统，不仅可以提高特异性，而且可以广泛应用于不同靶标的分析。
为了将腙化学应用于CRISPR/Cas12a系统中，研究团队巧妙地将激活链设计为发夹结构的两个片段，并分别由酰肼和醛基两个腙连接基团修饰。在碱基互补配对的作用下，含有酰肼基团的TS1更容易与修饰醛基基团的TS2链通过腙键反应形成完整的TS1/TS2链。激活的Cas12a/crRNA复合体的反式裂解活性导致ssDNA-FAM的任意切割和荧光恢复（图1 A）。研究团队探究了链长度对CRISPR/Cas12a激活的影响（图1 B1，B2），并通过动力学比较了腙化学对CRISPR/Cas12a系统激活的影响（图1 C1，C2），进而研究了碱基错配的影响（图1 D1，D2）。结果表明，腙化学的引入可以提高CRISPR/Cas12a系统的特异性，可以有效区分目标序列中的单碱基错配。
图1腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统。
（图源：Sheng,et al.,NAR, 2022）
接着，研究团队将所构建的腙化学介导CRISPR/Cas12a系统用于细菌分析。他们选取具有物种间高度保守的区域和物种特异性的可变区域16S rRNA基因序列(16S rDNA)作为靶标，该序列也通常被用于各种细菌的鉴定[9]。研究团队精心设计16S rDNA探针互补序列，由于16S rDNA与探针的特异性结合，从而释放Probe/TS1-NHNH2杂交链中的TS1-NHNH2，该链可以通过碱基互补配对与TS2-CHO杂交，其中TS1-NHNH2修饰的酰肼基与TS2-CHO修饰的醛基之间的腙键加速TS1/TS2的形成，而形成的TS1/TS2可以激活CRISPR/Cas12a系统，对ssDNA-FAM进行切割，导致荧光的恢复（图2 A）。他们采用革兰氏染色和荧光显微镜分别验证了细菌形态和16S rDNA探针特异性（图2 B）。进一步研究发现，如果没有P. aeruginosa，几乎无法观察到荧光峰（图2 C b）；相反，在P. aeruginosa存在时，可以发现明显的高荧光峰（图2 C a）。因此，研究结果表明，研究团队所建立的基于腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统可以成功地应用于细菌分析。
图2基于腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统的细菌分析机理。
随后，研究团队利用建立的方法对细菌进行定量分析，并通过稀释涂布平板法进行了测定（图3 A）。细菌数量从3.8×10
2CFU/mL到3.8×10
6CFU/mL，荧光强度随细菌浓度对数值的增加呈线性增加（图3 B）。线性方程为：I= - 931.07 + 669.35 × LogCP. aeruginosa(R
2= 0.9924)（图3 C），其检出限为24 CFU/mL，RSD值为6.6%，结果表明，所建立的方法具有较低的检出限和良好的重现性。
图3基于腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统的细菌定量分析。
研究团队对基于腙化学辅助的CRISPR/Cas12a系统所建立的细菌检测新方法的性能进行了评价。他们采用不同的细菌验证了所建立的P. aeruginosa分析方法的特异性。革兰氏染色表明，不同的细菌具有不同的形态特征（图4 A）。此外，只有P. aeruginosa可以观察到红色荧光（图4 B），相较于其他细菌，表现出高的荧光强度（图4 C）。这些结果表明该方法对P. aeruginosa具有较高的特异性。为了验证该方法的实用性，研究团队还选取纯净水、牛奶、葡萄柚汁和绿茶模拟样本，添加不同浓度的P. aeruginosa。如图4D所示，相对回收率在90% ~ 110%之间，相对误差小于8.7%，说明所构建的方法可以用于真实样品中的P. aeruginosa的分析。
图4对所建立的方法进行性能评价。
此外，由于DNA探针中目标结合域的序列具有可编程性，因此腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统可以很容易地用于其他靶基因的检测。研究团队因而探索了腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统检测金黄色葡萄球菌，实验结果证实了所建立方法的良好特异性。由此可见，腙化学介导的CRISPR/Cas12a体系不仅具有良好的稳定性和普适性，而且对非核酸靶点的间接检测也具有良好的特异性。
综上所述，研究团队构建了一个腙化学介导的CRISPR/Cas12a系统，并探索了其识别单碱基错配的能力。在这一设计中，他们利用碱基互补配对产生的邻近效应加速了腙键的形成。同时，由于其模块化和独特的结构性质，腙化学可以将分裂的激活链连接到整个激活链上，从而有效地激活CRISPR/Cas12a系统。在此基础上，他们进一步开发了高灵敏度的细菌检测平台，并应用于细菌检测。该平台操作简单，灵敏度高，检出限低，特异性好，不仅可以应用于细菌中16S rDNA的检测，而且可以借助适体或探针识别级联反应直接检测核酸靶点。同时，该平台还可以为其他非核酸靶标的间接检测提供了稳定、经济的检测系统。因此，腙化学的引入拓宽了CRISPR/Cas12a系统的应用范围。
然而，腙键具有酸不稳定性，在生理条件下会缓慢水解，从这点来说，该体系并不是一个最优的策略，这对反应体系的长时间稳定性提出了高的要求。因此，未来可以将点击化学引入到“裂开式”激活链介导的CRISPR/Cas12a系统中，从而构建更具模块化的稳定反应体系。
通讯作者：李根喜（左）、张娟（右）
（照片提供自：李根喜/张娟团队）
李根喜，教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者。先后担任中国生物物理学会第九、十、十一届理事会理事，中国生物化学与分子生物学会第十、十一、十二届理事会理事、蛋白质专业委员会副秘书长、副主任兼秘书长，中国仪器仪表学会化学传感器专业委员会委员；《Biosensors and Bioelectronics》的副主编，以及国内外多家学术刊物的编委。
张娟，教授，博士生导师。2018年入选上海市浦江人才计划。主持国家自然科学基金面上项目和上海市重点科技攻关等项目10余项。担任《Molecules》杂志编委和上海市食品学会青年工作委员会委员及中国医药卫生文化协会医工融合分会委员。以第一作者或通讯作者在Analytical Chemistry、Biosensors and Bioelectronics等国际权威杂志发表论文60篇。授权国家发明专利10余项。荣获中国（国际）传感器创新创业大赛等奖励。
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