文献解读 |《In vitro models》肿瘤微环境—成功开发骨肉瘤体外模型的关键
骨肉瘤（OS）是一种高级别原发性骨骼恶性肿瘤，特点是间充质来源的梭形细胞沉积形成类骨质基质。OS全球发病率为3.4/1万人每年，是青春期第三大常见癌症。由于OS通常具有放射抵抗性，遗传异质性高，肿瘤切除手术和化疗都不能控制OS的转移扩散，90%以上患者死于肺转移[1]。当前在OS研究中，大多依赖于过于简化的二维（2D）细胞和复杂的动物模型，由于模型存在各自的局限，限制了科研人员对OS疾病的研究以及新药研发的效率。由于肿瘤微环境（TME）在肿瘤的转移和发展中具有重要影响，同时，人们对靶向TME特异性通路的抗癌新疗法的兴趣日益浓厚，这使得包含肿瘤微环境的三维（3D）模型成为科研界的研究热点。3D体外模型不仅能够模拟癌细胞生长，还涉及了肿瘤与微环境（TME）的相互作用，是具有巨大应用潜力的药物筛选新工具。来自波尔图大学的Bruno Sarmento和Catarina Leite Pereira教授团队，于2022年1月在《In vitro models》杂志上以“Osteosarcoma tumor microenvironment: the key for the successful development of biologically relevant 3D in vitro models[2]”为题发表文章。本综述简要概述了骨稳态，然后详细描述了骨微环境在肿瘤发展过程中的变化。此后，讨论了TME如何影响肺转移，以及如何通过靶向级联反应和TME来改善OS治疗。最后，介绍了现有的OS 3D体外模型，并重点介绍了如何改进并建立更相关的培养系统，用以模拟OS发生及癌症转移和扩散。l 骨稳态与骨肉瘤病理生理学 骨骼是一种高度可塑性的组织，主要细胞类型有三种：成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。这些细胞间以及细胞与周围环境间相互作用，调节和维持着骨稳态。当刺激促进骨形成时，成骨细胞可以抑制破骨细胞的活性。成骨细胞和破骨细胞活性之间的这种平衡对于维持骨稳态和旧骨更新及其合成的矿化骨基质至关重要。目前对OS肿瘤发生及其转移知之甚少。一种猜想是基因改变导致成骨细胞或破骨细胞不完全分化，破坏了骨细胞增殖和分化之间的平衡，使细胞异常增殖，突变积累产生原发性骨肿瘤。据报道，这些遗传改变的积累产生了OS癌症干细胞亚群，这些干细胞能够与TME相互作用，并维持自我更新和促进肿瘤进展。l 肿瘤微环境如何影响转移？OS的转移和扩散是患者存活率低的主要原因。转移级联反应包括癌细胞侵袭周围组织、渗入血液/淋巴管、循环存活、外渗至继发器官以及在远处建立继发肿瘤的多个步骤。成骨细胞、破骨细胞和癌细胞一旦OS在骨中产生，肿瘤细胞就会分泌因子（PTH相关蛋白，IL-11，TGF-β1），启动破骨细胞介导的骨重吸收。TGF-β通过增加基质金属蛋白酶（MMP）的分泌来增强肿瘤细胞的细胞迁移/侵袭。肿瘤还上调了VEGF和PDGF，促进了血管生成和肿瘤生长。间充质干细胞/基质细胞和成纤维细胞间充质干细胞（MSCs）是人体中的多能非造血干细胞，主要存在于骨髓中。肿瘤细胞分泌因子诱导MSCs迁移到OS 周围，一旦进入TME，MSCs就会表现出癌症相关成纤维细胞（CAF）表型，并通过增加趋化因子和VEGF的表达，促进癌细胞存活、增殖、侵袭和经内皮迁移。免疫细胞串扰OS的免疫生态位主要由肿瘤相关巨噬细胞（TAM）组成。M2表型的巨噬细胞被称为促肿瘤细胞，可释放与免疫抑制、肿瘤进展和血管生成相关的抗炎信号。OS细胞可以使M1和M2巨噬细胞之间的平衡失调，诱导TAM从M1样巨噬细胞转变为M2样巨噬细胞。血管微环境血管不仅调节成骨和造血，而且通过为肿瘤细胞提供氧气和营养物质来促进肿瘤灌溉和存活。缺氧和酸性骨微环境促进肿瘤细胞释放促血管生成因子（HIF和VEGF），这促进了新血管向肿瘤部位生长。OS肿瘤是高度血管化的组织，这被认为是OS预后不良的一部分因素。细胞外基质ECM成分显着改变并且分泌显着增加。这导致基质更硬，使OS表现出更具侵袭性的癌症表型。MMP和肝素酶可以重塑ECM，这允许细胞侵入邻近组织并内渗入血管，使OS细胞外渗并建立转移。目前OS的治疗方法包括手术切除肿瘤联合化疗（包括多柔比星、顺铂和甲氨蝶呤）。这种疗法通常对约50%的患者有效。然而，对于转移性或复发性OS患者，生存率仅为20%左右。靶向OS TME开发新疗法的策略包括：（1）通过将M2样巨噬细胞重编程为抗肿瘤M1表型来靶向TAM，并通过抑制SIRPα受体促进吞噬作用;（2）通过抑制某些分子（胶原蛋白-IIIα1，αvβ3整合素）的致瘤活性来靶向ECM;（3）利用针对免疫检查点抑制剂（PD-1、PD-L1、CTLA-4、HHLA2、B7-H3）的单克隆抗体促进细胞毒性T细胞的活性，抑制MDSCs和T调节细胞的活性;（4）靶向破骨细胞活性（双膦酸盐）、RANKL/RANK信号通路（单克隆抗体）和TGF-β受体活性;（5）抑制间充质干细胞的促致瘤活性;（6）靶向多种酪氨酸激酶受体（VEGFR，PDGFR，FGFR，IGF1R，HER2），促进肿瘤细胞存活和增殖以及血管生成;（7）靶向OS细胞中过表达的其他细胞表面受体（GD2），通过增强FAS受体（CD95）的活性促进肿瘤细胞凋亡。LPS、脂多糖、MHC-I、主要组织相容性复合物 I、TCR、T 细胞受体。l 骨肉瘤3D体外模型的现状基于支架的模型骨基质由主要由羟基磷灰石（HA）纳米晶体无机相（65%）、I型胶原蛋白有机相（25%）和水（10%）组成。支架材料（包括海绵、水凝胶、去细胞化基质或材料组合）为肿瘤细胞接种提供了简单的基质，允许模拟细胞生长的自然环境。理想的支架不仅应具有生物相容性，而且还应具有足够的孔径（至少100μm）以允许分子和细胞扩散；机械性能应与骨组织的机械性能相匹配（皮质骨的杨氏模量从 15 到 20 GPa 不等；也应考虑骨组织中高水平的细胞外钙、缺氧和低pH值的特性。多细胞肿瘤球状体多细胞肿瘤球状体（MCTS）是癌症研究中最常用的平台之一，特别是用于抗癌药物筛选。MCTS能够模拟肿瘤中观察到的氧气、pH和营养梯度。通常，在中心，氧气和营养物质的扩散较低，导致坏死核心形成，而在球状体的外边缘观察到更多的增殖细胞。尽管它们简单且具有高通量筛选功能，但与支架类似，局限性涉及球体内细胞排列缺乏可控性，因此不能模拟某些生理条件。肿瘤类器官类器官优势在于通过多次传代保留患者特异性组织特征和异质性，并在体外重现天然肿瘤的形成。该模型的局限性包括难以达到体内样成熟度、方案耗时以及缺乏基质细胞和脉管系统。微流控平台由于微流控芯片可以适应动态条件下的培养，因此它们是在体外模拟脉管系统，并研究转移级联和肿瘤细胞的迁移。由于，微流控芯片已经被广泛应用构建其他癌症组织模型，基于微流体的模型研究OS的潜力仍然是一条不败的道路，可以完全自由地探索这些平台作为强大的药物筛选工具的能力，并揭示OS进展和转移的未知过程。l 转移建模：3D体外模型是否足够？OS的理想模型应允许骨中原发性OS肿瘤的自发形成，并在免疫功能正常的宿主内发生肺转移。目前，没有强大的OS动物模型可以完全概括骨肿瘤在与人类相同的解剖位置的形成以及肺转移的自发发展。异种模型涉及免疫缺陷动物，而同源模型具有免疫功能，但肿瘤形成不是自发的。在转移建模方面，芯片上肿瘤方法具有许多优点，允许：（i）细胞区室化，可以在共培养中引入多种细胞类型;（ii）流量和梯度控制，例如，允许在动态环境中培养免疫细胞以靶向癌症转移;（iii）实时分析细胞迁移，以研究癌细胞侵袭，外渗或内渗;（iv）控制可能影响癌细胞反应的机械力，例如呼吸运动或ECM硬度;（v）通过荧光共聚焦成像进行简单的数据分析和成像。因此，在临床前阶段考虑这些模型不仅有助于减少癌症研究中的动物数量，而且可以加快药物开发途径，有利于减少临床试验中的意外失败，使研发过程更加有效。文献索引：[1] DEAN, Dylan C., et al. From genomics to metabolomics: emerging metastatic biomarkers in osteosarcoma. Cancer and Metastasis Reviews, 2018, 37: 719-731.[2] RODRIGUES, João; SARMENTO, Bruno; PEREIRA, Catarina Leite. Osteosarcoma tumor microenvironment: the key for the successful development of biologically relevant 3D in vitro models. In vitro models, 2022, 1.1: 5-27.♥ 喜欢我们的内容，欢迎关注@艾玮得生物，欢迎点赞、评论、分享给其他读者哦~