应用案例 | 跨膜蛋白质(TM)的作用机制研究（蛋白质-小分子结合)
介绍CD36  (白细胞分化抗原36 )是具有多种功能的跨膜蛋白的一部分。在脊椎动物许多细胞类型的表面可发现来源于CD36基因编码的CD36 蛋白。它在脂质摄入、细胞粘附和病原体感知等方面发挥着不同的作用。因此，动脉高血压、糖尿病、心肌病等与这些跨膜蛋白的突变或调节不当有关。    尽管这些蛋白质具有重要作用，其功能上的精确机制尚未得到很好的理解。在文献里许多基于体外生化测定的研究发现，这些蛋白质有大量的配体和配体结合区域。在其他研究中,有证据表明配体/CD36 蛋白相互作用可能参与调节配体在膜上的易位和受体介导的配体内化。然而，这些未被发现的 CD36 蛋白生化特性的相关性尚未在其原生环境中得到广泛验证。一个特别受关注的遗传学模型地中海黑腹果蝇已知有14个CD36样的蛋白质，因此提供了一个有用的系统来研究CD36 蛋白质在体内的功能。其中一个果蝇 CD36 家族成员称为感觉神经元膜蛋白1(SNMP1)，表达在嗅觉感知神经元(OSN)中，具有检测脂源信息素的功能。SNMP1通常存在于昆虫的树突状纤毛中，气味受体(ORs，图一) 也位于这里。在OSN中，已知果蝇 SNMP1 的功能是检测雄性信息素(Z)-1-八度乙酸 (cis-vaccenylacetate,  cVA) 。缺乏 SNMP1 时会降低这些神经元对cVA 刺激的敏感性。因此，SNMP1 在此信号通路中起着重要的作用，但其作用机制尚不明确。尽管如此，SNMP1与细胞外脂质配体的相互作用进而引发信号通路下游反应，与哺乳动物 CD36 在脂肪味觉感知、病原性细菌脂质、脂蛋白的免疫识别方面类似1,2。因此，SNMP1 为理解体内 CD36蛋白提供了一个相关的模型。因为具有无标记和实时监测的特点，表面等离子共振(SPR) 技术在研究生物分子相互作用时有明显优势。在这篇应用笔记里，我们将说明如何用 P4SPR 来研究不同昆虫信息素和 CD36 蛋白的结合作用，提供一个分子遗传学，细胞生物学，生化，电生理学和同源建模的补充技术来表征SNMP1 的结构功能。最终的目标是综合概述跨膜蛋白在兴奋剂的刺激下所显示的作用机制。实验设置P4SPR 设备设置  USB供电个人型四通道 SPR (P4SPR) 连接到笔记本后可经过P4SPR控制软件控制和记录数据。蠕动泵模块可轻松集成到 P4SPR 实验中，以确保稳定的液流到 SPR 芯片上( 图二) 。实验开始前需要先把Au SPR芯片插入P4SPR 的流动池支架中。PDMS 微流体单元放置在 SPR 芯片顶部，并在 P4SPR 盖上牢固地施加压力以避免任何液体泄漏。为设备进行实验的设置流程不多于 5分钟的准备时间。实验程序  首先Au SPR芯片的表面涂有肽自组装的单层以结合带有His标签的蛋白质，其功能类似于Ni-NTA。由于SNMP1的胞外域难以表达，鉴于结构特征的同源性，本研究过程使用哺乳动物CD36作为结合研究的替代品。高浓度的 His-tagged 标记的CD36蛋白溶液在芯片表面孵育15分钟后完成CD36的固定 (图三)。实验中总共研究了9个信息素分子与CD36蛋白的结合相互作用。配体在 PBS 中制备的浓度在亚uM和mM之间。PBS中加入0.1%的二甲基硫氧化物提高疏水配体的溶解度。从固定到分析的每个SPR步骤都可实时监控。配体溶液从低浓度到高浓度依次注入。每个配体的分析时间是 30 分钟，其中包括 6 种不同的浓度流经P4SPR。SPR 位移在热力学平衡后做记录并绘制，以确定每个配体的亲和曲线。平衡解离常数 (KD)和最大SPR信号可通过Matlab拟合 Langmuir 等温线到亲和力曲线来提取。结果和讨论SPR传感器图SPR 传感图的结果显示随着法呢醇，CVA 和(Z)-11-16烯醛浓度增加，SPR 位移也相对增加。对于乙酸异戊酯未观察到 SPR 位移表明与CD36几乎没有结合。配体浓度-响应曲线与 KD 比较为了比较，我们建立了各种分析物的浓度响应曲线。通过SPR 检测，5个信息素分子显示与CD36结合（图五）。检测CVA、法呢醇和(Z)-11-16 烯醛得到的解离常数和一些已知的CD36结合肽的检测结果在相同量级(图六)3特异性和灵敏度信息素与CD36相互作用的特异性在本文中得到验证。已知仅激活非 SNMP1 表达神经元（乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯或丁酸乙酯）的其他刺激物无显著相互作用（图六），表明了昆虫信息素与 CD36 外域直接结合的证据。此外，P4SPR 对研究 88-250Da 之间分子量配体的结合具有足够的灵敏度。这表明 P4SPR 能够通过相关的表面修饰获得互作检测的特异性，并能检测低分子量的小分子。P4SPR优势Affinité instruments 的P4SPR是一个模块化、个人型的多通道分子互作系统，用于提供对这些跨膜蛋白在信息素刺激下的作用机制的基本理解。它的模块化允许与液流传输系统轻松集成。多通道特性提高了测量精度，其灵敏度允许检测低分子量的小分子。对于采用多种方法来理解生物功能背后的作用机制的综合研究，特异性强、灵敏度高且用户友好的P4SPR 系统非常适合于快速收集SPR 数据来表征结合相互作用。结论P4SPR 提供的相互作用结合信息，进一步证明了信息素与跨膜蛋白的直接结合，其是信息素在细胞内的隧道效应的主要来源。P4SPR 为不同信息素和 CD36 的结合作用和特异性提供了宝贵的信息，进一步揭示了其作用机制。参考文献【1】Hoebe, K. et al. CD36 is a sensor of diacylglycerides. Nature 433, 523–527 (2005)【2】Laugerette, F. et al. CD36 involvement in orosensory detection of dietary lipids, spontaneous fat preference, and digestive secretions. J. Clin. Invest. 115, 3177–3184 (2005).【3】Bolduc, O. R. et al. Modified peptide monolayer binding His-tagged biomolecules for small ligand screening with SPR biosensors. Analyst 136, 3142–3148 (2011).