第十五章rna生物合成【课件】
第十五章RNA生物合成(转录)RNA Biosynthesis(Transcription) 博士/副教授生物化学与分子生物学系 第一节、转录 第二节、转录后的加工 第三节、基因转录调控 转录:生物体以DNA为模板、NTP为原料， 在RNA聚合酶催化下合成单链RNA的过程。
RNA DNA DNA复制 (dNMP) +dNTP(dNMP) n+1 +PPi (NTP) 底物(substrate):ATP, GTP, CTP, UTP; 模板(template):DNA单链; 聚合酶(polymerase):依赖DNA的RNA聚合酶; RNA的延长只可沿5‘3’方向进行; 其他辅助因子:转录因子(真核生物)，延长因子(真核生物)。
与模板链进行碱基配对的另一股DNA单链 称为编码链(coding strand)，也称为反义 链或Crick链。
RNA RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA pol): 催化DNA转录合成RNA的酶，也称DNA指导的RNA聚合酶(DNA dependent RNA polymerase)。
RNA复制酶又称为RNA指导的RNA聚合酶 (RDRP)。
RNA RNA复制酶 RNA复制酶 启动子(promoter):指的是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段特定DNA序列， 位于转录单位5’端上游区。
1.原核生物启动子 原核生物启动子区域有3个功能部位:起始 转录部位转录第一个核苷酸的碱基对(+1 )、RNA聚合酶识别位点(-35)和结合位点 (-10)，其中后两项为启动子的核心区域 RNA-pol结合位点(Pribnow box) Py-10 -30-50 10 -10 -40 -20 RNA-pol辨认位点(Sextama box) RNA聚合酶保护区结构基因 2.真核生物启动子真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有 自己的启动子类型: RNA聚合酶III负责转录tRNA和5SrRNA，其启动子位于转录的DNA序列之内，故称下游启动子 2.真核生物启动子真核生物RNA聚合酶II的启动子是多部位结构， 主要有四个部位: 帽子位点(capsite):转录起始位点(+1); TATA框:序列为TATA(A/T)A(A/T)，决定了转录的起始点的选择; CAAT框:其一致的序列为GG(C/T)CAATCT，控制转录起始的频率; 增强子(enhancer):核心序列TGG(A/T)(A/T)(A/T)，能使和它连锁的基因转录频率明显增加。
TATA box(-25) CAAT box(-75) 增强子(>-100) 结构基因 ---CAAT---TATA-- 转录起始点(+1) 启动子 转录方向 (一)转录起始: 2.移动定位并牢固结合在结合位点上;3.在起始位点上建立一个开链式启动子复合 闭链式二元复合物开链式二元复合物 转录起始复合物 RNApol (a2bbs)-DNA-pppGpN-OH s亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移; 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。
(NMP) NTP(NMP) n+1 PPi转录延长复合物--转录空泡 RNA-pol (核心酶)DNARNA 编码链 模板链 核心酶 转录方向 转录方向 (三)转录终止 终止子:提供转录停止信号的DNA序列。
RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再 前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。
原核生物有两种转录终止方式: 依赖Rho (r)因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止 (三)转录终止 依赖r因子的转录终止模式ATP ρ因子具有ATP 酶活性和解螺 (helicase)的活性。
(三)转录终止 非依赖r因子的转录终止模式在转录后期，转录生成的RNA产物可形成特殊的“发夹(hairpin)”结构使RNA聚合酶变构，丧失其RNA聚合酶活性，导致转 录终止。
反向重复序列反向重复序列 使RNA聚合酶变构，转录停顿 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放 RNA-pol RNA-pol 真核生物的转录过程也可以分为起始、延伸和终止三个阶段。
真核生物转录起始需要各种转录因子(TF)与顺式作用元件相互结合，同时蛋白质因子之间也要相互识别、结合。
能直接、间接辨认和结合真核生物基因顺式作用元件的蛋白质，统称为反式作用因子，直接或间接结合RNA聚合酶的反式作用因子，则称为转录 因子。
RNA-pol TF *相应于RNA-pol I、II、III的转录因子，分别称为TF I、TF II、TF III。
第一节、转录 第二节、转录后的加工 第三节、基因转录调控 基因转录的直接产物初级转录产物 (primary transcripts)，必须经过转录 后加工(post-transcriptional processing)，才会转变为有功能的RNA， 即成熟RNA分子。
一系列的加工修饰包括: RNA链的裂解 特殊结构的形成剪接(splicing) 碱基修饰和糖苷键改变 mRNA mRNA通常没有转录后的加工过程。
rRNA需经剪切和修饰加工。
•剪切:将初级转录产物剪成16S、23S和5S三个片段 •修饰:核糖2’-羟基的甲基化 tRNA的加工方式也是剪切和修饰。
•剪切:切除多余的核苷酸序列 •修饰:甲基化和3’-端加CCA mRNA 真核生物的大多数基因都被插入序列 nter veni ng sequence)即内含子 (interruptedgene)即外显子(exon)。
内含子是真核细胞基因中的非编码序列，而 外显子是指真核细胞基因中的编码序列。
转 录后需通过剪接反应去除非编码区(内含子 )使编码区(外显子)成为连续序列。
转录产物为hnRNA的真核基因结构示意图 转录起始点AATAAA 切离加尾 转录终止点 修饰点 外显子 翻译起始点 内含子 顺式作用元件 结构基因 非编码序列非编码序列 转录hnRNA 非编码序列非编码序列 加工mRNA mRNA 由hnRNA转变成mRNA的加工修饰过程包括: (1)5’端形成特殊的帽子结构; (2)在链的3’端切断一段序列并加上多聚腺 苷酸(poly A)尾巴; (3)通过剪接除去由内含子转录来的序列。
―帽子”结构 “帽子”结构 GpppX)“帽子”结构 “帽子”结构 核糖的2’OH同样 可以被甲基化 GpppGp…pppG ppi 鸟苷酸转移酶 GpppGp…磷酸酶 Pi 加帽可以使mRNA免遭核酸酶的攻击;也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。
加尾可以维持mRNA作为翻译模板的活性 ，以及增加mRNA本身的稳定性。
RNA mRNA的前体(hnRNA)经过剪接体 (spliceosome)加工处理，去除内含子， 并将相邻外显子连接起来，形成有功能 mRAN(成熟mRNA)，这一过程称为RNA剪 接(RNA splicing)。
内含子外显子C 内含子(snRNA) mRNA 内含子 外显子1 外显子2 hnRNA 中间产物 成熟mRNA 降解 第一次转酯反应 第二次转酯反应 剪接体 (spliceosome): 是由细胞核小分子 核糖核蛋白颗粒 (snRNP)与 hnRNA结合，使 内含子形成套索并 拉近上、下游外显 子距离的复合体。
hnRNA 蛋白 snRNA 【U1、U2、U4、U5、U6 snRNP剪接体 (spliceosome) 成熟mRNA 剪接体组分 套索 切下的内含子 鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰 hnRNA 剪接、剪切 及首尾修饰 成熟的mRNA 白基因RNA 甲状腺 大脑 mRNA tRNA rRNA (一)tRNA转录后的加工 剪切与剪接RNase 剪切 剪接 tRNA rRNA (一)tRNA转录后的加工 添加:添加3´氨基酸臂-CCAtRNA核苷酸 转移酶、连接酶 tRNArRNA (一)tRNA转录后的加工 tRNArRNA (二)rRNA转录后的加工 甲基化:发生于45srRNA 剪切:45S 41S 28S-5.8S 28S 5.8S (真核生物) DNA 转录 rRNA 甲基化 甲基化群 剪切 45S rRNA 成熟rRNA 相同点: 需要DNA模板 遵循碱基配对原则 聚合反应形成磷酸二酯键 合成方向为5´3´ 不同点: DNA复制 RNA转录 模板 两条链为模板 其中一条链为模板 合成方式 半保留复制 不对称转录 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 原料 dNTP NTP 碱基配对 引物需要不需要 产物 双链DNA 单链RNA 第一节、转录 第二节、转录后的加工 第三节、基因转录调控 基因(gene):负载特定遗传信息的DNA片段， 可以编码单个具有生物功能的产物，如RNA和多 肽链，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节 序列和内含子组成的DNA区域。
基因表达(gene expression):指基因通过转 录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物(如tRNA、rRNA等)的过程。
基因表达调控(Regulation GeneExpression): 指在不同时期和不同条件下，基因表达的开或关 以及基因表达速率均受到调节和控制。
一、原核细胞转录水平的调节-操纵子学说 操纵子(operon):由几个功能相关的结构基因及其调控区组成一个基因表达单位。
乳糖操纵子的结构调控区 CAP结合位点 启动序列 操纵序列 结构基因 Z:β-半乳糖苷酶 乳糖操纵子受到了阻遏蛋白的负性调控mRNA 阻遏蛋白 pol 阻遏基因 无乳糖存在时 乳糖操纵子受到了阻遏蛋白的负性调控mRNA 阻遏蛋白 有乳糖存在时 启动转录 mRNA 乳糖 半乳糖 β-半乳糖苷酶 分解物基因激活蛋白(CAP)的正性调节有葡萄糖，cAMP浓度低，CAP 未被激活，不能结合CAP位点 无葡萄糖，cAMP浓度高，CAP 被cAMP激活可结合CAP位点 DNACAP CAP CAP site CAP CAP RNA 没有CAP结合CAP位点，RNA聚合酶仅 具有低转录起始活性;但CAP结合CAP后， 能显著提高RNA聚合酶的转录起始活性。
当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对乳糖操纵子表达不起调控作用; 当阻遏蛋白失活，基因开放时，无CAP的正性调控，乳糖操纵子仅处于低表达或不 表达状态; 当阻遏蛋白失活，基因开放时，CAP的正性调控使乳糖操纵子处于高表达状态。
mRNA 低乳糖时 高乳糖时 葡萄糖低 cAMP浓度高 葡萄糖高 cAMP浓度低 RNA-pol 【阻遏蛋白关闭基因】【基因高表达】 【阻遏蛋白关闭基因】 【无CAP，基因低表达】 葡萄糖与乳糖对乳糖操纵子的调节作用 葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。
单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源; 葡萄糖对乳糖操纵子的阻遏作用称分解 代谢阻遏(catabolic repression)。
Trp Trp trpR调节区 结构基因 RNA聚合酶 RNA聚合酶 辅阻遏蛋白 (无活性) 辅阻遏蛋白 (激活) 顺式作用元件(cis-actingelement):与相关 基因同处一个DNA分子上，对基因转录起调控作用的一段DNA序列。
反式作用因子(trans-actingfactor):与顺式 作用元件进行特异性结合的蛋白质因子。
根据 它们的结构特点分为三类:螺旋-转角-螺旋、亮 氨酸拉链和锌指蛋白。
HTH一个 一个αα螺旋 螺旋((羧基端 羧基端))识别 识别特特异的顺式作用元件上的异的顺式作用元件上的DNA DNA 序列， 序列， 另一个 另一个αα螺旋 螺旋((氨基端 氨基端))则则结结合合在在DNA DNA上，调控基因的转 上，调控基因的转 zinefinger 结构示意图 结构示意图 作用示意图 作用示意图 leucine zipper 结构示意图 结构示意图 作用示意图 作用示意图 RNA 真核基因表达调控的环状理论模型:转录因子可使DNA形成环状，将远处的顺式作用元件(增强子)拉到起始部位形成复合物，促进和调控基因表达。
TATA盒() CAAT盒() GC盒() 增强子() 结构基因 -GCGC---CAAT---TATA 转录起始点 顺式作用元件 顺式作用元件:转录起始点上游具有转录调节 功能的特异DNA序列。
转录方向 lacZ结构基因 操纵序列 启动子 DNA P:promoter;