邻近化学策略在生命体系研究中的应用
近年来，邻近化学已成为研究细胞间通讯、时空蛋白质组、蛋白-蛋白相互作用组以及蛋白-核酸相互作用组的新补充方法。在邻近化学策略认为，能催化产生活性物质的酶可以与感兴趣的蛋白进行基因融合，使其广泛应用于各种生物环境。在邻近标记策略中，催化产生活性中间体的酶能通过基因工程与靶标蛋白融合表达；同时，研究人员可对酶进行定向进化。用于邻近标记的工程酶可满足研究的需求，并应用于不同生理环境中。根据酶促标记的机制不同，可将这些酶分为非接触依赖酶与接触依赖酶。非接触依赖酶可催化产生半衰期短的活性中间体，这类中间体可在较短的扩散半径内实现邻近生物大分子的共价标记。这类酶的主要类型有生物素连接酶（如BioID、BioID2、TurboID、miniTurbo以及BASU）、过氧化物酶（如HRP、APEX以及APEX2）以及基于蛋白的光敏剂（如mini Singlet Oxygen Generator，miniSOG）（图1a）。生物素连接酶主要通过产生活化酯中间体标记靶蛋白，而过氧化物酶则是在过氧化物的参与下产生自由基中间体对靶蛋白的富电子氨基酸进行快速标记。基于蛋白的光敏剂策略，这类策略经光照激活生成单线态氧，对邻近生物大分子进行快速标记（图1a（iii））。在该策略中，蛋白残基（如Met、Tyr、His以及Trp）与核酸碱基可被单线态氧氧化，随后与以氨基-或者巯基-为基础的探针发生共价标记。近期已有不同的研究者利用这类策略以RNA与蛋白为基础开展邻近的时空图谱绘制研究。与过氧化物酶策略不同，单线态氧标记策略具有更小的反应把手以及更高时空分辨率。然而，策略中产生的单线态氧具有一定细胞毒性，有可能干扰生理过程，这将使之应用范围受限。与非接触依赖酶不同，接触依赖酶可识别并标记邻近蛋白的非扩散型底物（图1b）。PUP-IT（Pupylation-based interaction tagging，图1b（iv））：PafA蛋白是结核分枝杆菌的Pup化信号通路中的关键催化酶，在ATP的参与下，PafA可磷酸化Pup蛋白的C端谷氨酸，并催化其共价标记到靶蛋白上的赖氨酸残基。在此特异性标记赖氨酸-酶促策略的基础上，上海科技大学庄敏/王皞鹏合作共同发表了PUP-IT策略，首次利用酶识别并催化底物蛋白对靶蛋白的互作蛋白进行标记。这种基于酶与受体底物的物理接触的标记方式特异性高，可显著降低标记背景。mgSrtA（图1b（v））：金黄色葡萄球菌的分选酶SortaseA（SrtA）能催化分选肽（LPETG）与寡聚甘氨酸（G5）受体肽产生共价连接。以野生型SrtA标记体系为研究基础，陈鹏/樊新元课题组通过定向进化得到了对底物识别范围更广的mgSrtA，该工程化邻近标记酶可识别待标记蛋白上的单甘氨酸，将生物素-LPETG转移到邻近细胞的膜蛋白上，可应用于细胞-细胞相互作用的原位标记与捕获。Fuco-ID（图1b（vi））：美国Scripps研究所吴鹏课题组与其合作者发现岩藻糖基转移酶（Helicobacter pylori α-1,3-fucosyl-transferase，FucT）能快速识别天然供体底物鸟苷二磷酸岩藻糖（GF），并能将其转移至LacNAc二糖结构上。结合FucT的底物耐受性与细胞表面普遍存在的糖基化修饰，研究者们开发了用于分析肿瘤免疫微环境细胞-细胞相互作用的邻近标记策略Fuco-ID。由小分子或金属复合物介导催化产生活性中间体标记邻近生物大分子的催化剂-邻近化学标记策略提供了一种补充性方法。目前用于开发邻近标记策略的小分子光敏剂主要有三种：（1）二溴荧光素（Dibromofluorescein，DBF）（图2a（i））：DBF经由光照激活催化生成单线态氧，氧化邻近蛋白上的酪氨酸，联用生物素-伯胺探针可对邻近蛋白进行共价标记；（2）罗丹明123（Rhodamine 123）（图2a（ii））：罗丹明经由光照激活可催化叠氮苯基生成三线态氮宾活性中间体，随后快速进攻亲核氨基酸残基，实现邻近蛋白的标记；（3）黄素（Flavin）（图2a（iii））：光照激活的黄素可参与生物素-酪胺分子氧化生成苯氧基自由基，对邻近蛋白的酪氨酸进行共价标记。普林斯顿大学麦克米兰课题组首次利用光氧化还原催化反应开发了mMap策略。研究者利用抗原-抗体相互作用将金属光催化剂锚定在细胞膜表面上，在光照激活后可生成高活性、半衰期短以及扩散半径短（&lt;4nm）的卡宾活性中间体用于对邻近蛋白质的共价标记，实现瞬时细胞-细胞相互作用的捕捉（图2b（iv））。在后续的研究中，麦克米兰课题组围绕光氧化还原体系做了不同的尝试，例如红外激活的光氧化还原标记体系（图2b（v））、构建细胞互作平台探索SARS-CoV-2相关受体ACE2的互作蛋白等，感兴趣的读者可关注麦克米兰课题组所发表的系列工作。陈鹏/樊新元课题组发表了新型的光催化邻近标记策略：CAT-Prox与CAT-Ex（图2b（vi）），叠氮苯光笼基团修饰的亚甲基醌化学探针在光照与光催化剂双重作用下脱除保护基团后，可生成较高亲电活性的反应中间体对邻近蛋白进行标记。研究者利用不同递送方式将光催化剂递送至细胞的不同结构中，绘制了细胞生理过程的时空互作图谱。相比于直接的探针激活策略，脱笼激活策略具有更好的功能化拓展性能，可针对不同需求搭建细胞互作平台。其它内容请见《全球药物创新快讯》2023年第4期（总第130期）。【参考资料】更多资讯尽在“创药网”www.iddds.cn