北航赵勇教授Matter：可拉伸螺旋纳米纤维支架用于运动型组织动态再生|细胞|基质|胶原纤维
在运动和其他的体育活动中，当肌腱或肌肉等运动组织承受的负荷超过临界值时，可能会发生永久性的组织损伤，导致功能和活动能力的丧失。几千年来，病人受伤的运动组织需要固定相当长的时间，以等待组织的自然愈合。然而，由于临床医学中血液循环缓慢和缺乏足够的机械刺激，固定疗法往往导致组织萎缩，或者更糟糕的是出现褥疮。虽然人们在面对这种矛盾时认为这是理所当然的。但在适当的锻炼，有可能实现运动性组织修复。因此，在组织修复过程中，不仅要考虑组织结构的重建，而且要为细胞迁移和增殖提供相匹配的机械微环境。其目的是在促进愈合的同时保持受伤组织的运动功能。由于运动组织固有的不良愈合特性，自然愈合过程的效率极低。因此，迫切需要找到一种理想的治疗方法。
基于以上挑战，北京航空航天大学赵勇教授课题组提出了一个动态修复的概念，在适当的运动下实现组织的恢复。作者建立了一个具有高伸展性的分层螺旋支架，它不仅在结构上与天然组织相似，而且还与它们的机械性能相匹配。由于支架结构的非平面运动减轻了拉伸过程中的局部最大应变，因此该支架上的细胞可以在循环应变下保持较高的活力。此外，体内实验表明，该支架为细胞生长和组织形态形成提供了一个稳定的结构和机械微环境。这种螺旋状的支架打破了固定修复的固有思维定势，即使在适度运动的情况下也能重建有缺陷的组织。相关成果以“Bioinspired stretchable helical nanofiber yarn scaffold for locomotive tissue dynamic regeneration”为题发表在国际著名期刊Matter上。
多层结构螺旋纤维
基于非线性机械性能和运动组织的分层组织（图1A），理想的工程支架应该是可拉伸的，具有从纳米到宏观的定向排列结构。为了获得模仿天然可拉伸组织的合成支架，作者准备了一种通过过度缠绕纳米纤维组装的分层螺旋支架（图1B）。具有良好生物相容性的聚己内酯（PCL）和具有良好强度和弹性的聚氨酯（PU）被用来通过顺序电纺构建对齐的双层纳米纤维膜。得到的双层膜被折叠成PCL/PU/PCL夹层条。然后将条状物连续拧成直纱，并进一步过度拧成螺旋纱线支架（图1C）。该螺旋状支架在体外应用于循环拉伸下的动态细胞培养（图1D），在体内应用于肌腱植入和动态愈合（图1E）。图2A显示了由上层PCL纳米纤维和下层PU纳米纤维组成的双层PCL/PU纤维膜的横截面扫描电子显微镜（SEM）图像。定向良好的纳米纤维均匀分布，PCL和PU纤维的平均直径与天然组织中的蛋白质纤维的尺度一致。然后，将PCL/PU双层膜折叠成PCL-PU-PCL夹层膜。这种折叠的目的是为了暴露生物相容性的PCL，同时包裹住骨架PU。如图2B所示，夹层薄膜被扭曲形成一个直径为460μm、扭曲角q为41.6°的直支架。接着将直的脚手架进一步被过度扭曲，形成一个分层的螺旋脚手架（图2C）。截面共聚焦显微镜图像表明螺旋支架的PCL和PU纳米纤维层是一个扭转的三明治结构（图2D）。这种结构有利于细胞在螺旋支架上的粘附和生长。
图1天然肌腱启发的分层纳米纤维螺旋支架的设计示意图
为了验证机械性能，系统地研究了PCL/PU纳米纤维薄膜、直线支架和螺旋支架的单轴拉伸试验（图2E）。图2F显示了三个样品的应力-应变曲线，其中螺旋形支架显示了典型的非线性机械反应。这与天然机体组织的应力-应变曲线示意图相似。据统计，PCL/PU双层膜的最大断裂强度只有5.5 MPa，断裂伸长率为341.3%。直线脚手架的断裂强度（45.9 MPa）和断裂伸长率（549.6%）有明显增加，这主要是由于在拉伸过程中纱线直径的均匀减少。由于PCL/PU纳米纤维的高取向和紧密捆绑，分层螺旋支架在断裂时的应力和应变值分别增加到69.8 MPa和1,427.6%（图2G和2H）。韧性的统计计算结果表明，螺旋支架的韧性是直支架的三倍，比薄膜大得多（图2I）。作者将较高的韧性是归因于增量的断裂应变。为了进一步评估螺旋支架对外部应力的顺应性和抗疲劳性，对螺旋支架进行了动态机械分析（DMA）的疲劳试验。结果显示了在不同应变下10,000次循环的稳定粘弹性。随后，作者在应变50%的40,000次循环中观察到类似的结果，在1Hz的恒定频率下，储能模量远远高于损耗模量（图2J），表明螺旋支架的弹性性质。因此，大部分的能量是通过螺旋体本身的变形储存的，这很好地说明了上文提到的支架的弹性恢复能力。这些结果表明螺旋线圈结构和聚氨酯弹性成分的协同作用。
图2 螺旋支架结构与机械性能的表征
分层螺旋形支架的体外生物相容性
为了进一步研究螺旋形支架的细胞活力、增殖和伸长行为，对大鼠骨髓间充质干细胞（RMSC-bm）进行了播种和培养。通过活（绿）/死（红）细胞染色评估支架的生物相容性。结果显示，细胞可以在螺旋状支架的表面上很好地粘附和生长（图3A）。1、3、5和7天的细胞存活率分别为88.5%、98.4%、99.3%和 99.4%（图3B和3C）。细胞在支架上的增殖情况也通过细胞数量统计进行了定量评估（图3D）。结果是观察到RMSC-BM在螺旋形支架上迅速增殖，并随着培养时间的增加逐渐覆盖整个表面。这些结果表明，螺旋状支架具有良好的生物相容性，并能提供细胞再生的生理支持。
在培养皿和螺旋支架上观察细胞内F-actin染色和细胞核DAPI染色，以测试细胞附着和与不同基质的互动。播种7天后，RMSC-BM变得细长，并与螺旋支架的纳米纤维几乎平行（图3E）。相比之下，培养皿上的RMSC-BM表现出典型的多角形形态和随机方向。为了量化细胞形态的变化，作者对细胞的长宽比和面积进行了统计。使用荧光显微照片对细胞的长宽比和面积进行了定量分析（图3F）螺旋支架上的RMSC-BM的细胞核长宽比达到近1.89。这明显高于培养皿上的 (平均值为1.08)。相应地，螺旋支架上的细胞的面积值也低于培养皿上的细胞（图3G）。这些结果表明RMSC-bm可以感知并响应螺旋支架的纤维方向，最初附着导致细胞生长和沿纳米形态表面的形状改变。纳米纤维螺旋为干细胞分化的生物物理调控提供了一个途径，并作为螺旋支架在体内定向修复缺陷的生物学基础。
图3 螺旋支架的生物相容性
动态拉伸下的细胞培养
作者设计了一个动态拉伸细胞培养装置，可以通过编程来控制速度和伸长，以施加机械刺激。作为先决条件，作者先将RMSC-BM播种到螺旋支架上24小时，让它们完全附着。然后，首先检查了细胞的存活率，在螺旋支架上使用不同的应变率，而在直线支架上使用100%和10%的应变率，并将应变率分别调节为5、10、15、20、25和30mm/min。如图4A所示，直板支架在5mm/min的应变率下，细胞活力达到86%，随着应变率增加到25毫米/分钟，细胞活力急剧下降到只有7%。而螺旋形支架在25毫米/分钟的应变率下，细胞活力保持在98%。这表明螺旋结构可以抵消应变对对细胞的影响。播种细胞的影响。随后，作者研究了两种结构基质对循环拉伸中不同应变下的细胞的影响（图4B-4E）。结果显示在螺旋支架上拉伸到600%应变的细胞保持了较高的细胞存活率（高达96%）（图4B 和4D）。然而，当细胞在直线支架上培养时，存活率随着应变的增加而急剧下降。在100%的应变下，只有约4%的细胞存活（图4B和4E）。为了进一步说明大应变对细胞的影响，可以在图像中观察到拉伸后的形态变化。在螺旋状支架上，在400%的循环应变下，播种的细胞被很好地粘附，并保持膨胀的形态。而在直的支架上，在只有75%的循环应变下，大部分细胞（约84%）的结构被破坏，导致细胞凋亡（图4E）。这表明螺旋状支架在大拉伸下具有独特和优秀的细胞变形缓冲效果。这与天然可拉伸组织对细胞的影响相似，从而为螺旋状支架在再生医学领域的应用提供了可行性。
此外，作者用有限元分析（FEA）软件Abaqus模拟了单个纳米纤维线的局部旋转，证明它与实验中测得的细胞方向变化是一致的。这表明，在拉伸过程中，细胞角度的变化是随着螺旋支架表面的纳米纤维的重新定位而发生的。同时，通过有限元分析，探讨在相同的拉伸条件下，不同结构的局部和整体应变之间的相关性（图4G）。模拟结果显示，螺旋线的局部应变比总应变小104倍（图4H）。这些结果从理论上支持了实验。因此，螺旋支架允许在大应变下的结构重新排列，与外部施加的应变相比，细胞所承受的实际应变被大大减轻了。
图4 循环应变下的动态细胞生存
体内组织相容性的评估
接下来，作者系统地研究了体内的组织相容性和结构稳定性。作者选择将支架嵌入大鼠腿部具有高弹性的可拉伸肌肉组织中（图5A）。如图5B和5D所示，支架的螺旋结构在4至8周内没有明显变形。这表明弹性支架在体内长期活动期间能够承受周期性的机械应变。如图5C所示，在手术4周后，在横截面和垂直截面上发现了细胞渗透到支架的程度和细胞外基质（ECM）的产生。然而，在8周时，更密集的和细胞向内渗透，更多的ECM沿着定向纳米纤维平行排列在螺旋支架上形成（图5E）。细胞渗入支架的厚度也得到了定量评估。它从第4周的33 mm增加到第8周的52 mm（图5J）。这些数据不仅表明螺旋形支架在肌肉组织中具有良好的兼容性，而且还表明在支架边界有一个逐渐再生的新组织。并且支架周围没有明显的炎症。
接下来用Masson's三色染色法（图5F-5I）评估可拉伸肌肉环境对支架功能化的影响。结果显示，在整个8周的植入时间里，胶原蛋白沉积增加，并紧紧包裹着支架，它更多地沿着机械轴线定向。为了量化胶原蛋白的沉积，作者进一步测量了支架边界的胶原蛋白厚度，4周的数值为8 mm，8周的数值为17 mm（图5K）。这表明胶原蛋白沉积有明显的增加。同时，在新生肌纤维向支架内部的渗透处也观察到同样的趋势（图5G和5I）。结果显示，螺旋状支架的可拉伸性在功能化和保持结构完整性方面起着关键作用。从宏观行为学的角度来看，可拉伸的支架使肌肉即使在肌肉损伤时也能控制自主运动。这使得支架能够促进损伤修复，同时防止肌肉萎缩。因此，分层螺旋式支架为克服临床医学中运动组织损伤的运动-固定悖论提供了一个理想平台。
图5 嵌入大鼠腿部肌肉的螺旋形支架的组织相容性能
再生肌腱的组织学评价
为了确定螺旋形支架的再生潜力，作者采用了一个成熟的大鼠跟腱缺损模型来评估体内的愈合效果。让大鼠在没有固定的情况下自我愈合4和8周，如图6A所示。首先，在植入4或8周后大鼠中观察修复后的肌腱的大体形态（图6B）。可以看出，再生的组织与周围的正常组织融合得很好。如图6C和6D所示，植入后四周，对横切面上的组织交界处进行了H&E染色。观察到宿主细胞呈现出纺锤形，主要分布在螺旋支架的外部。同时，支架周围的ECM沉积没有方向性，是混乱分布的（图6D）。8周后，大量的细胞已经迁移到螺旋支架的内部（图6E和6F）。相对来说，更密集和更有方向性的细胞在支架表面生长，那里的ECM变得更加集中，并随着修复时间的增加而组合成一种有序的情况（图6F）。这种变化的主要原因是螺旋支架表面上的定向纳米纤维的引导作用。从某种意义上说，可拉伸的螺旋支架具有从纳米到宏观的多尺度层次结构，不仅为细胞生长提供了合适的机械微环境，而且还为细胞增殖和组织形态发生提供了结构因子，从而实现了缺陷组织的仿生重建。
作者选择Masson染色来显示胶原纤维的成熟程度。胶原纤维的密度和方向随着植入时间的增加而稳步增加，这与H&E染色的结果是一致的（图6H和6J）。作者用免疫组织学染色来分析修复部位的肌腱相关蛋白（Col I、Col III）的表达。所有组别中Col I/Col III纤维都被染成棕黄色（图6K-6N）。与手术后4周相比，8周时Col I的表达明显上调。同时，在4周和8周也观察到Col III表达的一些上调，但没有Col I那么多，这证明了向成熟肌腱形成的进展（图6P）。此外，偏振光显微镜显示，连续的胶原纤维在支架和组织的界面内形成，这意味着与4周相比，8周时胶原纤维更加均匀（图6O）。因此，作者在体内对分层螺旋支架进行了组织学分析，包括细胞的生长状态和跟腱缺损动物模型中胶原蛋白的沉积，证明了螺旋支架在促进肌腱修复中的积极作用。
图6 修复后的大鼠跟腱在体内的组织学评估
运动功能评估
为了直观的比较，作者将正常肌腱、缺陷肌腱和植入直板支架的大鼠的右爪设为三个对照组，将植入螺旋支架的大鼠设为实验组。如图7A所示，正常大鼠的步态无障碍，后爪印的长度和宽度在不同时期没有明显差异，说明两只爪子的受力是均匀的。术后两周，无论是缺陷组还是直板组，左爪印都比右爪印短而窄，说明行走时两只爪子受力明显不均匀。相比之下，螺旋形支架组在第二周时没有明显的差异。这表明螺旋形支架在植入初期能够为有缺陷的跟腱提供足够的机械支持，从而平衡左右脚掌上的力量。术后8周，虽然缺陷组和直式支架组的左脚掌印的长度和宽度都在逐渐增加，但与右脚掌仍明显存在不匹配的情况，而在螺旋形支架组中，后爪逐渐恢复到近似于正常的爪印。
为了更具体地评价愈合的肌腱的功能，检测并计算了基于爪印的AFI值，如图7B所示。正常大鼠的最佳AFI值接近于零，而较大的AFI值表示更严重的残疾。在正常组中，不同时期的AFI值最接近于零。在其他组中，AFI值的总体趋势是随着愈合时间的增加而连续增加。有趣的是，术后2周，螺旋组的AFI值明显高于直线支架组，证明了螺旋支架能够在短时间内迅速补偿跟腱的运动功能。随后，螺旋组的AFI值恢复仍明显快于直线支架组和缺陷组。8周后，螺旋形支架组的AFI值非常接近正常水平，显示了出色的修复性能。图7C和7D显示了8周开放场地试验的结果，螺旋形支架组的自主活动总距离比直形支架组长很多。在旋转杆试验中，大鼠在滚轮上达到稳定的运动，开始计时。而且螺旋形脚手架组的大鼠在滚轮中持续运动的时间也比直线组长（图7E）。这些结果为上述组织学结果和AFIs提供了有力的证据，它们直接评估了大鼠模型修复后的实际跟腱功能恢复状况。
图7 大鼠跟腱的运动功能恢复
小结：作者提出了一个动态修复的概念，即开发一种具有良好生物相容性和适应性机械性能的仿生分层螺旋支架。螺旋状支架提供了一个合适的机械微环境，在大应变和应变率下，使细胞变形远低于整体应变，可以有效地缓冲细胞的力量。体内实验表明，螺旋状支架能促进细胞浸润、ECM生成和胶原蛋白沉积，从而轻松形成新组织。更重要的是，螺旋状支架可以在植入初期迅速取代受损肌腱的功能，并促进新组织的再生，直至功能重建。这项工作提出了一种颠覆性的运动组织损伤动态修复策略，为组织再生和人工器官平台的临床转化赋能。它将在运动损伤的快速恢复、组织重建、事故紧急处理和许多野生动物救援场景中发挥新的作用。
来源：高分子科学前沿
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