《Small》：机械力诱导中草药水凝胶的自组装及其抗菌和免疫调节创面的协同作用
皮肤创伤，尤其是慢性感染创面，因其发病率高、治疗效果差而受到世界各国的广泛关注。因此，迫切需要具有抗菌和免疫调节功能的水凝胶敷料。来自高性能陶瓷和超微结构国家重点实验室的刘宣勇团队受中药研磨处理的启发，引入机械力来促进壳聚糖(CS)和葛根素(PUE)的有效分子碰撞和自组装，以制备中草药水凝胶。CS@PUE(C@P)水凝胶优异的抗菌性能可能源于其纳米纤维的结构和CS中氨基的取向所带来的Zeta电位的提高。因此，C@P水凝胶的协同抗菌和免疫调节性能可以杀灭细菌，缓解伤口床上的炎症，确保抗感染效果，促进伤口愈合。除了提供一种用于伤口愈合的基于PUE的水凝胶的通用机械合成之外，这一发现有望在构建生物材料时增加对中草药的关注。C@P水凝胶的自组装是由CS和PUE分子之间的非共价键诱导的。壳聚糖链上胺基的取向起到机械臂的作用，可以打破细菌的电荷平衡，从而产生优异的抗菌活性。C@P水凝胶注射后可迅速杀灭感染创面细菌，并诱导巨噬细胞极化为M2表型，促进感染创面愈合（A)CP1水凝胶在0、3、6和12 H下的凝胶过程照片。（b)高倍率下的PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2的扫描电子显微镜图像和低倍下的CP1水凝胶的扫描电子显微镜图像。（C)PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2的红外光谱。（D)PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2在超纯水中的Zeta电位。(E）在相对稳定的条件下，CS、CP0.2、CP1和CP2在1 Hz频率和1%应变下的储能模数(G‘)和损耗模数(G“)。（F)连续6h测定CP1水凝胶的G‘和G“的变化（G)CP1水凝胶的G‘和G“随应变从1%到1000%的变化。（H)CP1水凝胶的自愈合性能在1%~1000%应变范围内变化。作者通过简单的研磨工艺方便地制备了不同PUE/CS比的C@P水凝胶，命名为CP0.2、CP1和CP2。CP1水凝胶的外观如图1a所示，初始样品处于溶胶状态，放置12h后，可以清楚地观察到水凝胶的颜色从淡白色变为乳白色，最终处于凝胶状态。通过扫描电子显微镜(SEM；图1b)图像显示了CP1水凝胶的纳米纤维结构，与CS和PUE平整光滑的形态相比，CP0.2和CP1的复合材料呈现出相似的结构，而CP1和CP2则呈现出特殊的纳米纤维结构，且随着PUE含量的增加，直径逐渐增大。这种溶胶-凝胶转变起源于非共价相互作用诱导的自组装过程，伴随着C@P纳米纤维的形成。傅立叶变换红外光谱进一步证实了这种自组装过程。与CS、PUE和CP0.2相比，Cp1和Cp2在1633和1613 cm−1处出现了新的峰，这可能与PUE组分受大量氢键影响而发生C=O伸缩有关。经过仔细比较，Cp1和Cp2组在1065 cm−1处的吸收峰对应于CS的O—H带，向1060 cm−1的较低波数红移，这表明氢键已形成更稳定的结构。CP1和CP2基团吸收峰的变化具有相似的特殊性，可归因于CS和PUE的相互作用和纳米纤维的形成，从而影响了各组分的缔合作用。随着水凝胶的形成，G‘和G“显著增加，G’和G”的持续增长趋势可能与cp1水凝胶的连续自组装过程有关，这可能是由于物理键而不是化学作用(图1f)。根据图1G所示的CP1水凝胶在400%应变下的凝胶-溶胶化转变，在1%和1000%应变之间进行了5次循环模数变化，以考察其自愈能力，结果如图1h所示。G‘在1000%应变下小于G“，在1%应变降低时大于G”，对应着网络的破坏和恢复过程，证明了伤口愈合注射过程中流畅的替代物和自我修复能力。(A)C@P体系在0、0.5、1、1.5和2 ns处的结构变化。(B)无水C@P系统的相应结构。(C)稳定状态下刺激盒的分子结构。(D)稳定状态下CS和PUE的自组装结构。(E)相应的以CS链上的氮原子和外缘区暴露的氮原子为亮点的自组装结构都用红色圆圈标记。人们普遍认为，材料的成分、结构和性能是相互影响的，并呈现出三角关系。这些三角关系可以描述为材料组分的原子和分子相互作用决定材料的微观结构，而微观结构又进一步影响材料的物理化学性质。本文采用经典的分子动力学模拟方法，探讨了C@P水凝胶自组装形成纳米纤维结构的机理。去除了水分子的C@P体系在0、0.5、1、1.5和2 ns处的结构变化如图2b所示。可以清楚地发现，CS和PUE分子逐渐聚集在一起形成凝胶并均匀分散在体系中。在C@P体系中，研磨过程引入机械力，提高局部反应温度，增加活化分子数，促进分子间的有效碰撞，从而加速CS与PUE的自组装，形成纳米纤维结构。图2c显示了C@P体系的平衡状态，图2d显示了CS和PUE分子的线性聚集。自组装的结果进一步放大，所有的氨基都以蓝色突出显示，其余的以较高的透明度显示。从图2E可以直观地发现，相当一部分氨基暴露在CS和PUE取向结构的外缘区域(仔细计数并用红圈标记)，这合理地解释了CP1和CP2的Zeta电位异常提高的原因。采用分子相互作用和自组装结构计算的经典分子动力学模拟结果合理地解释了C@P水凝胶的形成及其独特的纳米纤维结构和物理化学性质，即大量的Hb和CS的长碳骨架有利于分子自组装和纳米纤维的形成，进而机械力可以降低分子激活能以加速自组装过程。用生理盐水(对照)、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2处理的(A)大肠杆菌和(B)金黄色葡萄球菌的细胞活力。(C)对照、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2样品中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落照片。(D)用对照、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2样本处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活/死染色。(E)在对照、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2样品上培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的扫描电子显微镜图像，破膜用红色箭头标记。根据图3A，与生理盐水(对照组)相比， CP1和CP2水凝胶表现出优异的抗菌性能。用每个样本处理的金黄色葡萄球菌组也出现了类似的结果。细菌在CP1和CP2水凝胶上的活性显著降低，这可能与CS和PUE的自组装有关，而Zeta电位的升高源于CS在自组装过程中氨基的取向。图3D所示。进一步证实了CP1和CP2组具有良好的抗菌能力。为了研究细菌膜的完整性，用扫描电子显微镜观察了细菌的形态，结果如图3E所示。对照组、CS组和PUE组细菌呈现完整的膜结构。反之，C@P水凝胶上的细菌数量明显减少，细胞膜受到破坏，其中CP1和CP2组尤为明显。据报道，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的Zeta电位分别为≈−22.6±1.16 mV和−13.8±0.75 mV。因此，C@P水凝胶的抗菌机理可能归因于其独特的纳米纤维结构和升高的Zeta电位破坏了细菌的电荷平衡和呼吸链平衡。L929细胞与对照组、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2共培养（A）24小时和(B)48小时的CCK8检测；(C)过氧化氢、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2处理的L929细胞的过氧化氢清除实验。(D)对照组、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2处理的L929细胞在第3天进行活/死染色，绿色荧光表示活细胞，红色荧光表示死亡细胞。(E)L929细胞经对照、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2处理2、10和24 h后，F-肌动蛋白的细胞骨架荧光染色：荧光素异硫氰酸酯异构体(FITC)-鬼笔环素(绿色)和4‘，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)染色的细胞核(DAPI，蓝)。(F)RAW264.7细胞与对照、PUE、CS、CP0.2、CP1和CP2共培养48 h后的iNOS(绿色)、CD206(红色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光染色。(G)RT-PCR检测相关基因的表达。如图4所示，这些组共培养48h后，PUE处理的L929细胞的活力因药物浓度过高而明显下降，而CP0.2、CP1和CP2组仍表现出良好的细胞活性,是由于分子间的相互作用，水凝胶可以避免PUE的大量释放，从而提高了生物相容性。此外，皮肤组织特别容易受到自由基高表达的氧化损伤，尤其是屏障被破坏的皮肤和伤口。并且CP0.2、CP1和CP2组可清除过氧化氢，并在CS和PUE的协同作用下有效抵抗氧化应激。活/死染色结果显示大量绿色荧光(活细胞)和少量红色荧光(死细胞)，表明所有样品都没有明显的细胞毒性。此外，初始细胞黏附显示CP1和CP2水凝胶可以刺激L929细胞的黏附和铺展。采用免疫荧光染色和实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)分析了C@P水凝胶的免疫调节作用。PUE样品显著抑制巨噬细胞向M1型极化。同时，CS样本诱导巨噬细胞极化为M2表型，与对照样本相比红色荧光显著增强。C@P各剂量组的红色荧光强度均高于对照组，CP1水凝胶的绿色荧光强度低于对照组，说明C@P水凝胶具有抗炎作用。另外根据图4G，PUE和CS均能显著抑制iNOS的表达，其中CP0.2、CP1和CP2组iNOS的表达最低。对于抗炎相关基因的表达，CP0.2样品表现出最佳的抗炎效果。CP1和CP2水凝胶的相对CD206表达与对照组、PUE组和CS组无差异。CP1组IL-4表达明显高于PUE组，CP1、CP2组IL-10表达明显高于对照组。不同的表达规律可能与PUE的量有关。综上所述，C@P水凝胶具有良好的生物相容性，可以通过改变巨噬细胞M1/M2比值的极化，抑制促炎相关基因的表达，促进抗炎相关基因的表达来调节免疫功能。(A)在全层创面模型中，分别于0、2、5、9、14天用生理盐水(对照组)、PUE、CS和CP1水凝胶处理的伤口照片。(B)对照组、PUE组、CS组和CP1组在第0、2、5、9和14天的创面闭合率和(C)相应的痕迹。(D)H&E染色评估对照组、PUE组、CS组和CP1组在第14天的创面再生。(E)在对照组、PUE组、CS组和CP1组的再生组织中进行iNOS(红色)、CD206(绿色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光染色。F)感染伤口模型中感染伤口的照片。(G)对照组、PUE组、CS组和CP1组在第0、2、5、9和14天的伤口闭合率和相应的痕迹和(H)在第2天从感染皮肤收集的金黄色葡萄球菌菌落的照片。(J)再生组织的免疫荧光染色。研究C@P水凝胶的创面愈合能力，探讨创面愈合过程中免疫与感染的关系。采用生理盐水对照组、PUE组、CS组和CP1水凝胶组，观察其对创面愈合的协同作用。5天后， CP1组创面闭合面积最大。此外，在连续的伤口愈合实验中，CP1水凝胶显示出最好的伤口愈合能力。并且根据图5d所示。对照组有较大的未愈合创面。与PUE组和CS组相比，CP1水凝胶的愈合组织最厚。免疫荧光染色显示Pue和CS可显著降低创面iNOS的表达，减轻创面炎症反应，CP1水凝胶组很少有红色荧光，表明iNOS的表达最低。因此，CP1水凝胶组可以很容易地填充创面，减轻炎症，促进组织愈合和毛囊生长。将金黄色葡萄球菌引入创面，建立感染全层创面愈合模型。在治疗感染创面时，CP1水凝胶能够保持良好的抗菌活性，调节免疫反应，避免皮肤创面因感染引起的过度炎症，并显著缩小创面面积，显示CP1水凝胶具有良好的体内抗菌能力。INOS和CD206免疫荧光染色结果显示， INOS较弱的红色荧光和CD206较强的绿色荧光进一步说明CP1水凝胶具有良好的抗感染和免疫调节作用。本工作受中草药粉碎工艺的启发，提出了一种构建PUE水凝胶的通用粉碎方法。在机械力诱导自组装过程中引入CS固有的抗菌成分，构建了协同抗菌和免疫调节的C@P水凝胶，用于治疗感染皮肤伤口。这些结果表明，CS和PUE的动态自组装和排列形成了特殊的C@P纳米纤维结构，赋予了C@P水凝胶特殊的物理化学性质和生物学性质。由于胺基团的取向，C@P水凝胶在纳米纤维结构的同时表现出了优异的抗菌能力。可注射自愈的C@P水凝胶不仅可以通过调节免疫反应促进非感染创面的愈合，而且具有良好的生物相容性、抗菌能力和抗炎能力，在治疗慢性感染创面方面显示出巨大的优势。因此，C@P纳米纤维水凝胶有望成为一种具有协同抗菌和免疫调节作用的敷料，用于治疗感染创面，该水凝胶具有潜在的应用前景。