治疗性HPV疫苗研究进展
目前，宫颈癌是全球女性的第三大常见癌症，全世界每年有近50万名女性确诊患有宫颈癌，其中超过25万人死亡。高危人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈和肛门生殖器恶性肿瘤的必要因素，[1]。[2]。因此，目前人们研究的方向是治疗性疫苗的开发，即通过引发细胞介导的免疫应答以治疗特定的感染和恶性肿瘤。二十世纪七十年代，Zur Hausen小组首次发现是宫颈癌的致病因子。目前人们发现的至少有170种HPV基因型共被分为两类：低风险（low-risk）类型，包括引起生殖器疣的HPV-6/11/40/42/43/44/54/61/72；以及高风险（high-risk）类型，包括HPV-16/18/31/35/39/45/51/52/56/58/66。其中，HPV-16和HPV-18已经被确定为两种最常见的hrHPV类型，分别占约62.6%和15.7%。这两种hrHPV类型导致病例中80-86％的外阴和阴道癌，89-95％的口咽癌，93％的肛门癌和63-80％的阴茎癌。图1，高危型和低危型HPV持续性高风险类型HPV（hrHPVs）感染会导致鳞状上皮内病变（squamous intraepithelial lesions，SILs）的发生；在子宫颈，这被称为宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）；在外阴被称为外阴上皮内瘤变（vulval intraepithelial neoplasia，VIN）。SILs会发展为恶性肿瘤。HPV病毒是一种小型、无包膜的双链DNA病毒，其基因组大小约为8kb，编码负责病毒 DNA 复制（E1,E2）、转录（E2）和致癌转化（E5,E6,E7）的蛋白，以及病毒衣壳蛋白。病毒在pH=3-7时稳定，在70℃下灭活，并在50℃以上的温度下30分钟后被杀死。通常，病毒感染导致细胞的破坏; 事实上，它也可能导致细胞转化和肿瘤发展。HPV病毒通过解剖学上可接触的位置感染基底上皮细胞，例如皮肤、生殖器官和口咽区域的微小病变等。衣壳蛋白L1和L2附着在上皮细胞受体上，最终其基因组进入受感染细胞的细胞核，进行转录和复制。病毒体成熟之后进行组装和释放，并且与与上皮细胞生命周期结束时衰老细胞的自然脱落一致。图2 典型hr-HPV的生命周期持续性的感染会可能导致病毒基因组整合到宿主细胞中，诱发侵袭性宫颈癌。在典型的hrHPV致癌过程中，HPV基因组被整合到宿主的染色体DNA中，E2序列在基因组线性化过程中被打乱。而E2蛋白是E6和E7的转录抑制因子，因此一旦E2被破坏，E6和E7就能够在宿主体内顺利转录。E6蛋白随后促进宿主凋亡调节蛋白p53的降解，激活端粒酶，从而延长细胞寿命；E7蛋白以肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）为降解目标，导致细胞生命周期向S期过渡，从而造成宿主细胞基因组复制。。目前，市面上共有三种HPV疫苗，均为预防性的：二价HPV-16/18疫苗、四价HPV-6/11/16/18疫苗和九价HPV-6/11/16/18/31/33/45/52/58疫苗，均靶向HPV的L1衣壳蛋白，。因此，大量已感染HPV的人无法从现有疫苗中获益，亟需开发能够消除现存感染的治疗性HPV疫苗。当前，研究者们已经开发了几类不同的HPV治疗性疫苗，包括活载体、核酸、肽、基于蛋白质和基于细胞的疫苗等，并在临床试验中获得了良好结果。DNA疫苗接种涉及将编码目的蛋白质的质粒DNA递送到宿主组织中，随后通过细胞转染，导致转基因的表达和能够进入细胞处理机制的蛋白质的产生。具有生产简单、成本较低、热稳定性好的优势。VGX-3100由两个DNA质粒组成，分别编码HPV-16和HPV-18的优化合成共识基因E6和E7，由INOVIO公司(NASDAQ: INO)开发。2023年3月， VGX-3100治疗子宫颈上皮内瘤样病变的III期临床topline数据公布，达到预设主要、次要终点，且安全性良好，没有与治疗相关的严重不良事件发生。图3 VGX-3100作用机制基于肽的治疗性疫苗具有稳定性、安全性和大规模生产的可行性。它们可分为特定表位（短）肽和合成长肽（SLPs）疫苗。由于肽疫苗的免疫原性很差，所以一般需要佐剂化。PepCan由包括HPV-16 E6蛋白的四种合成肽组成，以念珠菌属（）皮试剂为新型佐剂。实验中，65％的受体内能检测到由疫苗诱导的对E6的免疫应答。目前，PepCan治疗宫颈高级鳞状上皮内病变的II期随机双盲试验正在进行中(NCT02481414)。另一种合成长肽（SLP）疫苗ISA101由跨越整个HPV-16 E6和E7癌蛋白的13种合成长肽组成。。图4 PepCan二期临床登记信息基于蛋白质的疫苗内有许多CD4和CD8T表位，并规避了短肽疫苗接种的缺点，不再受到MHC限制。然而，抗原优先通过MHC II类呈递，这导致产生抗体而不是效应细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。因此，我们需要通过一些辅助手段加强内源性加工，或将抗原靶向到DC细胞，以达到诱发细胞免疫的目的。GTL001（Procervix）包含来自HPV-16和18的E7蛋白，它们各自与来自百日咳博德特氏菌（，CyaA）的解毒腺苷酸环化酶融合并由咪喹莫特佐剂化。CyaA的N原子端与表达在APC上的黏附分子CD11b相结合。经过试验数据测定发现，该疫苗与对照组（只给安慰剂）病毒清除率的差异没有达到统计学意义，最终结果是GTL001和安慰剂组的高级病变进展率相同（NCT01957878）。。目前，已经有第二代疫苗处于研究过程中。GTL002中包含来自HPV-16/18/45/31/33/52的修饰的E7蛋白。人们已经在近交系和远交系小鼠和犬类动物中评估了GTL002的临床前免疫原性。六种HPV基因型的E7蛋白均能诱导T细胞进行特异性免疫应答，并且已经通过广泛使用的TC-1肿瘤攻击模型证明了疫苗的体内功效。由于它们将自身遗传信息转导到宿主细胞中以进行复制的天然倾向，病毒是开发治疗性HPV疫苗的一种具有吸引力的方式。。产生的抗原具有活性并且其载体和多肽将被细胞表面的MHC I类分子呈递出来。此外，病毒核酸内含有刺激先天免疫反应的PAMP，能够进一步诱发细胞免疫。但是，病毒载体疫苗有一个最大的缺点，就是存在载体特异性免疫：目前，人们利用最广泛的病毒载体是腺病毒（adenoviruses, Ad）及其衍生病毒、甲病毒（alphaviruses）和牛痘病毒（如经过修饰的安卡拉牛痘疫苗，Modified Vaccinia Ankara，MVA）。图5常见病毒载体特性腺病毒在许多不同的细胞类型中表现出广泛的亲和力，这是腺病毒成为基因治疗的先驱并随后发展为疫苗载体的原因之一。腺病毒基因组有五个早期区域：E1A、E1B、E2、E3和E4。E1A蛋白可激活其他病毒基因，对病毒复制起着非常重要的作用。只要使得该区域的基因缺失或是用目标基因替换，就能得到适于人使用的安全的病毒载体。因此，人类和动物的大多数研究均使用了E1基因缺失的病毒作为载体。而E2、E3、E4编码序列的缺失则会增加目的基因片段插入的能力。进腺病毒载体可以通过各种系统途径和粘膜途径进行给药，并且能够同时转导静止和活跃分裂的细胞。由于腺病毒在人类中普遍存在，所以机体内预先存在的针对腺病毒的特异性反应非常普遍：生活在欧洲和美国的成年人中，高达60%的人对5型腺病毒（Ad5）具有高水平表达的中和抗体，而Ad5是人类血清型和疫苗试验中最常用的病毒载体。因此，人们转而寻找相似的替代品，以减弱机体本身对病毒载体的特异性反应。来自黑猩猩的腺病毒（ChAd）由于其在人群中的低/无血清阳性率和与人Ad5相当的免疫效力而进入临床。最近，Khan等人进行了利用罕见的人类腺病毒Ad26和Ad35，编码E2、E6和E7作为融合蛋白，治疗HPV-16/18相关疾病的研究。在临床前研究中，观察到小鼠强大的T细胞免疫原性和抗肿瘤的能力。痘病毒具有庞大而稳定的基因组，可以支持大量转基因DNA的稳定表达，同时保留转录和翻译能力。在感染细胞被免疫系统清除之前，重组基因表达约7天。它们的整个生命周期发生在体细胞的细胞质中，这使插入诱变的风险最小化。此外，痘病毒通过被动膜融合感染细胞，从而赋予哺乳动物细胞广泛的亲和力，包括单核细胞和发育不成熟的树突状细胞。广泛使用具有复制能力的牛痘和后来的MVA作为天花疫苗，为痘病毒在疫苗中充当载体对人类是安全的提供了有效证据。所以，MVA和其他减毒牛痘株（NYVAC）不仅能够以低成本投入生产，并已通过皮下、鼻内、阴道内和直肠内途径安全使用。对于目前处于研发状态的两种疫苗，MVA E2和TG4001。前者在任何研究中都没有提供关于E2特异性T细胞的描述，并且因为在这些研究中没有使用对照疫苗，疫苗的真正效力尚不能完全确定；后者由转基因公司研制，包含编码HPV-16 E6 / E7和人IL2的重组MVA，由于疫苗效力远低于切除/消融治疗的效果，所以TG4001于2012年被停止开发。减毒活细菌载体具有诱导粘膜和全身体液免疫及细胞介导免疫的能力。给药后，重组细菌极大几率会被巨噬细胞和其他抗原呈递细胞所吞噬。革兰氏阴性细菌中的脂多糖、革兰氏阳性细菌中的脂壁酸、肽聚糖和鞭毛蛋白等保守分子模式可被PRRs识别，从而触发先天免疫反应。细菌的衰减是通过删除毒力调节系统或芳香氨基酸生物合成途径所涉及的必要基因来实现的。这些突变使细菌不能在宿主中繁殖，同时保留其合成编码抗原的能力，故对人体无害。用于疫苗开发的最常用的细菌载体是单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm），这是一种革兰氏阳性细胞内兼性厌氧菌。一旦进入吞噬体，Lm菌将分泌膜活性毒力因子LLO和磷脂酶C，通过降解吞噬溶酶体膜，进入细胞质，表达蛋白质进入内源性抗原加工途径。Lm能够引发持久的CD8T细胞反应。一旦在吞噬体中表达，Lm编码的蛋白质也可以直接呈递给MHC II类分子，进而诱导CD4和CD8 T细胞应答。细菌载体生产相对简单且廉价，适合于大规模生产并且室温状态下能够保持稳定状态（通过冷冻干燥）。如果在大规模试验期间发生不良反应，可以通过口服抗生素根除症状。活性减毒细菌感染治疗性HPV疫苗的第一次临床试验证明疫苗是安全的，并且对患者的症状有明显的改善。入选II期试验的疫苗正在进行肛门直肠癌、头颈癌和宫颈癌的临床试验（NCT02399813，NCT02002182，NCT02291055，NCT01266460）。III期临床试验（AIM2CERV）正在研究ADXS11-001作为辅助免疫疗法，对化疗或放疗后的高危、局部晚期宫颈癌患者是否有效（NCT02853604）。由于目前的疫苗没有治疗效果，因此迫切需要治疗性HPV疫苗来减轻宫颈癌对人类健康造成的负面影响。迄今为止，尚未有被批准用于治疗HPV感染和相关恶性肿瘤的商业用途的治疗性疫苗，但。参考文献[1]de Martel, C., et al.,  Int J