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금앵자 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1 지방세포의 분화억제 효과와 그 메커니즘 규명	<h2>RLE에 의한 분화초기세포 증식 억제(Clonal expansion 억제)</h2> <p>지방세포로의 분화 초기단계에서 contact inhibition에 의해 증식이 정지되어 있던 세포는 지방세포 유도 복합체에 의해 다시 세포 증식을 시작하는데, 이 과정에서 핵심적인 역할을 하는 인자가 바로 \( \mathrm { C } / \mathrm { EBP } \beta \)이다. Fig.4A에서 \( \mathrm { C } / \mathrm { EBP } \beta \)의 발현이 RLE에 의해 저해됨을 확인하였기에, RLE가 지방세포 유도 복합체에 의한 세포 증식, 즉 clonal expansion 단계를 저해시킬 것이라 판단하고, 이를 확인하기 위해 trypan blue exclusion assay를 통해 생세포수를 확인하였다. 그 결과 대조군의 세포 증식은 0시간일 때 \( 100 \% \)라고 봤을 때 24,48 시간에는 \( 154.77, 225.1 \% \)의 증식을 보였지만 RLE \( 900 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리군은 \( 119.6,158.03 \%, \mathrm { RLE } 1000 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리군은 \( 101.59,127.85 \% \)로 증식이 억제됨을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 증식 억제 효과는 RLE를 처리하기 전 confluent 상태, 즉 Day 0에서의 세포수와 비교하였을 때 RLE 처리 이후 생세포수의 감소는 유도되지 않는 것으로 보아 세포 독성에 의한 효과는 아닌 것으로 사료된다. 따라서, RLE는 3T3-L1 세포의 분화초기 clonal expansion 단계에서 세포증식 억제를 통해 지방세포로의 분화를 억제하는 것으로 사료된다.</p> <h2>RLE에의한 3T3-L1 지방전구세포의 G1기에서의 세포주기 정지 효과</h2> <p>위의 결과에 의하면, RLE는 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 초기 단계에서 세포 분열을 억제시킨다. 즉, 정지된 세포주기가 MDI로 인해 다시 진행될 때, RLE의 작용에 의해 세포주기 진행의 변화가 있을 것으로 생각되어 Muse \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Cell Analyzer를 이용하여 세포주기 분포도를 확인하였다.</p> <p>Fig. 6 에서와 같이 RLE를 처리하지 않고 MDI와 \( 0.5 \% \) \( \mathrm { DMSO } \)를 처리한 대조군의 G1기의 세포 비율은 \( 42.9 \% \)로 나타났으나, RLE를 처리한 군들의 G1기 세포 비율은 RLE 처리 농도가 높아질수록 점점 증가하여 최고농도인 \( 1000 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } \)에서는 \( 82.1 \% \)로 나타났다. 이러한 결과는, RLE가 clonal expansion 단계에 있는 지방세포의 세포주기를 G1기에서 정지시킴으로써, 지방세포로의 분화를 억제시킨다는 것을 나타낸다.</p> <h2>세포 독성</h2> <p>RLE의 독성을 알아보기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate \( \left(5 \times 10^{3}\right. \)cells/well)에 seeding 하고 24 간 배양하였다. 이후, 대조군으로 \(0.5\%\) DMSO(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 처리하였으며, RLE를 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하고 48시간 배양하였다. WST-1 reagent를 각 well에 \( 20 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 30분 반응시킨 다음 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>분화초기와 분화후기에 발현되는 전사인자들의 발현양상 확인</h2> <p>RLE에 의한 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 과정동안 발현되는 전사인자들의 발현변화를 확인하기 위해, 지방전구세포에 MDI와 함께 RLE를 처리하고 2일 후 세포를 회수하여 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \) 발현 양상을 확인하였다(Day 2). 또한 지방세포 분화 후기에 발현되는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)와 \(\mathrm{PPAR} \gamma \)의 발현양상을 확인하기 위해 MDI와 RLE를 함께 처리하여 2일간 반응 시킨 다음, FBS가 첨가된 DMEM 배지에 insulin만 처리할 때 RLE를 함께 처리하여 4일간 반응시킨 다음 세포를 회수하였다(Day 6).</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>RLE를 처리한 3T3-L1 세포를 회수하여 PBS로 washing한 후, lysis buffer(Cell signaling technology, Danvers, MA, USA)를 세포에 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 용해시킨 후 \( 14,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액의 단백질 농도는 BCA법을 이용하여 정량 한 후 동량의 단백질을 (SDS)-polyacrylamide gel에서 전기영동하였다. 전기영동 후 gel 내의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 전사시키고 Blocking solution[0.15 M NaCl, \( 1 \mathrm{M} \) Tris-\( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 7.5), 0.1\% Tween- \( 20,5 \% \mathrm{BSA}] \)을 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 blocking 시켰다. 1차 항체는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 반응시켰으며, TBS[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}] \)에 \( 0.1 \% \) Tween-20이 첨가된 buffer를 사용하여 membrane을 washing 한 다음 2차 항체를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 반응시켰다. 면역반응 단백질은 화학발광시스템(Chemi-luminescence system; Super Signal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다. 본 실험에 사용한 1차항체는 Cell signaling technology(Danvers, MA, USA)에서 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta, \mathrm{Rb} \), phospho-Rb를 구입하였으며, Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 p21, Cyclin E, Cdk2, Actin를 구입하여 사용하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP, anti-mouse IgG-HRP는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>비만이란 섭취한 에너지와 소비하는 에너지 사이의 심각한 불균형으로 인하여 신체 내 지방이 축적되는 현상으로, 고지혈증, 간기능 이상, 당뇨병, 고혈압, 심혈관계 질환 등의 성인병이나 각종 암 발병의 직·간접적 원인이 되고 있어 비만의 치료 및 예방이 시급한 실정이며, 이를 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 체내 지방은 지방전구세포가 지방세포로 분화한 후 지방세포의 증식과정에서 지방이 축적되는 현상이다. 지방전구세포가 과다 분화하거나 분화된 지방세포가 과다 증식하면 지방세포의 수가 많아지고, 지방세포 내 지방 축적량이 증가할수록 지방세포의 크기가 커져 비만으로 이어질 수 있다. 따라서, 지방세포의 증식 및 분화 억제, 지방세포 내 지방축적 억제 및 축적된 지방의 분해를 통해 비만을 억제할 수 있다.</p> <p>지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정은 세포의 형태나 호르몬 감수성, 다양한 유전자들 상호작용 등이 동반되는 복합한 과정이다. 이러한 반응은 여러 가지 전사인자들의 단계적 작용에 의해 일어나는데, 그 중 CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBP) family와 peroxisome proliferator activated receptor \( \gamma \)가 가장 대표적인 전사인자로 알려져 있다. 지방전구세포인 3T3-L1은 confluence 상태 즉, 세포 배양용 dish에 세포들이 가득 차면 contact inhibition으로 인하여 세포 주기가 정지되어 세포의 성장이 멈추게 된다. 이 상태에서 지방세포 유도 복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine)를 처리하면 정지된 세포주기가 다시 진행되어 세포의 수가 2-3배 늘어나게 되는데, 이 과정을 clonal expansion 단계라 부르고, 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화 될 때 매우 중요한 과정이며, 이 과정이 진행되지 않으면 분화가 일어나지 않는다고 보고되어 있다. 지방세포의 clonal expansion 단계에서 핵심적인 역할을 하는 인자는 바로 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)이다. 지방세포 유도 복합체 처리에 의해 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \delta \)의 발현이 유도되고 세포주기의 진행이 시작된다. 또한 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)와 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)의 promoter에 결합하여 발현을 유도한다. 지방세포의 분화를 조절하는 핵심 인자인 \( \mathrm{C} / \) \( \mathrm{EBP} \alpha \) 와 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)가 발현이 되면 지방세포 유도 복합체에 의해 진행되던 세포 주기가 다시 정지되며, \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)와 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)가 서로 상호 작용을 하면서 다양한 지방세포의 분화 및 지방합성과 저장에 관여하는 유전자들의 발현을 유도하여 세포 내 지방이 축적되고 분화가 완료된다.</p> <p>금앵자(Rosae laevigata fructus)는 열대지방에서 자라는 상록성 관목의 장미과 식물이며 그 열매와 뿌리를 약용으로 이용한다. 금앵자는 가시가 있고 마치 적갈색의 작은 석류와 흡사한 모양을 하고 있으며 열매 속에 30-40개의 황갈색 종자가 들어 있다. 금앵자의 성미는 평(平)하고, 시고 떫은 맛이 난다. 성분으로는 꽃받침과 열매에 유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌이 있다. 한방에서는 금앵자의 꽃받침과 열매를 강장, 수렴, 지사, 유정, 유뇨, 빈뇨, 만성장염, 설사 등에 사용되어 왔다. 금앵자의 항산화효능, 혈액성 상에 관한 연구, 항염증 효능에 관한 연구가 보고되어 있으나, 항비만 효능에 관한 연구는 아직 보고되어 있지 않다.</p> <p>본 연구에서는 금앵자가 항비만 효능을 가지고 있는지 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포를 인위적으로 분화시킬때 금앵자 추출물을 처리하여 나타나는 변화를 확인하였고, 지방세포 분화에 관련된 인자들인 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta, \mathrm{PPAR} \gamma \) 등의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 분화 초기 지방세포 유도 복합체에 의해 세포가 증식하는 과정에서 금앵자가 미치는 영향을 확인하였다.</p> <h2>G1 arrest 관련 단백질의 발현변화</h2> <p>RLE가 분화 초기 지방세포 유도 복합체인 MDI 처리에 의한 세포의 증식 유도 단계에서, G1기에서 세포 주기를 정지시킴으로써 세포의 증식을 억제함을 확인하였다. RLE에 의한 G1기로의 세포주기 정지에 대한 분자기전을 확인하기 위해 세포주기 조절에 관여하는 단백질들의 발현 변화를 western blot analysis를 통해 확인하였다. 세포주기는 Cyclin에 의한 cyclin-dependent kinase(Cdk)의 활성화 및 Cdk inhibitor의 발현에 의해 조절된다. 그 중 G1기에서 S기로 진입하는 단계에서는 Cyclin E가 발현되어 Cdk2를 활성화시켜 세포주기가 진행된다. 그러나 어떠한 요인에 의해 Cyclin과 Cdk 발현이 정상적으로 유도되지 않으면, 필요한 단백질의 합성이 충분히 진행될 때까지 세포주기가 정지된다고 알려져 있다. 또한 Cyclin E와 Cdk2가 활성화 되면 \( \mathrm{Rb} \)를 인산화시키게 되는데, \( \mathrm{Rb} \)가 인산화되면 DNA 복제를 진행시키는 전사인자가 발현되어 S기가 시작된다.Cdk는 다양한 증식 억제 신호들에 의해 발현되는 Cdk inhibitor인 p21에 의해 그 활성이 억제된다고 알려져 있다. 3T3-L1 지방전구세포에 MDI와 다양한 농도의 RLE를 동시에 처리하여 배양한 후, 회수하여 G1기에서 S기로의 전이에 관여하는 단백질들인 Cdk2, Cyclin E, Rb, phosphor-Rb 및 p21의 발현변화를 검토하였다. 그 결과 RLE의 농도 의존적으로 Cdk inhibitor인 p21의 발현이 증가하였고, Cyclin E와 Cdk2, phosphor-Rb의 발현은 감소됨을 확인하였다(Fig. 7). 이는 RLE에 의해 증가된 Cdk inhibitor인 p21이 CyclinE/Cdk2 complex에 결합하여 CyclinE/Cdk2 complex의 활성이 저해되고 따라서, 이후 단계의 \( \mathrm{Rb} \)의 인산화가 억제되어 S기로의 진행이 저해되고 G1기에서 세포주기 정지가 유도되었을 것으로 사료된다.</p> <p>본 연구에 사용된 금앵자는 장미과의 금앵자 나무 열매를 건조한 것으로, 유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌 등의 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 금앵자가 속해있는 장미과 식물 중 비파엽, 용아초, 복분자, 산사 등에 의한 지방세포 분화억제 효능에 대한 보고가 있다. 그 중 비파엽은 3T3-L1 cell에서 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현 억제를 통해 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로, 금앵자 추출물의 효능 및 작용 메커니즘이 유사한 것으로 사료된다. 또한 용아초 \( \mathrm{EtOH} \) 추출물은 지방축적이 유도된 HepG2 세포내에서 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)의 발현 억제를 통해 지방 축적을 억제시키고, 그 외 복분자 열매 추출물이나 산사 약침은 지방세포의 분화 억제 효능은 확인되었으나 메커니즘에 대한 연구는 아직 진행되지 않은 상태이다. 또한 비타민 C, 탄닌, 사포닌 등 금앵자에 포함된 성분에 대한 항비만 효능도 다수 보고되어 있다. 그러나 본 연구에 사용된 금앵자는 항염증, 항산화 등에 대한 보고 외에 항비만 효능에 대한 보고는 본 연구팀이 최초이며, 금앵자 추출물이 지방세포의 분화에 관련된 핵심 전사인자들의 발현을 저해하는 것은 비파엽 추출물의 메커니즘과 유사하다고 할 수 있다. 그러나 금앵자 추출물은 지방세포의 분화에 중요한 단계인 clonal expansion에서 세포의 주기를 G1기에서 정지시킴으로써, 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 보다 효과적으로 억제시킬 것으로 사료된다. 따라서 금앵자는 지방세포의 분화 억제활성을 나타내는 성분의 규명 및 실험 동물 내에서의 지방 억제 효능에 대한 연구 등 항비만 활성과 관련된 기초연구를 위한 소재로 활용이 가능할 뿐만 아니라 기능성 식품 등의 소재로도 활용이 가능할 것으로 사료된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>금앵자 추출</h2> <p>금앵자(Rosae laevigatae fructus) \( 100 \mathrm{~g} \)을 분말화 한 다음, \( 30 \% \mathrm{EtOH} 1 \mathrm{~L} \)를 넣고 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 3회 반복하여 추출하였다. 추출액은 ADVANTEC filter paper 2(ADVANTEC, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고 감압 농축하여 추출물 \( 29.75 \mathrm{~g} \)을 얻었다. 이후 금앵자 \( 30 \% \) EtOH 추출물을 RLE(Rosae laevigatae fructus \( 30 \% \mathrm{EtOH} \) extracts)로 표기하고자 한다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양</h2> <p>3T3-L1(mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구세포는 ATCC(American type culture collection)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea)에 \( 10 \% \) bovine calf serum(BCS, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea), antibiotics(penicillin/streptomycin 100 units/ml, Bioshop, Burlington, Ontario, Canada)를 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>지방세포로의 분화</h2> <p>지방전구세포인 3T3-L1을 지방세포로 분화시키기 위하여 35-mm dish(SPL Life Sciences, Seoul, Korea)에 \( 5 \times 10^{4} \)cells/dish의 농도로 세포를 seeding한 후, \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin solution(100 units/ \( \mathrm{ml} \))이 첨가된 DMEM 배지로 confluence 상태가 될 때까지 배양하였다(Fig. 1, Day 0). 그 후, 지방세포 분화 유도제인 MDI \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), \( 0.25 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), \( 0.5 \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)]를 첨가한 DMEM 배지를 세포에 처리하여 2일간 배양하였다(Day 2). 이후, 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하여 4일간 배양하였고(Day 6), 완전 분화를 위해 DMEM에 \( 10 \% \) FBS, antibiotics를 첨가하여 2일간 더 배양하였다(Day 8). RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향은 MDI나 insulin 처리시, RLE를 함께 처리하여 확인하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색</h2> <p>RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 MDI와 insulin 처리 및 완전분화를 위한 배지에 RLE를 함께 처리하였다. \( 0.5 \% \mathrm{DMSO} \)를 처리한 대조군이 \( 100 \% \) 분화가 되었을 때, 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline(PBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 cell을 washing 한 후, \( 10 \% \) formalin(Junsei Chemical, Tokyo, Japan)을 처리하여 실온에서 1시간 고정시켰다. Formalin을 완전히 제거한 다음 \( 60 \% \) isopropanol(Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA)로 헹군 뒤 Oil Red O working solution 을 넣고 실온에서 10 분간 염색을 하였다. 이 때 Oil Red O working solution은 \( 0.35 \mathrm{~g} \) Oil Red O powder(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 \( 100 \mathrm{ml} \) isopropanol에 녹인 뒤 증류수에 \( 6: 4 \)의 비율로 희석한 다음 여과하여 사용하였다. 염색 후 Oil Red O working solution을 완전히 제거하고 증류수로 4 번 washing한 뒤 현미경으로 세포의 염색 상태를 확인하였으며, 흡광도 측정을 위하여 \( 100 \% \) isopropanol에 용출시켜 spectrophotometer를 이용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>RLE의 지방세포 내 triglyceride 축적억제 효과 확인</h2> <p>RLE가 지방세포 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포가 confluent 상태가 된 이후 전체 분화 과정 동안 \( 100-1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 RLE를 함께 처리하여 지방세포 내 triglyceride 축적 정도를 확인하였다. 그 결과 RLE를 처리하지 않고 \( 0.5 \% \mathrm{DMSO} \)를 처리한 대조군의 분화 정도를 \( 100 \% \)로 하였을 때, RLE를 농도별로 처리한 실험군들의 triglyceride의 축적율이 RLE의 농도가 증가할수록 감소하였다(Fig. 2). 그러나, RLE의 농도 100-500 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 효과가 미미하였고, \( 600 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)부터 triglyceride 축적억제 효과가 뚜렷하게 나타나, 최고 농도인 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 대조군에 비해 약 \( 84 \% \)의 triglyceride 축적억제 효능을 나타내었다. 따라서 RLE는 지방전구세포에서 지방세로로의 분화를 억제하는 효능이 높은 것으로 사료되며, 이후 실험은 triglyceride 축적 억제 효능이 뚜렷하게 나타나는 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도의 RLE를 사용하였다.</p> <h2>RLE의 3T3-L1 세포에서의 독성확인</h2> <p>앞서 확인한 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효능이 세포 독성에 의한 효능인지 확인하기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System을 사용하여 세포생존율을 확인하였다. Triglyceride 축적억제 효과가 있는 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 RLE 농도로 세포 생존율을 확인한 결과, RLE 농도 \( 600,700,800,900 \) 그리고 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 각각 \( 99.5 \pm \)\( 4.74,95.6 \pm 4.64,90.35 \pm 6.63,94.06 \pm 2.97,85.59 \pm 4.03 \% \)로 측정되었다(Fig. 3). 따라서 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효과는 3T3-L1에 대한 독성 효과는 아닌 것으로 사료된다.</p> <h2>RLE에 의한 지방세포 분화관련 전사인자의 발현 변화</h2> <p>지방세포의 분화는 peroxisome proliferation activated receptor gamma(\( \mathrm{PPAR} \gamma \)), CCAAT enhancer binding protein \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \) family라고 불리는 전사인자들이 중추적인 역할을 담당하며 다양한 상호작용을 통해 조절된다. 지방세포 유도 복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine)는 이러한 전사인자의 발현을 촉진함으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면 지방세포 분화 관련 전사인자들의 발현 저해를 통하여 지방 세포로의 분화를 억제하고 지방 축적 감소 등을 야기시킬 수 있으므로, 이는 항 비만 물질 탐색의 기작 연구에 가장 많이 쓰이는 방법 중 하나이다. 따라서, RLE에 의한 지방축적 억제 효과가 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자들의 발현 변화와 관련되는지 알아보았다.</p> <p>\( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)는 지방세포의 분화초기에 MDI에 의해 발현되는 단백질로 지방전구세포에 MDI와 RLE를 2일간 복합처리 한 후(Day 2) 세포를 회수하여 단백질 발현 양상을 확인한 결과 RLE를 처리한 실험군의 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 발현량이 대조군 보다 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 또한 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 자극을 받아 발현하는 단백질들로, adipogenesis에서 중요한 transcription factor로 널리 알려져 있고, 지방세포 완전분화의 지표로 사용된다. RLE에 의한 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현량의 변화를 확인하기 위해, MDI와 RLE를 복합 처리하여 2일간 반응시키고, insulin과 RLE를 4일간 복합처리 한 후 단백질 발현 양상을 확인한 결과(Day 6), RLE의 농도 의존적으로 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현이 감소하였다(Fig. 4B). 따라서, RLE는 지방세포의 분화 초기에 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 발현을 저해시킬 뿐 아니라, 이후 분화 전체 단계에서 중요한 역할을 하는 \( \mathrm{PPAR} \gamma \) 및 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현 또한 저해시켜 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로 사료된다. 즉, RLE는 지방세포의 분화를 유도하는 핵심 전사인자들의 발현을 저해하여 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 사료된다.</p>	생명
	<h1>서 론</h1><p>쌀은 동남북아시아 국가에서 주식으로 사용되는 주요 곡물로서 전 세계적으로 5,670만톤이 생산되며, 이중 약 \( 91 \% \)가 아시아에서 생산된다. 쌀의 생산량은 매년 증가하는 추세지만 서구화된 식습관에 의해 밀의 소비량은 증가하는 반면 상대적으로 쌀의 소비량은 낮아지고 이로 인해 잉여쌀로 쌀 가공식품을 개발하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 또한 가공식품 제조 후 생성되는 쌀 가공부산물의 양도 쌀 가공식품의 증가와 함께 늘어나고 있다. Rhee 등은 쌀 부산물을 이용하여 가식성 필름을 제조하였고 Gnanasambandam 등은 쌀 도정 중 부산물로 생성되는 미강으로부터 단백질 농축물을 제조하였으며 Cho 등은 도정 부산물로부터 색소를 분리하거나 떡 고물 및 소를 제작하였다. 과거에는 쌀 단백질을 미강으로부터 알칼리 추출하여 등전점 침지법으로 제조하거나 쌀을 분쇄하여 효소를 사용한 다음 전분질을 제거하는것이 주요 방법이었으나 기능성과 비용적인 문제가 있어서 다른 단백질들에 비해 식품산업에 널리 이용되지 못하고 있다. 쌀 단백질의 새로운 활용방법으로서 Shih는 쌀 가루를 효소 처리하여 전분을 제거함으로써 쌀 단백질 농축물을 제조하여 pullulan과의 혼합 가식성필름을 제조하였다. Park 등은 쌀 부산물을 초미세분쇄/공기분급을 이용하여 특성을 연구하였고, Gnanasambandam 등은 쌀 도정 중 부산물로 생성되는 미강으로부터 가식성 필름을 제조하였으며, Jang 등은 쌀 부산물을 파운드 케이크에 첨가하여 품질특성을 연구하였다.</p><p>이러한 쌀을 효소처리 하여 물엿이나, 엿, 조청 등을 제조하고 부산물이 남게 되는데, 그 양은 하루에 \(25~30 \mathrm{ton} \)으로 아주 많으며 영양적 가치 또한 높아서 폐기처분하지 않고 이들 대부분을 가축사료로 사용하고 있다. 하지만 쌀 부산물을 가축사료로 사용하는 방법 외에도 단백질 등을 추출하여 식품첨가물로써 활용하는 방안이 연구되고 있으며, 특히 쌀로부터 분리한 쌀 단백질은 식물성 단백질의 급원으로서 가장 많이 사용되고 있는 분리대두단백(Soy Protein Isolates, SPI)이나 우유단백(Whey Protein)과 달리 오랫동안 아시아에서 주식으로 사용된 쌀로부터 유래된 단백질로써 알레르기 작용이 거의 없고 필수아미노산이 풍부한 것으로 알려져 있다.</p><p>쌀 시럽박은 당, 지방 등을 소량 함유하고 있지만 단백질과 식이섬유가 주성분을 이루고 있으며 단백질의 함량은 쌀이나 밀, 보리보다 높다. 따라서 쌀 부산물의 식품소재로서의 이용을 위해 Sharif 등은 쌀 부산물을 쿠키에 첨가하여 특성을 연구하였으며, Ghosh 등은 쌀 부산물로부터 산, 알칼리 분해방법을 이용하여 단백질 가수분해물을 추출하여 특성을 연구하였다. 그러나 건물기준 \( 70 \% \) 이상의 단백질 성분을 protease로 단일 혹은 혼합 가수분해하고 그 특성을 조사한 연구는 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 상업적으로 쓰이는 단백질 분해 효소들을 단일 혹은 혼합으로 쌀시럽박에 처리하여 불용성 쌀 단백질을 수용성 단백질로 수용화하고 이렇게 얻어진 가수분해물의 특성과 효소의 혼합에 의한 시너지효과를 연구하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>일반성분 분석</h2><p>시료의 수용성 분획을 제거하기 위해 증류수로 수세를 하였고 수용성 분획의 제거는 수세 횟수에 따른 무게변화를 통해 알 수 있었다. 수세 횟수에 따른 무게 변화는 Fig. 2에 나타내었는데, 쌀시럽박을 4회 이상 수세하여 건조하였을 때 처음무게기준 건물량 \( 68.5 \% \)로써 그 무게 변화가 없는 것을 알 수 있었으며 3회 수세한 쌀 시럽박을 취합하여 건조한 후 이후 실험의 시료로 사용하였다.</p><p>쌀 시럽박의 일반성분을 Table 1에 나타내었다. 쌀 시럽박 내의 수분, 조단백질 및 조지방 함량은 각각 \( 0.62 \% \), \( 71.16 \%\), \(8.13 \% \)이었고 조회분 함량은 \( 0.94 \% \)이었다. 쌀 시럽박의 경우 쌀에 비해 단백질함량이 매우 높은 것을 알 수 있었는데, 이는 효소를 이용하여 쌀의 주성분인 전분을 당화시키는 과정에서 대부분의 전분이 제거되었기 때문에 상대적으로 단백질 함량이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.</p><h2>단일효소 처리</h2><p>단일효소 처리를 하였을 때 세가지 방법으로 측정한 단백질 함량의 변화를 Fig. 3에 나타내었다. Lowry protein assay, Kjeldahl protein assay 및 Gravimetric method를 이용하여 수용성 단백질 생성량의 경향을 비교분석 하였다. 이때 Lowry, Kjeldahl 그리고 Gravimetric method의 경우 Protease N을 처리한 시료는 각각 \( 59.02 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 70.43 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 85.36 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM을 나타내었고 Protease A의 경우는 각각 \( 27.17 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 62.73 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 58.31 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM을 나타내었으며 Protease M의 경우는 각각 \( 57.46 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 53.32 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 80.00 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM을 나타냄으로써 같은 샘플 에서도 측정 방법에 따라 수용성 단백질 함량에 약간의 차이가 있는 것으로 나타났다.</p><p>Lowry protein assay의 경우 Protease N이 가장 큰 분해 정도를 나타내었고 Protease M과 Protease A의 순으로 분해 정도가 큰 것으로 나타났으며, Protease M과 Protease N은 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. Gravimetric method의 경우 Lowry protein assay와 마찬가지로 Protease N이 가장 큰 분해 정도를 나타내었고 Protease M 그리고 Protease A의 순으로 분해 정도가 나타났다. Kjeldahl method의 경우 Protease N이 가장 큰 분해 정도를 나타내었고, Protease A가 두 번째로 큰 분해 정도를 나타내었으며, 다음으로는 Protamex가 높은 분해율을 나타냄으로써 앞의 두 방법의 결과와는 다른 결과를 나타내었다. 3가지 방법에서 모두 효과가 좋았던 Protease N과 Protease A, 그리고 Kjeldahl method에서는 비록 분해율이 떨어졌지만 Lowry와 Gravimetric method에서 분해율이 좋았던 Protease M 이렇게 3가지 단백질 분해 효소의 효과가 좋음을 알 수 있었으며 3가지 효소 중 수용성 단백질 함량이 가장 높았던 Protease N의 경우 Gravimetric method로 측정하였을 때 전체 단백질 중 \( 12 \% \)의 분해율을 나타내었다.</p><p>쌀 시럽박과 유사한 보리 부산물인 맥주박에 protease 처리를 한 Faulds 등의 연구에서는 맥주박에 protease를 사용했을 경우 단백질의 \( 26 \% \)가 분해되어 식품에 상업적으로 쓰이는 protease가 곡물에 있어서는 쌀 시럽박과 마찬가지로 높은 분해율을 나타내지 못하는 것을 보여주었다. 이러한 낮은 분해율은 곡물에 존재하는 다량의 섬유질 중 hemicellulose나 lignin과 같은 물질이 단백질과 complex를 형성하여 효소의 가수분해를 방해하는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 현상의 주요 원인은 섬유질이 효소와 단백질의 binding site에 존재하거나 binding site를 둘러쌈으로써 가수분해를 방해하는 것으로 생각된다. Faulds 등은 이런 단점을 보안하기 위해 맥주박에 carbohydrase와 protease를 혼합하여 처리하였지만 분해율이 크게 증가하지 않는다고 보고하였는데 이는 효소에 의해 분해가 잘 되지 않고 잔존하는 lignin이 다당류와 세포벽에 결합되어 있는 단백질과 지속적으로 결합하여 단백질의 가수분해가 방해를 받기 때문이라고 하였다.</p> <h2>SDS-PAGE analysis</h2><p>Protein sample은 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel을 이용한 Laemmli의 방법에 따라서 전기영동을 하였다. Separating gel은 \( 10 \% \) acrylamide gel을 준비하였고, Running gel은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 1.9 \mathrm{ml}\), \(30 \% \) acrylamidemix \( 1.7 \mathrm{ml}\), 1.5M Tris \((\mathrm {pH} 8.8 \)) \( 1.3 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) SDS \( 0.05 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) ammonium persulfate \( 0.05 \mathrm{ml}\), N, N, N', N'-tetramethylethylenedi-amine (TEMED) \( 0.002 \mathrm{ml} \)의 조성으로 제조하였으며, Stacking gel은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 0.68 \mathrm{ml}, 30 \% \) acrylamidemix \( 0.17 \mathrm{ml} \), \( 1.0 \mathrm{M} \) Tris \( (\mathrm{pH} 6.8\)) \( 0.13 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) SDS \( 0.01 \mathrm{ml}, 10 \% \) ammonium persulfate \( 0.01 \mathrm{ml}\), N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) \( 0.001 \mathrm{ml} \)의 조성으로 제조하였다. Sample은 \(5 \times\) sample buffer [\(60 \mathrm{mM}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer \( (\mathrm{pH} 6.8\)), \(14.4\mathrm{mM}\) \(\beta\)-mercaptoethanol, \(2\%\) (w/v) SDS, \(25\%\) (v/v) glycerol, \(0.1\%\) (w/v) bromophenol blue]와 섞어서 10분간 끓인 다음 \( 12,000 \times \mathrm{g} \)으로 1분간 원심분리 시켜서 충분리를 시킨 후 아래층을 gel에 loading하였다. 전기영동은 \( 150 \mathrm{~mA} \)로 분리했으며, staining buffer (coomassie blue R-250 \( 1.0 \mathrm{~g} \), methanol \( 450 \mathrm{ml}, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \ 450 \mathrm{ml} \), glacial acetic acid \( 100 \mathrm{ml} \) )와 destaining buffer (methyl alcohol \( 100 \mathrm{ml} \), acetic acid \(100 \mathrm{ml}\), \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 800 \mathrm{ml} \) )를 사용해서 염색과 탈색을 하였다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>시료 \( 30 \mathrm{mg} \)을 \( 300 \mu l \)의 \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)에 녹인 후 \( 10 \% \) TCA solution을 \( 1: 1 \)의 비율로 첨가하고 10분간 원심분리 \( (12,000 \times g) \)하여 단백질을 침전 시켰다. 지방을 제거하기 위해 hexane을 \( 1: 1 \)의 비율로 첨가하여 지방을 녹인 후 5분간 원심분리 \( (12,000 \times g) \)를 하고 침전된 침전물을 아미노산 분석시료로 사용하였다. Sample은 \( 0.4 \mu \mathrm{m} \)의 filter로 여과한 후 Amino Acid Analyzer (Hitachi L-8900, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험은 3회 이상 반복 측정하고 SAS V8.02 (SAS Institute, Inc. 2002)를 사용하여 분산 분석 및 Duncan 다범위 검증(Duncan's multiple range test)을 실시하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>쌀 시럽박</h2> <p>본 실험에 사용된 쌀 시럽박은(주)동희(Yongin, Korea)에서 물엿을 제조 후 생성된 부산물을 수거하여 \( -19^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉동 보관하면서 해동하여 사용하였다.</p> <h2>효소</h2> <p>이 실험에 사용된 효소들은 상업적으로 널리 사용되는 Protamex (Novozyme, Bagsvaerd, Denmark), Neutrase (Novozyme), Flavourzyme (Novozyme), Alcalase (Novozyme), Protease M (Amino, Nagoya, Japan), Protease N (Amino), Protease A (Amino) 그리고 Molsin F (Seishin, Noda, Japan) 등 총 8가지의 효소를 구입하여 사용하였다.</p> <h2>시료의 수용성 성분 제거</h2> <p>쌀 시럽박에 존재하는 수용성 단백질을 제거하기 위해 쌀 시럽박 \( 100 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( 400 \mathrm{ml} \)를 가하여 5분간 교반 후 이를 20분간 원심분리\( (3,000 \times g) \)를 하여 얻어진 침전물을 dry oven에 24시간 동안 건조하여 무게를 측정하였다. 증류수를 가하여 수세하는 횟수에 따라 각각 무게를 측정한 후 그 무게의 변화가 없을 때의 시료를 수용성 성분이 완전히 제거된 시료로 결정하여 마쇄한 후 \(40 \mathrm{mesh}\)의 표준체를 통과시켜 이후 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>단일효소 처리</h2> <p>수용성 성분이 완전히 제거된 쌀 시럽박 \( 5 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( (28.3 \mathrm{ml}) \)를 첨가하여 \( 15 \% \) 현탁액 형태로 제조한 후 \(1\ \mathrm{N}\ \mathrm{HCl} \) 혹은 \(1\ \mathrm{N}\ \mathrm{NaOH}\)를 사용하여 기존에 알려진 효소들의 최적 \( \mathrm{pH} \)를 조절하고, 시료의 고형분 대비 \( 0.1 \% \)의 효소를 첨가한 후 각 효소들의 최적 온도에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 현탁액을 20분간 원심분리\( (3,000 \times g) \)하고 이때 얻어진 상등액과 침전물, 그리고 침전물의 건조 후 무게변화를 통하여 생성된 단백질의 양을 비교하였다.</p> <h2>혼합효소 처리</h2> <p>단일효소 처리로 얻어진 결과를 토대로 가장 효과가 좋은 효소인 Protease M (M), Protease N (N) 그리고 Protease A (A)를 각각 다음과 같이 2개 또는 3개의 효소를 4가지의 방법 (M+N, M+A, N+A, M+N+A)으로 흔합하여 단일처리와 같은 방법으로 최적 \( \mathrm{pH} \)와 최적 온도에서 4시간 동안 반응한 후 20분 동안 원심분리\( (3,000 \times \mathrm{g}\))하여 상등액과 침전물을 분리, 분석하였다.</p> <h2>단백질 분석</h2> <p>단백질분석은 총 3가지의 방법으로 분석하였다. 원심분리하여 얻어진 상등액 중의 수용성 단백질은 TP0300- 1KT Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 Lowry protein assay를 통하여 측정하였다. 또한 침전물은 Digester (MBCM12, Raypa, Barcelona, Spain), Distiller (DNP1500, Raypa, Barcelona, Spain)와 Titrater (Akku-drive, Hirschmann Laborgerate, Eberstadtt, Germany)를 사용하여 semimicro-Kjeldahl 법으로 측정하였으며, 무게변화를 통한 불용성 단백질의 변화량을 알아보기 위해 원심분리를 하여 얻어진 침전물을 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)의 Dry oven에서 24시간 건조한 후 처음 시료의 무게와 건조된 침전물의 무게 차이를 이용하여 단백질 변화량을 계산하고 3가지 방법의 값을 비교, 분석 하였다. 이때 각각의 분석방법에 대한 계산식은 다음과 같다.</p> <h3>-Lowry protein assay (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{P \times(28.3+E+C)}{S} \)</p> <ul> <li>P: Protein contents \( (\mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)</li> <li>E: Amounts of enzyme \( (\mathrm{ml}) \)</li> <li>C: Amounts of 1 N NaOH or HCl (\(\mathrm{ml} \))</li> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{~g}) \)</li></ul> <h3>-Semimicro-Kjeldahl (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{1.4 \times T}{S} \times 5.95 \)</p> <ul> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{g}) \)</li> <li>T: Amounts of 0.1 N HCl (\(\mathrm{ml}) \)</li></ul> <h3>-Gravimetric method (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{(S-W)}{S} \times 1,000 \)</p> <ul> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{g}) \)</li> <li>W: Weight of sample after drying (g)</li></ul> <h2>수분함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 시료 \( 2 \mathrm{~g} \)을 Forced convection dry oven (HB-502M, Hanbaek scientific co., Gyeonggi-do, Korea)을 이용하여 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 처리한 후 무게를 측정하여 수분함량을 계산하였다.</p> <h2>조회분 함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)을 Electric muffle furnace (LMF 1200, Carbolite/Sheffield, Hope, England)를 사용하여 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 처리한 후 무게를 측정하여 조회분 함량을 계산하였다.</p> <h2>조지방 함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 Refrigerated circulator (Isotemp 1006p, Pittsburgh, PA, Fisher Scientific, USA)를 사용하여 ether 추출을 하는 Soxhlet extraction을 하여 조지방 함량을 계산하였다.</p> <h2>혼합효소 처리</h2><p>단일 효소처리를 하여 가장 높은 분해율을 나타낸 Protease M, Protease N 및 Protease A 세가지 효소 중 두가지 혹은 세가지 모두를 혼합하여 쌀 시럽박의 단백질을 분해한 결과 단일에서 가장 효과가 좋았던 Protease N과 3가지 효소 모두 혼합한 것을 비교하였을 때 Lowry protein assay의 경우 단일처리 한 것은 \( 59.02 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, 혼합의 경우 \( 75.96 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이며, Gravity method는 단일처리 한 것은 \( 85.36 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, 혼합의 경우 \( 147.51 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이다. Kjeldahl 의 경우는 단일처리 한 것은 \( 70.43 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이고, 혼합의 경우 \( 93.80 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM 으로 모든 방법에서 효소를 혼합하였을 때 상승효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 단일 처리에서 가장 분해능력이 높았던 Protease N에 비하여 효소들을 두 개씩 혼합하여 단백질을 분해하여도 이들 간의 유의적인 차이가 인정되어 상승효과가 뚜렷했음을 알수 있었다. 이는 쌀 시럽박의 불용성 단백질 중 분해가 가능한 부분이 Protease N에 의해 완전히 분해되지 못하고 남은 단백질들이 다른 효소들에 의해 분해가 일어나기 때문으로 판단된다. 특히 상업적으로 사용되는 protease의 경우 크게 endo- 혹은 exo- 형태이며 서로 분해할 수 있는 아미노산이 틀리므로 Protease N이나 Protease M 혹은 Protease A가 각각 분해를 하지 못했던 아미노산을 분해하여 상승효과가 생긴 것으로 생각된다. Treimo 등의 실험에서도 쌀 시럽박과 유사한 부산물인 맥주박에 carbohydrase를 혼합하여 처리하였는데 protease와 마찬가지로 단일 처리하였을 때 보다 상승효과가 있는 것으로 나타났다. 이는 곡물의 탄수화물의 경우 당뿐만 아니라 cellulose, hemicellulose, lignin 등이 존재하여 carbohydrase가 혼합이 될수록 cellulose 혹은 lignin 등이 분해되어 상대적으로 단백질의 노출부분이 증가되고 효소가 반응할 수 있는 표면적이 증가하여 이런 상승효과를 나타낼 수 있는 것으로 알려졌다. 또한 protease는 각각 가수분해 할 수 있는 고유의 특정 아미노산이 있는데 이러한 특정 아미노산이 곡물에 풍부하면 protease의 가수분해 효과가 증가하는 것으로 알려져 있다.</p><h2>효소에 의해 분해된 단백질의 특성</h2><p>효소를 이용하여 분리한 단백질의 특성을 확인하기 위하여 단일효소를 사용한 경우 수용성 단백질을 가장 많이 생성한 Protease M, Protease N, Protease A와 혼합효소에서 가장 효과가 좋았던 Protease M+Protease N+Protease A를 선택하여 SDS-PAGE를 하였다. 효소처리를 한 모든 시료에는 어떠한 밴드도 형성이 되지 않는 것을 확인할 수 있었는데(data not shown), 이것은 쌀 시럽박에 존재하는 단백질이 \( 15\ \mathrm{kDa} \) 이하의 작은 크기의 polypeptide 혹은 amino acid의 형태로 분해가 된 것을 의미한다. Treimo 등이 연구한 맥주박의 경우도 protease를 맥주박에 처리 하였을 경우 분자량이 \( 10\ \mathrm{kDa} \) 미만의 polypeptide와 같은 물질들이 나타났고 대부분의 단백질은 \( 1\ \mathrm{kDa} \) 미만의 작은 peptide나 amino acid의 형태로 분해가 되는 것을 알 수 있었다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>단백질 분해 효소로 처리한 쌀 시럽박의 수용성 성분에 존재하는 아미노산의 조성을 분석한 결과를 Table 2에 나타내었다. 효소를 단일 혹은 혼합처리 하였을 때의 아미노산 조성은 특정 패턴을 보이지 않았으며 쓴맛을 유발하는 아미노산인 Leucine, Isoleucine, Valine, Phenylalanine, Arginine의 함량이 높은 것으로 보아 샘플의 쓴맛이 강할 것이라고 예상된다. 필수 아미노산인 Phenylalanine, Valine, Leucine, Isoleucine 등의 함량은 일반 쌀에 비해 높게 나타내었으며 특히 곡물의 제 1 제한 아미노산인 Lysine의 경우 효소의 종류에 따라 그 값의 차이가 있었지만 Protease M의 경우 일반 쌀에 비해 높은 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히 총 아미노산 함량의 경우 Protease M을 단일 처리하였을 때와 3가지 효소를 혼합하였을 때의 값이 비슷함을 확인 할 수 있었는데, 이는 Protease M의 경우 단백질을 분해할 때 peptide와 amino acid를 동시에 생성하고 자신이 생성한 peptide를 또다시 amino acid로 분해하는 특성을 가지고 있으므로 이러한 특징으로 인해서 효소를 혼합하였을때와 그 값이 비슷한 것으로 판단된다. 한편 효소처리 후 생성된 총 단백질 함량은 효소를 혼합할수록 증가하였지만 아미노산 함량은 단일과 비교하였을 때 비슷한 결과를 나타내었는데 이것 또한 Protease M의 특성으로 인해서 기인된 것으로 판단되며 상대적으로 효소를 혼합할수록 아미노산으로 분해되지 못한 polypeptide가 단일 처리에 비해 다량 존재할 것으로 생각된다.</p>	생명
CoCl2 처리로 유도된 hypoxia상태에서 세포자살과 ER stress에 관련된 인자의 발현	<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양</h2><p>PC12 cell를 \( 10 \% \) 마혈청과 \( 5 \% \) 우혈청(GIBCO)을 포함하고 있는 RPMI 1640 (JBI)배지 내에서 배양하였다. 배양조에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 이산화탄소, 그리고 충분한 습한 조건으로 \(2-3\)일 간격으로 배지를 교체하며 배양하였고, 1주일에 한번씩 계대배양하였다. 실험에 사용한 세포는 현미경하에서 \( 70-80 \% \) 정도의 세포 충실도를 보이는 것을 사용하였다.</p><h2>Hypoxia 및 ER stress 유도</h2><p>Hypoxia 유도약물 처리는 각각의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) (0.1 mM, Sigma), DFA \( (0.4 \mathrm{mM} \), Sigma)를 12시간 배양세포에 처리하였으며, ER stress 유도약물은 3시간 동안 tunicamycin ( \( 2 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} ; N \) 당 쇄형성 억제, Sigma)을 배양세포에 처리함으로써 유도하였다.</p><h2>Total RNA 분리</h2><p>각각의 실험별로 처리된 PC12 세포를 cold PBS로 한번 세척해 낸 후, RNA isolation reagent (TRI-REAGENT)을 \( 500 \mu l \) 넣고 2~3분 지난 후 scrapper로 긁어 모아 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 넣고 \( 100 \mu l \)의 chloroform을 첨가하여 충분히 섞어준 다음 \( 12,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 동안 원심분리 하였다. \( 500 \mu l \)의 상등액을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropanol 넣고 상온에서 10분 정도 처리한 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 10분 동안 원심분리하고 tube의 바닥에 얻어진 pellet에 \( 75 \% \) ethanol을 초기 RNA isolation reagent 양과 동일한 \( 500 \mu l \) 넣고 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 5분 동안 원심분리하여 최종적으로 total RNA를 얻었다. Total RNA는 DEPC가 처리된 sterilized distilled water에 녹여서 자외선 분광계로 정량하여 이후의 실험에 사용할때까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보존하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>Total RNA \( (3 \mu g) \)를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 가열하여 변성시킨후, ice에서 5분 이상 급랭하였다. \( 3 \mu l \)의 \( 5 \times \) RT buffer, \( 2.5 \mu l \)의 dNTP mixture (\( 2.5 \mathrm{mM} \) each), \( 0.6 \mu l \)의 oligo-dT (300ng), 1.6 U의 RNase inhibitor, 200 U의 reverse transcriptase(M-MLV)를 가하고, 총 반응액이 \( 15 \mu l \)가 되도록 조절한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 그리고 \( 30 \mu l \)의 DEPC가 처리된 증류수를 첨가하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 반응하여 spin down하였다. 이렇게 얻은 cDNA에 \( 35 \mu l \)의 DEPC가 처리된 증류수를 가하여 최종 \( 50 \mu l \)를 만들고, cDNA를 증폭하기 위하여 \(2 \times \) Dyemix (Enztnomics)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 denaturation, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초 ex-tension한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 final extension하여 30회 반복시키는 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR을 수행한 primer는 table 1로 정리하였다. PCR 산물 \( 3 \sim 5 \mu l \)를 \( 2 \% \) agar-ose gel 상에서 전기영동시킨 후 밴드를 확인한 후, TOMOROScopeEye 3.5 프로그램을 이용하여 PCR band를 정량화하여 그래프로 나타내었다. XBP1의 PCR 증폭 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 denaturation, \( 68^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 ex-tension한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 final extension하여 35회 반복시켰다. 이 후 PCR 산물 중에 \( 5 \mu l \)를 취하여 \( 1 \mu l \)의 \(10 \times \) restriction buffer와 5 U의 PstI 제한효소(Takara, Japan)를 가하여 총 반응액 \( 10 \mu l \)가 되도록 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후, \( 2 \% \) agarose gel에서 전기영동 시키고 UV 상에서 밴드를 확인하였다.</p><h2>Westem blot</h2><p>Protein electrophoresis kit (ATTO Co., Japan)를 사용하여 \( 12 \% \) SDS-PAGE에 준비된 sample을 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 transfer kit (Bio-RAD, USA)를 사용하여 gel의 protein을 PVDF cell membrane (PALL corporation, USA)에 transfer buffer (\( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( 150 \mathrm{mM} \) glycine, \( 20 \% \) meth-anol, \( \mathrm{pH} \) 8.3))를 사용하여 transfer하였다. Transfer가 끝난 후membrane을 PBST (PBS, \( 0.0.5 \% \) Tween 20)와 \( 5 \% \) skim milk를 사용하여 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. Blocking이 끝난 후 1차 반응 시킬 때에는 PBST와 \( 5 \% \) skim milk에 \(1:500\sim1:2,000\)의 비율로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 membrane을 PBST로 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 2차 항체를 반응 시킬 때에는 PBST에 \( 1: 2,000 \)의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응 시켰으며, 반응이 끝난 후 mem-brane을 PBST로 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 West save (Lab Frontier, Korea)을 사용하여 발색반응을 유도한 후 X-ray film에 감광하여 결과를 분석하였다.</p><h2>Hoechst 33342 staining</h2><p>각각의 실험별로 처리된 PC12 세포를 찬 PBS로 세 번 세척해 낸 후, \( 4 \% \) paraformaldehyde로 실온에서 30분간 고정하였다. 다시 PBS로 10분씩 세 번 세척해 낸 후, \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 Hoechst 33342 solution (Invitrogen)을 PBS에 \(1:1,000\)으로 희석하여 실온에서 10분간 암처리하여 염색하였다. 염색이 끝난후 PBS로 10분씩 세 번 세척한 후에 형광현미경(OlympusIX71)을 이용하여 핵의 파편화를 관찰하였다.</p>	생명
양식장 배출수 퇴적층에서 분리된 미생물의 다당분해효소 활성 및 특성	<h1>요 약</h1> <p>제주도 양식장 배출수 퇴적층에서 다당 분해효소를 생산하는 세균을 분리되었으며, 각각 ST-63, ST-140라고 명명하였다. 분리균주 ST-63의 16S rDNA의 염기서열 분석 결과 Bacillus amyloliquefaciens와 Bacillus velezensis의 염기서열과 \(99 \% \)의 상동성을 보였으며, BIOLOG를 이용한 생화학적 분석에서도 Bacillus amyloliquefaciens와 가장 유사한 특성을 보여 최종적으로 분리균주 ST-63을 Bacillus sp. ST-63으로 명명하였다. 또한 분리균주 ST-140의 16S rDNA의 염기서열 분석 결과 Pseudoalteromonas marina와 Pseudoalteromonas agarivorans의 염기서열과 \(99 \% \)의 상동성을 보였으며, BIOLOG를 이용한 생화학적 분석에서도 Pseudoalteromonas 종과 유사한 특성을 보여 최종적으로 분리균주 ST-140을 Pseudoalteromonas sp. ST-140이라고 명명하였다. 다당 분해효소 생산 균주인 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 증식을 위한 최적 배양온도를 확인하고 증식온도에 따른 다당 분해효소 활성의 변화를 조사하였다. 그 결과 균주 Bacillus sp. ST-63 는 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구 보다 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구에서 가장 높은 균 생육도를 보였으며, 효소활성에 대한 영향을 확인해본 결과 \( 20 \) ~ \(40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 모든 실험구에서 24시간 이후 매우 높은 활성을 보이는 것으로 나타나서 본 균주는 효소활성의 생산에 있어서 온도에 매우 민감하게 작용하지 않는 것으로 나타났다. 또한 Pseudoalteromonas sp. ST-140 균주는 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구보다 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구에서 가장 높은 균 생육도를 보였으며, 효소활성에 대한 영향을 확인해본 결과 \( 20 \sim 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구 모두에서 24시간을 기준으로 효소활성이 계속적으로 증가하였으며, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양 실험구에서는 배양 시간 96시간에도 높은 효소활성을 보이는 것으로 나타났다. 그리고 분리균주가 배지의 초기 \( \mathrm { pH } \)에 따른 효소활성의 변화를 확인하기 위하여 \( \mathrm { pH } 4 \sim 10 \)범위의 배지를 사용하여 조사하였다. 그 결과 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140 균주 모두다 비슷한 결과를 보였으며, \( \mathrm { pH } \)6을 기준으로 효소활성이 급격히 증가하다가 7~8에서 최고 활성을 보였다. 차후 분리균주의 효소생산을 위한 최적배양조건 및 물질분리 방법을 통하여 미생물 유래의 효과적인 효소를 생산하는 기술을 개발할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>다당분해 효소 생산 미생물의 분리 및 동정</h2> <p>다당분해 효소를 생산 하는 미생물을 분리하기 위하여 총 200여 균주를 대상으로 실험해본 결과 colony 주변위에 \( 0.2 \% \)\((\mathrm{W}/\mathrm{V})\) KI-I2용액으로 염색하여 clear zone이 생기는 균주만을 amylase 분해능이 있는 균주로 확인되어, 총 10균주를 선별하 였으며, 이들 중 가장 amylase 활성이 좋은 균주를 선정하여 각각 ST-63, ST-140라 명명하였다.</p> <p>분리된 효소생산 균주의 생화학 특성을 조사한 결과를 Table 1, Table 2에 나타내었다. 분리균주 ST-63은 \( \beta \)-cyclodextrin, dextrin, tween 40, glycogen, arbutin, D-cellobiose, D-fructose, genfiobiose, maltose, maltotriose, D-mannitol, D-mannose, palatinose, D-psicose, salicin, D-sorbitol, sucrose 및 turanose, 등의 탄수화물이 대사됨을 확인하였다. 또한 분리균주 ST-140은 dextrin, glycogen, arbutin, D-cellobiose, D-fructose, gentiobiose, \(\alpha\)-D-glucose, palatinose, D-sorbitol, thymidine 등의 탄수화물이 대사됨을 확인하였다. 최종적으로 분리균주 ST-63은 BIOLOG 분석 결과에서 Bacuillus amyloiquefaciens 균주와 가장 유사한 생화학적 특성 을 보이는 것으로 나타났으며,분리균주 ST-140은 Alteromonas sp. 종들과 Pseudoalteromonas marina의 생화학적 특성이 가장 유사하게 나타났다. 분리균주의 확실한 동정을 위해서 16S ribosomal DNA 염기서열 분석을 실시하였으며, 분리균주 ST-63, ST-140의 계통학적 분석결과를 Fig. 2, Fig. 3에 나타내 었다. 일반적으로 리보솜 RNA (rRNA)는 전 생물에 보편적으로 존재하는 보존성이 높은 핵산분자이며, 미생물의 진화계 통의 연구에 가장 유용한 분자마커로 이용되고 있다. 특히 범용성이 높은 분자는 small subunit rRNA (AAU rRNA)로서 분류에 이용되는 16S 및 16S유사(18S) rRNA가 이에 속한다. 현재 미생물의 분류체계는 SSU rRNA의 정보를 근거로 재구축되어 있으며, 이 방법은 미생물 분류학에 필수적인 것으로 인식되기에 이르렀다. 특히 미지의 분리균주의 계통학적 위치를 알기위한 최초의 실험단계에서 SSU rRNA 분석은 필수적이다.</p> <p>분리균주 ST-63, ST-140의 16S rRNA PCR 증폭을 통해 얻은 염기서열을 National Center Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 수행한 결과 균주 ST-63은 Bacillus velezensis FJ426275, Bacillus amyloliquefaciens NC009725 균주와 유전적 \(99\%\) 상동성을 보였으며, 분리균주 ST-63을 BIOLOG의 생화학적 분석 결과 및 염기서열 분석결과를 종합했을 때 Bacillus sp.로 동정 되었으며, 최종적으로 Bacillus sp. ST-63으로 명명하였다. 또한 분리균주 ST-140의 염기서열 분석결과 Pseudoalteromonas marina FJ200648, Pseudoalteromonas agarivorans FJ200640 균주와 \( 99 \% \)의 상동성을 보였으며, 최종적으로 BIOLOG의 생화학적 특성 및 염기서열 분석결과를 기초로하여 Pseudoalteromonas sp. ST-140으로 명명하였다. 또한 분석된 염기서열 데이터들은 Genbank에 각각 등록한 후, 분리균주 Bacillus sp. ST-63는 FJ595989, Pseudoalteromonas sp. ST-140은 FJ595990으로 Accession number를 부여받았다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주의 선별</h2> <p>본 연구에 사용된 균주는 제주도 양식장(표선, 성산) 배출수연안에 형성된 퇴적층으로부터 분리되었으며, 멸균된 모종삽을 이용하여 멸균 위생팩에 시료를 넣고 채집 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하면서 실험실로 운반하여 실험에 이용하였다. 채집된 퇴적층 \( 1 \mathrm{g} \)를 멸균해수 \( 9 \mathrm{ml} \)에 넣고 충분히 섞어준 후, 이 시료를 원액으로 10의 지수로 희석한 후, 각각의 멸균된 배지에 \( 100 \mu \mathrm{l}\)씩 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 배양하였다.</p> <p>종속영양세균의 분리 및 배양은 marine agar (MA; Difco. Co. USA)배지, 성장속도가 느린 세균의 배양은 R2A agar (Difco. Co. USA) 배지, 영양이 풍부한 일반적인 배지로 일반 세균의 배양을 nutrient agar (NA; Difco. Co. USA)배지, 효모, 곰팡이 또는 내산균의 배양은 YM agar (Difco. Co. USA) 배지를 사용하여 균주를 분리하였다.</p> <h2>Amylase 생산 미생물 분리</h2> <p>높은 다당 분해효소를 생산하는 균종을 분리할 목적으로 연안 퇴적층에서 분리된 200 균주를 이용하여 다당 분해능 측정 실험에 이용하였다.</p> <p>본 실험의 경우 soluble starch (Difco. Co. USA) \( 1 \% \)를 첨가한 NA (nutrient agar)배지를 멸균해수를 이용하여 제조한 후, 각각의 분리된 균종을 백금이를 이용하여 도말하고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)배양기에서 48시간 동안 배양한 후, 배지에 \( 1 \mathrm{M} \) 요오드용액을 떨어뜨려 전분이 가수분해 되어 투명환(clear zone or halo)을 보이는 균주를 분리하여 본 연구에 이용하였다. 또한 본 균주 의 보관을 위하여 멸균된 glycerol stock solution을 사용하여 냉동 보관하였으며, 실험은 전분분해능의 활성유지를 위해 \( 1 \% \) soluble starch가 첨가된 NA배지에서 계대 배양하면서 실험에 이용하였다.</p> <h2>분리균주의 생화학적 특성 분석</h2> <p>분리균주의 생화학적 특성 분석은 \(3\%\)로 \( \mathrm{KOH} \)를 이용하여 간이그람동정을 한 후, Biolog사(BIOLOG Inc., USA)의 GN2, GP2 plate를 이용하여 95가지의 기질이용 특이성을 시험하였 으며, 분석은 MicroLog \(^{TM}\) system (release 4.05) program을 이용하였다.</p> <p>순수 분리된 균주를 BUGM (Biolog Inc., USA) 사면배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양 한 후, 현탁하여 탁도계(Biolog 21907, USA)를 이용하여 균주 현탁액을 각각 GP의 경우 \( 20 \% \), GN의 경우 \(52 \sim 59\%\)가 되도록 조절한 후 GP2와 GN2 micro olate의 각 well에 \( 150 \mu \mathrm{l} \)씩 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양 후, 보라색을 발색되는 well을 양성으로 판정하였다.</p> <p>이때 현탁액은 \( \mathrm{NaCl} ~150 \mathrm{g}\), \(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 51 \mathrm{g}\), \(\mathrm{KCl} 3.7 \mathrm{g} \)을 증류수 \( 912 \mathrm{ml} \)에 녹인 MCS stock solution 을 증류수로 10 배 희석한 후, 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>16S ribosomal DNA 염기서열 분석</h2> <p>분리 균주의 동정을 위해 16S ribosomal DNA 염기서열을 이용하였으며, 16S rDNA 유전자 단편을 PCR 반응으로 증폭하여 염기 서열을 결정하였다. PCR 반응에 사용된 primer는 27F (forward primer; AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)와 1492R (reverse priver; GGTTACCTTGTTACGACTT)을 사용 하였고, ABI 3730XL capillary DNA sequencer를 이용하여 sequencing 분석을 하였으며, 염기조성, 상호비교(pairwise comparisons)를 위한 염기치환 양상, codon usage 및 각 개체 - 개체군의 유전자 차이는 MEGA 3.0 프로그램으로 계산되었으며, 미생물 군집 분석에 이용된 계통수는 distance 방법으로 MEGA 3.0 프로그램의 pair-distance를 이용하여 작성하였다. 결정된 염기서열을 NCBI BLAST를 이용하여 Genbank에 보고된 균주와의 상동성을 조사하였으며, Genbank에 분리균주의 유전자 염기서열을 등록한 후, Accession number를 각각 부여 받았다.</p> <h2>다당분해 효소 생산 미생물의 온도별 생육도 및 amylase 활성 측정</h2> <p>Amylase 활성이 확인된 균주를 MB broth (Difco. Co. USA) 에 배양 후, 각각의 시간대별로 균주 배양액을 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 취하여 분광광도계를 이용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 각각의 성장도를 측정하였으며, 분리균주의 증식과 amylase 생산의 최적 조건을 알기 위하여 증식 온도와 초기 배지의 \( \mathrm{pH} \)에 변화를 주면서 효소활성을 조사하였다. 기본배지로 MB broth를 사용하였으며, 배양온도를 \( 20 \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 각각 액체 배양하였다. 초기 배지의 \( \mathrm{pH} \)는 4~10 까지 조성하여 실험을 수행하였다.</p> <p>선별된 균주는 MB broth(Difco, USA)에 배양 후, 시간대별로 배양액을 \(9,600 \times \mathrm{g}\)에서 3분간 원심분리하여, 상등액을 조효소액으로 사용하였다.</p> <p>분리된 균주의 amylase 활성은 \( 1 \% \) soluble starch \( 0.1 \mathrm{ml} \)에 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시킨 후, 생성된 환원당을 DNS법을 변형하여 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도에서 당 분해능을 측정하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>일반적인 육상 양식시설은 넓은 부지와 다량의 해수를 이용 한 사육방식이기 때문에 유지 관리 차원에서 비경제적이며, 배출수는 그 수량이 막대하고, 오염물질 배출농도의 변화폭이 대단히 크다는 점 등의 제한요인들에 의하여 기존의 통상적인 물리·화학적, 생물학적인 폐수처리공법의 도입이 거의 불가능한 특성을 가지고 있다. 또한 양식장이 해안가를 중심으로 넓게 분포하고 있다는 점은 국내외를 불문하고 많은 연구자들의 표준적인 처리법 개발에 걸림돌이 되고 있어 이에 대한 방안이 시급한 실정이다. 이러한 취지에서 이들 배출수의 관리 방안 연구는 절실히 요구된다.</p> <p>또한 배출물 오염을 저감시키기 위한 별도의 처리 방법이 확립되어있지 않을 뿐만 아니라 이러한 배출물을 이용한 사료 등의 재활용에 있어, 아직 안전성에 대한 검토가 전무한 실정이다. 따라서 양식장 배출수에 존재하고 있는 유기물 성분들은 일차적인 해안에 퇴적층을 이루며 환경적인 문제점을 일으키고 있기 때문에 이에 대한 환경친화적인 처리 방안이 절실하다. 미생물을 이용한 오폐수처리는 일본에서 처음 시도되었으며, 국내에서는 양식장 베출물의 제거를 위한 여과장치의 개발 및 순환여과식 양식법 개발에 따른 수질관리기술 확립과 관련된 연구들이 보고되고 있다. 일반적으로 육상 양식장의 대부분의 배출물은 양식어류가 섭이하고 남은 잔류 생사료이며, 탄수화물, 지방, 단백질 함량이 높은 것이 특징이다. 따라서 이러한 유기물들을 효과적 및 친환경적으로 분해할 수 있는 미생물 자원의 개발이 필요하다.</p> <p>Glucose 중합체인 starch는 가장 널리 이용되는 식물체의 탄수화물로서 amylase는 이러한 starch를 분해하는 효소이다. Amylase는 \( \alpha \)-amylase, \( \beta \)-amylase, glucoamylase와 isoamylase 로 크게 구분할 수 있는데 \( \alpha\)-amylase (endo- amylase) 는 amylose나 amylopectin의 \( \alpha \)-1,4결합을 무작위로 가수분해 하여 dextrin을 형성하고 \( \alpha \)-amylase의 계속적인 작용에 의해 maltose, maltotriose, maltotetraose 등의 oligosaccharide를 형성한 뒤 glucose와 maltose로 분해하는 효소이다. \( \beta \)-amylase (exo-amylase)는 starch의 비환원성 말단으로부터 maltose 단위로 가수분해하는 효소로서 \( \alpha\)-1,6결합을 포함하는 dextrin을 형성한다.</p> <p>Gluconamylase는 starch에 작용하여 amylose와 amylopectin의 \(\alpha\)-1,4, \(\alpha\)-1,6결합을 가수분해하여 glucose를 생성하는 당화효소이며, isoamylase는 starch의 \( \alpha\)-1,6 결합에만 작용하는 효소이다. 이러한 전분의 분해에 관련하는 효소는 효모, 곰팡이, 세균, 맥아 및 동물체내에 널리 존재한다.</p> <p>본 연구에서는 제주도 육상수조양식장의 밀집지역의 배출 수 배출 지역을 중심으로 퇴적층 분해에 관련된 미생물을 탐색하여 amylase 활성을 측정하였으며, 활성이 강한 균주를 선별하여 amylase의 생산을 위한 조건을 검토하였다. 또한 차후 미생물의 생태적 지위를 파악하여 환경적 및 산업적인 이용가능성을 확인하고자 본 연구를 수행하였다.</p> <h2>배양 온도 및 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 균체증식 및 효소 활성의 영향</h2> <p>분리 균주 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 증식을 위한 최적 배양온도를 확인하고 증식온도에 따른 다당분해 효소 활성의 변화를 조사하였으며, 이를 위하여 배양 온도를 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 배양하여 균체의 증식과 분비되는 다당분해 효소의 활성을 조사하였다.</p> <p>Bacillus sp. ST-63은 초기 배양온도가 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 10시간의 유도기를 거친 후, 대수기로 접어들어 24시간대에 가장 높은 미생물 성장을 보였으며, 24시간 이후에는 정체기를 거쳐 사멸기에 접어드는 것으로 나타났다. 하지만, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 유도기가 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 6시간 지속된 반면, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 이보다 짧은 3시간으로 나타났다. 대수증식기의 경우 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)배양에서는 24시간대에 가장 높은 증식을 보인 후, 바로 정체기와 사멸기를 거친 것으로 나타난 반면, \(30^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우, 30시간대에 최대의 증식을 보였으며, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 다른 온도의 배양보다는 더욱 빠른 대수기를 진행하였으나, 결론적으로 최대 증식량은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양보다 떨어지고 대수기는 길게 나타났다.</p> <p>Pseudoalteromonas sp. ST-140은 배양온도가 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 36시간의 유도기를 거친 후 대수기로 접어들어 48시간대에 최대 증식량을 보인 후 바로 정체기 없이 사멸기로 접어들었다.</p> <p>\( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우, 6시간의 유도기를 거친후 대수증식기로 접어들고 48시간대에 최대 증식량을 보였다. 반면, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양과 비슷한 시간대에 대수증식기에 접어들었으나 최대 증식량은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양에 비하여 현저히 낮은 증식량을보였다.</p> <p>분리균주 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 각각의 온도별 증식 속도 및 증식에 따른 효소활성의 변화를 Fig, 6~7에 나타내었다.</p> <p>균주 Bacillus sp. ST-63의 경우 Fig. 6와 같이 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양에서는 시간의 흐름에 따라 amylase 활성이 시간이 흐름에 따라 점차적으로 증가하는 양상을 나타내었으나, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 최초 3시간에도 amylase 활성이 나타남을 확인 할 수 있었다. 이는 Bacillus sp. ST-63균주의 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 유도기가 거의 없이 바로 대수 증식기로 접어드는 양상을 보였기 때문인 것으로 사료된다. 또한 전체적으로 배양온도에 따라서 \( 20 \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \) 모든 실험구에서 24시간 배양 후, 최대 효소활성을 보였으며, 배양일수가 길어저도 효소활성이 거의 떨어지지 않는 것으로 확인되어, 본 균주가 온도에 대한 효소활성에 크게 민감하게 작용하지는 않는 것으로 사료 된다. 그리고 균주가 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \)에 따른 효소활성을 조사하기 위하여 \( \mathrm{pH} 4 \sim 10 \)범위의 배지를 사용하여 조사하였다. 초기 \(\mathrm{pH} 4 \)인 배지에서는 균체의 증식을 관찰 할 수 없었으며, \( \mathrm{pH} \)6인 배지에서부터 왕성하게 증식이 이루어져 \( \mathrm{pH} 7 \) 배지에서 가장 높은 효소활성을 보였다.</p> <p>또한 균주 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 경우 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 시간의 흐름에 따라 amylase 활성의 차이는 있었으나, 활성의 점진적으로 증가하는 양상을 보인 반면, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 12시간 까지는 효소활성의 거의 없다가 24시간대에 들면서 급격한 효소활성을 보이면서 96시간까지 지속적인 높은 활성을 보였다. 이는 대수증식기를 거쳐 최대 증식시간과 비슷한 양상으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 그리고 모든 실험구에서 배양시간 24시간을 기준으로 효소활성이 증가하는 것을 보였으며, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \(40^{\circ} \mathrm{C} \)실험구에서는 배양시간 96시간에도 높은 효소활성을 보이는 것으로 나타났다. 그리고 Pseudoalteromonas sp. ST-140균주 또한 배지의 초기\( \mathrm{pH} \)에 따른 효소활성을 조사하기 위하여 \( \mathrm{pH} 4 \sim 10 \)범위의 배지를 사용하여 조사하였으며, 초기 \( \mathrm{pH} 4 \)인 배지에서는 균체의 증식 및 효소활성을 거의 관찰 할 수 없었으며, \( \mathrm{pH} \)6인 배지에서부터 왕성하게 증식이 이루어져 \( \mathrm{pH} 8 \)배지에서 가장 높은 효소활성을 보였다.</p>	생명
인진쑥 첨가사료를 급여한 흑우육의 이화학적 품질특성	<h2>관능 특성 및 통계처리</h2> <p>관능 특성은 전공 교과목을 이수한 식품전공 대학 및 대학원생 남 3명, 여 7명의 20 27세 10 명을 평가원으로 하였다. 평가원은 개인용 검사대에서 각각의 관능특성 평가를 평가원 1인이 무작위로 배치된 2개의 시료를 평가하도록 하였다. 평가원들은 실험 시작 전 5 회 물로 입을 가시도록 하였고, 시료를 평가하는 사이마다 정수된 물로 입을 가시도록 하였다. 생육은 색깔 및 냄새를, 가열육은 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 종합적인 기호도에 대하여 가장 좋다(like ex-tremely)를 7점, 가장 나쁘다(dislike extremely)를 1점으로 하는 7점 채점시험으로 하였다. 각 실험은 3 회 이상 반복 측정한 후 SPSS 14.0 (statistical package for social sci-ence, SPSS Inc., Chicago II., USA)을 사용하여 통계처리 하였으며, 각각의 시료에 대하여 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다. 각 시료에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 \( p<0.05 \) 수준에서 Student's t-test를 실시하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>흑우육의 catechin 함량</h2> <p>인진쑥 첨가 사료를 급여한 흑우육(treatment)과 첨가하지 않고 급여한 흑우육(control)의 카테킨 함량을 실험한 결과는 Table 2와 같다. 흑우육의 총 cathechin 함량은 대조군 및 급여 군이 각각 \( 0.262 \) 및 \( 0.379 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 이고, epicatechin 함량은 각각 \( 0.042 \) 및 \( 0.059 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 으로 급여군의 catechin 및 epicatechin 함량이 대조군보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \).</p> <h2>흑우육의 \( \mathrm { pH } ,VBN 함량, TBARS, 전자공여능 및 총균수</h2> <p>인진쑥 첨가사료 급여가 도축 후 3일 저장한 흑우육의 \( \mathrm { pH } \), VBN함량, TBARS, 전자공여능 및 총균수에 미치는 영향을 실험하고 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 대조군 및 급여군의 \( \mathrm { pH } \), VBN 함량 및 총균수는 인진쑥의 급여에 의한 유의한 차이가 없었다. 그러나 TBARS는 대조군 및 급여군이 각각 \( 0.132 및 0.117 \mathrm { mg } \mathrm { MA } / \mathrm { kg } \) 이고, 전자공여능이 각각 \( 34.40 \% 및 36.57 \% \) 로 TBARS는 대조군이 높았고, 전자공여능은 급여군이 유의하게 높았다 \( (p \times 0.05) \).</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>인진숙 TMR사료 제조 및 흑우 사육조건</h2> <p>인진쑥은 수분함량이 \( 40 ~ 50 \% \) 되도록 자연건조한 후 \( 10 \sim \) \( 12 \% \) 까지 열풍 건조하여 얻어진 건초를 사용하였다. 건조한 인진쑥은 수분 \( 10.70 \% \), 조단백 질 \( 9.48 \% \), 조지방 \( 2.05 \% \), 조회분 \( 4.89 \% \), 조섬유 \( 38.04 \% \), 총 열량이 \( 8,188 \mathrm { kcal } / \mathrm { kg } \), 그리고 cat-echin 함량은 \( 1.257 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 함유하였다. 인진쑥 TMR사료는 비 육한우 영양 요구량에 맞도록 제조하였으며, 인진쑥 첨가량은 예비 사양시험에서 우수한 결과를 얻은 배합비율로 하였는데, 대조군(control)은 인진쑥을 첨가하지 않았으며, 급여군 (treatment)은 인진쑥을 비육중기에 \( 4.6 \% \), 비육후기에 \( 6.5 \% \) 를첨가 급여하였다. 흑우는 24-25개월 사육된 평균체중 \( 350 \mathrm { kg } \) 의 거세흑우 10 두 (대조군과 급여군 각각 5 두)를 공시하였다. 예비사양 1 개월과 본 사양 12 개월(비육중기 6개월, 비육 후기 6개월)로 총 13 개월간 사양시험을 하였다. 도축할 때의 평균 생체중은 대조군 \( 660 \mathrm { ~kg } \), 급여군 \( 670 \mathrm { kg } \) 이었고, 평균 도체중은 대조군 \( 365 \mathrm { kg } \), 급여군 \( 375 \mathrm { kg } \) 이었다. 사양관리는 서귀포의 \( \mathrm { S } \) 흑우 시험목장의 사육방법에 의하였다. 육질분석용 시료의 채취는 도축 후 12 시간, \( 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 예비 냉각한 지육에서 등심부위 전체를 분할하여 진공 포장한 것을 제주동물산업연구기술센타에서 공급 받아 실험실로 이동하고, 도축 후 3 일이 될 때까지 \( 3 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 냉장한 후 실험에 이용하였다.</p> <h2>카테킨 함량</h2> <p>플라스크에 흑우육 \( 5 \mathrm { g } \) 과 더운물 \( 80 \mathrm { ml } \) 를 가한 다음 \( 85 ^ {\circ } \mathrm { C } \) water bath에서 3 시간 가온 추출하였다. 플라스크를 실온에서 식히고 물로 나머지 표선을 맞춘 용액을 감압농축하여 HPLC (HPLC 1100 series, Agilent, California, USA)로 분석하였다. 분석조건은 mobile phase \( 0.05 \% \) acetonitrile, flow rate \( 1.5 \mathrm { ml } \), detector는 UV detector (280 nm), column temp. \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 그리고 column은 C18이었다.</p> <p>고기의 보수력은 근원섬유, 세포막, 근속 사이에 수분을 저장할 수 있는 능력을 말하며 연도와 관련이 있다. 고기의 보수력에 영향을 미치는 요인으로서는 동결, 근내지방도 및 성숙도, 도체등급, pH 등이 있다. 보수력은 감량에 영향을 미치는데, 보수력이 높으면 감량이 낮아지는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서 대조군과 급여군의 보수력에 차이가 없어서 감량의 차이도 없었으며, 급여 사료가 보수력과 감량에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 감귤부산물의 급여가 한우육의 보수력에 영향을 미치지 않았다는 Yang 등의 결과와 무화과 발효물의 급여가 가열감량에 영향을 미치지 않았다는 Kook과 Kim 의 결과와 일치하는 경향이었다.</p> <p>기계적 조직감으로 표현되는 경도(hardness)는 물질을 \( 50 \% \) 변형에 도달하기 위하여 필요한 힘을, 탄성(springiness)은 외부의 힘으로 형성된 변형이 힘을 제거하였을 때 원상 복구하는데 필요한 힘을, 응집성(cohesiveness)은 식품의 몸체를 이루는데 필요한 내부의 결합 정도를, 검성(gumminess)은 삼킬수 있을 정도로 단단한 상태의 것을 반고체 상태로 분해하기 위하여 필요한 에너지를, 저작성(chewiness)은 단단한 상태의 것을 삼킬 수 있을 정도로 분쇄하는데 필요한 힘을 나타낸다. 본 연구에서 대조군의 탄성이 급여군보다 높은 것은 Moon과 Jung 의 결과와 유사하였다. 그리고 대조군과 급여군의 전단력에 차이가 없는 것은 Kim 의 티머시 건초조사료의 급여가 전단력에 영향을 미치지 않았다는 결과와 유사하였다. 기계적 조직감이나 전단력은 근내지방도, 성숙도, 육질등급 등에 따라서 달라진다는 Kang 등 및 Lee 등의 결과를 볼 때 인진쑥의 급여가 흑우육의 기계적 조직감이나 전단력에 영향을 미치지 않으며, 흑우의 유전적 조건,사양방법, 성별, 연령, 등급 등이 복합적으로 작용하여 나타난 결과로 사료된다.</p> <p>본 연구에서 인진쑥을 급여한 급여군과 대조군의 생육 및 가열육의 관능특성에 유의한 차이가 없었는데, 이것은 쑥을 급여한 한우육의 생육 색깔 및 향이 대조군보다 우수했다는 Moon과 Jung 의 결과와 쑥의 급여가 가열육의 맛과 전체적인 기호도를 향상시켰다는 Moon 등의 결과와는 다르게 나타났다. 고기의 기호성은 근육 내에 존재하는 ATP 관련 화합물, 유리아미노산, 유리지방산, 유산, 당, peptide 등이 복합적으로 작용하여 나타나며, 향기는 휘발성 물질들이 영향을 미치며 이러한 현상들은 품종, 연령, 성별, 사료 등에 영향을 받는다.</p> <p>이상의 결과에서 알 수 있었던 것은 인진쑥의 급여가 근육내 catechin류의 축적으로 흑우육의 지방산화를 억제하고 적색도를 향상시키면서 전단력이나 관능특성에 나쁜 영향을 미치지 않는 것이었다. 따라서 흑우는 그 자체만의 희귀성으로 브랜드화가 가능하지만 여기에 인진쑥의 급여로 고품질의 기능성 흑우육의 생산이 가능하며, 우리나라 산야 어느 곳에서나 쉽게 구할 수 있는 인진쑥이 천연사료로서의 가능성이 있는 것으로 생각된다.</p> <h2>보수력 및 감량측정</h2> <p>보수력은 Hoffman 등의 방법에 따라 데시케이터에서 습기를 제거한 여과지 위에 시료 \( 0.3 \mathrm { g } \) 을 올려놓고, planimeter (X-plan, Ushikata 360d II, Yokohama, Japan)로 눌러 여과지 위에 나타난 수분의 면적을 구하고 육의 표면적을 수분의 면적으로 나눈 값으로 표시하였다. 흑우육의 동결감량은 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(30 \) 일 동안 동결하였을 때 동결 전후의 무게 차이, 해동감량은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(20 \) 시간 동안 해동하였을 때 해동 전후의 무게 차이, 열탕 가열감량은 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 끓는 물속에서 고기의 중심온도 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 가 되게 가열하였을 때, 팬 가열감량은 \( 150 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 프라이팬 위에서 중심온도 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 가 되게 가열하였을 때 가열 전후의 차이를 각각 백분율로 나타내었다.</p> <h2>조직감 profile측정</h2> <p>조직감은 근섬유와 평행하게 가로, 세로, 높이를 각각 \(40 \) , \(15 \) 및 \( 5 \mathrm { ~mm } \) 로 자르고 rheometer (CR-200D, SUN Scientific Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 경도(hardness), 탄성(springiness), 응집성(cohesiveness)은 round adapter 25번을 이용하여 table speed \( 120 \mathrm { ~mm } / \mathrm { min } \), graph interval 30 \( \mathrm { m } / \mathrm { sec } \), load cell (Max) \( 2 \mathrm { kg } \) 의 조건으로 측정하였다. 검성 (gumminess)은 peak max \( \times \) cohesiveness 값으로, 저작성 (chewiness)은 (peak max \( \div \) distance) \( \times \) cohesiveness \( \times \) spring-iness값으로 나타내었다. 전단력(shear force)은 전단력용 칼날 (angle adapter 10 번)을 이용하여 table speed \( 120 \mathrm { ~mm } / \mathrm { min } \), graph interval \( 30 \mathrm { ~m } / \mathrm { sec } \), load cell (Max) \( 10 \mathrm { kg } \) 의 조건에서 측정하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>우리나라에서 사육되고 있는 한우는 털의 색을 기준으로 황갈색의 한우, 황색바탕에 흑색 호반 무늬를 띄는 칡소(호반우), 그리고 흑색의 흑우로 구분하고 있다[. 이중 제주도에서 사육되고 있는 흑우는 외형은 황우와 비슷하지만 체형이 작고 털의 색깔이 전반적으로 흑색을 나타낸다. 세종실록 기록에 의하면 흑우는 고려시대부터 왕실에 진상될 만큼 우수하였으나 현대에 와서 양질의 고기를 생산할 목적으로 오랫동안 반복된 개량으로 잡종화되어 순수 흑우의 사육두수가 현저하게 줄면서 멸종위기에 처하자 1992년 이후 엄격하게 제주도외의 반출을 통제하고 혈통보전 및 복원사업을 추진하고 있다. 이러한 사업의 일환으로 흑우의 대량 증식을 위한 연구들이 일부 이루어지고 있지만 흑우의 육질분석을 통한고급화 및 브랜드화에 대한 연구는 찾아 볼 수 없다. 최근 우리나라는 농축산물 수입개방 시대를 맞아 가격 경쟁력을 갖춘 고품질의 축산물을 생산해야 한다. 흑우의 경우 국내 소비자들에게는 물론 국제 경쟁력을 갖춘 상품으로 개발될 수 있는가능성이 있다. 따라서 사양관리 방법 개선과 기능성 부여 등 흑우고기의 고급화를 위한 많은 연구가 이루어져 흑우고기에 대한 많은 정보들이 축적되어야 한다.</p> <p>한우는 식이를 통한 고품질의 식육을 얻기 위하여 다양한 연구들이 수행되고 있으며, 그 중에서도 천연의 식물 도는 그 부산물을 급여함으로서 고품질의 기능성 식육 생산 가능성을 모색하고 있다. Lee는 마쇄보리를 배합사료에 \( 10 \% \) 첨가한 경우 한우 등심의 근내지방도, 등심 단면적, 육질등급 및 명도가 높아진다고 하였고, Kang 등은 옻나무 \( 4 \% \) 를 급여한 경우 보수력 및 색택이 향상되었다고 하였으며, Kook과 Kim은 무화과 발효물 \( 10 \% \) 를 급여한 경우 연도 및 맛 개선효과가 있었다고 보고하였다. 그리고 Kim 등은 두충 잎을 \( 5 \sim 10 \% \) 급여한 경우 육질개선 효과가 있었으며, Yang 등은 감귤박을 비육중기 \( 6 \% \),비육후기 \( 2 \% \) 급여한 경우 육질, 저장성, 기호성 등이 개선된다고 하였다.</p> <p>인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.)은 우리나라 산야에 자생하는 다년생 초본식물로 어디에서든 쉽게 구할 수 있는 흔한 약용식물이며, scopoletin, 6,7-dimethylesculetin, phenol, ca-pillarisin, caffeic acid, chlorogenic acid, cresols, eugenol, eth-ylphenols 등 다양한 종류의 생리활성 물질을 함유하고 있다 . 인진쑥은 독성이 없어서 가공식품의 주원료 및 기능성 식품의 원료로 사용이 가능하며, 한우의 사료에 첨가하여 이화학적 품질 특성에 대한 연구도 일부 시도되고 있다. Kim과 Jung은 인진쑥의 첨가급여로 비육한우의 육질등급이 높아졌다고 하였으며, Moon과 Jung은 인진쑥의 급여로 지방산화 억제 및 보수력 개선으로 고품질 한우 생산의 가능성을 제시하였다. 따라서 본 연구는 인진쑥에 함유된 쓴 맛의 alkaloid 성분으로 인하여 흑우의 기호성을 저하시키는 원인을 제거하기 위하여 완전 흔합 사료인 TMR (total mixed ration) 사료를 개발하였다. 그리고 인진쑥 TMR사료를 흑우에게 급여하고 그 고기의 이화학학적 품질특성을 검토하였으며, 아울러 인진쑥을 급여하지 않고 배합사료로 사육한 흑우와 품질을 비교하여 차별화된 고품질의 기능성 흑우육생산의 기초자료로 이용하고자 하였다.</p> <h2>흑우육의 표면색깔</h2> <p>Table 4 는 흑우육 표면의 명도( \( \left ( \mathrm { L } ^ { * } \right ) \), 적색도(a) 및 황색도(b)를 나타낸 결과이다. 혹우육의 \( \mathrm { L } ^ { * } \) 및 \( \mathrm { b } ^ { * } \) 값은 두 시료 사이에 유의한 차이가 없었다. 그러나 a은 급여군이 대조군보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \)</p> <h2>흑우육의 보수력 및 감량</h2> <p>인진쑥 첨가사료 급여가 흑우육의 보수력, 동결감량, 해동 감량 및 가열감량에 미치는 영향을 검토하고 그 결과를 Table 5 에 나타내었다. 대조군 및 급여군의 보수력, 동결감량, 해동 감량 및 가열감량은 유의한 차이가 없었다.</p> <h2>흑우육의 조직감 profile</h2> <p>흑우육의 기계적 조직감으로 측정한 경도, 탄성, 응집성, 검성, 저작성 그리고 연도를 측정하기 위한 전단력의 결과는 Table 6 과 같다. 대조구 및 급여군의 경도는 각각 \( 5.02 및 6.18 \) \( \mathrm { g } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \), 검성은 \( 316.63 및 450.05 \mathrm { ~kg } \) 으로 급여군의 경도 및 검성이 대조군 보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \). 탄성은 대조군 및 급여군이 각각 \( 80.02 \% \) 및 \( 72.37 \% \) 로 대조군이 급여군보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \). 그러나 응집성, 저작성 및 전단력은 대조군과 급여군 사이에 유의한 차이가 없었다.</p> <h2>흑우육의 관능특성</h2> <p>인진쑥 첨가사료가 흑우육의 관능특성에 미치는 영향을 파악하고자 생육의 색 및 향, 그리고 가열육의 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 전체적인 기호성을 실험하고 그 결과를 Table 7에 나타내었다. 생육의 색 및 향은 대조군 및 급여군 사이에 유의한 차이가 없었으며, 열탕 가열육 및 가열 팬 위에서 가열한 대조군 및 급여군 사이에도 관능특성의 유의한 차이가 없었다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>우리나라는 오래 전부터 축산물 시장의 전면적인 개방에 대응하기 위하여 다각적인 준비를 해왔다. 그 중 한 가지가 특별한 사료 급여체계에 의한 표준모델을 정하고, 표준모델에 따라 소를 사육하여 균일한 품질의 소고기를 생산하기 위한 브랜드화다. 이를 위하여 많은 연구자들이 식이에 다양한 천연자원을 첨가 급여하는 연구를 수행하고 있으며, 우리나라 제주도에서 사육하고 있는 흑우도 모색이 특이하여 브랜드화의 대상이 되고 있다. 특히 본 연구는 흑우에게 인진쑥 TMR사료를 급여하고 이화학적인 품질특성을 파악하여 고품질의 브랜드육을 생산하기 위한 기초자료를 얻기 위하여 수행하였다. 인진쑥은 쓴맛의 alkaloid 가 있어서 소에게 인진쑥만 급여할 경우 잘 먹지 않는 경우가 있다. 따라서 배합사료와 함께 섞은 TMR 사료를 급여하여 인진쑥만 선택적으로 거절할 수 없도록 하였다.</p> <h2>\( \mathrm { pH } \) 측정</h2> <p>흑우육의 \( \mathrm { pH } \) 측정은 대기온도에서 \( \mathrm { pH } 4.0 \) 과 7.0 buffer로 보정한 유리전극이 부착된 \( \mathrm { pH } \) meter (ATI Orion 370, Pennsylvania, USA)를 이용하여 측정하였으며, 시료는 분쇄한 후 \( 10 \mathrm { g } \) 을 취하여 증류수 \( 40 \mathrm { ml } \) 와 함께 균질한 후 측정하였다.</p> <h2>VBN 함량</h2> <p>흑우육의 VBN (volatile basic nitrogen) 함량은 Conway unit를 이용한 미량확산법에 의하여 측정하였다. 즉 시료 \( 2 \mathrm { g } \) 에 증류수 \( 16 \mathrm { ml } \) 와 \( 20 \% \) perchloric acid \( 2 \mathrm { ml } \) 를 넣고 균질화 한 후 \( 3,000 \mathrm { rpm } \) 에서 15 분 동안 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 상층액 \( 1 \mathrm { ml } \) 와 \( 50 \% \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 1 \mathrm { ml } \) 를 Conway unit 외실에 넣고, 내실에는 \( 10 \% \) 봉산흡수제 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 80분 동안 방치한 다음 \( 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 로 적정하고 다음 식에 의하여 구하였다.</p> <p>VBN \( ( \mathrm { mg } \%) = 0.14 \times \frac { ( \mathrm { b } - \mathrm { a } ) \times \mathrm { f } } {\mathrm { W } } \times 100 \times \mathrm { d } \) a: 공시험 \( 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 적정량 \( ( \mathrm { ml } ) \) \( \mathrm { b } \) : 시료의 \( 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 적정량 \( ( \mathrm { ml } ) \) \( \mathrm { W } : \) 시료 채취량 \( ( \mathrm { g } ) \) \( \mathrm { f } : 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 역가 \( \mathrm { d } \) : 희석배수</p> <h2>TBARS 측정</h2> <p>TBARS (2-thiobarbituric acid reactive substances)는 흑우육 \( 5 \mathrm { g } \) 을 3 배의 증류수로 균질한 다음 여과하여 얻은 여액 \( 1 \mathrm { ml } \)에 \( 7.2 \% \) BHT (dibutylhydroxy toluene) 50 씨를 넣고 산화반응을 정지시켰다. 반응 혼합물 \( 2 \mathrm { ml } \) 에 TBA \( 2 \mathrm { ml } \)를 가하여 혼합한 후 꿇는 물에서 15 분간 가열하고 냉수에 식힌 다음 \( 2,000 \times g \) 로 원심분리시켜 상층액을 \( 531 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 공시료는 시료 대신 증류수를 이용하여 같은 방법으로 측정하였다. TBARS는 홉광도 수치에 \( 5.88 \) 을 곱하여 계산한 후 시료 \( \mathrm { kg } \) 당 반응물 \( \mathrm { mg } \) malonalde-hyde로 계산하였다.</p> <h2>DPPH radical에 대한 전자공여능 측정</h2> <p>흑우육의 항산화력은 DPPH (1,1-dephenyl-2-picrylhy-drazyl) free radical에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA \%)으로 나타내었다. 즉 시료 \( 5 \mathrm { g } \) 을 취한 후 \( 0.1 \) \( \mathrm { M } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } 7.4 \) )를 \( 4 \) 배 첨가하여 homo-genate 분획으로 하고, \( 13,000 \times g \) 로 \( 15 \) 분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 DPPH free radical 활성측정의 시료 추출물로 사용하였다. DPPH free radical에 대한 전자공여능 측정에 사용된 DPPH 시약은 \( 59 \mathrm { mg } \) 을 정확히 취하여 ethanol 11 에 녹여 사용하였다. 일정 농도의 시료에 DPPH를 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 넣어 혼합하고 실온에서 \(30 \) 분 방치한 다음 ice bath 상에서 반응을 종료시키고 \( 520 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>\( \begin {array} { l } \mathrm { EDA } \% \text { (electron } \\ \text { donating ability) } \end {array} = \frac {\text { 대조군 흡광도-Sample 흡광도 } } {\text { 대조군 흡광도 } } \times 100 \)</p> <p>인진쑥을 첨가한 흑우육의 총 catechin과 epicatechin 함량이 대조군보다 유의하게 높았는데, 이것은 Moon과 Jung 이 한우에게 인진쑥을 급여하였을 경우 대조군보다 급여군의 총 catechin과 epicatechin 함량이 높았다는 결과와 일치하는 경향이었다. 특히 catechin류는 epicatechin, epi-catechin gallate, epigallocatechin, epigallocatechin gallate 등 이 있으며, 이들은 강한 항산화 작용이 있어서 인진쑥을 급여하여 생산된 소고기는 catechin류들이 가지고 있는 항산화 효과를 나타낼 수 있기 때문에 매우 의미가 있는 결과이다.</p> <p>흑우의 \( \mathrm { pH } \) 측정은 인진쑥의 급여로 인하여 근육의 사후변화에 영향을 미치는 가를 알아보기 위하여 실시하였다. 그 결과 대조군과 급여군 사이에는 \( \mathrm { pH } \) 의 차이가 없었으며, Kim 등이 쑥을 급여한 한우육의 저장 3일 후 \( \mathrm { pH } \) 가 \( 5.36 \sim 5.40 \)이 고, 쑥의 급여가 \( \mathrm { pH } \) 에 영향을 미치지 않았다는 결과와 일치하는 경향이었다. 그러나 Moon과 Jung 은 쑥을 급여한 한우육의 대조군과 급여군의 \( mathrm { pH } \) 가 각각 \( 5.67 및 5.85 \) 이고, 쑥의 급여로 \( \mathrm { pH } \) 가 높아졌다는 결과와는 차이가 있었다. VBN함량 에 대한 결과에서 Moon 등은 쑥 급여에 의한 대조군 및 급여군이 각각 \( 6.59 및 5.18 \mathrm { mg } \) \%로 쑥 급여에 의하여VBN 함량이 낮아졌다는 결과와는 상이하였으나 Moon과 Jung 이 쑥의 급여가 VBN함량에 영향을 미치지 않았다는 결과와 유사하였다. 그리고 총균수도 대조군과 급여군 사이에 차이가 없었다. 따라서 인진쑥의 급여가 단백질 부패와 미생물의 성장에 대하여 영향을 미치지 않았다. 한편 인진쑥의 급여로 TBARS가 낮고, 전자공여능이 높은 것은 Table 2 의 인진쑥에 함유된 catechin류가 근육에 축적되어서 항산화 작용을 나타낸 결과로 예측된다. 이러한 결과는 인진쑥의 급여가 전자공여능을 높게 하였다는 Moon 등의 결과와 감귤 부산물을 급여한 한우육의 TBARS가 대조군보다 낮았다는 Moon 등의 결과와 유사한 경향이었다.</p> <p>고기의 색깔은 관능적인 품질평가 수단으로 중요하게 인식되고 있다. 고기의 색깔인 적색은 myoglobin의 화학적 상태 즉, deoxymyoglobin, oxymyoglobin, metmyoglobin의 비율에 따라 선호도가 결정되고, 이들의 비율이 명도 \( ( \mathrm { L } ) \) ), 적색도 \( ( \mathrm { a } ) \) ), 황색도 \( ( \mathrm { b } ) \) )에 영향을 미친다. 그리고 고기의 적색은 산화에 의하여 변색이 되면 metmyoglobin의 농도가 높아져서 암갈색을 띄게 되는데, 적색의 산화는 지방의 산화와 함께 진행하게 된다. 따라서 인진쑥을 급여한 흑우육의 적색도가 대조군보다 높은 것은 Table 2 및 3 의 결과에서 인진쑥의 catechin이 근육에 축적되고, 이로 인하여 산화가 억제되어 나타난 결과로 사료된다.</p>	생명
Multiplex PCR을 이용한 생물방제균 Bacillus subilis AH18의 토양내 Genetic Monitoring	<h2>Multiplex PCR의 template DNA 준비.</h2><p>B. subtilis AH18의 chromosomal DNA 분리는 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN Inc., U.S.A.)를 사용하였다. Colony-PCR시 주형은 본 균주를 nutrient broth에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양 후 원심분리하여 균체만 모아 멸균 증류수로 2회 세척 하여 멸균증류수로 일정량 희석하여 사용하였다. 토양권역별 monitoring을 위한 template DNA는 토양 내에서 PowerSoil \( ^{\text {TM }} \) DNA Kit(Mo Bio Laboratories, Inc., U.S.A.)를 이용하여 DNA를 분리하여 사용하였다. Rhizosphere구는 근권, 즉 식물뿌리에 묻어있는 흙에서 DNA를 분리하였으 며, non-rhizosphere구는 hizosphere 이외의 식물뿌리로부터 근권영역의 2배 가량 떨어져 있는 상부와 뿌리 하부위치의 훍에서, endophytic구는 식물뿌리에 묻은 흙(rhizosphere)을 멸균 증류수로 2회 수세 후 식물뿌리를 마쇄한 후 동일한 kit를 이용하여 template DNA를 분리하였다.</p><h2>Monitoring을 위한 PCR primer 및 multiplex PCR 조건</h2><p>PCR용 primers는 Table 2에 나타내었으며, B. subtilis의 genomic sequences들을 기초로 제작하였다. 각 primer들 은 B. subtilis AH18이 생산하는 것으로 확인된 auxin의 방출에 관여하는 auxin efflux carrier (aec), siderophore의 생합성에 관여하는 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy benzoate dehydrogenase[EC:1. 3. 1. 28] gene (sid) 그리고 cellulase structure gene (cel)의 유전자를 포함하게 제작하였다. Multiplex PCR 용 Taq DNA polymerase는 Prime Taq DNA polymerase(Genet Bio Co., Ltd., Korea)를 사용하였으며, PCR 조성은 template DNA \( 2 \mu \mathrm{L} \)에 \( 10 \times \) reaction buffer \( 5 \mu \mathrm{L} \), 각각의 \( 10 \mathrm{pM} \) primer \( 1 \mu \mathrm{L} \), dNTP \( (10 \mathrm{mM}) 3 \mu \mathrm{L} \), Taq DNA polymerase \( (5 \mathrm{unit} / \mu \mathrm{L}) 0.5 \mu \mathrm{L} \)와 멸균증류수 \( 33.5 \mu \mathrm{L} \) 를 가하여 총 final volume \( 50 \mu \mathrm{L} \) 가 되도록 하였다. PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 5분(pre-denaturation) 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 60초(denaturation), \( 60^{\circ} \mathrm{C}\) 60초(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 90초(polymerization), 29 cycle를 수행 한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 5분(post-polymerization)을 행하였다.</p><h2>Gene cloning, DNA sequencing 그리고 상동성 확인</h2><p>각각의 PCR fragment들의 cloning방법은 우 등의 방법과 동일하게 실시하였다. 형질전환 후 선별배지에 도말하여 white-colony를 분리하였으며, 분리된 균주를 colony PCR을 통해 형질전환 균주를 선발하였나. 형질전환 균주에서recombinant plasmid를 정제 후 Solgent Co., Ltd. Korea 사에 의뢰하여 sequencing 하였으며 sequencing 결과는 NCBI의 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 에서 blast 및 blastx를 통해 비교 확인하였다. 그 결과는 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)에 등록하였다.</p> <h2>Bacillus spp.에서의 primers 특이성 확인</h2><p>Bacillus spp. 에 해당되는 11 종의 균주를 한국농업미생물 생물자원센터 (KACC, http://kacc.rda.go.kr/)에서 분양받아 제작된 3종의 primers를 대상으로 PCR 및 mutiplex PCR을 수행하였다. 11종의 균주에서 chromosomal DNA 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 위와 동일한 방법으로 수행하였다. 뿐만 아니라 11종의 균주를 대상으로 auxin, siderophore, 그리고 cellulase의 생산을 확인하였다. Auxin 생산은 정 등의 방법 즉, L-tryptophan \( 0.1 \% \) 를 첨가한 King's B broth( \( 2 \% \) proteose peptone No.3, \( 0.15 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.15 \% \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1.5 \% \) glycerol, \( \mathrm{pH}~ 7.2 \))에 전배양액을 \( 1 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3일간 배양한 후 배양상등액 \( 1 \mathrm{~mL} \)에 Salkowski시약 \( \left(0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~1 \mathrm{~mL}\right. \) in \( 35 \% \mathrm{~HClO}_{4} \) \( 50 \mathrm{~mL})\) \(2 \mathrm{~mL}\)를 첨가하고 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 \( 535 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 확인하였다. Siderophore는 CAS(chrome azurol S) blue agar와 CAS liquid assay로 확인하였으며, cellulase는 위와 동일한 방법인 Congo red plate방법과 DNS 방법으로 확인하였다.</p><h2>일반토양에서 multiplex PCR을 통한 B. subtilis AH18의 monitoring</h2><p>일반토양 \( 200 \mathrm{~mL} \)를 이용해 pot에 고추를 이식 후 B. subtilis AH18의 균체를 멸균증류수에 현탁하여 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \) 관주하였으며, 대조구는 B. subtilis AH18을 처리하지 않았다. 7일간 매일 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 멸균증류수를 주면서 관찰하였으며, 그 후 식물체를 뽑아 rhizosphere과 non-rhizosphere을 \( 125 \mathrm{mg} \)씩 혼합하여 PowerSoil \( { }^{\mathrm{TM}} \) DNA Kit(Mo Bio Laboratories, Inc., U.S.A.)를 사용해 total DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 template DNA로 사용하여 PCR 및 multiplex PCR을 수행 후 B. subtilis AH18을 확인하였다.</p><h2>B. subtilis AH18의 처리 농도별 monitoring 민감도 확인</h2><p>B. subtilis AH18의 토양내 monitoring 민감도 확인을 위하여 일반토양 \( 250 \mathrm{mg} \)에 B. subtilis AH18의 균체 \( \left(1.8 \times 10^{7}\right. \) cfu)를 10배씩 희석하여 접종하였으며, 이를 24시간 후 위와 동일한 방법으로 토양내 total DNA를 분리하였다. 그리고 이를 대상으로 PCR 및 multiplex PCR을 수행하여 monitoring을 위한 민감성을 확인하였다. B. subtilis AH18 의 균체 수 확인은 접종하여 남은 균체를 nutrient agar에 희석 도말하여 확인하였다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 분포확인</h2><p>토양내 B. subtilis AH18의 분포를 확인하기위해 뿌리내 부 내생부위(endophytic), 근권(rhizosphere), 그리고 비근권 (non-rhizosphere)로 구분하여 확인하였다. 고추를 일반토양을 이용하여 위와 동일한 방법으로 이식하였으며, B. subtilis AH18을 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \)로 관주처리 하였으며, 20일간 매일 \(10 \mathrm{mL} \)의 멸균증류수를 주면서 관찰하였다. 그 후 endophytic, rhizosphere, 그리고 non-rhizosphere로 구분하여 DNA를 분리하였으며, 이를 template DNA로 PCR 및 multiplex PCR 을 수행하여 B. subtilis AH18의 토양내 분포위치를 확인하였다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 기간별 monitoring</h2><p>일반토양에 처리된 B. subtilis AH18의 우점능 기간을 확인하기위해 위와 동일한 방법으로 고추를 이식하였으며, B.subtilis AH18를 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \)를 처리하여 7일 주기로 5주간 rhizosphere의 토양을 분리하여, total DNA를 분리 후 PCR 및 multiplex PCR을 통해 B. subtilis AH18의 우점능 기간을 확인하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 유전자</h2><p>본 연구에 사용된 균주는 정 등에 의해 분리, 선발된 식물성장촉진호르몬인 auxin과 식물병원성진균의 생육을 억제하는 siderophore 그리고 식물병원성 진균의 세포벽을 융 해하는 cellulase를 동시에 생산하는 plant growth promoting rhizobacterium(PGPR)인 Bacillus subtilis AH18을 사용하였다. PCR로 증폭된 유전자의 cloning용 host cello은 Escherichia coli DH5를 사용하였으며, 유전자 cloning 및 DNA sequencing용 vector는 pUC 18,19 vector를 이용하였다. 사용한 균주 및 plasmid는 Table 1과 같다.</p><h2>균주의 배양 및 배지</h2><p>B. subtilis AH18의 배양조건 확인은 nutrient medium (Difco Co. U.S.A.)을 사용하였으며, 액체배양은 전배양액을 \( 0.1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 160 \mathrm{rpm} \)으로 24시간 진탕배양 하였고, 균주 보존용 고체배양은 nutrient agar에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 24시간 배양하였다. E. coli의 배양은 LB(LuriaBertani) medium(Difco Co. U.S.A.)을 사용하였으며, 형질 전환 시 heat shock 후 유도배양에 사용한 배지는 SOC medium(tryptone \( 2 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 0.5 \mathrm{~g}, 1 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} 1 \mathrm{~mL} \), \( 1 \mathrm{~M} \mathrm{~KCl}~0.25 \mathrm{~mL} \), filter-sterilized \( \mathrm{Mg}^{2+} \) stock( \( 1\mathrm{M} \mathrm{~MgCl}_{2} \)\( \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1 \mathrm{M} \mathrm{~MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) ) \( 1 \mathrm{~mL} \), filter-sterilized \( 2 \mathrm{M} \) glucose \( 1 \mathrm{~mL} \), total \( 1 \mathrm{~L} \) )을 사용하였다. 액체배양은 전배양액을 \( 0.1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 160 \mathrm{rpm} \) 으로 24시간 진탕배양 하였고, 균주 보존용 고체배양은 LB agar에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 24시간 배양하였다. 형질전환 균주의 배양 및 보관은 LB agar에 ampicillin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)이 첨가된 배지를 사용 하였다.</p><h2>식물 및 토양</h2><p>본 연구에 사용한 식물로는 고추(Capsicum annuum L., 부촌-Seminis Korea Co., 오륜-Seoul Seed Co.)을 이용하였으며, 고추 이식용 pot는 흥농 3공 컵 포트 \( (90.0 \times 90.0 \times 70.0 \) \( \mathrm{mm} \))를 사용하였다. 생물방제력 확인을 위한 식물이식용 토양은 TKS2(Floragard, Germany)를 autoclave( \( 121^{\circ} \mathrm{C}, 30\)분) 하여 사용하였으며, monitoring을 위한 식물이식용 토양은 경산지역의 경작지 밭 토양을 그대로 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>B. subtilis AH18의 PCR fragment 및 sequencing</h2><p>B. subtilis AH18의 chromosomal DNA를 정제하여 이를 주형으로 Pfu DNA polymerase를 이용해서 PCR을 수행하였으며, 그 결과 약 \( 800 \mathrm{bp}\)(sid), \(1.0 \mathrm{~kb}\(aec),\( 1.6 \mathrm{~kb}\)(cel)의 fragment를 확인하였고, 각 fragment를 insert로 pUC 18,19 vector를 이용해서 host cell인 E. coli DH5a에 cloning하였으며, 그 결과 recombanant DNA pSH \(7\)(pUC \( 19+ \) sid product), pAL \(5\)(pUC \( 18+ \)aec product), pCM \(4\)1(pUC \( 18+\) cel product)를 획득하였다.</p><p>각각의 recombinant plasmid를 정제하여 sequencing한 결과 sid\((794 \mathrm{bp}\)), ae\((1,062 \mathrm{bp})\), cel\((1,582 \mathrm{bp}) \)의 sequences를 확인하였으며 NCBI의 Genbank에 등록하였다(Genbank accession sid: No. EF408238, aec: No. EF408239, cel: No. blastx를 통해 비교한 결과 sid gene는 B. subtilis의 siderophore의 생합성 key enzyme인 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy benzoate dehydrogenase [EC:1. 3. 1. 28]에 \( 97 \% \)의 상동성을 나타내었으며(data not shown), aec gene는 B. subtilis의 auxin efflux carrier와 \(99\%\), B. licheniformis ATCC 14580의 auxin efflux carrier와 \( 77 \% \)의 상동성을 나타내었고(data not shown), cel gene는 Bacillis spp. 들이 생산하는 cellulase와 \( 98 \% \)이상 일치하였다. 본 연구에 사용된 primer들을 이용하여 PCR을 수행 후 agarose gel 상에서 확인하면, \( 794 \mathrm{bp}\), \(1,062 \mathrm{bp} \) 및 \( 1,582 \mathrm{bp} \)의 PCR products를 확인할 수 있으며, 이는 siderophore, auxin 및 cellulase의 생산하는 B. subtilis AH18이 존재함을 토양 내에서 그 고유의 특정유전자들을 확인함으로써, 미생물제제로 투여한 미생물의 토양내 존재를 간접적으로 나타내는 결과이다.</p><h2>Multiplex PCR을 통한 B. subtilis AH18의 확인</h2><p>B. subtilis AH18의 PCR을 통한 monitoring을 위해 합성된 primers들로 PCR을 수행하여 확인하였으며, 이들 3종의 primer들을 동시에 넣은 multiplex PCR법으로 3종의 유전자와 동일한 위치의 triplex band를 확인하였다. 이는 별개의 유전자를 각각 PCR하는 대신에 동일시간 동일 공간 내에서 동시에 PCR 함으로써 한번의 PCR로 간편하고 정확하게 B.subtilis AH18과 같이 토양 내 투입된 특정미생물을 손쉅게 확인가능하다는 것을 의미한다. 뿐만 아니라 B. subtilis AH18을 cell 그대로 PCR의 template로 사용 시 multiplex PCR을 통해 비교한 결과 DNA를 template로 사용한 PCR 경우와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 이 방법은 미생물의 template DNA를 정제하는 비용과 시간을 많이 줄여 효율적으로 PCR을 이용해 환경내 미생물을 신속하고 간편하게 검출하는데 많은 활용될 것이다. Multiplex PCR은 PCR에 비해 특정 유전자를 동시에 증폭함으로써 다른 미생물로 인한 비 특이적 증폭을 배제할 수 있으며, triplex band의 동시 증폭만이 토양내 B. subtilis AH18의 존재를 확인 할 수 있었다.</p><p>지금까지 많은 종의 PGPR균주들이 보고되었고, 이중에서 Bacillus sp. 균주들만 수십 종에 달한다. 그리하여 본 연구에 사용된 B. subtilis AH18균의 monitoring용으로 제작된 3쌍의 primers를 이용하여 11종의 Bacillus spp.의 chromosomal DNA를 대상으로 PCR 및 multiplex PCR 수행 결과 우리가 원하는 size의 band를 확인할 수 없었다. 뿐만 아니라 phenotype에서 auxin, siderophore, 그리고 cellulase의 생산능이 확인된 3종의 Bacillus subtilis에 대해서도 어떠한 증폭도 확인되지 않았다. 이로보아 본 연구에 사용된 3쌍의 primer는 B. subtilis AH18균주의 monitoring에 사용되며, 본 균주와 동일한 phenotype 및 genotype을 나타내는 균주 즉, auxin, siderophore, 그리고 cellulase를 생산하는 균주의 monitoring에도 활용될 것이다.</p> <h2>미 살균 일반경작지 토양에서의 B. subtilis AH18의 확인 및 민감성 확인</h2><p>일반경작지토양에는 많은 종류의 미생물들이 존재하며 그 중에서 특정 유전자를 소유하고 있는 B. subtilis AH18을 확인하기위해 토양에서 DNA를 각각 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 수행하였다. 그 결과 B. subtilis AH18을 투여한 토양에서만 B. subtilis AH18의 각각의 특정 고유유전자 band만 확인할 수 있었다(data not shown). 그리하여 multiplex PCR 실시결과 B. subtilis AH18을 투여한 토양에서는 3종의 특정 고유유전자의 triple band가 확인되었고, 균주를 투여하지 않은 토양에서는 primer dimer만 관찰되었다. 이는 B. subtilis AH18을 투여 후 7일이 지난 후에도 토양내에서 사멸되지 않고 존재함을 의미하여, 3종의 primers들을 이용해 PCR 및 multiplex PCR을 하면 타 유사 토양미생물과 구분하여 B. subtilis AH18의 존재를 확인할 수 있었다. 이 방법은 향후 경작지 토양내에서 생물방제를 위해 처리된 미생물제제의 존재유무와 토양내 우점능력을 확인하는데 널리 활용될 것으로 사료된다.</p><p>또한 토양내에서 B. subtilis AH18의 민감성 확인을 위하여 PCR 및 multiplex PCR 수행 결과, 두 PCR 모두 동일하게 B. subtilis AH18가 토양내 \( 1.8 \pm 0.3 \times 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 이상 존재시 monitoring이 가능하였다. 이는 지금까지 보고된 토양내 rhizobacteria의 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) of root 농도 이상이 존재시 유도저항성 및 방제능을 나타낸다는 보고처럼, 본 균주의 PCR 및 multiplex PCR을 통한 monitoring 농도가 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 임을 생각할 때, 위의 primers를 이용한 monitoring 방법을 이용하면 경작지 토양내에서 유효농도의 미생물제제를 monitoring 할 수 있는 새로운 방법이라고 생각한다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 분포확인 및 우점기간 확인</h2><p>고추 식물체의 endophytic과 rhizosphere, 그리고 nonrhizosphere에서 DNA를 분리하여 PCR 및 multiplex-PCR를 수행하였다. 그 결과 rhizosphere와 non-rhizosphere에서 우점한 B. subtilis AH18의 triple band는 뚜렷이 확인할 수 있었지만, non-rhizosphere에서는 triple band 이외에 여러 다른 band도 확인할 수 있었다. 이는 토양 내 수많은 미생물들의 존재를 나타내고 있으며 non-rhizosphere에서는 B. subtilis AH18이 우점을 하지 못하고 있는 것으로 사료된다. 즉, B. subtilis AH18은 식물체의 rhizosphere와 non-rhizosphere에서 모두 triple band를 확인할 수 있으며, 이는 B. subtilis 종들의 토양내에 널리 분포한다는 보고와 동일하였다. 또한 B. subtilis AH18의 처리 기간별 monitoring을 위해 PCR 및 multiplex PCR 결과, 3주동안은 토양내에서 유효미생물제제 농도인 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 이상이 확인됨으로 영양형 세포 이외에 포자형으로 변형된 세포수까지 감안한다면 충분한 밀도 이상으로 3주 이상 토양내 우점할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 균주를 이용해서 미생물제제를 개발 사용한다면 영양형 세포의 기준으로 3주 간격으로 미생물제제의 처리 시 식물성장촉진능과 생물방제능을 유지 할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>최근 환경오염으로 인한 피해사례가 급증하면서 환경문제가 세계적인 관심사로 떠오르게 되었다. 특히 농업의 경우에는 유기합성 농약과 화학비료 사용량의 증가로 농업생태계가 파괴되고, 농산물의 잔류농약 과다 검출로 소비자의 건강을 위협하고 있다. 최근 농업분야에서도 환경에 친화적이며 지속 가능한 농업방식이 절실히 요구되고 있으며, 우리 나라를 비롯한 전 세계적으로 많은 종류의 환경친화적 농법이 성행하고 있고, 그 중에서 미생물제제롤 이용한 미생물 농법이 최근 연구, 개발되어 활용되어지고 있다.</p><p>미생물농법이란 화학농약과 합성비료를 대신하여 식물의 생육이나 질병방제에 직·간접적으로 좋은 영향을 끼칠 수 있는 미생물제제를 개발하여 농업에 이용하는 친환경 농법을 말하여, 지금까지 연구되어진 미생물제제의 특성은 식물 생장을 촉진하는 물질을 생산하거나, 식물의 저항성을 유도 또는 항생물질, siderophore 그리고 식물병원성 진균의 세포벽을 분해하는 가수분해효소 등의 작용으로 식물병원성 미생물을 직접적으로 저해 및 억제함으로 식물병원성 미생물을 방제하는 특성이 있다. 그리하여 많은 과학자들이 유용 토착길항미생물을 분리, 선발, 제제화 하여 실제 농업에 활용을 시도하고 있다. 하지만, 토양이라는 많은 미생물이 살아가는 환경에서 사용한 미생물제제가 어떻게 우점하는지, 어디에 어느 정도로 분포하는지에 대한 신속하고 간편한 추적, 확인하는 monitoring 방법은 Green Fluorescent Protein (GFP) 유전자를 이용한 monitoring 방법 이외에 거의 찾아 볼 수 없다.</p><p>최근 polymerase chain reaction (PCR) 및 Real-Time PCR을 이용해 인간의 삶에 해로운 영향을 미치는 B. anthracis, B. cereus, C. botulinum, C. jejuni, F. nucleatum, Vibrio spp., Y. enterocolitica 등과 이로운 영향을 미치는 B. thuringiensis 등의 미생물들과 병원성 virus 뿐만 아니라 유전자재 조합 콩도 신속하고 간편하게 monitoring하는 방법이 개발, 널리 활용되고 있다.</p><p>지금까지 토양 내에 처리된 미생물제제의 사용주기 및 사용농도의 적합성에 대해 확인할 수 있는 방법이 없었다. 그리하여 토양 내에 처리된 미생물제제균을 신속하고 간편하게 monitoring하는 새로운 방법을 개발하고자 PCR 및 multiplex PCR을 활용하여 개발하고자 하였다. 본 방법은 유전자 조작을 하지 않고 미생물제제군이 생산하는 특유의 물질을 조사하여 그 생산물질에 해당하는 유전자 중 key enzyme이 되는 유전자를 기초로 primers를 합성하고, 토양내 DNA를 주형으로 PCR 및 multiplex PCR을 수행하면 key enzyme의 유전자가 중폭됨으로, 증폭여부에 따라 미생물제제균의 존재여부를 확인할 수 있는 방법이다. 따라서 본 연구는 식물성장 촉진능과 생물방제능을 동시에 지닌 B. subtilis AH18을 토양내에서 monitoring하기 위해 primers를 제작하였으며, 이를 토대로 PCR 및 multiplex PCR을 수행 하였다. 그리고 고추를 이식한 토양에서 PCR 및 multiplex PCR를 이용해 B. subtilis AH18을 monitoring하여, 민감성과 토양내 분포 등을 조사하여 보고하는 바이다.</p>	생명
1년간의 복합 운동프로그램이 남성 치매환자의 운동능력과 인지기능에 미치는 영향	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>연구대상</h2> <p>본 연구는 치매센터에 거주하는 환자들 가운데 초\(\cdot\)중등학교 이상 교육을 받았고 평소 운동습관은 없으나 기본적인 일상생활이 가능하며, 병력조사, 신경심리검사 및 CT (Computer Tomography) 검사 결과 혈관성 치매로 진단을 받은 남성 치매 환자 24명을 연구 대상으로 선정하였다. 무작위로 각각 12명씩 운동군과 통제군으로 분류하였고, 연구 대상자의 신체적 특성은 다음과 같다.</p> <h2>운동프로그램</h2> <p>본 연구에 앞서 병력청취를 통해 운동시 주의해야 할 사항들을 기록하였고, 4명씩 오전 또는 오후 컨디션이 좋은 시간대에 맞춰 그룹운동을 수행하였다. 1년간의 운동프로그램은 3개월씩 총 4단계(초기단계, 적응단계, 발달단계, 유지단계)로 구분하였고, 각 단계별로 10분간 의자 운동(chair exercise)으로 준비운동을 실시한 다음 바로 본 운동에 들어갔으며, 마지막 5분간 스트레칭으로 정리운동을 하였다. 본 운동은 15분부터 시작하여 마지막 45분까지 단계별로 10분씩 점증적으로 증가시켰으며, 어깨회전운동(shoulder wheel), 탄력밴드운동(thera-band), 어깨신전운동(overhead pulley), 상지재활운동(wall bar), 공운동(swiss ball), 아령운동(dumb bell)을 이용한 상체운동과 페달운동(restorator), 평행봉걷기운동(parallel bar), 다리진동운동(vibrator), 계단오르기운동(staircase), 공운동(swiss ball)을 이용한 하체운동을 복합적으로 구성하여 수행하였다. 운동강도의 경우 \( \mathrm{ VO_2max } \) \(30 \sim 60 \%\), 운동빈도는 주 2~3회, 운동시간은 일 30~60분 실시하였다.</p> <h2>운동능력 및 인지기능 측정</h2> <p>모든 피험자는 전(0개월), 중(6개월), 후(12개월) 총 3회에 걸쳐 운동능력과 인지기능을 측정하였다. 운동능력은 심폐지구력(6분걷기: 6분 동안 걸은 거리 측정), 근력(악력: 악력계를 이용하여 양손 평균치 측정), 근지구력(앉았다 일어서기: 30초 동안 앉았다 일어서기 횟수 측정), 유연성(좌전굴: 다리 앞으로 뻗고 앉아서 앞쪽으로 손을 뻗어 손끝과 발끝 사이 거리측정), 평형성(눈뜨고 외발서기: 눈뜨고 선 채로 양손을 옆으로 뻗어 외발로 서있는 시간측정), 민첩성(누웠다 일어서기: 누운 상태에서 최대한 빨리 일어서기까지 시간측정) 등 6종목을 측정하여 분석하였고, 치매환자의 인지기능을 평가하기 위해 MMSE(Mini-mental state examination) 검사를 실시하였는데, 이 검사는 지남력(시간, 장소), 3단어 기억등록, 집중력과 계산, 3단어 기억회상, 언어 및 공간 구성 등으로 이루어져 있으며 30점 만점에 9점 이하는 말기(severe), 10~20점은 중기(moderate), 21~26점은 초기(mild), 그리고 27이상은 정상(normal)으로 평가한다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>본 연구의 자료처리는 SPSS/PC package (10.0)를 이용하여 분석하였고 가설검중의 유의수준은 \( \alpha \leq .05 \)로 설정하였다. 자료의 기술통계량으로 평균과 표준편차를 산출하였고, 그룹별 시기간(전 \( \&\) 중, 전 \(\&\) 후)에 따른 종속변인(운동능력, 인지기능)의 차이를 알아보기 위해 paired samples \( t \) test를 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>운동능력의 변화</h2><p>치매환자에 대한 운동의 목적은 삶의 질 향상에 있다. 즉, 혼자 이동할 수 있고 일상생활을 영위할 근력을 강화시키며 넘어지거나 다치는 것을 예방하는데 있다. 장기간의 규칙적인 운동은 치매환자의 뇌혈류와 신경전달물질의 분비를 증가시켜 뇌를 지속적으로 자극함으로써 뇌의 노화를 방어하는데 최선의 처방으로 사용될 수 있다. 본 연구에서는 1년간의 운동에 따른 운동능력의 변화를 알아보고자 체력의 6대 요소로 알려져 있는 심폐지구력, 근력, 근지구력, 유연성, 평형성, 및 민첩성을 분석하였으며, 그 결과는 다음과 같다.</p><p>심폐지구력은 운동군의 경우 전 \( 148.33 \pm 80.15 \mathrm{~m} \), 중 \( 175.50 \pm \)\( 84.48 \mathrm{~m} \), 후 \( 202.34 \pm 96.26 \mathrm{~m} \)로 나타나 운동전에 비해 운동중\( (\mathrm{p}<0.01)\)과 운동후\( (\mathrm{p}<0.01) \)유의하게 증가한 반면, 통제군에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이와같은 결과는 운동이 남성 치매환자의 심폐지구력을 향상시키고 시간이 경과할수록 그 효과 또한 크게 나타남을 명백히 보여주고 있다. 근력과 근지구력은 서로 유사한 결과를 보였는데, 운동군의 근력은 전 \( 16.15 \pm 2.40 \mathrm{~kgW} \), 중 \( 19.64 \pm 2.53 \mathrm{~kgW} \), 후 \( 24.05 \pm 4.42 \mathrm{~kgW} \), 운동군의 근지구력은 전 \( 12.22 \pm 4.32 \mathrm{~times} \), 중 \( 15.25 \pm 5.44 \mathrm{~times} \), 후 \( 18.10 \pm 3.26 \mathrm{~times} \)로 나타나 운동전에 비해 운동중\( (\mathrm{p}<0.05) \)과 운동후\( (\mathrm{p}<0.01) \) 유의하게 증가하였으나, 통제군의 경우에는 모두 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 치매 노인들을 대상으로 근력운동을 실시한 결과 하지근력과 근지구력이 증가하였다는 Dvorak과 Poehlman의 연구와 일치하고 있다. 유연성은 다른 결과들과는 달리 운동군, 통제군 모두 유의한 차이가 없는 것으로 나타났는데, 이는 아마도 남성 치매 환자들의 뼈가 이미 상당히 경직되어 있는 상태이고 근육의 탄력성 또한 저하되어 관절의 가동범위가 현저히 감소되었기 때문인 것으로 보여진다. 평형성과 민첩성도 유사한 결과를 보였는데, 운동군의 평형성은 전 \( 1.27 \pm 2.33 \mathrm{~sec} \), 중 \( 2.37 \pm 1.78 \mathrm{~sec} \), 후 \( 3.41 \pm 1.29 \mathrm{~sec} \), 운동군의 민첩성은 전 \( 18.55 \pm 20.17 \mathrm{~sec} \), 중 \( 17.36 \pm 10.15 \mathrm{~sec} \), 후 \( 14.66 \pm 3.76 \mathrm{~sec} \)로 나타나 운동전에 비해 운동후\( (\mathrm{p}<0.05) \)만이 유의하게 증가하였고, 통제군의 경우에는 모두 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 남성 치매환자의 평형성과 민첩성을 향상시키기 위해서는 최소한 12개월 이상은 운동을 해야 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다. Thomas와 Hageman은 치매환자들을 대상으로 근력 트레이닝을 실시한 후 무릎과 고관절 신전검사, 악력 및 걷기검사 등 신체능력을 평가하였는데 이 중에서도 걷기 능력이 현저히 증가하여 치매환자의 근육상해를 감소시키고 골절의 위험성을 줄이는데 효과적이었다고 보고하였다. 또한, Naso 등은 너싱홈(nursing home) 치매환자들에 게 있어 낮은 강도의 근지구력 트레이닝은 향후 발병률을 낮추고 심장질환을 예방할 뿐만 아니라 치매의 진행속도를 지연시켰다고 보고한 바 있다. 이렇듯 가벼운 근력 \(\cdot\) 근지구력 트레이닝 프로그램은 초기 치매환자에게 적용이 가능하고 효과를 기대해 볼 수 있다.</p><h2>인지기능의 변화</h2><p>MMSE는 노인이나 치매환자의 인지기능을 평가하는 도구로서 현재 임상적으로 가장 널리 사용되고 있는 선별적 신경심리 검사이다. 이 검사는 특히, 중증 이상의 치매에 매우 예민하고 감별력이 높으며 이미 많은 연구에 사용되어 타당도와 신뢰도가 검증되었다는 장점이 있는 반면, 저 학력(illiteracy)인 경우 검사가 어렵고 초기 인지기능 선별이 어려우며, 전두엽 기능장애에 예민하지 못하다는 단점이 있다. 본 연구에서는 MMSE 측정시 매회 같은 문항을 이용하였으며, 이에 따른 운동군과 통제군의 MMSE 변화는 다음과 같다.</p><p>MMSE는 운동군의 경우 전 \( 13.42 \pm 3.14 \mathrm{~pt} \), 중 \( 16.59 \pm 5.80 \) \( \mathrm{~pt} \), 후 \( 18.74 \pm 6.51 \mathrm{~pt} \)로 나타나 운동전에 비해 운동중\( (\mathrm{p}<0.05) \)과 운동후\( (\mathrm{p}<0.01) \) 유의하게 증가하였고, 통제군에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이러한 연구결과는 일반 치매환자의 경우 MMSE가 연간 평균 3점씩 감소한다는 사실에 비추어 볼 때, 비록 중기(10~20점) 내에서의 변화이지만 유의하게 향상되었다는 사실만으로도 운동과 치매치료에 있어 의미있는 연구결과라 사료된다. 이는 단기간 운동보다 장기간 운동이 치매환자의 인지기능을 유지하고 향상시키는데 더 효과적이었다고 보고한 Netz와 Jacob의 연구결과와 일치하였고, 규칙적인 중강도의 유산소 운동이 뇌에 많은 산소를 제공하여 치매환자의 인지기능 향상에 크게 기여하였다고 주장한 Brinton의 연구를 뒷받침하고 있다.</p><p>그러나 이와 같은 결과들은 연령, 유전, 병력, 학력, 생활 및 식습관 등에 따라 차이가 나타날 수도 있기 때문에 운동능력과 인지기능에 관한 운동의 효과에 대해 확정지어 단언하기에는 다소 무리가 있을 수 있다.</p>	생명
v22n2	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료 및 조직 추출액의 준비</h2> <p>경골어류 농어목 파랑볼우럭(Lepomis macrochirus, \( 10 \pm 3 \) \( \mathrm{cm} \) )은 4, 5, 9월에, 큰입우럭(Micropterus salmoides, \( 35 \pm 5 \mathrm{~cm} \) )은 9월에 채집하여 얼음에 채워 운반하였고, 눈조직에 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH} 6.85,4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)를 3배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 glass homogenizer로 파쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times g \) 에서 1시간씩 2회 원심분리(Mega 21R, Hanil)하였으며 상등액을 시료로 사용하였다.</p> <h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동(native-PAGE): Western blotting 및 면역침강반응</h2> <p>파랑볼우럭 눈조직의 LDH 동위효소를 확인하기위해서 Western blotting 및 면역침강반응 후 native-PAGE를 실시하였다. Native PAGE는 polyacrylamide vertical slab system (SE250, Hoefer)으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시키면서 실시하였다. Slab gel은 \( 7.5 \% \) acrylamide separation gel 및 \( 2.67 \% \) acrylamide stacking gel로 만들었고, 시료에는 sucrose와 bromo phenol blue 용액을 1: 1\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가한 후 \( 5 \mathrm{mM} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 20분간, \( 200 \mathrm{~V} \)에서 2시간 10분간 전기영동하였다. LDH는 DL-lactate, NBT, PMS 및 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 혼합한 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색한 후, \( 15 \% \) 초산 용액에서 고정하였다. Western blotting 실험은 LDH eye-specific \( C_{4} \) 동위효소를 native-PAGE한 후 semi-dry transfer systems (Trans-blot SD, Bio-Rad)에서 \( 0.015 \mathrm{M} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 25 \mathrm{~V} \)에서 30분간 nitrocellulose 막에 전이시켰다. 막을 \(5\%\) skim milk/TBS \( (0.01 \mathrm{M} \) Tris buffered saline, \( \mathrm{pH} 7.5 \) ) 용액에 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후 TBS 용액으로 10분간 3회 세척하였다. \( 1 \% \) skim milk/TBS로 희석한 조피볼락(Sebastes schlegeli) LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4}\)(1: 1,000)에 대한 항혈청 용액에 막을 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후 TBS 용액으로 10 분간 2회 세척하였다. \(1\%\) skim milk/TBS를 사용하여 희석시킨 2차 항체 (anti-rabbit \( \mathrm{IgG}\), 1: 1,000) 용액에서 1시간 반응시키고 TBS 용액으로 10분간 3회 세척하였다. 전개용액(chloronaphtol, methanol, TBS, 30\% \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) )으로 반응시키고 증류수로 세척 후 밴드를 확인하였다.</p> <p>눈조직 추출액에 꺽지(Coreoperca herz) LDH \( \mathrm{A}_{4} \), 소(Bos taurus) LDH \( \mathrm{B}_{4} \), 및 조피볼락 LDH \( \mathrm{B}_{4} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대한 항혈청을 각각 1: 0.5, 1: 4, 1: 0.5\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 면역침강반응 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times \mathrm{g} \)에서 원심분리하였으며, 상등액을 native-PAGE하여 항원-항체 복합체를 이루지 않은 LDH 동위효소를 확인하였다.</p> <h2>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2> <p>LDH 활성을 Whitt의 방법에 따라 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 측정하여 최대활성을 기준으로 상대활성 \( (\%, \mathrm{~V} / \mathrm{Vmax}) \)을 구한 결과 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( \mathrm{pH} \) 4.0에서 81.9 \(\%\), \(\mathrm{pH} \) 7.5에서 최대 활성을 나타냈으며, \( \mathrm{pH} \) 8.5까지 \( 80 \% \) 이상의 활성을 나타냈다. 따라서 최적 \( \mathrm{pH} \)는 7.5였고, \( \mathrm{pH} 4.0 \)과 \( \mathrm{pH} \) 7.5~8.5에서 안정적이었다. 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 4.0에서 최대 활성을 나타내고, \( \mathrm{pH} \) 4.5에서 \( 95.3 \%, \mathrm{pH} 8.0 \)에서 \( 86 \% \) 활성을 나타내므로 최적 \( \mathrm{pH} \)는 4.0이었고, \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 4.5 \)와 \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서 안정적이었다. 그리고 Whitt 방법에 따른 \( \mathrm{pH} 6.85 \) 완충액, \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 LDH 활성을 측정하는 경우, 큰입우럭과 파랑볼우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 각각 \( 33 \% \)와 \( 60 \% \) 활성이 측정되었다. 고등어 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 8.5에서 최대 활성을 나타내고, \( \mathrm{pH} \) 6.5~10.0에서 \( 75 \% \) 활성을 나타냈으며, 풀망둑 눈조직은 \( \mathrm{pH} \) 6.5에서 최대 활성을 나타내지만 \( \mathrm{pH} 7.5 \) 부터 활성이 급격히 감소되었다. 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 8.5에서 최대 활성을 나타냈으나 \( \mathrm{pH} \) 7.0~8.0에서 80~97 \( \% \), \( \mathrm{pH} \) 6.5~7.0에서 23~35\( \% \) 활성이 측정되었다. 또한 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 5.5에서 최대 활성을 나타내지만, \( \mathrm{pH} \) 7.0에서 \( 37 \% \) 활성이 측정되어 큰입우럭과 파랑볼우럭과 같이 중성에서 활성이 낮게 측정되었다.</p> <p>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산으로 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따라 LDH 활성을 측정한 후 상대 활성을 구한 결과 파랑볼우럭은 \( \mathrm{pH} 4.5 \sim 5.0 \)에서 \( 79 \%, \mathrm{pH} 7.5 \sim 8.5 \)에서 \( 80 \% \) 이상 활성을 나타내 산성과 약알카리에서 활성이 강했으며, \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서 최대 활성을 보였고, \( \mathrm{pH} \) 6.8에서는 \( 70 \% \) 활성을 나타냈다. 그리고 큰입우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} 4.0 \)에서 최대 활성을 나타낸 후 감소하여 \( \mathrm{pH} 4.5 \)에서 \( 65 \%, \mathrm{pH} 7.5 \)에서 \( 50 \% \) 활성을 나타냈다. 또한 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 경우 최대 활성을 나타내는 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 측정한 결과 \( \mathrm{pH} 4.0 \)에서 최대 활성을 나타내고, \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 5.0 \)에서 \( 74 \% \) 이상의 활성과 \( \mathrm{pH} \) 6.0~7.0에서 \( 58 \sim 60 \% \) 활성을 보였으며 \( \mathrm{pH} 7.5 \)에서 \( 48 \% \) 활성을 나타내지만 \( \mathrm{pH} 8.0 \) 이상에서는 활성이 낮게 나타났다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동: Western blotting 및 면역침강반응</h2> <p>눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( C_{4} \) 동위효소에 대해 연구하기위해 눈조직에서 발현되는 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~B}_{4} \) 및 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 확인하였다. 파랑볼우럭 눈조직 추출물을 native-PAGE한 후 Western blotting하여 양극 쪽에 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 확인하였다. 또한 눈조직에 LDH \(\mathrm{A}_{4} \)에 대한 항혈청을 반응시켜 면역침강반응 후 native-PAGE를 실시한 결과 \( \mathrm{A}_{4} \) 밴드는 확인되지 않고 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 는 흐리게 나타났으며, LDH \(\mathrm{B}_{4} \)에 대한 항혈청을 반응시킨 경우 \( \mathrm{B}_{4} \) 밴드가 나타나지 않았고 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 활성이 흐려졌으며, LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대한 항혈청을 사용하여 반응시킨 결과 \( \mathrm{A}_{4} \)와 이질동위효소, \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 나타나지 않고 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소만 확인되어 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 \( \mathrm{B}_{4} \)보다 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소에 유사한 것으로 확인되었다.</p> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직의 LDH 전기영동상은 음극 쪽으로 부터 \( \mathrm{B}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{~A}_{4}, \mathrm{~A}_{3} \mathrm{C}, \mathrm{C} \) hybrid 및 양극 쪽의 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 나타났고, \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B} \)와 \( \mathrm{AB}_{3} \) 동위효소가 나타나지 않은 것이 유사하였으나, 파랑볼우럭의 LDH \(\mathrm{C} \) hybrid의 발현이 큰입우럭보다 약하게 나타나 차이를 보였다. 그리고 풀망둑과 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 역학적 성질이 \( \mathrm{B}_{4} \)보다 \( \mathrm{A}_{4} \)에 유사하다는 보고와도 일치하였다. 쥐노래미 LDH는 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 가장 음극에 나타나 차이를 보였으나 \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B}, \mathrm{AB}_{3} \)가 나타나지 않은 것은 동일하여, 5가지 동위효소가 나타나는 가물치에 비해 저산소에 적응된 것으로 보였다. 그리고 파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직의 미토콘드리아 LDH도 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{~B}_{4}, \mathrm{C} \) hybrid, \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 모두 확인되었으므로 미토콘드리아에서 LDH에 의한 에너지 대사가 활발하게 이루어지는 것으로 사료된다.</p> <h2>세포기질 LDH, 미토콘드리아 LDH 및 CS의 활성</h2> <p>4, 5, 9월에 채집한 파랑볼우럭 눈조직의 LDH 활성을 측정하였다. 9월에 채집한 파랑볼우럭 눈조직의 LDH 활성은 30.4 \( \mathrm{units} \)로 4월의 9.45 \( \mathrm{units} \)에 비해 크게 증가되었다. CS의 활성은 5월에 0.53 \( \mathrm{units} \)로 4월의 활성보다 감소되었지만 9월에 0.9 \( \mathrm{units} \)로 4월의 활성과 유사하였다. 따라서 LDH 가 CS 보다 증가폭이 컸으므로 LDH CS는 9월에 33.78로 증가되어 혐기적 대사가 증가된 것으로 확인되었다. 또한 단백질양이 9월에 \( 48.3 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)이므로 가장 많이 증가되었다. 파랑볼우럭(9월)의 눈조직 추출액의 MAOX 활성은 0.35 \( \mathrm{units} \)였으나, 미토콘드리아 분획 추출액에서는 MAOX가 0.43 \( \mathrm{units} \)였으므로 미토콘드리아가 분리되었음이 확인되었으며, 눈조직 미토콘드리아 분획의 LDH 활성이 1.38 \( \mathrm{units} \)였고, LDH 의 비활성은 1.29 \( \mathrm{units} / \mathrm{mg} \)였다. 그리고 큰입우럭 눈조직의 미토콘드리아 LDH 활성은 0.55 \( \mathrm{units} \)였고, LDH의 비활성은 5.00 \( \mathrm{units} / \mathrm{mg} \)였다. 따라서 파랑볼우럭 미토콘드리아 LDH 활성은 세포기질 LDH 활성의 \( 4.54 \% \)였고, 큰입우럭의 경우는 \( 4.7 \% \)로 나타났으므로 미토콘드리아에서 LDH 에 의한 젖산의 대사가 이루어지는 것이 확인되었다. 파랑볼우럭(9월)의 눈조직 추출액의 활성은 풀망둑 눈조직 LDH 53.25 \( \mathrm{units} \), CS 8.35 \( \mathrm{units} \) 가물치 눈조직 LDH3.5 \( \mathrm{units} \), CS10.9 \( \mathrm{units} \), 쥐노래미 눈조직 LDH 10.90 \( \mathrm{units} \)와 비교하면 풀망둑 LDH 활성 보다 낮지만 쥐노래미와 가물치의 LDH 활성보다 높게 확인되었고, CS는 풀망둑과 가물치보다 낮아 파랑볼 우럭과 큰입우럭 눈조직의 경우 혐기적 대사 비율이 높은 것으로 확인되었다.</p> <h2>Preparative native-PAGE에 의한 LDH eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 동위효소의 분리</h2> <p>Eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소를 분리하기 위해서 Preparative native-PAGE을 실시하였다. 파랑볼우럭의 경우, \( 5 \% \) acrylamide gel로 실시한 결과 10 32번(4.5~16 \( \mathrm { ml } \)) 분획에서 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)가 분리되었으며, 시료의 LDH 활성 38.58 units로부터 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 17.11 \( \mathrm { units } \)를 얻어 수득률이 \( 44.35 \% \)이었고. 208~211번에서 \( \mathrm { A } _ { 4 } \), 270 번에서 \( \mathrm { A } _ { 2 } \mathrm { ~B } _ { 2 } \) 350번에서 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위 효소가 확인되었다. 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)와 같이 \( 4 \% \) acrylamide gel로 분리한 경우 bromophenol blue와 eye-specific \( C_ { 4 } \) 가 동일 분획에서 함께 용출되어 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 동위효소를 분리하기가 어려웠으므로 \( 5 \% \) gel에서 분리하였다. 큰입우럭 eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소는 \(5 \% \) acrylamide gel로 분리한 경우 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 동위효소와 인접하게 위치한 동위효소가 함께 용출되므로 \(6 \% \) acrylamide gel로 분리하였으며, 35~65번(17~32.5 \( \mathrm { ml } \)) 분획에서 분리되었다. 정제 후 분획을 native-PAGE하여 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } , \mathrm { ~A } _ { 4 } \) 및 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위 효소를 확인하였으며. 큰입우럭 눈조직의 LDH 활성 9.16 units로부터 eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소 0.46 \( \mathrm { units } \)를 얻어 수득률은 \( 5.05 \% \)로 파랑볼우럭의 수득률에 비해 낮았으며, 이는 인접하여 위치된 \( \mathrm { AC } _ { 3 } \) 동위효소로 인해 분리가 어려웠기 때문이다. 가물치 eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소의 경우 \( 4 \% \) acrylamide gel로 Prep cell을 실시하여 \( 2 \mathrm { ml } \)씩 분획할 때 9~15번 분획(16~30 \( \mathrm { ml } \))에서 얻어 수득률이 \( 0.7 \% \)였고, 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)는 \( 4 \% \) acrylamide gel에서 10~12번(18~24 \( \mathrm { ml } \))에서 용출되어 수득률이 \(2.4 \% \)라는 보고와 비교하면 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)의 경우 LDH 활성도 높고 acrylamide gel의 농도도 잘 조절되어 수득률이 높은 것으로 사료 된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, LDH)는 Ldh - A, B, C에 의해 만들어진 사량체로 \( \mathrm{NAD}^{+} / \mathrm{NADH} \) 존재 하에 피루브산과 젖산의 상호 전환을 촉매하며, Ldh-A는 골격근과 같이 혐기적 대사가 우세한 조직에서 발현되고, Ldh-B는 심장조직과 같이 호기적 대사가 우세한 조직에서 발현되나, 종에 따라, 조직에 따라 대사적으로 필요한 정도가 다르므로, 진화를 통해 LDH 동위효소의 발현, 전하 및 역학적 특성이 최적화 되어있다. Ldh-C는 경골어류의 간이나 눈조직에서 나타나며, 역학적 특성과 전하도 다르고 다른 유전자에 의해 발현되며 농어목의 눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \), 잉어목과 대구목의 간조직에서 발현되는 LDH liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 및 포유류와 조류의 정소와 정자에서 발현되는 LDH tes-tis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 보고되었다. 따라서 왜 Ldh-C를 특정 조직에서만 필요로 하는지에 대해 확실하지 않지만, LDH C는 유전적 이점이 있으므로 진화를 통해 보존되어 있는 것으로 받아 들여져 정소의 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대해서만 활발히 연구가 진행되고 있다.</p> <p>LDH testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 정소와 정자에서 포도당 대신 젖산과 피루브산을 우세하게 사용하여 에너지를 생성하고 정자가 운동하는데 사용되므로, 생쥐 정자의 LDH 활성의 \( 80 \% \) 이상을 차지한다고 보고되었다. 따라서 Ldh-C가 결손된 정자는 미토콘드리아의 활성은 변화되지 않지만 해당과정이 억제되어 \( \mathrm{NAD}^{+} \)가 부족해지고 피루브산이 축적되어 ATP가 빠르게 감소되었다. 그 결과 운동성이 떨어져 불임을 이끌었으므로 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 경우 정자의 ATP 항상성에 포함되는 복합물로서 에너지 대사에 직접 작용한다고 보고되었지만 여전히 Ldh-C의 기능에 대해서는 해결되지 않은 상태다. Liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 퍼옥시솜에서 \( \mathrm{NAD}^{+} / \mathrm{NADH}^{2} \)를 조절하고 대사와 관련되어진다는 것이 보고되었다.</p> <p>그리고 눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 망막의 광수용기 세포에 존재하여 광색소 재생성에 필요한 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 생성할 수 있다고 제시되어[33,46], 농어목 어류에서 보고되었고, cichlidae 어류의 눈 및 뇌조직에서 eye-specific Ldh-C가 확인되었으며, 송어에서 피루브산에 대해 친화성이 크게 자연 선택되었다고 보고되었다. 그리고 lactate shuttle에 의한 젖산의 중요성이 인식되면서 망막에서의 젖산 대사와 monocarboxylate 수송체(monocarboxylate transporters, MCT)에 대한 연구가 진행되고 있으나 LDH와 관련된 연구는 이루어지고 있지 않다. 눈조직에서의 Ldh-C에 대한 연구는 국내산 농어목 어류에서 Ldh-C의 발현이 확인되었고, Ldh-C가 발현되는 꺽지의 DO와 온도를 급격히 변화시킨 경우 초기에 Ldh-C가 Ldh-B 보다 먼저 발현되는 것으로 나타나 에너지 대사에서의 Ldh-C의 기능에 대한 관심을 불러 일으켰다. 또한 풀망둑과 얼룩동사리 눈조직의 LDH 활성이 높게 확인되어 농어목의 육식성어류에서 먹이 포획시 눈조직의 LDH 활성이 기능을 할 것으로 예상하였다. 그러나 가물치, 쥐노래미에서는 LDH 활성이 비교적 낮고 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR}} \)이 낮아 피루브산에 대한 친화성이 크게 나타났으므로, 에너지 대사에서의 역할이 중요함이 인식되었고, 종들의 서식환경, 먹이 포획 방법을 포함한 행동 양상 및 운동성에 따라 눈 및 뇌조직에서 Ldh-C가 다르게 발현됨을 알 수 있었다. 그리고 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 활성에 대한 \( \mathrm{pH} \) 안정성 실험에서 약산성에서 최대 활성이 나타나고, LDH 활성을 측정하는 중성 \( \mathrm{pH} \)에서 활성이 약해, eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 활성을 측정하는 조건이 재검토 되어야 할 필요가 있는 것으로 나타났다.</p> <p>따라서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 특성을 확인하기 위해 농어목 어류 중 피식자와 포식자 관계의 파랑볼우럭과 활동성이 큰 큰입우럭을 선택하였다. 포식자가 먹이를 찾는데 시간이 소모되고, 다가가서 추적하고 먹이를 잡아먹는 행동을 하므로, 먹이를 잡는 행동은 시간의 소비와 관련된다. 추격행동은 혐기적 대사에 의해 생성된 에너지로 급격하게 수영하여 포획하는 행동으로 비교적 시간은 적게 소요되나 에너지 소모가 크다. 어류가 먹이를 포획하는데 근육 LDH 의 혐기적 대사에 의해 에너지를 빠르게 생성하여 사용한다고 보고하였다. 또한 밀집 식생의 경우 먹이를 찾는데 많은 시간이 소요되고 포획율도 감소하므로 밀집 식생군에서 에너지 비용을 줄이는 추적행동으로 매복행동이 나타나 에너지를 보존하는 방향으로 행동한다. 따라서 LDH는 단시간 에너지 소모와 관련된 혐기적 에너지 비용을 담당하므로 어류 활동의 방식과 사용되는 에너지의 양을 연관 지을 수 있는 수단이고 표지자로 사용될 수 있다. 큰입우럭은 골격근의 LDH 를 사용하는 혐기적 대사에 의해 포획 활동을 하며, 먹이의 크기가 증가함에 따라 LDH 활성이 증가하고, 큰입우럭의 활동이 증가하여 포획 활동 정도에도 영향을 미치게 된다. 그러나 포식자인 큰입우럭이 먹이를 포획하는 순간과 피식자인 파랑볼우럭이 먹이를 얻고, 방어하는 기능에 눈조직이 관여하고 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 가 중요한 역할을 할 것으로 예상되어 연구하였다.</p> <p>본 연구에서 농어목에 속하는 열대산 광온성 어류로서 피식자와 포식자 관계를 갖는 종인 파랑볼우럭과 큰입우럭을 선택하여 눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 특성을 비교하고, LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성을 측정하는 조건을 제시하고자 하였다.</p> <h2>Preparative native-PAGE에 의한 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 분리</h2> <p>Preparative native-PAGE (Model 491 Prep cell, Bio-Rad)는 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 정제하기위해서 \( 5 \% \) acrylamide separation gel과 stacking gel을 5:1로 만들었고, 큰입우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 분리하기 위해 \( 6 \% \) acrylamide separation gel \( (28 \times 50 \mathrm{~mm}) \)을 만들었다. Buffer (0.025 M Tris-Glycine, \(\mathrm{pH} \) 8.3)를 upper chamber에 \( 400 \mathrm{ml} \), lower chamber에 2 l, elution chamber에 \( 800 \mathrm{ml} \) 채운 후 시료 \( 3 \mathrm{ml} \) 와 sample buffer (0.0625 M Tris-HCl, \(\mathrm{pH} \) 6.8, \( 10 \% \) glycerol, \( 0.025 \% \) bromophenol blue)를 \( 1: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 섞은 용액을 gel의 상부에 가하고, \( 460 \mathrm{~V}, 40 \mathrm{~mA} \)에서 전기영동 하였으며, bromophenol blue가 separation gel을 빠져나갈 때 elution buffer를 \( 0.75 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 유속으로 유입시키면서 용출액을 \( 0.5 \mathrm{ml} \)씩 분획 하였다. 각 분획의 LDH 활성을 측정하고, native-PAGE하여 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)만 존재하는 분획을 모아 농축시킨 후 기질의존성 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 기질의존성 측정 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2> <p>\( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH 를 함유하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (pH 6.85)에 피루브산 \( 0.01 \sim 10 \mathrm{mM} \)을 가하고 파랑볼우럭 눈조직 추출액 및 파랑볼우럭과 큰입우럭의 정제한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성을 측정하여 최대 활성을 기준으로 상대 활성(\(\%, V/Vmax\))을 구하여 기질농도에 의해 저해되는 정도를 확인하였다. 그리고 Lineweaver-Burk plot에 의해 \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\text {PYR}} \)를 얻었다. \( 0.7 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NAD}{ }^{+} \)를 함유하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85)에 L-lactate \( 0.1 \sim 200 \mathrm{mM} \)을 가하고 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 LDH 활성을 측정하였고, 최대 활성에 대한 상대 활성 (\( \%\), \( \mathrm{V} / \mathrm{Vmax}) \)을 확인하였다. 또한 \( \alpha \)-ketobutyric acid, \( \alpha \)-ketovaleric acid, \( \alpha \)-ketoglutaric aicids, \( \alpha \)-ketocaproic acid, DL-d-keto- 3 -methyl-n-valeric acid, \( \alpha \)-ketoisocaproic acid, 및 \( \alpha \)-ketoisovaleric acid 등의 \( \alpha \)-ketoacids 기질에 대한 활성을 측정하여 기질 특이성을 확인하였다.</p> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭의 정제한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH}\) 4.0,4.5,5.0), 0.1 \( \mathrm{M} \) sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH} \) 5.5), \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH}\) 6.0, 6.5, 7.0), \(0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH}\) 7.5, 8.0 , 8.5), 0.1 M Tris-glycine buffer ( \( \mathrm{pH} \) 9.0) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 9.5, 10.0, 10.5) 에 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 피루브산, \( 0.5 \) \( \mathrm{mM} \) 피루브산 및 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 LDH 활성을 측정하여 비교하였고, 또한 최대 활성에 대한 상대 활성(\%)을 구하여 \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)를 확인하여, 눈 조직 LDH 및 LDH eye-specific \( C_{4} \) 활성을 측정하는 조건으로 제시하였다.</p> <p>피루브산 \( 10 \mathrm{mM} \)에서 풀망둑 눈조직의 LDH는 \( 35.22 \% \), LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 36.53\% 활성을 나타냈고[49], Scombo japonicus LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( 30 \% \) 활성을 나타냈으며, 가물치 \( \mathrm{LDH} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( 16.87 \% \) 활성을 나타낸다고 보고되었으므로 본 실험의 큰입우럭 \( 15.8 \% \), 파랑볼우럭 \( 5.2 \% \) 보다 저해정도가 낮았으며, 쥐노래미는 \( 6.5 \% \) 활성을 나타내는 것으로 보고되어 파랑볼우럭이 가장 저산소에 적응된 것으로 확인되었다. Whitt의 방법에 따라 LDH 활성은 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 파랑볼우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} 20.9 \% \), 큰입우럭 \( \mathrm{C}_{4} 31.6 \% \), 눈조직 LDH \( 61.6 \% \)로 측정되었고, 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} 40 \% \), 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} 73 \% \), 풀망둑 눈조직 LDH \( 100 \% \)로 측정되었다. 그리고 \( 0.5 \mathrm{mM} \)에서는 파랑볼우럭 eye-specifc \( \mathrm{C}_{4}\) \( 72.2 \% \), 큰입우럭 eye-specifc \( \mathrm{C}_{4} \) \( 78.9 \% \) 활성이 남아, 조직의 LDH 및 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 활성을 측정할 수 있는 조건으로 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 보다는 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 농도를 선택하여야 할 것으로 사료된다. 그리고 꺽지 \( \mathrm{A}_{4} \), 쏘가리 \( \mathrm{A}_{4} \), 가물치 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{~B}_{4} \), 소 \( \mathrm{B}_{4} \), 풀망둑, 칠성장어 및 메기류 조직들 LDH 의 활성이 피루브산 농도에 따라 변화되는 정도를 종합하면 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 95 \%, 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 84 \% \)의 활성이 측정되었으므로 다른 조직들의 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소 및 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소에서는 활성의 차이를 크게 보이지 않았다.</p> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직의 LDH 동위효소가 젖산에 의해 저해되는 정도를 측정한 결과 파랑볼우럭의 LDH 활성이 낮은 농도의 젖산에서 큰입우럭의 LDH 활성보다 조금 더 크고 파랑볼우럭LDH 가 \( 22 \mathrm{mM} \), 큰입우럭 LDH가 \( 24 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타내고, 이후 농도에서 활성이 급격히 저해되었다. 따라서 큰입우럭 눈조직 LDH 동위효소의 젖산에 대한 친화성이 파랑볼우럭보다 조금 낮고, 좀 더 많은 양의 젖산에 내성이 있으므로, 해당과정에 의해 에너지를 더 많이 생성할 수 있는 것으로 볼 수 있다. Channa punctatus 심장조직 LDH는 \( 12.5 \mathrm{mM} \), 골격근의 LDH는 \( 175 \mathrm{mM} \), 아마존에 서식하는 Mylossoma duriventris 심 장조직 \( 14 \mathrm{mM} \), 골격근 \( 20 \mathrm{mM} \), C. macropomum 심장조직 \( 20 \mathrm{mM} \), 골격근 \( 25 \mathrm{mM} \) 및 토끼 골격근 LDH가 \( 25 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타냈다는 보고와 비교해 보면 eye-specific \( C_{4} \)의 경우 M. duriventris 심장조직과 골격근 보다는 젖산에 대한 내성이 강하고, C macropomum 골격근의 LDH와 파랑볼우럭의 \( \mathrm{C}_{4} \)와 유사하지만 C. punctatus 골격근의 LDH는 젖산의 농도가 특히 높아 골격근에서 해당과정에 의해 많은 에너지를 생성할 수 있다는 것을 나타내므로 이와 비교해 볼 때 눈조직에서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 에너지의 양은 적지만 빠르게 생성하는 것으로 사료된다. 따라서 포식자인 큰입우럭의 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 저농도 피루브산에서 파랑볼우럭 \( \mathrm{C}_{4} \) 활성보다 크고 최대 활성에 빨리 도달하지만, 저 농도의 젖산에서는 파랑볼우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 가 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 보다 활성이 조금 크고, 최대활성에도 빨리 도달하고 이후 농도에서 저해되므로, 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 젖산에 대한 내성이 커서 피식자인 파랑볼우럭에 비해 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 의해 순간 에너지를 좀 더 빠르고 크게 생성하는 것으로 볼 수 있다.</p> <p>\( \alpha \)-ketoacids 기질에 대한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성을 측정하여 피루브산에 의한 LDH 활성에 대해 상대 활성(\(\%\))을 측정한 결과 파랑볼우럭은 \( \alpha \)-ketobutyric acid가 \( 72.90 \% \)였고, 큰입우럭은 \( \alpha \)-ketobutyric acid가 \( 114.58 \%, \alpha \)-ketovaleric acids가 \( 83.3 \% \)로 높았으며, 모든 기질에서 활성이 41.67~114.58 \( \% \)로 나타나 기질에 대한 특이성이 넓게 확인되었다. 파랑볼우럭 눈조직의 미토콘드리아 내 LDH 는 \( \alpha \)-ketobutyric acid가 \(52.77\%\), 큰입우럭 미토콘드리아 내 LDH는 \( \alpha \)-ketoglutaric aicids가 \( 35.12 \% \)로 가장 높게 측정되었고, 나머지 기질에서는 모두 낮게 확인되었다. 세포기질과 미토콘드리아에서 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 피루브산 다음으로 \( \alpha \)-ketobu-tyric acid가 활성이 가장 크게 나타나, \( \alpha \)-ketoacids에 대한 상대 활성도는 탄소 사슬의 길이가 길어질수록 감소하여 \( \alpha \)-ketobutyric acid \( \rightarrow \alpha \)-ketovaleric acid \( \rightarrow \alpha \)-ketoglutaric acid 순으로 감소한다는 결과와 일치하였다. 생쥐 정소의 LDH testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 결과와 고등어 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 a-ketobutyric acid에 반응하였다는 결과와 일치하였다. 그리고 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 \( \alpha \)-hydroxyvalerate에 대사하는 등 기질에 대한 특이성이 넓다는 결과와도 유사하였다.</p> <h2>LDH와 CS의 활성 측정 및 단백질 정량</h2> <p>LDH의 활성은 \( 1.50 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH 를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \(\mathrm{pH} \) 6.85) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 다음 NADH로 부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 산화되는 정도를 분광광도계(UV-160A, Shimadzu)를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Citrate synthase (CS, EC 4.1.3.7)의 활성은 \( 0.2 \mathrm{mM} \) acetyl-CoA, \( 0.1 \mathrm{mM} \) DTNB[5,5'-dithiobis(2-nitro-benzoic acid)], \( 0.5 \mathrm{mM} \) oxaloacetic acid를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer ( \(\mathrm{pH} \) 7.5) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 후, DTNB가 전환되는 정도를 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 412 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였으며 LDH / CS를 구하였다. 활성의 단위(unit)는 1 분 동안 기질 \( 1 \mu \mathrm{M} \)을 전환시키는 효소의 양으로, LDH 경우 millimolar extinction co-efficient 6.22를, CS 경우 13.6을 사용하여 계산하였으며, 단백질은 BSA를 표준단백질로 사용하여 분광광도계로 595 \( \mathrm{nm} \)에서 Bradford의 방법에 따라 정량하였고, LDH의 비활성은 단백질 양에 대한 효소의 활성 (\( \mathrm{units/mg} \))으로 나타냈다.</p> <h2>미토콘드리아 분리 및 LDH 추출</h2> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직을 적출하여 혈액을 제거한 후 \( 0.25 \mathrm{M} \) sucrose를 함유한 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85)를 3배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하고 glass homogenizer로 조심스럽게 파쇄하였다. 조직 추출액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 270 \times \mathrm{g} \)에서 7 분간 원심분리하였고, 상등액을 동일 조건에서 다시 원심분리하였다. 상등액을 \( 1,500 \times \mathrm{g} \)에서 10 분간 원심분리한 뒤 상등액을 \( 10,000 \times \mathrm{g} \)에서 1시간 동안 원심분리 한 후 미토콘드리아 침전물을 얻었다. Monoamine oxidase (MAOX)의 활성을 측정하여 미토콘드리아의 분리를 확인하였으며, 분리된 미토콘드리아를 3분 간격으로 30초간 초음파로 파쇄한 후 LDH 활성을 측정하고 native-PAGE로 mitochondrial LDH 동위효소를 확인하였다. MAOX 활성은 Tabor 등의 방법을 변형하여 측정하였다. \( 2.5 \mathrm{mM} \) benzylamine을 함유하는 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer (\(\mathrm{pH} \) 7.2) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 후 benzylamine이 감소되는 정도를 분광광도계로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 활성의 단위는 1분 동안 \( 1 \mu \) mole benzylamine을 분해하는 효소의 양으로 millimolar extinction coefficient 13.8을 사용하여 계산하였다.</p> <h2>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 피루브산, 젖산 및 \( \alpha \)-keto acids에 대한 기질의존성</h2> <p>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 기질에 대한 저해 정도를 확인하기위해서 피루브산 농도를 \( 10 \mathrm{mM} \)까지 증가시키며 LDH 활성을 측정하였다. 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 활성은 피루브산이 증가됨에 따라 증가되어 \( 0.1 \mathrm{mM} \)에서 \( 97 \% \) 활성을, \( 0.2 \mathrm{mM} \)에서 최대활성을 나타내고 \( 0.2 \mathrm{mM} \) 이상의 농도에서 급격히 감소되었다. 큰입우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( 0.01 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 37 \% \) 활성을 보여 파랑볼우럭 LDH 의 \( 10 \% \) 활성보다 컸으며, \( 0.1 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타내고 \( 0.3 \mathrm{mM} \)까지 \( 97 \% \) 활성을 보이고, 이후 감소 되었다. 파랑볼우럭과 큰입우럭 LDH 활성이 최대활성 이후부터 급격히 저하되어 피루브산 \( 1 \mathrm{mM} \) 에서 각각 \( 50.4 \%, 59.2 \% \) 활성이 남았고, \( 1.5 \mathrm{mM} \)에서는 \( 20.9 \%, 31.6 \%, 10 \mathrm{mM} \)에서 \(5.2\%\), \( 15.8 \% \) 활성이 남아 저해 정도가 컸으며 파랑볼우럭이 저해 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 파랑볼우럭 눈조직의 경우도 \( 0.3 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 최대 활성을 나타내고 \( 1 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 74.1 \%, 1.5 \mathrm{mM} \)에서 \( 61.6 \% \) 및 \( 10 \mathrm{mM} \)에서 \( 22.1 \% \) 활성을 나타냈다. 따라서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 눈조직 LDH 보다 더 낮은 피루브산 농도에서 최대 활성에 이르고, 이후 급격히 저하되어 피루브산에 대해 더욱 민감하게 저해되었으며, 피루브산 \( 4.3 \mathrm{mM} \) 이후부터 저해되기 시작하는 토끼 근육 LDH 보다 낮은 농도에서 저해하는 것으로 보였다. 가물치 경우 저농도의 피루브산에서 심장조직의 LDH 활성이 더 크나 피루브산 농도가 증가됨에 따라 골격근의 LDH 활성이 증가하여 \( 26 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 최대 활성을 나타내고, 심장조직은 \( 60 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타낸다는 보고와 비교하면 골격근과 심장조직의 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 와 \( \mathrm{B}_{4} \)에 비해 눈조직의 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 상당히 낮은 농도의 피루브산에서 저해되는 것으로 확인되었다. Cichlid fish의 LDH 활성이 피루브산 \( 0.33 \mathrm{mM} \)에서 측정되었고, Fundulus heteroclitus LDH 활성은 피루브산 \( 0.667 \mathrm{mM} \)에서 측정되었으며, Amazonian cichlids 경우 환경에 적응되어 대사회로를 조절하고 효소 양을 조정하여 혐기적 대사를 하므로 LDH 활성을 \( 1 \mathrm{mM} \) 피루브산, \( 0.15 \mathrm{mM} \) NADH 및 \( \mathrm{pH} \) 7.4의 완충액에서 측정하였다고 보고되었지만 본 실험에서는 LDH 활성이 \( 0.33 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 높고 \( 0.667 \mathrm{mM} \)과 \( 1 \mathrm{mM} \) 피루브산에서는 낮게 측정되었다. 그리고 Lineweaver-Burk 식에 의해 측정한 결과 파랑볼우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)는 \( 0.088 \) \( \mathrm{mM} \), 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)는 \( 0.033 \mathrm{mM} \)로 확인되었다. 따라서 큰입우럭의 경우 저농도의 피루브산에 의한 \( \mathrm{LDH} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 활성이 크고, \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} \)이 낮아 피루브산에 대한 친화력이 큰 것으로 나타났다. 또한 최대 활성에 이르는 피루브산의 농도가 비교적 낮아 에너지가 더 빠르게 생성되므로, 눈조직에서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위 효소에 의해 생성된 에너지가 포식 행동의 초기반응에 빠르게 사용되는 것으로 사료된다. 또한 고농도 피루브산에서 파랑볼우럭이 큰입우럭보다 저해정도가 크므로 더욱 저산소 조건에 적응되어 진화된 것으로 볼 수 있다. 큰입우럭의 경우 돌 또는 수풀 사이에 숨어있다가 먹이를 발견하고 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)로 급격히 에너지를 생성하여 먹이를 추적한 후 즉시 골격근의 LDH \( \mathrm{A}_{4} \)에 의해 에너지를 생성하여 먹이를 포획하는 것으로 보이므로, 행동의 정도에 따라 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 활성이 차이를 나타내는 것으로 보인다. Eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 이러한 기능은 정자에서 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 ATP 생성과 밀접한 관련이 있다는 보고와 유사한 것으로 사료된다. 그리고 파랑볼우럭과 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)는 cichlid fish, Oreochromis mossambicus의 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} 0.0323 \) \( \mathrm{mM} \)과 \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 \( 0.0141 \mathrm{mM} \) 및 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} 0.0188 \mathrm{mM} \) 보다 친화력이 낮은 것으로 나타났지만, 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} 0.133 \mathrm{mM} \), 잉어 골격근의 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} 0.173 \mathrm{mM} \) 및 송어 골격근의 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} 0.209 \mathrm{mM} \)에 비해 친화력이 상당히 높게 확인되었으며, 풀망둑 눈조직 \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\text {PYR }} 0.089 \mathrm{mM} \)과 비교하면 파랑볼우럭의 \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소와 유사하였다. 특히 눈조직이 골격근과 심장조직보다 \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\mathrm{PYR}} \)도 낮아 친화력이 크므로 만성적인 저산소에 적응되어 LDH 활성은 낮지만 대사속도가 빠르게 최적화된 것으로 생각된다.</p> <p>피루브산 \( 0.1 \mathrm{mM}, 0.5 \mathrm{mM} \) 및 \( 1.5 \mathrm{mM} \)에서 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따라 측정한 두 종의 LDH 활성을 비교하였다. 파랑볼우럭 LDH는 피루브산 \( 1.5 \mathrm{mM} \)에서 활성을 측정한 경우 보다 \( 0.5 \mathrm{mM} \)에서 측정한 경우의 활성이 높았고, \( \mathrm{pH} 4.5 \sim 5.0\), \( \mathrm{pH} \) 7.5~8.5에서 활성이 높았으며 최대 활성은 \( \mathrm{pH} 8.0 \)이었다. 큰입우럭 LDH는 피루브산 농도에 따라 활성이 높은 \( \mathrm{pH} \)가 다르게 나타났지만 \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 5.0 \)까지 비교적 모두 높게 나타났고, \( 0.1 \mathrm{mM} \) 경우 \( \mathrm{pH} 6.0 \sim 7.5,0.5 \mathrm{mM} \) 경우 \( \mathrm{pH} 7.0 \sim 8.0,1.5 \) \( \mathrm{mM} \) 경우 \( \mathrm{pH} \) 7.5~8.5에서 높게 나타났으므로 \( \mathrm{pH} \) 4.0~5.0와 \( \mathrm{pH} 7.5 \)가 안정적이었다. 또한 LDH \(\mathrm{A}_{4} \)와 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소도 최적 \( \mathrm{pH} \) 가 6.5~7.5에서 보고 되었으므로 두 종의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 상대적 활성 및 LDH 활성과 세포 내 \( \mathrm{pH} \)를 고려하여 피루브산 \( 0.5 \mathrm{mM} \)과 \( \mathrm{pH} \) 7.5를 측정조건으로 선택하였다.</p> <p>따라서 파랑볼우럭과 큰입우럭의 LDH 활성을 Whitt 방법에 따라 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( \mathrm{pH} \) 6.85에서 측정한 경우 활성이 저해되어 낮게 나타났으므로 본 실험 결과에서 LDH 활성을 측정하는 조건으로 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산 농도와 Tris-HCl buffer, \( \mathrm{pH} \) 7.5를 제시하였다. 어류의 경우 종에 따라 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 LDH 활성이 저해되는 정도가 다양하고, 특히 저산소 환경에 적응된 어류 종의 눈조직 LDH 와 LDH eye-specific \( C_{4} \) 동위효소의 경우 일반적으로 피루브산에 대한 저해 정도가 크게 나타나므로 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산 농도 및 \( \mathrm{pH} \) 7.5에서 측정해야할 것으로 사료된다.</p> <p>실험 결과 파랑볼우럭과 큰입우럭은 저산소 조건에 적응되어 있는 종으로써 눈조직에서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 발현되고, 혐기적 대사 비율이 높게 확인되었으며, 피식자인 파랑볼우럭의 눈조직 LDH 활성이 더 큰 것으로 확인되었다. LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 눈조직 LDH 보다 더욱 낮은 피루브산 농도에서 최대 활성에 이르러 에너지를 더욱 빠르게 생성하는 것으로 나타났다. 파랑볼우럭 눈조직 LDH 와 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 큰입우럭의 LDH 에 비해 고농도 피루브산에 의해 저해되는 정도가 조금 더 크므로 저산소 조건에 더욱 적응되어 진화된 것으로 사료된다. 그리고 큰입우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 파랑볼우럭의 \( \mathrm{C}_{4} \) 동위 효소보다 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)이 낮아 친화력이 크고 저농도의 피루브산에서 활성이 더 크며, 고농도 피루브산에 의해 LDH 활성이 저해되는 정도가 낮고 젖산에 대한 내성이 크므로 해당과정에 의해 에너지를 좀 더 많이 생성할 수 있는 것으로 보인다. 따라서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 의해 크기는 작지만 빠르게 생성된 에너지를 포식 행동의 초기반응에 사용하여 먹이를 추적한 후 골격근의 LDH에 의해 생성된 에너지를 사용하는 것으로 사료된다.</p>	생명
장수상황버섯 균사체를 이용한 고체 발효한약재의 대장암 세포성장 억제 활성	<h2>한약재 추출물 및 발효 한약재 추출물의 인간 적혈구 용혈활성</h2> <p>36 종 한약재 추출물과 발효 한약재 추출물을 대상으로 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 평가하였다. 먼저 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 10 \% \) 이상의 용혈을 나타낸 한약재는 감국 \( (11 \%) \)과 견우자 \( (67 \%) \) 2종이었으며, 발효 한약재중에는 골쇄보에서 \( 11 \% \) 의 용혈현상을 나타내었다(result not shown). 그러나 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 12 종의 한약재가 \( 20 \% \) 이상의 용혈활성을 나타내었으며, 특히 백과, 신이 및 견우자 추출물은 각각 \( 80.8,93.4 \) 및 \( 99.4 \% \) 의 강력한 용혈활성을 보였다. 한편, 발효에 이용된 장수상황버섯 균사체 추출물은 \( 150 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 3.56 \% \) 의 무시할 만한 용혈활성을 나타내었음에도 불구하고, 고체발효 한약재의 경우에는 거의 모든 한약재에서 용혈활성이 증가되었다. 발효에 의해 용혈활성이 감소된 경우는 백렴, 삼칠, 행인 및 괄루근의 4 종이었다. 일반적으로 한약재의 경우 찌거나 발효에 의해 saponin성분들이 증가되고, 이에 따라 항암활성 및 용혈활성이 증가됨을 고려할 때, 이러한 결과는 한약재의 고체발효 동안 사포닌 성분의 급격한 증가 때문에 나타나는 현상으로 이해되며, 향후 관련성분의 탐색이 필요하다. 따라서 한약재 고체발효과정을 통해 한약재의 다양한 성분 변화와 이에 따른 생리활성의 변화가 나타남을 확인하였으며, 본 실험에서는 고체발효에 의해 대장암세포 성장억제능이 의미있게 증가된 골쇄보, 구기자 및 패모를 대상으로 항암활성 및 정상세포에 대한 독성정도를 추가적으로 조사하였다.</p> <h2>고체발효 골쇄보, 구기자, 패모의 정상세포 및 대장암세포 생육억제 활성</h2> <p>HCT116 대장암세포에 대한 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 농도별 생육억제능을 평가하였으며, 그 결과 \( 50 \% \) 생육억제능을 나타내는 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \)는 각각 394, 917 및 \( 149 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 로 계산되었다. 그러나 고체 발효시킨 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 경우에는 각각 28, 85 및 \( 80 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 를 나타내었다. 이는 골쇄보, 구기자 및 패모의 고체발효 과정 중 암세포 성장억제 활성물질이 생산되었음을 의미하며, 발효 골쇄보가 가장 강력한 암세포 성장억제능을 가짐을 알 수 있었다. 반면 인간 및 마우스 유래의 정상세포 HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1에 대해 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물을 처리한 경우 \( 200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도까지 세포독성은 나타나지 않았으며, 오히려 \( 200 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 의 고농도에서는 이들 세포들의 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. 또한 고체발효한 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물 역시 정상세포들에 대해 심각한 세포독성을 나타내지 않았으며, 골쇄보 \( (200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 의 경우 HEK-293 세포에서 35 \%, 구기자 \( (200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 의 경우 MC3T3-E1세포에서 \(30 \% \)의 세포성장 억제를 나타내었다. 그러나 대장암 세포에 대한 발효 골쇄보 및 구기자의 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 가 \(28 \) 및 \( 85 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)임을 고려할 때(Table 3), \( 100 \sim 200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리농도 범위에서는 정상세포에 대한 세포독성은 미미하여 대장암세포에 우선적으로 세포독성을 나타낼 것으로 예상된다.</p> <h2>한약재의 methano추출물의 조제</h2> <p>준비된 36 종의 한약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 각각 \(1 \mathrm { l } \) 플라스크에 넣고, 이를 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 멸간한 후 상온에서 냉각하였으며, 이후 10 배 부피의 methanol을 첨가하여 상온에서 24 시간 동안 3회 반복 추출하였다. 추출액은 filter paper (Whatman No.2)로. 거른 후 감압 하에서 농축하여 한약재 추출물을 조제하였다.</p> <h2>균사체를 이용한 한약재의 고체발효 및 발효 한약재의 추출물 조제</h2> <p>준비된 36종의 한약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 각각 \( 850 \mathrm { ml } \) polypropylene bottle (Namsan Eng., Korea)에 넣고 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20분간 멸균한 후 냉각하였으며, PDB 배지에서 \( 25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } , 130 \mathrm { rpm } \) 으로 10일간 배양한 장수상황버섯 균사체 액체 종균 \( 20 \mathrm { ml } \) 씩을 한약재에 각각 무균적으로 접종하였다. 이후 멸균마개를 이용하여 오염을 방지하고, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 90 \% \) 의 배양기에서 20일간 발효시켰다. 발효 한약재의 methanol 추출물은 한약재 추출물 조제와 동일한 방법으로 조제하였다. 접종에 사용된 액체 종균 균사체는 원심 집균한 후 멸균수로 2회 수세하고 2일간 동결건조 후, 상기와 동일한 방법으로 균사체의 methanol 추출물을 조제하였다.</p> <h2>세포주 배양 및 생존율 조사</h2> <p>본 실험의 HCT116, HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1 세포주의 배양 및 계대에는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco-BRL Inc., USA)를 사용하였으며, \( 10 \% \) Fetal Bovine Serum (Gibco-BRL Inc., USA), 1 \% penicillin 및 streptomycin(WelGene Inc., Korea)을 첨가하여 사용하였다. 한편 조제된 다양한 추출물들이 HCT116, HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1 세포주의 세포 생육에 미치는 영향은 One solution cell proliferation assay kit (Promega, USA)을 이용하여 평가하였다. 즉, 96 well plate에 well당 \( 3 \times 10 ^ { 3 } \) 개의 세포를 접종하고 24 시간 배양한 후 다양한 농도의 한약재 추출물, 발효한 약재 추출물 및 균사체 추출물을 처리하였다. 각 추출물을 각각 24시간 동안 반응시킨 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 \( \mathrm { H } \)-tetrazolium (MTS; Promega, USA) 용액을 각 well 당 \( 20 \mathrm {\mu l } \)씩넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 4 시간 동안 반응 시켰으며, 반응 종료 후 96 well plate reader (Expert 96 UV ASYS Hitech, Austria)를 이용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 성장률을 계산하였다. 결과 수치는 4 개의 독립적인 well 에서 수행한 값을 mean \( \pm \)SD 값으로 나타내었으며, \( 50 \% \) 성장억제를 나타내는 농도를 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) (Inhibitory Concentration 50)로 표시하였다.</p> <h2>인간 적혈구 용혈 활성 평가</h2> <p>제조된 추출물의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구 \( (4 \%) \)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다. 기존의 보고한 방법과 동일하게, PBS로 3회 수세한 인간 적혈구에 추출물 시료용액을 가하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응한 다음, 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 \( 414 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. 용매 대조구로 DMSO ( \(2 \% \)), 적혈구의 \( 100 \% \) 용혈을 위한 실험 대조구로 triton X-100 ( \( \ 0.1 \% \))을 사용하였으며, 다음의 수식을 이용하여 용혈활성을 계산하였다.</p> <p>( \( \% \)) Hemolysis \( = [( \mathrm { S } - \mathrm { C } ) /( \mathrm { T } - \mathrm { C } )] \times 100 \) \( \mathrm { S } \) : 시료 첨가구의 흡광도, \( \mathrm { C } \): DMSO 첨가구의 흡광도, \( \mathrm { T } \): triton X-100 첨가구의 흡광도.</p> <h2>통계분석</h2> <p>실험 결과는 SPSS 17.0 버전을 사용하여 mean \( \pm \)SD로. 나타내었으며, ANOVA Tukey LSD 통계처리방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 \( \mathrm { p }<0.05 \) 로 하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>한약재 추출물 및 발효한약재 추출물의 대장암세포 성장억제 활성</h2> <p>36 종 한약재 추출물이 대장암세포 성장에 미치는 영향을 평가하고자 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 HCT116 배양액에 첨가하고 24 시간 배양한 후 각각의 성장률을 측정하였다. 그 결과, 사인, 천궁, 석곡, 백선피, 시체, 두충, 백과, 신이, 와송, 삼칠, 견우자, 원지 및 괄루인의 13 종에서 암세포 성장률이 \( 50 \% \) 이하를 나타내어 이들 한약재가 대장암세포 성장억제능을 가짐을 알 수 있었다. 특히 사인, 와송, 삼칠, 견우자 및 원지 추출물은 무첨가구에 비해 각각 \(29.3,29.5,17.5 \), 및 \( 20.6 \% \) 의 성장률을 나타내어 우수한 암세포 성장억제능을 나타내었다. 한편 한약재 고체발효의 경우, 백부자, 감국, 신이, 황정 및 대추의 경우 정상적인 균사체 성장이 이루어지지 않아 대장암세포 성장억제능을 평가하지 못하였다. 발효에 이용된 장수상황버섯 균사체 추출물의 경우 \( 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 46.3 \% \) 의 성장률을 나타내어 대장암세포 성장억제능을 확인할 수 있었다. 고체발효 한약재 추출물에서는 사인, 천궁, 석곡, 시체, 두충, 와송, 삼칠, 견우자, 원지 및 괄루인의 10 종은 발효전과 거의 동일한 성장억제 활성을 나타내었으나, 백선피, 백과 및 신이의 경우에는 고체발효에 의해 대장암세포 성장억제능이 부분적으로 감소하였다. 반면 도인, 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 경우에는 발효에 의해 대장암세포 성장억제능이 오히려 증가되어 암세포 성장률이 무첨가구에 비해 각각 \( 26.6, 29.1, 23.4 \) 및 \( 26.3 \% \) 를 나타내었다(Table 2). 최종적으로 한약재 고체발효에 의해 대장암세포 증식억제능이 증가된 경우는 도인, 골쇄보, 구기자 및 패모의 4 종이었으며, 증식억제능이 감소된 경우에는 백선피, 백과, 신이, 황부자, 산약, 현삼 및 괄루인의 7종이었다.</p> <h2>고체발효 골쇄보, 구기자, 패모의 인간 적혈구 용혈활성</h2> <p>고체발효 골쇄보, 구기자, 패모의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 평가한 결과는 Table 4에 나타내었다. 먼저 장수상황버섯 균사체 추출물의 경우 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도까지는 거의 용혈이 나타나지 않았으며, \( 250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 15.5 \%, 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \( 84 \% \) 의 용혈을 나타내었다. 선정 한약재 중 골쇄보 추출물은 \( 125 \sim 250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \(13 \sim 17 \% \)의 용혈을 나타내었으나, 발효 후 추출물에서는 \( 50 \sim 125 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \(11 \sim 18 \% \)의 용혈을 나타내었다. 특히 \( 150 \sim 250 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \(74 \sim 88 \% \) 의 매우 강력한 용혈현상을 확인하였다. 구기자의 경우에도 이러한 현상은 유사하게 나타났으며, 구기자 추출물 \( 250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 11.2 \% \) 의 용혈이 나타났으나 발효. 후 추출물에서는 \( 125 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 10 \%, 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \( 69.2 \% \) 의 용혈을 나타내어 발효과정 중 용혈활성 물질이 생성되었음을 알 수 있었다. 패모 추출물의 경우에는 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 36.6 \% \), 발효 후 추출물 \( 150 \mathrm { lg } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 85.7 \% \) 의 용혈 활성을 발효 골쇄보와 거의 유사한 용혈독성을 확인하였다. 이러한 결과는, 골쇄보, 구기자, 패모의 고체발효 중 암세포 성장억제물질 및 용혈 활성물질이 동시에 매우 강력하게 생성됨을 시사하고 있으나, 발효 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 대장암 세포에 대한 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 농도범위(28 \( 85 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 에서는 용혈현상이 심각하게 나타나지는 않을 것으로 예상된다. 따라서, 향후 고체발효 최적화 및 대량발효를 통한 대장암세포 성장억제 활성물질 및 용혈활성 물질의 각각의 분리연구가 필요하다고 판단된다. 본 연구 결과는 장수상황버섯 균사체를 이용한 한약재 고체발효가 새로운 항암 활성물질 개발 및 신규의 생리활성물질 생산에 이용될 수 있음을 제시하고 있다.</p> <h1>서 론</h1> <p>버섯은 전 세계적으로 약용 및 식용으로 널리 이용되고 있으며 다양한 생리기능 조절작용과 항암 활성이 알려져 있다. 그 중에서도 상황버섯은 항암 활성 및 면역기능 증강 활성이 우수한 것으로 보고되어 있다. 뽕나무 줄기 등에 자생하는 진휽버섯속 백색 부후균인 상황버섯은, 갓 표면을 제외하고는 모두 황색을 나타내어 상황이라 불리며 전 세계적으로는 약 220 여종이 존재한다. 이 중 국내에서는 Phellinus linteus, P. baumuii, P. gilvus, P. igniarius 등의 7종이 존재하며 P. baumii와 P. linteus가 가장 일반적으로 재배, 유통되고 있다. 상황버섯 자실체는 독성이 없어 식품 원재료로 사용 가능하며, 면역력 강화, 급성알러지 억제, 항산화, 항혈전, 항고혈압, 항돌연변이 활성 및 암, 심장병 등의 성인병 예방과 개선효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는, 자실체 이외에 상황버섯 균사체에서도 항혈전 활성, 항산화 및 항암작용, 위궤양 완화효과 및 항염증 작용, 치매 관련 \( \beta \)-secretase저해 활성 등의 생리활성이 보고되면서, 경제적이면서도 배양이 용이한 상황버섯 균사체 이용에 관한 연구가 집중되고 있는 실정이다. 이와 더불어, 버섯의 강력한 섬유소 분해능 및 고체발효 능력을 이용하여 새로운 기능성 생물소재를 개발하고자 하는 시도가 있으며, 특히 생리활성이 우수한 다양한 한약재에 유용 버섯균 사체를 접종하여 새로운 생리활성물질 개발 및 기존 한약재의 생리활성을 강화하려는 연구가 진행되고 있다.</p> <p>본 연구팀에서도 최근 항산화 및 항혈전 활성이 우수하다고 알려진 36 종의 한약재를 대상으로 P. baumii 균사체를 접종하여 고체발효를 성공하였으며, 고체발효에 의해 골쇄보, 천련자, 도엽, 와송의 경우 항혈전 활성이 발효전에 비하여 \( 14 \sim 32 \% \) 증가되었고, 원지, 현삼, 백지, 향부자, 골쇄보 및 육종용에서는 항산화 활성이 발효전에 비해 \( 20 \sim 60 \% \) 정도 증가됨을 보고한 바 있다. 본 연구에서는, P. baumii 균사체를 이용한 한약재 고체발효 추출물의 암세포 성장억제 효과를 확인하고자, 36 종의 한약재 및 이들의 고체발효 한약재 추출물을 대상으로 인간 대장암세포 성장억제능과 인간 적혈구 용혈활성을 각각 평가하였다. 그 결과 일부의 고체발효 한약재 추출물이 정상세포에는 독성이 거의 나타나지 않으면서 대장암세포의 성장을 특이적으로 억제함을 확인하였다. 본 연구는 유용버섯을 이용한 한약재 고체발효가 새로운 생물자원 개발에 이용될 수 있음을 제시하고 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, 배지, 종균, 한약재 및 세포주</h2> <p>Phellinus baumii (장수상황버섯)는 (주)바이온에서 보관중인 균주를 Potato dextrose agar (Difco Co., USA) 배지에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 일 배양하여 사용하였고 4 주 간격으로 계대배양 하였다. 36종의 한약재는 2007년 및 2009년 대구 한약재시장에서 구입하여 사용하였으며, 사용부위 및 이들의 고체발효. 정도는 Table 1에 나타내었다. 한약재는 사용 전 흐르는물에 30초간 수세하여 불순물을 제거한 후 탈수하여 사용하였으며, 한약재에 접종할 종균은 이미 보고한 방법과 동일하게 준비하였다. 암세포 성장억제능 평가에는 인간 대장암 세포주 HCT116를 이용하였고, 정상세포에 대한 독성평가를 위해서는 인간 embryonic kidney 유래의HEK-293 세포, 마우스 지방 전구세포인3T3-L1 및 조골 전구세포 MC3T3-E1을 이용하였으며, 이들은 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p>	생명
초피 과피의 성숙정도에 따른 향기성분의 변화	<h1>결과 및 고찰</h1> <p>초피 과육의 성숙 시기별 향기성분의 변화를 관찰하기 위하여 2001년 6월 2일, 7월 14일 및 9월 11일에 채취하여 음건한 다음 향기성분을 추출하여 각 화합물의 mass spectrum을 해석하여 동정한 향기성분의 종류를 Fig. 1~6 및 Table 2에 나타내었다. 초피가 완전히 성숙하가 전인 6월 2일에 채취한 과피에서는 \( \alpha \)-pinene, myrcene, \( \gamma \)-terpinene, \( \alpha \)-terpinolene, 등 8 종의 terpene류, \( \alpha \)-amorphene, \( \delta \)-cadinene, 8-heptadecene, 등 7종의 hydrocarbon류, linalool, 1-\( \alpha \)-terpineol, citronello13의 alcohol류, citronellal 등 3종의 aldehyde류, piperitone 등 5종의 ketone류, \( \alpha \)-terpinenyl acetate, lavandulyl acetate 등 4종의 ester류 및 rose oxide trans 등 2종의 oxide가 검출되었으며, 밝혀지지 않은 물질도 수 종 검출되었다.</p> <p>또한 이 성분들 중에서 \( \gamma \)-terpinene, myrcene, citronellal 및 piperitone 4종은 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \) 이상 검출되어 초피의 향 발현에 주요한 역할을 하는 것으로 추정되었으며, 특히 citronellal은 최종 채취시기인 완숙기에 \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \)에 이르러 \( a \)-pinene이 최대량으로 검출되었다는 보고와는 상이한 결과였다.</p> <p>초피의 향기성분 중 가장 많은 종류는 terpene 및 terpene alcohol 등의 terpenoid류이며, 타 식물체에서도 검출 되고 있는 \( \beta \)-myrcene, \( \alpha \)-pinene, \( \alpha \)-terpinene 및 \( \alpha \)-terpinolene 등이 검출되었다. Terpenoid는 쑥, 들깻잎, 살구와 매실, 카모밀 및 미나리 등의 식물체에 존재하며, 식물종류에 따라 다양한 조성을 이루므로서 고유의 향을 발현하는 것으로 알려져 있다. 이중 초피에서 검출된 pinene과 terpinolene은 향긋한 솔향, myrcene은 풀향, 그리고 terpinene과 terpene alcohol은 꽃과 과일의 주요향으로 알려져 있어, 이 화합물들이 초피의 전체 향 발현에 가장 주요한 역할을 하는 것으로 추정되었다. 또한 꽃과 과일의 향으로서 알려진 geraniol, fenesol, terpineol, terpinene-4-ol 등의 terpene alcohol함량이 다소 검출되어 이들 화합물도 초피의 향에 기여할 것으로 추정되었다.</p> <p>초피의 성숙 진행에 따른 향기성분의 변화를 보면, terpene류인 \( \alpha \)-phellandrene, \( \alpha \)-terpinolene과 ester류인 lavandulyl acetate 등은 감소하는 반면에 linalool, citronellal, piperitone 등의 alcohol류, aldehyde류 및 ketone 류의 함량이 급격하게 증가하는 경향을 나타내었다.</p> <p>그리고 alcohol 및 terpene alcohol류 (Fig. 2)는 6월 2일에는 13종류, 7월 14일과 9월 11일에는 15종류로서 같았으나, 구성물질의 종류는 채취시기에 따라서 달랐는데, 6월 2일 채취한 재료에서는 cis-linalool oxide, linalool, piperitol isomer, 4-vinyl-methoxy-phenol, stathulenol이, 7월 14일 재료에서는 cis-linalool oxide, linalool L, piperitol isomer, trans-nerolidol이, 9월 11일 채취 재료에서는 1- \( \alpha \)-terpineol, cis-piperitol, trans-(\(+\))-carveol, cuminic alcohol, 4-vinyl-methoxy-phenol, stathulenol 및 farnesol isomer B가 소량 또는 관찰되지 않아서 시기별로 상당한 차이가 있었다. Aldehyde 및 terpene aldehyde류 (Fig. 3)는 9월 11일 채취 재료에서 cuminic aldehyde와 phellandral이 관찰되지 않았다. Ketone류 (Fig. 4)는 채취시기가 늦어질수록 물질의 수가 감소하였는데, 7월 14 일 채취시에는 caran-2-one이, 9월 14일 채취시에는 pinocarvone과 caran-2-one이 관찰되지 않아서 생육후기로 갈수록 감소하는 경향이었다. Ester류 (Fig. 5)는 6월 2일 채취시에 [(E)-6,7-ephoxy-3,7-dimethyl-2-octenyl]ester of acetic acid과 geraniol propionate이, 7월 11일 채취시에는 cinnamyl acetate과 [(E)-6,7-ephoxy-3,7-dimethyl-2-octenyl]ester of acetic acid이, 9월 11일 채취시에는 geranyl acetate, lavandulyl acetate 및 geraniol propionate이 관찰되지 않아 채취시기에 따라 성분물질의 생성 또는 분해에 의한 차이가 있었을 것으로 추측된다. Hydrocarbon류 (Fig. 6)는 6월 2일에 채취하였을 때에는 7종류가 있었으나, 7월 14일 채취 재료에서는 4,7,10-cyclou-ndecatriene과 n-heptadecane이, 9월 11일에 채취 재료에서는 [3-nonen-5-yne, 4-ethyl-, (E)-]이 관찰되지 않아 각각 7종과 8종의 물질이 확인되었다.</p> <p>한편 한국산 초피 (Z. piperitum DC)로부터 정유성분을 분석한 몇가지 연구결과를 보면, 과피에서는 1,8-cineol, limonene, geraneol acetate, and myrcene이, 잎에서는 citronellal, 1,8-cineol과 citronellol이 주요 방향성물질이라고 하였으며, 초피잎에서 limonene외 7 hydrocarbon류들, citronellol 7외 alcohol류들, cumin aldehyde외 1 aldehyde, carvone, 그리고 estragole외 1 oxide를 확인하였으며, 그 중 citronellal \( (23.11 \%) \), 1,8-cineol \( (18.38 \%) \), citronellol (6.04\( \% \), methyl cinnamate \( (4.08 \%) \) 등이 주성분이라고 보고하였다. 또한 일본의 Kojima 등[15]은 일본산 초피의 필수오일에는 주요 방향성물질이 2-tridecanone, (Z)-3-hexenol과 2-undecanone이라고 하였으며, aroma extract dilution analysis (AEDE) 방법을 이용하여 분석한 또 다른 결과에서는 citronellol과 citronellal이 주요한 향기활성을 나타내는 물질이라고 하여, 일본산과의 비교는 물론 국내산들의 비교에서도 초피의 향기성분 조성은 연구자에 따라서 차이가 있었다. 이러한 결과와 본 연구의 결과를 종합하면 초피의 향기성분은 채취시기, 또는 기후 풍토에 따라 향기의 조성이 달라지기 때문일 것으로 추측되며, 더구나 우리나라와 일본에서 생산한 초피 향기성분 조성의 차이는 채취시기는 물론 품종 또는 식물생장기의 기후와 밀접하게 관계하고 있을 것으로 생각된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>초피나무는 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 등지에서 널리 자생하는 운향과 (Rutaceae)의 산초나무속 (Zanthoxylum)에 속하는 낙엽관목으로 각종 매운 맛, 정유성분 및 유지가 함유되어 있어 동북아시아에서 가장 오래된 전통적인 조미료일 뿐만 아니라, 의약품, 살충제 및 곤충의 섭취방해제로서 사용되기도 하였으며, 항균활성도 있는 것으로 보고되어 최근 관심을 끌고 있는 식물이다.</p> <p>초피 (Z. piperitum DC)에는 특이하면서 강한 향이 있는데, 이 향이 사람의 눈에 자극성을 나타내는 물질이라고 알려져 왔다. 이 특유한 향은 limonene, \( \alpha \)-terpineol, linalool, citral, citronellal, cineol dipentene과 geraniol 등으로서 과피의 주요 향기성분이라고 하였으나, Kojima 등[15]은 citronellol과 citronellal이 향기특성을 나타내는 주성분이라고 하였다. 한국산 초피의 정유성분을 분석한 결과, 과피에서는 1,8-cineol, limonene, geraneol acetate과 myrcene이, 잎에서는 citronellal, 1,8-cineol과 citronellol이 주요 향기물질이라고 하였다. 한편, 초피에는 향기 화합물 외에도 차가운 맛과 함께 혀의 감각을 마비시키는 자극성 물질인 \( \alpha \)-HO-sanshool과 어독성 성분인 L-asarinin 및 각종 항암물질 등이 함유되어 있어, 앞으로 활용 가치가 높은 자원식물로 인식되고 있다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 아시아의 전통적인 향신료로서 생리적 기능성이 뛰어난 한국산 초피의 성숙중에 휘발성 정유성분의 변화를 조사하고자, 성숙 시기별로 채취한 초피과육의 정유를 SDE추출장치 (Simultaneous Steam Distillation-Extraction Apparatus)로 포집하여 GC-MS로 분석하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <p>초피 (Zinthoxylum piperitum DC)의 채취 시기별 향기성분의 변화를 관찰하기 위하여 밀양시 단장면 국전에 있는 재배 농가에서 2001년 미숙시기인 6월 2일, 크기가 최대에 도달하고 과피가 적색을 나타내기 전인 7월 14일과 과피가 익어서 선명한 붉은 색을 나타내고, 열개하기 전인 9월 11에 채취하여 음건한 것을 시료로 하였다. 향기성분의 분석은 강 등의 방법[6]에 준하였는데, 초피의 과피 \( 30 \mathrm { ~g } \)을 취하여 증류수 \( 150 \mathrm { ~m } \ell \)를 함께 넣고 SDE 연속추출장치 (Simultaneous Steam Distillation-Extraction Apparatus)로 3시간 동안 diethyl ether에 포집하였다. SDE장치로 포집하여 농축한 휘발성 정유는 GC-MS (HP 6890GC \( + \)HP 5970 MSD)에서 Table 1과 같은 조건으로 분석하였다. 각 화합물의 동정은 Willey, REVE 및 REVF NBS liberary 및 표준물질을 이용하였다. 분리된 각 화합물의 정량은 각 피크의 면적을 내부표준물질 (4-decanol)의 피크면적과 비교하여 아래의 계산식으로 산출하였으며, 이때의 response factor를 1로 가정하였다.</p> <p>\[ \text { 휘발성화합물의 농도 } ( \mu \mathrm { g } ) = \\ \frac {\text { 휘발성화합물의 피크면적 } \times \text { 내부표준물질의 양 } ( \mu \mathrm { g } ) } {\text { 내부표준물질의 피크면적 } } \]</p>	생명
인동덩굴 추출물과 분획물의 항산화 활성 및 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과	<h2>총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량 측정</h2> <p>인동덩굴 추출물의 총 페놀성 화합물 함량 측정은 Alves 등의 방법을 이용하였다. 추출물 \( 80 \mu \mathrm { l } \) 에 Folin-Ciocalteu시약 \( (50 \% \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 을 \( 20 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가한 다음, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 반응시켰다. 그 후 포화 \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } \) 용액( \( \left .2 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } \right ) 200 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 혼합하고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 30 \mathrm { ~min } \) 반응시킨 후 ELISA reader (Tecan, Austraia)를 이용하여 \( 760 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. Caffeic acid를 표준 물질로 하여 농도별 표준 곡선을 작성한 후, 총 페놀성 화합물 함량을 측정하였다.</p> <p>인동덩굴 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등의 방법을 이용하였다. 추출물 \( 30 \mu \mathrm { l } \) 에 증류수 \( 120 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가한 다음, \( \mathrm { NaNO } _ { 2 } (25 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } ) 9 \mu \) 를 넣고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 반응시켰다. 이 용액에 \( \mathrm { AlCl } _ { 3 } (10 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } ) 9 \mu \mathrm { l } \) 를 넣고, \( 1 \mathrm { ~min } \) 후 \( \mathrm { NaOH } (1 \mathrm { M } ) 60 \mu \mathrm { l } \) 와 증류수 \( 72 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가한 뒤 \( 510 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로 luteolin을 이용하여 표준 곡선을 작성한 후, 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.</p> <p>인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 HPLC 크로마토그램은 Fig. 9에 나타내었다. HPLC 크로마토그램의 peak를 동정하기 위해 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 추출 및 여과하고 용매를 감압 건조시켜 파우더를 얻은 뒤, 에탄올로 녹여서 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. HPLC분석 결과, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 TLC크로마토그램에서의 LJT1 ( \( \left . \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } 0.74 \right ) \) 은 Fig. 9의 HPLC peak 2 (coumaric acid), LJT2 ( \( \left . \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } 0.63 \right ) \) 는 peak 4 (apigenin), LJT3 \( \left (R_ { f } 0.54 \right ) \) 는 peak 1 (caffeic acid), LJT4 \( \left (R_ { f } 0.40 \right ) \) 는 peak 3 (luteolin)과 일치함을 확인하였다.</p> <p>성분 분석을 통해 확인한 인동덩굴 주성분인 Caffeic acid와 luteolin의 항산화 효능은 여러 연구를 통해 알려져 있다. 페놀성 화합물인 caffeic acid는 주로 커피콩, 과일, 백리향과 같은 허브 등에서 발견되며, 항산화 효능뿐만 아니라 항암 효과를 가지고 있다. 플라본 화합물인 luteolin은 인동덩굴 이외에 땅콩 껍질, 목서초, 국화, 파슬리, 샐러리 등에 존재하며, 항산화, 항염증, 세포 보호 효과 등을 가지고 있다. Luteolin의 항산화 효능은 높은 환원력과 플라보노이드 B 고리의 금속 이온 킬레이팅 작용에 기인하며, 상호 작용할 수 있는 다른 항산화제가 존재하는 생물학적 시스템에서 항산화 시너지 효과를 나타낸다고 알려져 있다. TLC 및 HPLC 성분 분석을 통해 인동덩굴 추출물의 주성분인 caffeic acid와 luteolin이 인동덩굴 추출물의 높은 항산화 활성과 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과에 기여함을 확인하였다.</p> <h3>인동덩굴 추출물의 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량 측정.</h3> <p>페놀성 화합물 및 플라보노이드는 뛰어난 항산화 효능을 나타내는 물질로, 천연물의 항산화능에 매우 중요한 역할을 하는 성분 중 하나이다. 앞서 TLC와 HPLC를 통해 확인한 caffeic acid, luteolin을 포함한 페놀성 화합물 및 플라보노이드의 함량을 확인하기 위해 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 측정 결과는 Table 4 에 나타내었다.</p> <p>인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 분획물에 함유된 총 페놀성 화합물의 함량을 caffeic acid의 양으로 환산한 결과, 에틸아세테이트 분획물 \( (159.2 \mathrm { mg } / \mathrm { g } ) \) 이 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 \( (35.7 \mathrm { mg } / \mathrm { g } ) \) 보다 약 \( 4.5 \) 배 높은 함량을 나타내었다. 총 플라보노이드 함량을 luteolin의 양으로 환산하여 나타낸 결과, 인동덩굴 추출물과 분획물에 각각 \( 145.5,635.4 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 의 총 플라보노이드 함량을 나타내었다. 실험 결과를 통해 인동덩굴 추출물의 뛰어난 항산화 활성 및 세포 보호 효과가 다량의 페놀성 화합물과 플라보노이드의 함유에 의한 결과임을 확인하였으며, 특히 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 \( 50 \% \) 에탄올 추출물보다 약 \( 4.5 \) 배 높은 페놀성 화합물 및 플라보노이드를 함유하고 있어 더욱 우수한 항산화 활성을 나타냄을 확인하였다.</p> <p>ROS Scavenging ( \%) \( = \left \{\frac {\left ( \mathrm { Cpm } _ {\text { control } } - \mathrm { Cpm } _ {\text { experiment } } \right ) } {\left ( \mathrm { Cpm } _ {\text { control } } - \mathrm { Cpm } _ {\text { blank } } \right ) } \right \} \times 100 \)</p> <h2>광용혈(Photohemolysis)법을 이용한 세포 보호 효과 측정</h2> <h3>적혈구 현탁액 제조.</h3> <p>적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, \(1,518 \times g \) 으로 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.4 \), \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \cdot 12 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 9.6 \mathrm { mM } , \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 1.6 \mathrm { mM } \) )로 세척하여 원심 분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 이를 3 회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 냉장고에 보관하면서 사용하였으며 모든 실험은 채혈 후 \( 12 \mathrm { ~h } \) 이내에 행하였다. 광용혈 실험은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 O.D. 값이 0.6 이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10 ^ { 7 } \) cells \( / \mathrm { ml } \) 이었다.</p> <h3>인동덩굴 추출물 및 분획물의 광용혈 억제 효과.</h3> <p>적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm { ml } \) 를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 시료 용액을 첨가하였다. 시료를 농도별로 각각 \( 50 \mu 1 \) 씩 첨가하고 암소에서 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal \( (13 \mu \mathrm { M } ) 0.5 \mathrm { ml } \) 를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm { ~min } \)동안 광조사하였다. 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \mathrm { ~cm } \times 20 \mathrm { ~cm } \times 25 \mathrm { ~cm } \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm { ~W } \) 형광 등을 장치하고, 형광등으로부터 \( 5 \mathrm { ~cm } \) 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 \( 15 \mathrm { ~min } \) 동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응 (post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴 정도를 \( 15 \mathrm { ~min } \) 간격으로 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈 정도에 비례한다. 모든 실험은 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온실에서 행하였다. 인동덩굴 추출물 및 분획물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈 정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시간인 \( \tau_ { 50 } \) 을 구하여 비교하였다.</p> <p>본 연구에서 사용한 인동덩굴(Lonicera japonica Thunb.)은 우리나라 전역의 산에서 자라는 반상록활엽 덩굴성 관목으로, 한약재명으로는 “금은화”라고 한다. 예로부터 인동덩굴의 줄기, 꽃, 열매 등은 고열, 급성 간염, 염증 등에 약용으로 사용되어왔지만 약간 독성이 있어 오래 먹으면 좋지 않다고 알려져 있다. 인동덩굴 추출물의 효능으로 항균, 항염증, 항당뇨에 대한 연구가 일부 보고되었다. 인동덩굴의 항산화 효능은 라디칼 소거능으로 확인된 바가 있으나, 피부에서 생성되는 ROS와 이에 따른 손상에 대한 연구로는 진행되지 않았다. 다시 말해, 실제로 피부 세포 및 조직에서 나타나는 다양한 종류의 활성산소종 생성 시스템인 \( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } - \mathrm { EDTA } / \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 계에서의 총 항산화능 평가나 광노화의 중요한 실험 모델 중 하나인 광증감 반응으로 생성되는 \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 등의 활성산소에 의해 개시되는 세포막 파괴와 세포 손상에 대한 세포 보호 효과에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 상기에 제시된 항산화능 평가와 함께 피부 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에서 과산화수소 및 자외선으로 유도된 산화적 스트레스에 대한 인동덩굴 추출물 및 분획물에 대한 세포 보호효과를 조사하였다.</p> <p>본 연구는 피부 광노화에서 중요한 항산화 평가법을 이용하여 식물유래 천연 항산화제로서 인동덩굴의 각종 ROS에대한 항산화능을 재평가함으로써 화장품에서 꼭 필요한 항산화 기능성 화장품 소재로서 개발 가능성이 있는지를 확인하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>기기 및 시약</h2> <p>UV-visible spectrophotometer는 Cary 50 (Varian, Australia), 화학발광기는 6-channel LB9505 LT (Berthold, Germany)를 사용하였다. HPLC는 Shim-pack VP-ODS C18 column ( \( 250 \mathrm { ~mm } \times 4.6 \mathrm { ~mm } , 5 \mu \mathrm { m } ) \) (Shimadzu, Japan) 제품을 사용하였다. Free radical 소거 활성에 사용한 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), EDTA, luminol, Folin-ciocalteu's phenol reagent은 Sigma chemical Co. (USA)에서 구입하였다. 기타 \( \mathrm { FeCl } _ { 3 } \cdot 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 는 Dae Jung Chemical \& Metals (Korea)사 제품을 사용하였다. 에탄올( \( \mathrm { EtOH } ) \), 메탄올 \( ( \mathrm { MeOH } ) \), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급시약을 사용하였다. 비교물질로 사용한 ( + )- \( \alpha \)-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, apigenin, caffeic acid, coumaric acid, luteolin은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 인동덩굴은 2017년 4월 서울 경동시장에서 구입하여 사용하였다.</p> <p>인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 \( 1,5,10 \) 및 \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 각각 \( 24.8,36.2,46.0,31.8 \mathrm { ~min } \) 을 나타내었고 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 \( 0.1,0.5,1,5 \) 및 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 각각 \( 26.2,39.0,52.3,47.1,16.9 \mathrm { ~min } \) 을 나타내었다. 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 세포 보호 효과가 증가하는 경향을 나타내었지만 \( 25 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } \) 의 고농도에서는 세포 보호 효과가 약간 감소하였다. 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 가장 높은 세포 보호 효과를 나타내었으며 동일한 농도에서 비교 물질로 사용한 지질과산화 연쇄 반응의 차단제인 지용성 항산화제 ( + )- \( \alpha \)-tocopherol ( \( 37.5 \mathrm { ~min } \) )보다도 높은 세포보호 효과를 가지고 있음을 확인하였다. 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물 또한 농도 의존적으로 세포 보호 효과가 나타났으나, \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 세포 보호 효과가 약간 감소하였고 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 고농도에서는 세포 보호 효과가 현저히 감소하였다. 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도에 서 가장 높은 세포 보호 효과를 나타내었으며, 동일한 농도의 ( + )- \( \alpha \)-tocopherol ( \( 31.1 \mathrm { ~min } \) )과 비교하였을 때 매우 높은 세포보호 효과를 나타내었다. 또한, \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 인동덩굴 에틸아세테이트 분획은 \( 50 \% \) 에탄올 추출물보다 약 2 배 높은 세포 보호 효과를 나타내었으며 이는 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다.</p> <h2>HaCaT 세포 보호 효과 측정</h2> <h3>HaCaT세포 배양.</h3> <p>각질 형성 세포인 HaCaT 세포주는 CLS Cell Line Service GmbH (Eppelheim, Germany)에서 얻어 사용하였다. 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin (P/S)을 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.</p> <h3>인동덩굴 추출물 및 분획물의 HaCaT 세포 독성 평가.</h3> <p>인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물이 각질 형성 세포인 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-di-phenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay를 이용하여 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다. 96-well plate에 \( 1 \times \) \( 10 ^ { 4 } \) cells/well로 분주하여 \( 60-80 \% \) 까지 배양하였다. 무혈청 배지에 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 희석하여 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 처리한 후, 배지를 모두 제거하고 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { MTT } \) 용액을 각 well에 첨가하여 \( 2 \mathrm { ~h } \)동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 반응시켰다. 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 녹이고 ELISA reader (Tecan, Austria)를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 세포 보호 효과.</h3> <p>HaCaT세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 96-well plate에 분주하고 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 incubator에서 배양하였다. \( 24 \mathrm { ~h } \) incubation 후, 배지를 모두 제거하고 무혈청 배지에 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 희석하여 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 배양하였다. PBS \( 100 \mu \mathrm { l } \)로 1회 세척한 후, 과산화수소 \( 2 \mathrm { mM } \) 농도(in PBS)로 \( 30 \mathrm { ~min } \) 처리하였다. 과산화수소를 모두 제거 후, PBS \( 100 \mu \mathrm { l } \) 로 2 회 세척하였다. 세척 후, 무혈청 배지로 바꿔 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 \( 24 \mathrm { ~h } \) 배양하였다. \( 24 \mathrm { ~h } \) incubation후, MTT assay로 세포 생존율을 확인하여 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 분획물의 세포 보호 효과를 확인하였다.</p> <h2>인동덩굴의 추출/분획 및 수율</h2> <p>실험에 사용한 인동덩굴은 Fig. 1과 같은 방법으로 추출 및 분획을 실시하였다. 건조된 인동덩굴 \( 400 \mathrm { ~g } \) 을 잘게 분쇄하여 \( 50 \% \) 에탄올 \( 8 \mathrm { ~L } \) 에 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 침적시킨 후 여과하였다. 이 여액을 감압 건조하여 분말을 얻었다. 항산화 효능을 나타내는 활성 물질을 효과적으로 추출하기 위해 \( 50 \% \) 에탄올 추출물을 중간 정도의 극성을 갖는 에틸아세테이트로 3 회 분획하였다. 에틸아세테이트 분획을 감압-농축하여 파우더를 얻었다. 수율은 건조된 인동덩굴 \( (400 \mathrm { ~g } ) \) 을 기준으로 계산하였다. 건조된 인동덩굴의 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 \( 4.85 \% \), 에틸아세테이트 분획은 \( 0.41 \% \) 로 나타났다.</p> <h2>인동덩굴 추출물의 항산화 효과 측정</h2> <h3>DPPH법을 이용한 Free Radical 소거활성.</h3> <p>DPPH법은 시료의 라디칼 소거능을 평가할 수 있는 실험법으로서, 비교적 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 전자주게능을 통하여 시료의 환원력을 측정하는 실험법이다. 실험 방법은 메탄올에 용해시킨 \( 0.2 \mathrm { mM } \)DPPH 용액 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 에탄올 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 첨가하고 여러 농도의 인동덩굴 추출물 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 방치 후 spectrophotometer로 \( 517 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하였다. 자유 라디칼 소거활성은 DPPH의 농도가 \( 50 \% \) 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, \( \mathrm { FSC } _ { 50 } , \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) )로서 표기하였으며, 자유 라디칼(DPPH) 소거활성( \%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.</p> <p>Radical Scavenging ( \%) \( = \left (1- \frac { A_ {\text { experiment } } -A_ {\text { sample blank } } } { A_ {\text { control } } } \right ) \times 100 \)</p> <h3>세포 내 ROS 소거 활성.</h3> <p>피부의 최외각 방어망인 표피에 자외선을 처리하면 세포 내 생성된 ROS가 세포의 구성 성분인 단백질, DNA 및 지질을 손상시키고 콜라겐, 엘라스틴과 같은 세포외기질을 분해시키는 MMPs의 발현을 촉진시켜 피부 노화를 가속화시킨다. 그러므로 세포 내 ROS 억제 작용이 있는 항산화 물질은 피부 노화를 억제할 수 있다. 따라서 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 각질 형성 세포 내 UVB로 유도된 ROS 소거 활성을 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { DCF } - \mathrm { DA } \) 를 이용하여 측정하였다.</p> <p>실험 결과, UVB를 조사한 실험군은 조사하지 않은 군 \(100 \% \)에 비해 \( \mathrm { ROS } \) 가 \( 453.6 \% \) 로 증가하였다. 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 \( \mathrm { HaCaT } \) 세포에 \( 0.4-12.5 \mathrm { gg } / \mathrm { ml } \) 농도 범위로 \( 24 \mathrm { ~h } \) 처리하였을 때, 모두 농도 의존적으로 ROS 감소를 나타내었다. \( 50 \% \) 에탄올 추출물의 경우 UVB 처리군에 비해 \( 1.56 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 이상에서 유의적 감소를 나타냈으며, 각각 \( 33.9,39.7,44.3,45.2 \% \) 감소율을 나타내었다. 그에 반해, 에틸아세테이트 분획물의 경우 \( 0.78 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 이상에서 유의적 감소를 나타냈으며, 각각 \( 22.7 \), \( 33.3,47.2,52.9,63.3 \% \) 의 감소율을 나타내었다. 게다가 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물을 비교했을 때, 최고 농도 \( 12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 에서 유의적 차이가 있음을 통계적으로 관찰함으로써 세포 내 ROS 억제 효능이 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 분획물에서 더욱 뛰어남을 확인하였다.</p> <h3>인동덩굴 추출물의 TLC 및 HPLC 성분 분석.</h3> <p>물의 TLC 크로마토그램은 Fig. 8에 나타내었다. Fig. 8은 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 TLC 크로마토그램이며, 크게 6 개의 띠로 분리되었다. 이 중 4 개의 띠를 UV 및 NP-PEG 발색법을 이용해 확인하였다. 실험 결과, \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } \) 값이 \( 0.74 \)인 LJT1은 coumaric acid로 나타났고 \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } \) 값이 \( 0.63 \) 인 LJT2 는 apigenin, \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } \) 값이 \( 0.54 \) 인 LJT3는 caffeic acid, \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } \) 값이 \( 0.40 \) 인 LJT4는 luteolin으로 확인되었다. 확인된 성분중에 caffeic acid와 luteolin이 가장 진한 색의 띠를 나타내었다.</p> <h3>Luminol 발광법을 이용한 \( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } - \mathrm { EDTA } / \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 계에 있어서 활성산소 소거활성(총 항산화능).</h3> <p>\( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } - \mathrm { EDTA } / \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 계는 다양한 \( \operatorname { ROS } \left ( \mathrm { O } _ { 2 } ^ { { } ^ { * - } } , \cdot \mathrm { OH } \right . \) 및 \( \left . \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \) 를 생성시키고, 철은 이 반응에서 촉매로 작용한다. 따라서 이 계를 이용하면 ROS에 대한 총 항산화능을 측정할 수 있으며, 이 총 항산화능에는 활성산소의 생성을 막아주는 킬레이트 작용도 포함될 수 있다. 생성된 ROS의 검출은 루미놀과 ROS와의 반응을 통한 화학 발광을 측정함으로써 확인할 수 있다. 화학 발광 측정용 튜브에 증류수 \( 1.78 \mathrm { ml } \) 를 넣고 여러 농도의 인동덩굴 추출물을 넣었다. 여기에 \( 2.5 \mathrm { mM } \) EDTA \( 40 \mu \mathrm { l } \) 및 \( 5 \mathrm { mM } \mathrm { FeCl } _ { 3 } \). \( 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 10 \mu \mathrm { l } \) 를 가한 후 \( 35 \mathrm { mM } \) luminol \( 80 \mu \mathrm { l } \) 를 넣고 흔들어 섞어주었다. 이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 항온시킨 후 \( 150 \mathrm { mM } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } 40 \mu \mathrm { l } \) 를 넣고 화학 발광을 \( 25 \mathrm { ~min } \) 동안 측정하였다. 대조군 (control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 와 \( \mathrm { FeCl } _ { 3 } \cdot 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 대신 증류수를 첨가하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다. 화학발광으로 측정한 저해율(%)은 다음 식과 같이 나타내었고, 활성산소 소거활성의 크기는 화학 발광의 세기(counts per minute, \( \mathrm { cpm } \) )가 \( 50 \% \) 감소되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity, \( \mathrm { OSC } _ { 50 } \) )로서 표기하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>피부 노화는 주요 발생 원인에 따라 내인성 노화와 외인성 노화로 구분할 수 있다. 내인성 노화는 생리적 요인의 기능 감소에 의해 발생하는 노화이며 외인성 노화는 자외선과같은 외부 환경의 산화적 스트레스에 의해 발생하는 노화이다. 외인성 노화를 대표하는 인자에는 자외선이 있는데, 자외선에 의해 발생하는 노화를 광노화라고 한다. 이는 피부노화의 상당한 부분을 차지한다. 피부 조직학적인 관점에서 관찰된 광노화에 의한 피부 변화에는 두꺼워진 표피, 깊은 주름생성 등이 있다. 특히 자외선에 많이 노출된 목덜미 등 에 특징적인 능선형의 주름이 생성된다.</p> <p>피부의 광노화에 대한 가설 중 자유 라디칼(free radical)설에 의하면, 피부가 자외선에 노출되었을 때 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성되고 이것이 피부 조직이나 세포에 직·간접적으로 영향을 주어 피부 노화를 유발하거나 촉진시킨다. 즉, ROS는 광노화의 가장 주된 원인이다. ROS란 반응성이 매우 높은 산소 종으로 하이드록실라디칼 \( ( \cdot \mathrm { OH } ) \), 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 \( \left ( \mathrm { O } _ { 2 } { } ^ { - } \right ) \), 과산화 디칼( \( \mathrm { ROO } \cdot ) \) 등의 산소 중심 라디칼과 일중항 산소 \( \left ( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \), 과산화수소 \( \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \), 하이드로과산화물 \( ( \mathrm { ROOH } ) \) 등의 비라디칼종이 있다.</p> <p>앞서 언급한 활성산소의 공격으로부터 신체를 보호하기 위해 우리 몸은 다양한 항산화 네트워크를 구축하고 있다. 대표적인 항산화제로는 superoxide dismutase (SOD)와 같은 효소적 항산화제와 비타민 \( \mathrm { C } \), 비타민 \( \mathrm { E } \) 와 같은 비효소적 항산화제가 있다. 하지만, 자외선 조사에 의해 ROS가 과잉 생성되면 피부에 존재하던 항산화제가 감소하여 항산화 네트워크가 무너지게 되고 피부 노화가 촉진된다. 따라서 노화로부터 피부를 보호하고 항산화 네트워크를 유지하기위해 항산화 물질을 보충해줘야 한다. 항산화제는 크게 합성과 천연 항산화제로 나뉘어져 있는데, 뛰어난 항산화 효능을 지닌 식물유래 천연 항산화제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.</p> <h1>요 약</h1> <p>DPPH를 이용한 인동덩굴 추출물의 자유라디칼 소거활성 \( \left ( \mathrm { FSC } _ { 50 } \right ) \) 측정 결과, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물 (77.25 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 \( (152.00 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 보다 약 2 배 높은 활성을 나타내었다. Luminol 발광법을 이용한 인동덩굴 추출물의 활성산소 소거활성(총 항산화능, \( \mathrm { OSC } _ { 50 } \) ) 측정 결과, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물 \( (0.33 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } )>\) 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 \( (1.12 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } )>\mathrm { L } \)-ascorbic acid (4.95 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 순서로 높게 나타났다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 으로 유도된 적혈구 파괴에 대한 세포 보호 효과 \( \left ( \tau_ { 50 } \right ) \) 측정 결과, 인동덩굴 추출물의 농도에 의존적으로 세포 보호 효과가 나타났으나, 고농도에서는 세포 보호 효과가 감소하는 경향을 나타내었다. 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도(46.0 min)에서, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도(52.3 \( \mathrm { min } \) )에서 가장 높은 세포 보호 효과를 나타내었다. 인동덩굴 추출물 및 분획물의 세포 독성 평가 결과, 본 실험에서는 \( 0.4-12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도 범위를 설정하여 세포 보호 효과를 평가하였다. 과산화수소로 유도된 각질 형성 세포인 HaCaT세포 보호 효과는 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물 \( 12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 각각 \( 70.0,78.6 \% \) 의 세포 생존율을 나타냈으며, 대조군(65 \%)과 비교하여 유의한 세포 보호 효과를 가지고 있음을 확인하였다. UVB를 조사한 HaCaT세포의 세포 내 ROS 소거 활성에서 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물 모두 농도의존적으로 ROS를 소거하였으며, \( 12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 각각 \( 45.2,63.3 \% \) 의 ROS 소거율을 나타내었다. 이를 통해 인동 굴 에틸아세테이트 분획물이 \( 50 \% \) 에탄올 추출물보다 높은 세포 내 ROS 억제능이 있음을 확인하였다. TLC와 HPLC 크 로마토그램을 이용한 인동덩굴의 에틸아세테이트 분획물의 성분 분석을 통해 caffeic acid, luteolin, apigenin, coumaric acid를 확인하였다. Caffeic acid와 luteolin의 뛰어난 환원력과 킬레이팅 작용이 인동덩굴 추출물의 활성산소 소거활성과 세포 보호 효과에 크게 기인했을 것으로 사료된다. 인동 덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물의 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량 측정 결과를 통해, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물이 \( 50 \% \) 에탄올 추출물보다 많은 페놀성 화합물, 플라보노이드를 함유하고 있기 때문에 더욱 우수한 항산화 활성을 나타내었음을 확인하였다.</p> <p>본 연구에서는 자외선에 의해 생성되는 다양한 ROS에 대한 인동덩굴 추출물 및 분획물의 항산화 활성을 평가하였고 이상의 결과를 통해 인동덩굴 추출물이 식물유래 천연 항산화제로서 가치가 있음을 시사하였다. 뿐만 아니라, 인동덩굴의 항산화 기능성 화장품 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3 회 반복하였고 통계자료의 값은 mean \( \pm \mathrm { SD } \)로 표시하였다. 통계적 유의성 검증은 GraphPad Prism \( 5.0 \) (USA) 프로그램을 이용하였으며, Student's \( t \)-test 및 one-way ANOVA 검정을 적용하여 \( p<0.05 \) 또는 \( p<0.01 \) 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>인동덩굴 추출물의 항산화 활성</h2> <h3>DPPH법을 이용한 자유라디칼 소거활성.</h3> <p>자외선 조사로 인해생성되는 활성산소 중 라디칼을 보유하고 있는 것은 반응성이 높기 때문에 세포막과 결합하여 지질과산화반응을 개시할 수 있다. 이 때 라디칼에 전자를 제공하여 라디칼을 소거할 수 있는데 이러한 환원력을 이용하여 시료의 자유 라디칼 소거활성(free radical scavenging concentration, \( \mathrm { FSC } _ { 50 } \) )을 측정하였다.</p> <p>본 실험에서는 비교적 안정한 라디칼인 DPPH를 이용하여 인동덩굴의 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 라디칼 소거활성을 측정하였다. 지용성 항산화제인 ( + )- \( \alpha \)-tocopherol을 대조군으로 라디칼 소거능을 비교했을 때, 자유 라디칼이 \( 50 \% \) 소거되는 농도인 \( \mathrm { FSC } _ { 50 } \) 은 인동덩굴 \( 50 \% \)에탄올 추출물에서 \( 152.00 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), 에틸아세테이트 분획물에서는 \( 77.25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 로 나타냈다. 따라서 인동덩굴 추출물의 자유 라디칼 소거활성은 ( + )- \( \alpha \)-tocopherol \( \left ( \mathrm { FSC } _ { 50 } \right . \) \( 8.98 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 보다 높지 않았으며, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물이 \( 50 \% \) 에탄올 추출물보다 통계적으로 유의하게 약 2 배 높은 자유 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였다.</p> <h3>Luminol 발광법을 이용한 \( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } - \mathrm { EDTA } / \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 계에 있어서 활성 산소 소거 활성(총 항산화능).</h3> <p>본 실험법은 다양한 ROS를 생성하는 \( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } \)-EDTA/H \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 계에서 Fenton 반응을 이용한 항산화능 평가법이다. 본 실험에서는 Fenton 반응에 의해 생성된 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } , \mathrm { O } _ { 2 } { } ^ { - } , \cdot \mathrm { OH } \) 와 같은 활성산소 소거능과 활성산소 생성 억제의 중요 수단인 킬레이팅 효과를 동시에 평가하여 총체적인 활성산소 소거능을 확인할 수 있다. 총 항산화능(ROS scavenging concentration, \( \mathrm { OSC } _ { 50 } \) )은 활성산소로부터 전자를 받은 luminol이 에너지를 방출하면서 내뿜는 420-450 nm의 빛을 측정하여 평가하였다.</p> <p>고농도에서의 인동덩굴 추출물 및 분획물의 세포 보호 효과 감소를 통해, 고농도의 추출물 및 분획물에 세포막 교란 혹은 세포 독성을 나타내는 물질의 존재 가능성을 확인하였다. 게다가 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도의 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물에서 대조군(30.8 min)보다 용혈이 빠르게 나타나는 것으로 미루어보아 이 물질이 에틸아세테이트 분획에 더 많이 함유되어 있을 것으로 예상된다.</p> <h2>HaCaT 세포 보호 효과</h2> <h3>인동덩굴 추출물 및 분획물의 HaCaT 세포 독성 평가.</h3> <p>MTT assay를 통해 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에 대한 독성을 확인함으로써 앞으로의 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다. \( 0.4-400.0 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도의 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 HaCaT세포에 \( 24 \mathrm { ~h } \) 처리 후 세포 생존율을 확인하였다. 실험 결과, 아무 처리하지 않은 군에 비해 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), 에틸아세테이트 분획물은 \( 12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도까지는 세포 독성을 나타내지 않았다. 이를 바탕으로 본 실험에서는 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 최고 농도를 \( 12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 으로 설정하였다.</p> <h3>과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 세포 보호 효과.</h3> <p>과산화수소는 세포 내에서 \( \mathrm { O } _ { 2 } { } ^ { - } \)이 SOD로 촉매되어 생성되거나 자외선 조사에 의해서 과잉 생산되면 산화적 손상을 일으키게 된다. 활성산소인 과산화수소는 세포막을 통과하여 생체내 미량으로 존재하는 금속 이온과 반응하여 다른 ROS를 생성시켜 세포 손상을 야기시킨다[19]. 따라서 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물이 과산화수소로 유도된 HaCaT세포의 산화적 손상에 대한 세포 보호 효과를 확인하였다.</p> <p>실험 결과, 과산화수소를 처리한 실험군은 처리하지 않은 군에 비하여 약 \( 65 \% \) 의 생존율을 나타내었다. 0.4- \( 12.5 \mathrm { gg } / \mathrm { ml } \) 농도 범위에서 \( 50 \% \) 에탄올 추출물을 처리한 군은 최고 농도 \( 12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 에서만 \( 70.0 \% \) 의 세포 생존율을 나타내 유의적 차이를 나타냈다. 그러나 \( 0.4-12.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도 범위에서 에틸아세테이트 분획물을 처리한 군은 모든 농도에서 세포 생존율을 현저히 증가시켰으며 최대 \( 78.6 \% \) 까지 증가시켰다(각각 \( 73.2,74.8,76.9,76.0,78.0 \%) \). 세포 증식율은 Fig. 6B 에 나타내었다. 실험 결과, 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 최고 농도에서 \( 50 \% \) 에탄올 추출물이 약 \( 4.5 \% \) 의 증가율을 나타낸 것과 비교하여 에틸아세테이트 분획물은 약 \( 14.6 \% \) 의 증가율을 나타냄으로써 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 분획물이 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효능이 뛰어남을 확인하였다.</p> <p>활성산소가 \( 50 \% \) 감소하는 농도인 \( \mathrm { OSC } _ { 50 } \) 은 인동덩굴 \( 50 \% \)에탄올 추출물에서 \( 1.12 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), 에틸아세테이트 분획물에서는 \( 0.33 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 로 나타났다. 두 가지 조건 모두 강력한 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid \( (4.95 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 와 비교하여도 높은 항산화능을 가지고 있음을 알 수 있다. 특히, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 비교하여 약 4 배 높은 항산화 효능을 나타내었으며, L-ascorbic acid보다 월등히 높은 항산화 효능을 가지고 있음을 확인하였다. L-Ascorbic acid와 비교하여 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물은 모두 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. Fig. 2 와 비교하여 본 실험 결과에서 나타난 높은 항산화능을 통해 인동덩굴 추출물 및 분획물이 효과적인 킬레이트제라는 것을 확인하였다.</p> <h3>\( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 으로 유도된 적혈구 파괴에 대한 세포 보호 효과.</h3> <p>피부가 자외선에 노출되면 porphyrin 혹은 riboflavin과 같은 다양한 광증감제의 반응에 의해 \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 과 각종 \( \mathrm { ROS } \) 를 생성하게 된다. 이 때 생성되는 \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 은 반응성이 매우 강한 활성산소로 피부에 존재하는 항산화제를 빠르게 고갈시켜 항산화 네트워크를 붕괴시킨다. 또한 세포막의 지질과산화반응을 개시하여 세포 손상을 촉진시킨다[14]. 따라서 본 실험법에서는 광증감제인 rose-bengal과 적혈구 세포를 이용하여 인동덩굴의 피부 광노화에서의 항산화능 및 세보 보호 효과를 평가하였다. 특히, 적혈구는 철을 함유하고 있어 암반응 상태에서도 Fenton 반응에 의한 다양한 ROS를 생성하고 세포막 및 구성 성분을 파괴시키기 때문에 천연물의 항산화 활성을 평가하는데 적합하였다. 본 실험에서는 적혈구 세포가 \( 50 \% \) 파괴되는데 걸리는 시간 \( \left ( \tau_ { 50 } , \min \right ) \) 을 측정하여 세포 보호 효과를 평가하였으며 세포 보호 효과가 클수록 값이 크게 나타났다.</p> <h3>세포 내 ROS 소거활성 평가.</h3> <p>세포 내 ROS 소거활성 평가는 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate \( \mathrm { H } _ { 2 } \) DCF-DA)를 사용하여 fluorescence를 측정하는 방법을 이용하였다. HaCaT 세포를 96 -well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well의 농도로 분주하여 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 배양한 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 배양하였다. Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)를 이용하여 세포를 2 회 세척하였다. \( 20 \mu \mathrm { M } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { DCF } - \mathrm { DA } \) 로 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 처리한 후, CL-1000 ultraviolet crosslinker를 이용하여 DPBS 상태에서 200 \( \mathrm { mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \mathrm { UVB } \) 를 조사하여 세포 내 \( \mathrm { ROS } \) 를 생성시킨 직후, fluorescence ELISA reader (excitation, \( 490 \mathrm { ~nm } \) emission, \( 530 \mathrm { ~nm } \) ) 기기를 통하여 형광의 세기를 측정하였다.</p> <h2>TLC 및 HPLC를 이용한 인동덩굴 추출물의 성분 분석</h2> <p>인동덩굴 추출물 중 에틸아세테이트 분획물을 \( 100 \% \) 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milliopore \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) )를 이용하여 여과한 후 여과된 추출물 용액을 이용하여 극성 TLC (normal phase) 및 비극성 HPLC (C18) 분석에 이용하였다. TLC분석 시 사용한 전개 용매는 Table 1 에 나타내었다. 성분은 이미 보고된 분광학적 자료, 표준물질의 \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } \) 값과 자외선 및 NP-PEG (natural products-polyethylene glycol, 2-aminoethyl diphenylborinate) 발색법을 이용한 띠의 색상 등을 통해 확인하였다. HPLC 분석은 \( 2 \% \) acetic acid 수용액과 \( 0.5 \% \) acetic acid를 함유한 \( 50 \% \) acetonitrile 수용액을 이용해 기울기 용리법으로 분석하였고, HPLC 분리조건은 Table 2에 나타내었다.</p>	생명
비수리 추출물의 항균 및 항산화 활성	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>기기 및 시약</h2> <p>UV-visible spectrophotometer는 Varian(Australia) 사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold(Germany) 사의 6-channel LB9505 LT를, pH meter는 Istek(Korea) 사제품을 사용하였다.</p> <p>\( (+)-\alpha \)-Tocopherol(1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, arbutin, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), luminol, heparin, 증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 는 Junsei Chemical Co.(Japan) 제품을, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)는 Dae Jung Chemical \& Metals(Korea)사 제품을 사용하였다. 완충용액제조에 사용된 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \) -\( 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{NaCl} \), trizma base, \( \mathrm{HCl} \) 그리고 ethanol \( (\mathrm{EtOH}) \), methanol \( (\mathrm{MeOH}) \), ethyl acetate (EtOAc), octanol 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 L-tyrosine과 \( N \)-succinyl-(Ala) \( )_{3}-p \)-nitroanilide, 효소로 사용된 tyrosinase (9.3 mg solid, 5,370 units \( / \mathrm{mg} \) solid), elastase (4.5 \( \mathrm{mg} \) protein \( / \mathrm{mL}, 6.5 \) units \( / \mathrm{mg} \) protein)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 비수리 재료는 2009년 4월 경동시장에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>비수리의 분획 및 추출</h2> <p>건조된 비수리 \( 100 \mathrm{~g} \) 을 잘게 자른 후 \( 50 \% \) 에탄올 \( 2 \mathrm{~L} \) 를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하였다. 이 여액을 감압 - 건조하여 파우더를 얻고 이를 실험에 사용하였다. 또한 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 감압 - 농축한 후 물과 hexane을 이용하여 비극성 성분을 제거하고 이후 ethyl acetate 분획을 감압·농축하여 파우더를 얻었다.</p> <p>Ethyl acetate 분획으로부터 aglycone을 제조하였다. ethyl acetate 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수분해 반응을 이용하여 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 실험에 사용하였다. 실험 방법은 ethyl acetate 가용분 일정량에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 및 acetone 용액을 넣고, \( 4 \mathrm{~h} \) 동안 중탕 가열하면서 환류-냉각시킨다. 환류시킨 용액을 \( 5 \% \mathrm{KOH}-\mathrm{MeOH} \) 용액으로 중화 적정한다. 중화 적정 후 다시 ethyl acetate층을 분획하고 이를 감압·농축하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>Photohemolysis법을 이용한 세포보호 효과 측정</h2> <p>사람 적혈구를 대상으로 수행하는 활성산소에 의한 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한 점이 많다. 따라서 이 실험법을 이용하여 천연물을 대상으로 활성산소에 대한 세포보호 효과를 측정할 수 있다.</p> <p>적혈구 현탁액 제조: 적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 \( \mathrm{rpm} \) 으로 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.4 \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 9.6 \mathrm{mM}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1.6 \mathrm{mM} \) )로 세척하여 원심분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 3 회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 모든 실험은 채혈 후 \( 12 \mathrm{~h} \) 이내에 행하였다. 광용혈 실험은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \mathrm{cells} / \mathrm{mL} \) 이었다.</p> <p>비수리 추출물의 광용혈 억제 효과: 적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm{~mL} \)를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 시료용액을 첨가하였다. 추출물을 농도별로 각각 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하고 암소에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal \( (12 \mu \mathrm{M}) 0.5 \mathrm{~mL} \) 를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사하였다.</p> <p>광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \mathrm{~cm} \times 20 \) \( \mathrm{cm} \times 25 \mathrm{~cm} \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm{~W} \) 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 \( 5 \mathrm{~cm} \) 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 \( 15 \mathrm{~min} \) 간격으로 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 투광도(transmittance, \%)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다. 모든 실험은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 항온실에서 행하였다. 비수리 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시간인 \( \tau_{50} \) 을 구하여 비교하였다.</p> <p>대조군(control)은 \( \tau_{50} \) 이 \( 32 \mathrm{~min} \) 으로 오차범위 \( \pm 1 \mathrm{~min} \) 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.</p> <p>Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 \( 120 \mathrm{~min} \) 까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 4 회 반복하여 평균하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>비수리 추출물의 항균 활성</h2> <p>비수리 추출물의 ethyl acetate 분획의 항균 활성을 Table 1에 나타내었다. 비듬균인 P. ovale에 대한 비수리 추출물의 ethyl acetate 분획의 \( \mathrm{MIC} \) 는 \( 0.125 \% \) 로 나타났고 이것은 methyl paraben \( (0.13 \%) \) 과 비교하였을 때 더 큰 항균활성을 나타내었다. 황색포도상구균인 S. aureus에 대한 비수리 추출물의 ethyl acetate 분획의 MIC는 \( 0.25 \% \) 로 나타났는데 이것은 methyl paraben \( (0.25 \%) \) 과 비교하여 동일한 항균활성을 나타내었다. 여드름균인 P. acnes와 대장균인 E. coil에 대한 비수리 추출물의 ethyl acetate 분획의 항균활성은 비교물질에 비해서는 낮은 활성을 나타내었지만 현재 사용되고 있는 방부제나 항균제가 평균적으로 \( 0.2 \sim 0.4 \% \) 정도의 농도 범위 내에서 사용되고 있는 것을 감안하면 비수리 분획물은 낮은 농도에서도 천연방부제, 항균제로서의 역할을 충분히 수행할 것으로 기대된다.</p> <h2>비수리 추출물의 항산화 활성</h2> <p>DPPH법을 이용한 Free Radical 소거활성: 비수리 \( ( \) L. cuneata G. Don) 추출물과 비교물질인 (+)- \( \alpha \)-tocopherol의 free radical 소거활성 \( \left(\mathrm{FSC}_{50}\right) \) 측정 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 비수리 추출물의 \( 50 \% \) extract 분획의 \( \mathrm{FSC}_{50} \) 은 \( 40.88 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \), ethyl acetate 분획인 경우 \( 20.80 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \), aglycone 분획은 \( 14.63 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 으로 나타났다. 따라서 free radical 소거활성은 \( 50 \% \) extract 분획<ethyl acetate 분획<aglycone 분획 순으로 증가하였다. 비교 물질로 사용한 (+)- \( \alpha \)-tocopherol의 free radical 소거활성은 \( 8.98 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 나타났다.</p> <p>Luminol 발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에 있어서 활성산소 소거 활성(총 항산화능): 비수리 추출물의 활성산소 소거활성(총 항산화능, \( \mathrm{OSC}_{50} \) )을 Fig. 2에 나타내었다. 비수리 추출물의 ethyl acetate 분획의 활성산소 소거활성은 \( 0.14 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{mL} \) 이고 aglycone 분획은 \( 0.07 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 나타났다. 비교물질로 사용된 L-ascorbic acid의 활성산소 소거활성은 \( 1.50 \mu \mathrm{g} \) / \( \mathrm{mL} \) 로 나타났다. 따라서 비수리 추출물의 aglycone 분획이 ethyl acetate 분획보다 활성산소 소거활성이 보다 뛰어나고 이러한 비수리 추출물 분획들의 활성산소 소거활성은 비교물질로 사용한 L-ascorbic acid보다 큼을 알 수 있다.</p> <h1>요 약</h1> <p>본 연구에서는 비수리 추출물의 피부 상재균에 대한 항균작용과 항산화 활성, tyrosinase 저해 효과 등에 관한 조사를 수행하였다. 피부 상재균에 대한 항균활성 측정결과, \( P \). ovale에 대한 ethyl acetate 분획의 MIC는 \( 0.125 \% \) 로 나타났으며, 이는 methyl paraben보다 큰 항균활성을 나타내었다. 추출물의 free radical(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성 \( \left ( \mathrm { FSC } _ { 50 } \right ) \) 은 aglycone 분획 \( (14.63 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 에서 가장 큰 활성을 나타내었고, 또한 Luminol-의존성 화학발광법을 이용한 \( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } - \mathrm { EDTA } / \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 비수리 추출물의 총항산화능은 aglycone 분획 \( (0.07 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 비수리 추출물에 대하여 rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였고, 농도 의존적(1 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 으로 세포보호 효과를 나타내었다. Tyrosinase의 활성 저해 효과 \( \left ( \mathrm { IC } _ { 50 } \right ) \) 는 비수리 추출물의 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획이 각각 \( 104.83 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } , 27.55 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 으로 나타났다. 이상의 결과들은 비수리 추출물이 \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 혹은 다른 \( \mathrm { ROS } \) 를 소광시키거나 소거하고, ROS에 대항하여 세포막을 보호함으로써 생체계, 특히 태양 자외선에 노출된 피부에서 항산화제로서 작용할 수 있음을 시사한다. 또한 tyrosinase 저해활성과 피부 상재균에 대한 항균작용으로부터 항산화, 항노화 및 항균성 화장품 소재로서의 응용 가능성을 확인하였다.</p> <h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2> <p>L-Tyrosine으로부터 멜라닌 생성과정에서 전체 반응 속도를 결정하는데 작용하는 핵심효소는 tyrosinase다. 따라서 tyrosinase의 저해활성은 미백활성을 측정하는뎨 매우 중요하다. L-tyrosine \( (0.3 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } ) 1.0 \mathrm { ~mL } \), potassium phosphate buffer(0.1 M, pH 6.8) \( 1.85 \mathrm { ~mL } \), 시료 \( 0.05 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 항온 배양한 다음, 반응혼합물을 얼음수조에 넣어 반응을 종결시키고, \( 475 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 저해 활성은 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) tyrosinase의 활성을 \( 50 \% \) 감소시키는데 필요한 시료의 농도(inhibition concentration, \( \mathrm { IC } _ { 50 } , \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) )로 표기하였다.</p> <h2>Elastase 저해활성 측정</h2> <p>피부노화, 특히 주름 생성에는 활성산소에 의한 작용과 matrix metalloproteinase (MMPs : collagenase, elastase 등)에 의한 세포외 매트릭스의 파괴가 주 원인으로 간주되고 있다. 따라서 MMPs의 저해활성 측정은 피부노화 억제 평가에 대단히 중요하다.</p> <p>Tris- \( \mathrm { Cl } ( \mathrm { pH } \) 8.0) \( 0.12 \mathrm { M } \) 에 elastase 기질인 \( N \)-succinyl-(Ala) \( { } _ { 3 } \)-p-nitroanilide \( 1.0 \mathrm { mM } \) 이 용해된 buffer \( 1,300 \mu \mathrm { L } \) 에 측정시료용액 \( 7.5 \mu \mathrm { L } \) 와 buffer \( 92.5 \mu \mathrm { L } \) 를 첨가하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 pre-incubation 한 뒤 여기에 elastase 용액을 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 첨가(최종농도 \( 0.0025 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) )하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 수용상에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 항온배양한 후 \( 410 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 시료용액으로 사용된 용매를 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 첨가하였다. Blank는 \( N \)-succinyl-(Ala) \( )_ { 3 } \)-p-nitroanilide가 용해된 완충용액 대신 \( 0.12 \mathrm { M } \) tris-Cl buffer \( 1,300 \mu \mathrm { L } \) 를 첨가하였으며, 농도는 실험군과 동일하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 \( 5 \% \) 유의수준에서 Student's \( t \)-test를 행하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>피부는 다양한 환경적 요인과 항상 접촉하고 있기 때문에 산화적 스트레스 요인의 공격에 직접적으로 노출되어 있다. 이러한 산화적 스트레스의 주요인은 태양 자외선(UVA 및 UVB)에의 노출이며, 공해, 화학 산화제 및 미생물, 호흡이나 염증반응 등도 포함된다. 특히, 계속된 자외선의 노출로 인해 반응성이 매우 큰 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성되고 \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 및 \( \cdot \mathrm { OH } ^ { 2 } \) 를 비롯하여 \( \mathrm { O } _ { 2 } { } ^ {\cdot- } \), \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } , \mathrm { ROO } \cdot \mathrm { RO } \cdot, \mathrm { ROOH } \) 및 \( \mathrm { HOCl } \) 등의 활성산소종으로부터 유도된 광산화적 손상을 받게 되면 피부의 효소적 및 비효소적 항산화 방어망이 위태롭게 된다. 이러한 활성산소종이 야기하는 손상을 억제하기 위한 항산화 활성물질로서 다양한 천연 항산화제들과 BHA(butylated hydroxyanisol)와 BHT(butylate hydroxy toluene) 등의 합성 항산화제들을 많이 사용해 왔다. 하지만 합성 항산화제의 경우에는 과량 섭취 시 독성 작용을 일으키는 것으로 보고되고 있다. 따라서 최근에는 보다 안전하고 항산화효과가 뛰어난 천연 항산화제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.</p> <p>또한, 피부는 피부 상재균에 의해서 많은 피부질환이 발생되며, 대표적 피부 상재균으로는 여드름균, 비듬균 등이 있다[10]. 여드름은 일반적인 피부 질병이며 다양한 원인에 의해 발병된다. 이러한 원인 중 가장 중요한 원인은 여드름균(Propionibacterium acnes)의 증식이다. 비듬은 피지 분해 산화물이 혼합된 상태로 살아있는 피부 세포에서 생겨나게 되는 신진대사의 부산물을 말한다. 피부-에 상주하는 진균의 일종인 비듬균(Pityrosporum ovale)이 중요한 역할을 하며 긴장이나 스트레스와 같은 정신적 장애에 의헤 악화되기도 한다. 그 외에 의해 악화되기도 한다. 그 외에 잘 알려진 피부 상재균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 전 세계적으로 가장 많이 발견되는 피부 상재균이며 사람이나 동물의 표피에 다양한 질병을 야기시키고, 또 다른 피부 상재균인 대장균(Escherichia coli)은 식중독을 일으키며 사람이나 동물의 장에서 발견된다. 이러한 피부상재균 이외에도 화장품을 변질시키는 세균들이 피부에 악영향을 주고 있으며, 이를 사멀하기 위해 다양한 종류의 방부제나 항균제가 많이 사용되고 있다. 그러나 기존에 사용되고 있는 합성물질들은 피부에 알러지를 유발할 수 있으므로 비교적 인체에 무해한 물질로 대체하기 위해 많은 연구들이 진행 중이다.</p> <p>비수리(Lespedeza cuneata G.Don)는 콩과(Leguminosae)의 여러해살이 초본성 아관목으로 야관문, 삼엽초 등의 여러 가지 이름으로 불리며[13], 우리나라 전국의 산야에 분포하며 일본, 중국, 대만, 인도 등지에도 분포한다. 황폐지의 지피물 조성과 지력증진 식물로 널리 이용되는 흔한 식물이지만, 예로부터 민간에서는 간과 콩팥의 기능을 보호해 주므로 유정(遺精), 유뇨(遺尿) 등을 치료하고, 폐를 강화시키므로 해수, 천식, 유방염, 종기, 시력 강화 작용에 뛰어난 효과가 있다고 알려져 있다[15]. 지금까지 비수리에 관한 연구로서는 종자의 열수 및 에탄올 추출물의 항산화 활성과 미네랄, 아미노산, 비타민 분석이 보고되었으며, 잎 추출물에는 C-glycosylflavone 화합물인 isoorientin, isovitexin 등과 quercetin, kaempferol, vitexin, avicularin, juglanin 등이 보고되어 있다.</p> <p>그러나 비수리에 항균 또는 항산화 활성을 나타낼 것이라 사료되는 성분들이 많이 존재함에도 불구하고 비수리 추출물을 이용한 피부 상재균에 대한 활성이나 피부 노화 과정에 깊이 관여하는 활성산소인 \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 으로 유도된 세포손상에 대한 항산화적 보호 작용, 각종 \( \mathrm { ROS } \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } , \mathrm { O } _ { 2 } ^ {\cdot- } , \cdot \mathrm { OH } \right . \) 등)가 생성되는 계에서의 이들 ROS에 대한 총항산화능에 관한연구는 아직 되어 있지 않다. 따라서 비수리 추출물(혹은 분획)을 제조하고 이들 추출물(혹은 분획)의 피부 상재균에 대한 항균작용, \( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 으로 유도된 세포손상에 대한 보호활성과 free radical 소거활성, \( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } \)-EDTA/ \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 계에서 생성된 활성 산소에 대한 총항산화능, tyrosinase 활성 저해 효과를 측정함으로써 항균, 항노화 및 항산화 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다.</p> <h2>비수리 추출물의 항균 활성 측정</h2> <p>사용균주: 본 실험에서 사용한 균주는 호기성 그람 양성 균주인 Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC6538과 Escherichia coli (E. coli) ATCC23736, 여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes (P. acnes) ATCC6919, 비듬균인 Pityrosporum ovale (P. ovale) ATCC12078은 한국 미생물 보존센터에서 분양받아 사용하였다.</p> <p>배지 및 배양조건: 호기성 균주인 S. aureus와 E. coli는 Mueller Hinton 배지(Merck, Germany)를 사용하였으며 균을 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 배양하면서 사용하였다. 또한 비듬균인 P. ovale는 Pityrosporum 배지(Malt extract agar \( 6 \% \), ox-bile \( 2 \% \), tween- \( 401 \% \), glycerol monooleate \( 0.25 \% \) )를 사용하였으며 균을 접종한 뒤 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 \( \mathrm { h } \) 동안 배양하여 사용하였다. 또한 P. acnes의 배양 배지는 reinforced clostridial(RC) 배지(Merck, Germany)를 사용하였으며 P. acnes는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하면서 실험 \( 72 \mathrm { ~h } \) 전에 활성화시키고 균을 배양 배지에서 접종한 후 anaerobic jar에서 Gaspack system(Merck Anaerocult Gaspack system, Germany)을 이용하여 밀봉한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 72 \mathrm { ~h } \) 동안 혐기성 배양하였다.</p> <p>최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration: MIC): 최소억제농도(MIC)는 한천배지 확산법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 각각의 분획물들을 \( 2 \mathrm { ~mL } \) 씩 함유한 배지 20 \( \mathrm { mL } \) 를 petri dish에 주입하였고 시험균을 평판 배지 위에 \( 0.1 \) \( \mathrm { mL } \) 접종하였다. S. aureus 는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 24 \mathrm { ~h } \) 후에, P. ovale은 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 48 \mathrm { ~h } \) 후에, P. acnes는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 72 \mathrm { ~h } \) 후에 육안으로 관찰하였을 때, 각각의 균들이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.</p> <h2>비수리 추출물의 항산화 효과 측정</h2> <p>DPPH법을 이용한 Free Radical 소거 활성: Free radical은 피부노화의 원인 물질로 알려져 있는 물질이다. 따라서 \( \mathrm{DPPH} \) 를 이용하여 비수리 추출물에 대한 free radical의 소거활성을 측정하였다. 실험방법은 methanol에 용해시킨 \( 0.2 \) \( \mathrm{mM} \) DPPH 용액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 에탄올 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하고 여러 농도의 추출물 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 \( 10 \mathrm{~min} \) 동안 방치 후 spectrophotometer로 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 \( \mathrm{DPPH} \) 의 활성 저해율을 나타내었다. 소거 활성은 \( \mathrm{DPPH} \) 의 농도가 \( 50 \% \) 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, \( \mathrm{FSC}_{50}, \mu \mathrm{g} \) / \( \mathrm{mL} \) )로서 표기하였다.</p> <p>Inhibition (\%) \( =\left\{1-\left[\frac{\left(\mathrm{A}_{\text {Experiment }}-\mathrm{A}_{\text {Blank }}\right)}{\mathrm{A}_{\text {Control }}}\right]\right\} \times 100 \)</p> <p>Luminol 발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에 있어서 활성산소 소거 활성(총항산화능): \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계는 각종 \( \operatorname{ROS}\left(\mathrm{O}_{2^{*}} \cdot \cdot \cdot \mathrm{OH}\right. \) 그리고 \( \left.\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 를 생성시키고, 철은 이 반응의 촉매로 작용한다. 따라서 이 계를 이용하면 ROS에 대한 총 항산화능을 측정할 수 있는데 이 총 항산화능에는 활성산소의 생성을 막아주는 킬레이트 작용도 포함될 수 있다. 생성된 ROS의 검출은 luminol과 ROS 간의 반응을 통한 화학발광을 측정함으로써 알 수 있다.</p> <p>화학발광 측정용 튜브에 증류수 \( 1.78 \mathrm{~mL} \) 를 넣고 다양한 농도의 비수리 추출물을 넣었다. 여기에 \( 2.5 \mathrm{mM} \) EDTA 40 \( \mu \mathrm{L} \) 및 \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{FeCl} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 10 \mu \mathrm{L} \) 를 가한 후 \( 35 \mathrm{mM} \) luminol \( 80 \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 흔들어 섞어 주었다. 이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 항온 시킨 후 \( 150 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} 40 \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 화학발광을 \( 25 \mathrm{~min} \) 동안 측정하였다. 대조군(control)은 시료용액 대신에 에탄올을 넣고, 공시험 (blank)은 시료군과 조건이 동일하나 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 와 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를</p> <p>첨가하지 않은 것으로 하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 \( \mathrm{LT} \) 의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다. 화학발광으로 측정한 저해율을 다음 식과 같이 나타내었고, 활성산소 소거활성의 크기는 화학발광의 세기가 \( 50 \% \) 감소되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity, \( \mathrm{OSC}_{50}, \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) )로서 표기하였다.</p> <p>Inhibition \( (\%)=\frac{(\text { Control의 } \mathrm{cpm}-\text { Sample의 } \mathrm{cpm})}{(\text { Control의 } \mathrm{cpm}-\text { Blank의 } \mathrm{cpm})} \times 100 \)</p> <h2>\( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 으로 유도된 사람 적혈구의 파괴에 대한 세포보호 효과</h2> <p>비수리 추출물을 비롯한 몇 가지 항산화제들의 활성산소에 의한 세포 손상에 대한 보호 효과를 Fig. 3,4 에 나타내었다. 적혈구 세포가 \( 50 \% \) 파괴되는데 걸리는 시간 \( \left(\tau_{50}\right) \) 은 세포보호활성이 클수록 크게 나타난다. 비수리의 \( 50 \% \) extract 분획의 경우 \( 1,10,25,50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도에서 각각 \( 37.8 \), \( 51.3,65.3,98.1 \mathrm{~min} \), ethyl acetate 분획의 경우 38.7, 51.7, \( 64.5,72.2 \mathrm{~min} \) 으로 농도 의존적으로 세포 보호 효과를 나타내었다. Aglycone 분획의 경우는 \( 64.2,108.5,40.8,8.6 \) \( \min \) 으로 농도가 \( 25,50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 에서 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 아마도 추출물의 농도가 클 때는 세포막에 대한 교란작용(계면활성제로서의 작용)을 나타낼 수 있는 물질이 존재할 가능성도 생각할 수 있다. 세포보호 효과는 \( 10 \mu \mathrm{g} \)\( \mathrm{mL} \) 에서 \( 50 \% \) extract 분획 \( (51.3 \mathrm{~min})< \) ethyl acetate 분획 \( (51.7 \mathrm{~min})< \) aglycone 분획 \( (108.5 \mathrm{~min}) \) 순으로 증가하였다.</p> <h2>Tyrosinase 저해 활성</h2> <p>비수리 추출물 중 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획의 경우에 tyrosinase 저해활성 \( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \) 이 각각 \( 104.83 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \), \( 27.55 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 으로 나타났다. 비수리 추출물의 두 가지 분획 모두 비교 물질로 사용한 기능성 화장품의 미백제로 잘 알려진 arbutin의 저해 활성 \( (226.88 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 에 비해서 큰 tyrosinase 저해활성을 나타냈다. 따라서 ethyl acetate 분획 및 aglycone 분획을 화장품에 응용할 경우 미백효과가 클 것으로 사료되며 특히 aglycone 분획의 경우 매우 큰 미백효과가 나타날 것이라고 사료된다(Fig. 5).</p> <h2>Elastase 저해 활성</h2> <p>비수리 추출물의 elastase 저해활성 \( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \) 은 ethyl acetate 분획에서 \( 129.45 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \), aglycone 분획에서 \( 28.33 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 나타났다(Table 2). 따라서 비수리 추출물의 aglycone 분획은 ethyl acetate 분획에 비해 elastase 저해활성이 횔씬 뛰어나다는 것을 알 수 있다.</p>	생명
세균 배양액과 반응한 Lactobacillus plantarum 의 생장속도 및 항균 활성에 대한 연구	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Lactobacillus spp.의 항균활성</h2> <p>Lactobacillus spp. 균주로부터 Lactobacillus spp. M9 농축액을 확보하고 \( 25 ~\mu \mathrm{g} \)을 Escherichia coli (E. coli)에 처리하여 CFU assay를 시행하였다. 사용한 Lactobacillus spp.는 Lactobacillus plantarum (L. plantarum), Lactobacillus brevis (L. brevis), Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis (L. lactis), Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus)이다. 실험결과는 대조군 M9을 처리한 E. coli의 CFU를 \( 100 \% \)로 설정하고, 상대적인 값을 측정하여 비교하였다.</p> <p>L. brevis M9가 처리된 E. coli의 평균 CFU는 \( 42.98 \%\), L.lactis M9 처리군은 \( 33.37 \% \), L. acidophilus M9 처리군은 \( 61.14 \% \)였고, L. plantarum M9 처리군의 평균값은 \( 12.14 \% \)였다. 그러므로 본 실험으로 확보한 Lactobacillus spp. M9에는 Lactobacillus spp. 유래 항균물질이 존재함을 확인 할 수 있었으며, L. plantarum M9은 다른 Lactobacillus spp. M9과 비교하여 항균활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구는 항균활성이 가장 높은 L. plantarum M9를 선택하여 그 특성을 연구하였다.</p> <h2>다양한 세균에 대한 L. plantarum M9의 항균능력</h2> <p>L. plantarum M9의 농도에 따른 살균능력을 확인하기 위하여 사용된 표적 시험균주는 Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Salmonella typhimurium (S. typhimurium), Staphylococcus aureus (S. aureus)이다.</p> <p>실험에 적용된 L. plantarum M9의 농도는 각각 \(10, 25, 50 ~\mu \mathrm{g} \)으로 선정하였다. 실험을 통하여 농도 의존적인 항균 능력이 확인되었으며, 다양한 균에 대한 L. plantarum M9의 생장억제 기능을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 L. plantarum M9의 항균활성 관련 실험은 그 농도를 \( 25 ~\mu \mathrm{g} \)으로 고정하여 연구를 진행하였다.</p> <h2>세균 M9이 처리된 L. plantarum의 생장 속도 증가</h2> <p>일반적으로 장내 침입한 유해세균은 숙주의 장 세포에 상처와 스트레스를 유발하고 염증을 일으키는 endo-, entero-, exo-toixin 및 enzyme 등을 분비한다. 본 연구에서는 L. plantarum의 항균능력에 대항하는 병원균의 독성활성을 검토하였다. 즉, L. plantarum에 대한 세균 M9의 살균능력을 확인하였다. 이 실험을 위해 E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium, S. aureus의 M9을 확보하고 각 세균 M9의 \( 40 ~\mu \mathrm{g} \)을 L. plantarum에 처리하여 함께 배양한 후, L. plantarum의 생장속도를 확인하였다.</p> <p>흥미롭게도 모든 세균의 M9은 L. plantarum의 생장속도를 증가시켰다. 세부적으로는, M9 대조군 \( (\mathrm{OD}_{600}=0.48\), 6시간 배양 기준)과 비교하여, E. coli M9 처리군 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0.848\right) \), S. typhimurium M9 처리군 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0.85\right)\), P. aeruginosa M9 처리군 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0.654\right) \) 과 S. aureus M9 처리군 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0.721\right) \)이 모두 L. plantarum의 확연한 생장증가를 유도하였다. 반면 L. plantarum M9를 처리한 실험군에서는 L. plantarum \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0.47\right) \)의 생육증가가 관찰되지 않았다. 그러므로 L. plantarum은 세균 배양액을 특이적으로 인지하고 생장속도를 증가시킴으로써 병원균에 대한 방어를 준비하는 것으로 추측할 수 있다. 이 결과를 바탕으로 본 연구에서는 세균 M9의 처리 실험에서 가장 확연한 결과를 보였던 E. coli와 S. typhimurium의 M9을 사용하여 추후 실험을 진행하였다.</p> <h2>S. typhimurium M9와 반응한 Lactobacillus spp.의 생장 증가 유도</h2> <p>S. typhimurium M9이 처리된 L. plantarum의 생장증가 효과가 Lactobacillus spp.의 보편적 현상인지를 확인하기 위하여 Lactobacillus spp.의 생육증가를 확인하였다. 즉, S. typhimurium M9의 \( 40 ~\mu \mathrm{g} \)을 Lactobacillus spp.에 처리하여 함께 배양한 후 Lactobacillus spp.의 CFU를 분석하였다. 실험결과, M9이 처리된 대조군을 \( 100 \% \)라고 할 때, S. typhimurium M9을 처리한 L. plantarum의 CFU는 \(503\%\), L. brevis는 \(266\%\), L. lactis는 \(275\%\), L. acidophilus는 \( 206 \% \)로서 균주 모두 S. typhimurium M9에 의해 생장속도가 증가한 것으로 관찰되었고, 특히 L. plantarum의 증가량이 가장 큰 것으로 나타났다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주의 배양 조건</h2> <p>본 실험에서 사용한 Lactobacillus는 항생제내성균주은행 (CCARM, Seoul Women's University)에서 분양을 받았으며, 종류는 L. plantarum (CCARM 0067), Lactobacillus brevis (CCARM 0061), Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis (CCARM 0106), Lactobacillus acidophilus (CCARM 0059)이다. 이들 Lactobacillus는 Difco \( { }^{\mathrm{TM}} \) Lactobacilli MRS broth (Becton Dickinson, USA) 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 정치 배양하였다.</p> <p>Lactobacillus spp.의 생장속도와 항균능력을 관찰하기 위해 사용된 잠재적 병원성 세균은 Escherichia coli (ATCC 23736), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 29336), Salmonella typhimurium (CCARM 0125), Staphylococcus aureus (CCARM 3709)이며, Difco \( { }^{\text {TM }} \) Nutrient broth (Becton Dickinson, USA)의 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양하였다. 이 병원성 세균들은 항생제내성균주은행과 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, Korea)에서 분양받았다.</p> <h2>균 배양액의 농축</h2> <p>균의 정상배지에는 많은 영양요소가 함유되어 있으며, 균의 생장에 필요한 환경을 제공하기 때문에, 이러한 환경적 요인을 배제하기 위해 최소배지인 M9 minimal media를 선택하고 균을 배양하였다. 뿐만 아니라 실험을 통해 균이 분비한 물질에서 효과가 있음을 확인하였고, 정상배지의 요소를 배재하고 균이 분비한 물질의 효과에 초점을 두고 실험하기 위해 M9 minimal media를 선택했다. 시험 균주가 배양된 상층액은 균일한 농도로 실험하기 위해 농축하여 분말화 한 후 수용성인 부분만 취하였고 자세한 방법은 아래에 기술하였다.</p> <p>Lactobacillus M9: MRS 배지에 키운 \( \mathrm{OD}_{600}=8 \)의 Lactobacillus spp. 균은 M9 minimal broth(MB cell)의 \( 1 \mathrm{~L} \)에 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 36-48시간동안 정치 배양한다. \( \mathrm{OD}_{600}=1 \) 의 Lactobacillus를 \( 10,000 \times \mathrm{g}\), 10분간 원심 분리하여 pellet을 제거한 후 상층액을 취한다. 이 상층액은 \( 10 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} \)를 이용하여 M9 배지의 \( \mathrm{pH} \)를 6.8-7 사이로 맞춘다. \( 0.22 ~\mu \mathrm{m} \) filter (Millipore, USA)로 잔여의 균을 제거하고 감압 건조하여 분말화한다. 이 분말의 무게(Dry cell weight, DCW)는 \( 0.5 \mathrm{~g} /\mathrm{l} \)로서 ultrapure water \( 5 \mathrm{ml} \)에 녹여 최종 농도를 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 준비한다. 이 농축액을 Lactobacillus(spp.) M9이라 한다.</p> <p>세균 M9: Nutrient broth 배지에서 키운 병원성 세균들은 \( \mathrm{OD}_{600}=1 \) 까지 키우고, M9 minimal Broth의 \( 1 \mathrm{~L} \)에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양한다. 이와 같은 조건에서 \( \mathrm{OD}_{600}=1 \)의 균을 \( 10,000 \times \mathrm{g}\), 10분간 원심 분리하여 pellet을 제거한 후 상층액을 취한다. 이 상층액은 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \) filter (Millipore, USA)로 제균 후 감압 건조하여 분말화한다. 이 분말의 무게는 \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로서 ultrapure water \( 10 \mathrm{~ml} \)에 녹여 최종 농도를 \( 0.1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \)로 준비한다. 이 농축액을 세균 M9 bacterial M9)이라 한다.</p> <p>세균 M9과 반응시킨 Lactobacillus M9: 농축된 세균 M9이 처리된 Lactobacillus (spp.) M9으로서 MRS에서 배양된 Lactobacillus 균주를 M9에 접종할 때 세균 M9의 \( 40 \mu \mathrm{g} \)을 동시 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 36-48 \)시간동안 정치 배양하고 위와 설명한 동일한 방법으로 분리한다. 이 농축액을 세균 M9+ Lactobacillus M9이라고 표현한다.</p> <p>대조군 M9: M9 minimal broth의 \( 1 \mathrm{~L} \)를 감압 건조하여 ultrapure water의 \( 10 \mathrm{ml} \)에 녹여 대조군 처리 시약으로 사용한다. 이 농축액을 M9이라고 한다.</p> <h1>서 론</h1> <p>인간의 위장관(gastrointestinal tract)은 매우 복잡한 장내균총(gut microbiota)으로 이루어져 있으며, 장내균총은 영양소 합성, 소화, 병원균 정착 저해 및 항생능력, 숙주의 선천성 및 후천성 면역시스템의 성숙과 증진 등과 같은 인간의 생리기능에 있어 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 또한 장내균총은 조절 T 세포(regulatory T cells)를 유도함으로써 T helper 1 (Th1) cells과 T helper 2 (Th2) cells의 균형을 조절하여 면역학적 관용과 면역 활성에 기여한다.</p> <p>그런데 장내균총의 정착 및 발달은 유아기(infancy)부터 시작되고 태아기의 환경, 출산시기, 출산방법(자연분만 혹은 제왕절개), 수유 방법(모유 혹은 분유), 프로바이오틱스(probiotics) 및 항생제의 복용에 따른 환경적 요인과 유전자 유형 등에 따라 결정된다. 정상적인 분만 과정을 겪은 유아와 건강한 영·유아의 장(gut)에는 유익 균으로 알려진 Bifidobacterium 과 Lactobacillus가 우세하게 발견되며, 병원성 균은 적거나 발견하기가 어렵다. 하지만 반대로 출생과정 중에 겪게 되는 조기분만, 제왕절개, 또는 분유 섭취와 항생제 처방과 같은 환경적 요인은 병원균의 감염을 초래한다. 이때 유아기의 장내에 가장 먼저 침입하는 잠재적 병원성 세균은 Escherichia coli, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella와 Clostridium 속에 해당하는 균들이며, 이러한 세균에 감염된 장에서는 Bifidobacterium과 Lactobacillus가 극히 적게 발견된다. 특히 초년시기에 정착한 균총의 유형은 유년기 병원균의 감염여부와 환경적 위험요인(environmental antigen)에 따라 그 감수성에 영향을 미치고, 궁극적으로 성인시기의 장내균총을 결정하게 된다.</p> <p>장내 균총의 불균형은 유아기의 면역연관 질병(알레르기 관련 질환, 아토피 피부 질환, 염증성 장질환, 과민성 대장증후군, 신생아 괴사성 장염, 제 1 형 당뇨병 등)을 일으키는 요인이 되기도 하는데, 따라서 유아기의 장내균총 형성과정은 매우 중요하며, 궁극적으로는 생애전반의 건강과 삶의 질과 밀접하다고 할 것이다. 이러한 이유로 최근에는 면역 연관 질병의 예방 및 치료를 위해 probiotics가 유용하게 활용되는 경향을 보이고 있다. 또한 in vitro와 in vivo로 진행된 최근 연구는 유아기에 Lactobacillus plantarum (L. plantarum)을 이용한 probiotics 복용이 장점막 장벽의 안정화, 병원균으로부터의 방어 능력 향상, 항생 물질 분비 및 알레르기 질환 완화에 대한 효과를 보고하고 있다. 최근 수년간 소아 염증질환의 치료 목적으로 사용한 probiotics 및 synbiotics의 주요 균종은 Bifidobacterium 와 Lactobacillus 인데, 특히 L. plantarum은 probiotics 처방 후, 영유아의 장에 10일 내에 안정적으로 정착하지만, Bifidobacterium spp.은 30일 이상 소요된다는 결과가 보고되고 있다. 따라서 Lactobacillus은 유아기에 병원균 보다 먼저 장내에 우점종으로서 정착해야 면역시스템의 형성과 발달을 결정짓고 항생물질의 분비를 통한 방어 시스템이 가능하지만, 아직 Lactobacillus가 장의 우점종으로 정착하기 위한 환경적 요인과 항생물질 분비조절에 대한 이해는 부족한 실정이다.</p> <p>이에 본 연구는 Lactobacillus spp.를 병원성 세균의 배양 배지와 반응시켰을 때 Lactobacillus spp.의 생장속도를 알아보고자 한다. 이를 통하여 증가된 생장속도가 항생물질의 활성을 유도함으로써 항균효과가 증대시킬 것이라는 연구문제를 증명하고자 하며, 동시에 L. plantarum의 생장속도 및 항균물질 활성의 증가를 유도하는 병원균의 배양액 물질에 대한 특성을 검토하고, 분해효소, \( \mathrm{pH} \)와 열에 강한 소분자 물질이라는 가능성을 확인하고자 한다.</p> <h2>세균 M9과 반응한 L. plantarum의 항균 활성 증가</h2> <p>이상의 결과를 종합해볼 때, 다양한 세균을 비롯한 S. typhimurium M9은 L. plantarum 의 생장속도를 증가시키는 것으로 관찰되었다. 이를 바탕으로 본 연구는 S. typhimurium M9의 자극이 L. plantarum 생장증가 뿐만 아니라 항균 활성에도 영향을 주는지 확인하기 위해 아래와 같은 실험을 진행했다.</p> <p>M9만 세균에 처리한 대조군(Cont.), M9을 처리한 L. plantarum M9 (M9 + Lp), E. coli M9과 반응시킨 L. plantarum M9 (Ec + Lp), S. typhimurium M9과 반응시킨 L. plantarum M9 (St + Lp)을 시험균인 E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium, S. aureus 에 처리하여 각 균의 생육저해환 정도를 측정하였다.</p> <p>L. plantarum M9은 모든 시험세균에 대한 항균활성을 보였고, E. coli M9과 S. typhimurium M9와 반응시킨 L. plantarum M9의 항균활성은 L. plantarum M9 자체와 비교하여 큰 생육저해환이 관찰되었다(Table 1). 이 실험을 통해 세균 M9의 자극은 L. plantarum의 생장과 항균활성을 촉진한다는 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과를 통해 세균은 L. plantarum의 생장 및 항균능력을 자극하는 유도물질이 있음을 암시하며, Lactobacillus는 병원균 유래물질을 인지함으로써 항균능력이 향상되는 것으로 추정된다. 그러므로 본 연구에서는 세균 M9 내에 존재하는 L. plantarum의 자극 유도물질에 관심을 갖고 그 특성을 분석하였다.</p> <h2>세균 M9의 특성 분석</h2> <p>L. plantarum의 생장과 항균능력을 유도하는 세균 M9의 특성을 파악하기 위해 분해효소, \( \mathrm{pH} \)와 열에 대한 안정성을 조사하였다. 실험에 사용된 세균 M9은 S. typhimurium이며, 본 연구에서 사용되었던 다른 세균의 M9도 유사한 특성이 관찰되었다(data not shown). M9과 반응시킨 L. plantarum M9 (M9 + Lp), S. typhimurium M9와 반응시킨 L. plantarum M9 (St + Lp), 분해효소, \( \mathrm{pH} \)와 열을 각각 S. typhimurium M9과 반응시킨 후, 이 S. typhimurium M9을 처리한 L. plantarum M9 (Treated St + Lp)를 준비하고, 이들 M9을 E. coli에 처리하여 항균활성을 CFU로 확인하였다.</p> <p>결과는 다음과 같다.</p> <p>첫 번째, 세균 M9의 활성이 분해효소( \( \alpha \)-amylase, lipase, lysozyme, proteinase K)에 저해되는지 확인하였다. M9 + Lp (E. coli CFU: \(100\%\)) 보다 St+Lp (E. coli CFU: \(19.07\%\))의 항균능력이 높은 것으로 관찰되며, 각종 효소를 처리한 St + Lp (Treated St+Lp 처리군의 CFU; \( \alpha \)-amylase 처리: \( 22 \% \), lipase 처리: \( 18 \% \), lysozyme 처리: \( 24 \% \), proteinase K 처리: \( 18.2 \%) \)의 항균활성도 St + Lp와 유사하게 보존되었다. 그러므로 세균 M9은 다양한 분해 효소에 대해 안정한 것으로 나타났다.</p> <p>두 번째, \( \mathrm{pH} \)의 영향을 알아보기 위해 다양한 \( \mathrm{pH} \)범위에서 반응시킨 S. typhimurium M9의 특성을 분석하였다. \( \mathrm{pH} 2-8 \)의 산도에서 St + Lp와 비슷한 생육저해현상(CFU: \( 22 \%) \)이 관찰된것으로 미루어, 세균 M9은 넓은 \( \mathrm{pH} \)구간에서 매우 안정함을 알 수 있었다.</p> <p>세 번째, 온도에 대한 안정성을 검토하기 위해 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 항균실험을 실시했다. 열처리된 S. typhimurium M9 역시 L. plantarum의 항균능력(CFU: \( 20 \%) \)을 유도하였으며, 이 결과는 S. typhimurium M9의 내열성을 제시한다.</p> <p>추가로 다양한 세균 M9의 첨가 시 증가된 항균활성을 생육저지환의 결과로 도출하고 그 결과 사진은 Fig. 6에 나타내었다.</p> <p>따라서 이상의 결과는 세균 M9에 존재하는 분비대사체 중에서 L. plantarum의 생장과 항균능력에 영향을 주는 물질이 존재하며, 이 물질은 다양한 조건에서도 매우 안정성을 보유한 small molecule일 가능성을 제시한다. Lactobacillus는 유아기에 병원균 보다 먼저 장내에 우점종으로서 정착하는 것이 중요한 만큼, 병원균의 침입을 빠르게 인지하여 생</p> <p>장속도를 조절함으로서 항생물질의 분비를 통한 방어 시스템을 가동해야한다. 아직까지 Lactobacillus가 장의 우점종으로 정착하기 위한 환경적 요인과 항생물질 분비조절에 대한 이해는 부족한 실정이므로 본 연구는 이 질문에 대한 대답을 제공했다고 사료된다. 뿐만 아니라 probiotics는 항생제의 기능을 가짐과 동시에 항생제의 단점인 잔류량 및 내성 문제가 없기 때문에 병원성 미생물을 효과적으로 억제 할 수 있다면 현재로서는 가장 바람직한 대안이다. 그러므로 본 연구를 통해 관찰된 세균 감염에 의존적인 Lactobacillus의 항균활성증가는 관련 산업개발연구에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 또한 향후 Lactobacillus의 생장속도와 항균능력을 유도하는 세균유래물질의 발굴은 probiotics의 활용효과를 기대할 수 있을 것이다.</p> <h2>세균 M9과 반응시킨 Lactobacillus spp.의 생장속도 측정</h2> <p>Lactobacillus의 \( \mathrm{OD}_{600}=0.1(\mathrm{M} 9,1 \mathrm{ml}) \)에 각 세균 M9을 \( 40 \mu \mathrm{g} \)씩 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3, 6, 12시간동안 배양하는 동안 spectrophotometer (Optizen nano bio, Mecasys, Korea)로 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 도출하였다. 실험은 3회 이상 실시하고, 평균값을 분석하였다.</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>Colony Forming Unit (CFU) assay: Lactobacillus (spp.) M9을 이용하여 항균활성을 측정하였다. 측정은 시험 균주의 \( \mathrm{OD}_{600}=0.1( \) Nutrient broth의 \( 1 \mathrm{ml} \) )에 Lactobacillus spp. M9을 \( 10,25,50 \mu \mathrm{g} \)의 농도로 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 반응시킨 후 Nutrient agar plate에 도말하여 병원균의 생균수\( (\mathrm{CFU} / \mathrm{ml}) \)를 측정하여 확인하였다. 실험은 3회 평가 평균값을 결과로 도출하고, 대조군의 CFU를 \( 100 \% \)으로 하여 상대적인 값을 분석하였다.</p> <p>Disc diffusion assay: Lactobacillus M9의 항균활성은 시험 세균을 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 병원균은 Nutrient broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양한 후, 각각의 균은 \( \mathrm{OD}_{600}=0.1,100 \mu \mathrm{l} \) 를 Nutrient agar 평판배지에 도말한다. Lactobacillus M9의 \( 25 \mathrm{~mg} \) 가 함유된 멸균 disc paper(지름 \( 5 \mathrm{~mm} \), Whatsman No.2)를 시험 세균이 도말된 평판배지에 올린 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양하였다. 결과는 생육저해환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다. 대조군으로서는 ampicillin의 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{disc} \)를 사용하였으며, 생육저해환의 크기는 지름 \( \mathrm{mm} \) 단위로 측정하여, 3회 평가 평균값을 결과로 도출하였다.</p> <h2>세균 M9의 특성 분석</h2> <p>L. plantarum의 생장속도와 항균활성의 증가를 유도하는 세균 M9 유래 물질의 특성을 분석하기 위해 S. typhimurium M9(St M9)을 준비하고 아래와 같은 조건으로 반응시켰다.</p> <p>(1) 각종 효소에 대한 영향을 측정하기 위해 St M9의 \( 40 \mu \mathrm{g} \)에 \( \alpha \)-amylase (EC 3.2.1.1 Type VIII, Sigma), lipase (EC 3.1.1.3 Type VII, Sigma), lysozyme (EC 3.2.1.17, Sigma), proteinase K (EC 3.4.21.64, Sigma)를 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시켰다.</p> <p>(2) St M9의 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 측정하기 위해 \( \mathrm{pH} 2.0-4.0 \)은 \( 0.1 \mathrm{~M} \) glycine-\( \mathrm{HCl} \) 완충용액, \( \mathrm{pH} 4.0-6.0\)은 \( 0.1 \mathrm{~M} \) sodium acetate 완충용액, \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\)은 \( 0.1 \mathrm{~M} \) sodium phosphate 완충용액, \( \mathrm{pH} 8.0-10.0\)은 \( \mathrm{Tris-HCl} \) 완충용액을 사용하여 \( \mathrm{St} \) \( \mathrm{M} 9 \) 의 \( \mathrm{pH} \) 를 조절하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간동안 반응하였다.</p> <p>(3) 온도안정성에 대한 측정은 St M9를 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응한 후 항균물질의 잔존활성을 측정하였다.</p> <p>각각의 요소로 처리한 St M9는 배양중인 L. plantarum에 첨가하여 반응시키고 L. plantarum M9를 분리하여 시험 균주에 대한 항균활성을 생균수를 측정하여 확인하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>모든 실험의 측정값은 평균\( \pm \)표준편차로 나타냈고, SPSS \( 20.0 \) (SPSS, Chicago, IL, USA) 프로그램으로 통계처리 하였다. 유의한 차이 \( (p<0.05) \) 는 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)의 Turkey 다중범위검정(Turkey's multiple range test)으로 결정하였다.</p>	생명
Xylanase 생산균 Bacillus sp. MX47의 분리 및 동정	<p>LBX 액체 배지에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하여 회수된 MX47 균체로부터 genomic DNA를 추출하였다. 이를 template로 하고 bacterial universal primer 27 F와 1492R를 프라이머로 사용하여 16S rRNA 단편을 증폭하였다. 증폭한 DNA 단편은 pGEM-T easy vector (Promega corp., USA)에 클로닝한 후, (주)제노텍에 의뢰하여 Applied Biosystems 3730x1 DNA Analyzer로 염기 서열을 분석하였다. National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) N program[1]을 사용하여 GeneBank의 데이터베이스의 미생물 염기서열 정보를 비교하여 분리한 균주의 16S rRNA 염기서열(1,447 bp)의 상동성 검사를 수행하였고, GenBank 에 등록하였다(등록번호: JN578480). 관련 균주의 16S rRNA 염기서열 정보는 EzTaxon server (http://www.eztaxon. org)로부터 수집하였다. 확보된 염기서열들 간의 다중서열정렬(multiple sequence alignment) 검색은 Clustal W 프로그램을 사용하였고, 5'과 3' end의 gap은 BioEdit program으로 보정하였다. 진화적인 거리(evolution dis-tance matrix)는 Kimura's 2-parameter evolution model을 사용하여 계산하였고, 계통수(phylogenetic tree)는 neigh-bour-joining (NJ) analysis로 제작하였다. 계통수의 안정성 검사를 위해 1,000번의 bootstrap resampling을 시행하였다.</p> <p>16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 분석 결과 MX47 균주는 genus Bacillus에 속하는 것으로 판단되었으며, Bacillus safensis FO-036 \( { }^{\mathrm{T}} \) 유래의 16S rRNA 유전자 염기서열과 가장 높은 상동성 \( (99.86 \%) \)을 보였다. 이러한 16S rRNA 유전자에 기초한 NJ phylogenetic tree에서, MX47 균주는 B. safensis FO-\(36 \mathrm{~b}^{\mathrm{T}} \), Bacillus pumilus ATCC706 \( 1^{\mathrm{T}} \), Bacillus aerophilus \( 28 \mathrm{~K}^{\mathrm{T}} \), Bacillus stratosphericus \( 41 \mathrm{KF} 2 \mathrm{a}^{\mathrm{T}} \), Bacillus altitudinis \( 41 \mathrm{KF} 2 \mathrm{~b}^{\mathrm{T}} \) 와 함께 clade를 형성하였다.</p> <p>그람 반응 여부를 알아보기 위하여 그람 염색과 KOH 시험을 실시하였다. 그 결과, MX47 균주는 호기성, 그람-양성 박테리아임이 판명되었다. 또한, LBX agar 평판배지에 \( \mathrm{pH} \) \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 4-9)와 NaCl 농도\( (0-15 \%) \)를 달리하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 후 균주 생장에 미치는 이들의 영향을 관찰하였으며, 배양온도 \( \left(4-40^{\circ} \mathrm{C}\right) \)의 영향도 조사하였다. API kit (API Staph, bioMerieux, France)을 이용하여 MX47 균주가 사용하는 탄수화물, 생산하는 효소 및 활성 등을 조사하였으며, 기 타 주요한 형태학적, 생화학적 특성을 Table 1에 정리하였다.</p> <p>LBX agar 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 24시간 배양했을 때, 콜로니는 non-pigmented, white, circular, smooth, convex의 특징을 보이며, 직경 \( 1.2-1.4 \mathrm{~mm} \)의 부정형의 경계면을 형성하였다. 본 균주는 \( \mathrm{pH} \) 6.0-11.0(최적 \( \mathrm{pH} \) 7.0-8.0) 범위에서 잘 자라며, \( \mathrm{pH} 5.0 \) 이하에서 자라지 않는다. 생화학적으로 MX47 균주는 arginine dihydrolase, urease, \( \beta \)-glucosidase, \( \beta \)-galac-tosidase 효소 활성을 나타내나, nitrate reduction, alkaline phosphatase, Voges-Proskauer test, gelatinase 활성은 발견되지 않았다. 탄소원으로는 D-glucose, L-arabinose, mannose, mannitol, \( N \)-acetylglucosamine, maltose, gluconate, trisodium citrate를 이용할 수 있으나, capric acid, adipic acid, phenylacetic acid 는 이용하지 못한다. 또한, D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-maltose, D-lactose, D-trehalose, D-mannitol, D-xylose, D-saccharose, methyl- \( \alpha \)-D-glucopyrano-side, \( N \)-acetyl-glucosamine, glycerol, L-arabinose, D-ribose, D-galactose, amygdalin, arbutin, esculin ferric citrate, salicin, D-cellobiose, gentiobiose, D-turanose, D-tagatose로부터 유기산을 생산하지만, xylitol, D-melibiose, D-raffinose, ery-thritol, D-arabinose, L-xylose, D-adonitol, methyl- \( \beta \)-D-xylo-pyranoside, L-sorbose, L-rhamnose, dulcitol, inositol, methyl-\( \alpha \)-D-mannopyranoside, D-lactose, D-melibiose, inulin, D-melezitose, D-raffinose, starch, glycogen, xylitol, D-lyxose, D-fucose, L-fucose, D-arabitol, L-arabitol, potassium gluconate, potassium 2-ketogluconate, potassium 5-ketogluconate로부터 유기산 생산은 검출되지 않았다.</p> <p>전자전달계의 quinone은 역상 HPLC로 분석하였고, DNA의 GC 함량은 역상 HPLC를 이용한 Mesbah 등의 방법에 따라서 분석하였다. 그 결과, MX47 균주의 DNA G/C 함량은 \( 44.15 \% \) 이고, 주요한 respiratory quinone은 menaquinone 7 (MK-7)이었다.</p> <p>MX47 균주에 대한 항생제 감수성 검사(antibiotic suscep-tibility)를 실시하였다. 균주를 LBX agar 평판배지에 골고루 도말한 후, thiostreptone \( (50 \mathrm{mg} \)), kanamycin \( (50 \mathrm{mg} \) ), neomycin \( (30 \mathrm{mg}) \), ampicillin \( (50 \mathrm{mg} \) ), aparamycin \( (50 \mathrm{mg} \) ), chloramphenicol \( (25 \mathrm{mg} \) ) 및 nalidixic acid \( (25 \mathrm{mg}) \)를 각각 주입한 paper disc를 올려놓고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하여 disc 주변에 형성되는 성장 저지환의 크기를 측정하였다. 그 결과 MX47 균주는 thiostrepton (strong)과 chloramphenicol (weak)에 민감하며, ampicillin, kanamycin, apramycin, neo-mycin에 대해서는 저항성을 갖는 것으로 판명되었다.</p> <p>균체의 지방산 분석에는 LBX agar 평판배지에서 2일간 배양한 균체를 사용하였으며, 지방산을 methyl ester화 시킨 후, Microbial Identification System (MIDI)의 지침에 따라 gas cheromatography를 이용하여 전 처리된 fatty acid methyl ester (FAME) 분석을 수행하였다. 그 결과 얻어진 균체 세포의 총 지방산 함량을 Table 2에 정리하였다. 주요 지방산(>3\%)은 iso- \( \mathrm{C}_{15: 0}, 22.76 \% \) of anteiso- \( \mathrm{C}_{15: 0}, 3.92 \% \) of iso- \( \mathrm{C}_{17: 0} \) 이며, 이들이 \( 64.55 \% \)를 차지하였다.</p> <p>전술한 바와 같이, 16S rRNA 유전자염기서열의 상동성 분석과 계통수 분석 결과, MX47 균주는 genus Bacillus에 분류되어야 할 것으로 결론 지을 수 있다. 그러나, 본 균주는 효소 활성, 탄소 이용 능력, 유기산 생산능 등 많은 생화학적 특성에서 같은 clade에 속하는 타 Bacillus strains 과는 확연히 다른 것으로 관찰되었다. 따라서 본 연구팀은 상기의 특성을 갖는 균주를 기존의 Bacillus type-strain들과 구분하여 Bacillus sp. MX47으로 명명하였다.</p> <p>최근 본 연구팀은 Bacillus sp. MX47이 자일란 함유 배지에서만 xylanase를 생산하는 것을 발견하고, 이로부터 분자량 \( 26.4 \mathrm{kDa} \)의 alkalophilic xylanase를 정제하여 이 효소가 beechwood 자일란과 oat spelt 자일란에 특이하게 작용하며 carboxymethyl 셀룰로오스, avicel, pectin, starch에는 활성이 없는 신규의 endo- \( \beta-1,4-x y l a n a s e \)임을 보고하였다. 이 효소의 \( \mathrm{NH}_{2} \)-termial sequence와 동일한 아미노산 서열은, Bacillus 속 균주는 물론 타 균주에서도 발견 된 사실이 없는 신규효소이며, 이는 본 균주가 타 Bacillus 균주와 차별성이 있다는 사실을 지지하고 있다.</p> <p>식물세포벽은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌 등이 밀접하게 연결된 복잡한 구조문이다. 자일란은 헤미셀룰로오스 의 주성분으로 식물 바이오메스의 \( 20-40 \% \) 를 차지하며 셀룰로오스 다음으로 가장 풍부하게 자연계에 존재하는 biopolymer이다. 따라서, 자일란 바이오메스를 효율적으로 이용하기 위해서는 우선적으로 자일란을 저분자 물질로 전환시키는 분해과정이 필요하며, 최근에는 환경친화적인 효소분해 방법에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.</p> <p>자일란은 \( \beta-1,4 \)-linked xylopyranose units에 acety1, 4-O-methy1-D-glucuronosy1, \( \beta \)-arabinosy1 잔기들이 치환되어 있는 헤테로폴리사카라이드이며, 주로 \( \beta \)-1,4-endoxylanases \( (1,4, \beta \)-D-xylan xylanohydrolases EC 3.2.1.8)와 \( \beta \)-xylosidases \( (1,4, \beta \)-D-xylan xylohydrolases EC 3.2.1.37)에 의해 분해된다. 또한 \( \beta \)-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), \( \beta \)-D-glucuro-nidases (EC 3.2.1.1), acetyl xylan esterase (EC 3.1.11.6) 등과 같은 수 종의 side chain releasing enzymes들도 보고 되었고, 이들이 함께 작용하여 자일란을 완전히 분해하는 것으로 알려져 있다.</p> <p>Xylanase는 산업적으로 종이나 펄프 가공 전처리 공정(biobleaching), 리그노셀룰로오스 물질의 발효 가능한 물질로의 생물전환 공정, 쥬스 정화 공정, 맥주 제조 공정, 동물 사료 등에 이용될 수 있다. Xylanase는 용도에 따라 다양한 환경에 노출될 수 있으며 따라서 각 작업 환경에 적합한 효소를 개발하는 일이 필요하다. 만일 xylanase가 Kraft cooked pulp 전처리 공정에 사용되려면, 작은 분자량의 xylanase가 보다 효율적으로 구멍을 만들고 용이하게 내부로 침투하여 분해를 잘 하는 것으로 알려져 있다.</p> <p>자일란의 효율적인 분해를 위해서는 다양한 환경에서 보다 안정적으로 활성이 강한 신규 효소를 발굴하는 것이 중요하다. 따라서 본 연구의 목적은 성능이 우수한 신규 xylanase를 발굴하는 데 있다. 본 연구팀은 제주도 토양속에서 부패한 나무조각을 채취하여 이로부터 xylanase 활성이 높은 미생물들을 순수 분리하였다. 이 중 효소활성이 가장 뛰어난 균주를 최종적으로 선별하여 Bacillus sp. MX47로 명명하였고, 본 균주가 생산하는 신규의 alkalophilic xylanase를 정제하여 그 특성을 보고한 바 있다. 본 논문에서는 분리한 신균주 Bacillus sp. MX47의 생화학적, 생리학적 특징을 조사하였다.</p> <p>대한민국 제주도(동경 126.08-126.58도, 북위 36.06-33.00도)의 토양속에서 채취한 나무를 채집하여 멸균 식염수로 부드럽게 세척한 후 \( 500 \mathrm{~mL} \) 멸균 채수병에 넣고 실험실로 운반하였다. 이 채수병에 멸균 식염수 \( 250 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 상하로 강하게 흔들고, 이 식염수의 \( 10 \mu \mathrm{L} \)를 변형된 Luria-Bertani (LBX) agar 배지\(1\%\) tryptone, \( 0.5 \%\) NaCl, \(0.5 \% \) beechwood xylan (Poly( \( \beta \)-D-xylopyranose \([1\rightarrow 4]) \); Sigma Chemical Co, USA), \( 1.5 \% \) bactoagar)에 도말 한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하였다. 총 517개의 콜로니를 새로운 LBX agar 배지에 옮겨 접종하고 동일한 조건에서 배양한 후 \( 0.2 \% \) Congo red (benzidinediazo-bis-1-naphthylamine-4-sulfonic acid) 용액으로 염색하고 1 M NaCl용액으로 탈색하여 xylanase 활성을 검출하였다. 총 32개의 양성반응 콜로니 중 xylanase 활성이 가장 높은 균주를 MX47로 명명하고, 16S rRNA sequencing 및 생화학적 - 생리학적 특징을 조사하였다.</p>	생명
오리 기계발골육을 이용한 sausage 제조	<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 실험에서 사용한 시료육은 오리를 도살해체하여 정육을 제거한 후 뼈에 붙어있는 육을 온도 상승과 기계적 마손이 없는 장점을 가지고 있는 수압식(hydraulic presstype)에 의해 회수한 기계발골육을 즉시 \( -40^{\circ} \mathrm{C} \) 이하로 급속 동결시켜 동결고에 보관하며 사용하였다.</p><p>부원료는 폴리믹스 GA, 폴리믹스 CS 및 산성피로인산염은 SD BNI Co.(Korea)에서 식품첨가물로 시판하는 것을 사용하였으며, 나머지 첨가물과 부원료들도 식품첨가물로 허용되어 시판되는 것을 시중에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>소시지 제조</h2><p>오리 가공부산물인 기계발골육을 이용한 소시지의 제조는 우선 동결된 오리 MDM을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 3시간 방치하여 반해동시킨 후 얇게 자르고, 저온의 알칼리액 중에서 교반하면서 4시간 수세처리하고 다시 염지액 중에서 4시간 동안 교반하며 염지하였다. 염지가 끝난 육을 수도물로 수세 한 후 수분함량 \( 80 \% \) 이하로 탈수하여 silent cutter에 넣고 육만을 10분간 1차 고기갈이하고, 다시 식염을 첨가하여 30분간 2차 고기갈이를 한 후 최종적으로 Table 1에 나타낸 나머지 부원료와 첨가물을 넣고 15분간 3차 고기갈이한 후 즉시 PVDC 필름에 공기가 들어가지 않게 충진하여 밀봉한 다음 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)의 증기를 이용하여 80분간 가열하고 실온까지 급냉시켜 제품을 제조하였다. 제품은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장고에 보관하며 분석실험에 사용하였다.</p><h2>일반성분 분석</h2><p>일반성분 측정은 A.O.A.C.법에 준하여 측정하였다. 즉, 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet법 및 조회분은 건식회화법으로 측정하였다.</p><h2>환원당 측정</h2><p>환원당은 Somogyi-Nelson법으로 시료용액 \( 1 \mathrm{m\ell}\)와 구리시약 \( 1 \mathrm{m} \ell \)를 test tube에 각각 취하고, water bath에서 20분간 가열하여 산화제1구리\( \left(\mathrm{Cu}_{2} \mathrm{O}\right) \)를 생성시켰다. 여기에 몰리브덴용액 \( 1 \mathrm{m \ell} \)를 가하여 발색시킨 다음, \( 520 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여, 표준검량선으로부터 환원당을 정량하였다.</p><h2>색차 측정</h2><p>색도는 시료를 취하여 색차계(COLORI-meter JC801S, Juki)를 사용하여 reference plate는 백색판을 기준으로 \( \mathrm{X} \)값 은 78.19, \( \mathrm{Y} \)값은 79.43, \( \mathrm{z} \)값은 89.21로 하는 Hunter scale에 의해 \( \mathrm{L} \)(lightness), \( \mathrm{a} \)(redness) 및 \( \mathrm{b} \)(yellowness)값으로 표시하였다.</p><h2>아미노질소 측정</h2><p>아미노질소는 A.O.A.C. 법으로 시료를 취하여 증류수로 희석한 후 ninhydrin 액을 가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 후 dilution 용액을 가하여 발색시켜 spectrophotometer를 사용하여 \(570 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.</p><h2>지방산 분석</h2><p>지방산 분석을 위한 총지질은 Bligh and Dyer법에 따라 추출하였다. 시료를 chloroform : methanol(\( 2: 1\), \( \mathrm{v} / \mathrm{v} \))의 혼합용액을 가하여 혼합지방산을 추출하고, 이 지방산에 \( 14 \%\) \(\mathrm{BF}_{3} \)-methanol \( 3 \mathrm{m} \ell \)를 가하고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 환류가열하여 n-hexane과 증류수로 수세시켜 혼합 지방산 methyl ester로 한 다음 DB-Wax(J&W Scientific. Folsom. CA) column과 FID detector를 사용하여 gas chromatography (Shimadzu, Kyoto, Japan)로 분석하였다.</p><h2>Texture 측정</h2><p>소시지 제품의 texture 측정은 일정 규격의 시료(직경 \( 2 \mathrm{cm} \), 높이 \( 2 \mathrm{cm}) \)를 직경 \( 2 \mathrm{cm} \)의 cylinder형 plunger를 사용하고, deformation \( 50 \% \), crosshead speed \( 60 \mathrm{mm} / \mathrm{min} \), chart speed \( 60 \mathrm{mm} / \mathrm{min} \) 및 load range \( 10 \mathrm{kg} \)에서 Mode 21의 2 bite법으로 가압하여 rheometer(SUN Scientific. Co., Model LTD. CR-100D)를 사용하여 측정하였다. 제품에 대해서 수회 측정하여 나타나는 경도(hardness), 응집성(cohesivness), 탄력성(springness), 검성(gumminess) 및 부서짐성(brittleness)등을 평균과 표준편차로 나타내고 또한 시판품을 동일한 방법으로 측정하여 비교 분석하였다.</p><h2>관능검사</h2><p>오리 MDM으로 제조한 소시지에 대하여 15인의 panelist가 외관, 색상, 냄새, 단맛, 짠맛, 조직감 및 overall acceptance를 "대단히 좋다"(7점)에서 "대단히 싫다"(1점)까지 7점법으로 채점한 다음 평균과 표준편차로 나타내어 제품의 기호도를 조사하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>2000년 말 현재 우리나라의 오리 사육량은 약 513만 마리로서, 이 중 전남지역에서 182만 마리의 오리가 생산되어 전국의 약 \( 28 \% \)를 차지하는 오리의 주산지 역할을 하고 있으나, 생산된 오리는 대부분 오리탕 전문 음식점에서 단일 메뉴인 탕류로 소비되고 있고, 또한 일반 가정에서도 탕류로 조리하는 요리법이 전통화되어 왔기에 오리의 수요는 크게 신장되지 못하고 있다. 한편 극히 일부는 발골한 오리고기를 동결하여 편육으로 단순가공하여 구이용으로 상품화하고 있으나 판구이에서 두꺼운 피하지방층은 지방 용출이 쉽고 용출량이 많아 가식량은 상대적으로 적어져 소비자의 불만과 함께 고지방식품이라는 고정관념이 오리 고기의 소비신장을 크게 저해하는 요인이 되어왔다.</p><p>오리육의 이용에 대한 연구로는 염지와 훈연 오리고기의 판구이 수율 및 풍미평가와 저장특성, 오리고기의 영양생화학적 가치에 관한 연구, 오리고기 단백질의 아미노산 조성, 침탕방법을 달리한 오리근육의 actomy-osin의 추출성과 특성에 관한 연구, 오리고기의 근원섬유 단백질에 관한 연구, 오리고기의 지방산조성에 관한 연구 및 오리기름이 성숙주의 혈청 및 장기의 지질 조성에 미치는 영향 등 오리육 자체의 성분분석에 관한 연구가 대부분이며, 오리육을 이용한 다양한 가공제품의 개발에 관한 연구는 많이 이루어지지 않고 있다.</p><p>일반적으로 축육은 도체에서 뼈를 발골하여 가공육으로 이용하는데, 뼈에 붙어 있는 잔육을 기계적 처리에 의하여 미세하게 분쇄한 상태로 분리한 육을 기계발골육(mechan-ically deboned meat, MDM)이라 하며, 기계발골육은 보통 육과 마찬가지로 지방과 결체조직을 함유하여 프랑크푸르트 소시지나 볼로나 소시지와 같은 유화형 제품에 많이 이용된다. 그러나 오리 정육을 가공한 후 발골된 뼈에서 분리한 기계발골육은 불포화지방산을 상당 함유하므로 가열공정에서 이들 지방들이 쉽게 용출되어 가공상 큰 문제를 지닌다.</p><p>식육을 이용한 제품은 매우 다양한 것들이 있으며, 특히 가공 식육제품이란 한가지 이상의 가공절차를 거쳐 신선육의 성질을 변형시킨 것으로 대표적인 것이 햄, 베이컨 및 소시지 등이다. 소시지는 세절제품(comminuted product)으로 분류되며, 여러 가지 육류를 세절한 후에 조미료 및 향신료로 맛을 낸 식육제품으로 종류에 따라 염지, 훈연, 성형 및 열처리 등의 과정을 거친다. 우리나라의 식품공전에서는 소시지에 대하여 '식육에 조미료 및 향신료 등을 첨가한 후 훈연하거나 열처리한 것으로 수분 \( 70 \% \)이하, 조지방 \( 35 \% \)이하 의 것'으로 정의하고 있다. 이런 소시지의 원료육은 돼지고기가 주종을 이루고 있으나 소고기, 말고기 및 양고기를 비롯하여 토끼, 닭, 고래 및 어육 등도 상당량이 사용되고 있다.</p><p>본 연구에서는 불포화지방을 다량 함유하는 오리에서 정육을 취하고 남는 부산물과 기계발골육을 이용하여 영양성과 기호성이 우수한 소시지 제품의 개발적성을 검토하였다.</p> <h2>부원료 첨가 조건</h2><p>Iso 등은 난백, Yamashita와 Seki는 계란성분들을 첨가하였을 때 소시지 제품의 물성개선 효과를 확인하였고, Niwa 등은 gelatin과 gluten을 첨가하여 어육연제품의 탄력을 개선시켰으며, 또한 Cheong 등은 계육소시지제품에서 복합인산염의 첨가가 보수력 및 조직감을 향상시켰다고 보고하였다.</p><p>오리 MDM의 수분과 지방함량을 낮추는 전처리과정을 거친 후 소시지 제조시 탄력 형성을 위하여 원료육 중량에 대하여 \( 8 \% \) 전분, \( 7 \% \) 대두단백, \( 2 \% \) gelatin 및 \( 7 \% \)의 난백을 혼합하고, gluten의 첨가량을 변화시켜 그 효과를 검토 하여 Table 5에 나타내었다. 모든 gluten 첨가구들은 첨가하지 않은 대조구에 비하여 견고성과 탄력성을 비롯한 전 항목에서 높은 값을 나타내었다. 한편 2개사의 시판품과 비교하여 볼 때 \( 3 \% \) gluten 첨가구가 가장 근사한 값을 나타내었고 \( 4 \% \)이상의 첨가구에서는 견고성이 너무 높아 제품이 딱딱해지는 형태를 나타내어 오리 기계발골육을 이용한 소시지 제조에서 gluten 첨가량은 \( 3 \% \)로 결정하였다.</p><p>Collagen의 중요한 특성으로는, 산과 알카리 용액 중에 서 팽윤하며 열에 의하여 수축하고 gelatin으로 전환되는 성질이 있으며, 유도단백질 형태인 gelatin은 식용, 공업용, 의약용으로 이용되고 있다. Collagen 섬유는 수소결합과 공유결합이 끓어져야 불용성 collagen이 가용성 gelatin으로 전환되며 gelatin은 육단백질이나 비육단백질과 마찬가지로 지방구의 막을 형성한다고 한다. 그리고 전분 중에서 감자전분은 수화시 크게 팽윤하고 다량의 물과 결합하는 능력 때문에 겔 강화 효과가 크다고 알려져 있다.</p><p>\( 3 \% \) gluten, \( 7 \% \) 대두단백, \( 2 \% \) gelatin 및 \( 7 \% \) 난백의 첨가비율을 고정하고 감자전분 첨가량을 변화시켜 제조한 소시지 제품의 texture 값들을 Table 6에 나타내었다. 감자전분의 첨가량이 많아질수록 모든 측정 항목의 물성값이 증가하였는데, 감자전분이 \( 10 \% \) 첨가된 제품은 다소 딱딱해지는 경향이 있었다. 그리고 전분을 \( 10 \% \) 첨가한다 하더라도 gluten을 첨가하지 않는 경우에는 모든 항목이 다소 약화 되는 것을 확인할 수 있었고, gluten을 첨가하지 않고 \( 10 \% \) 전분의 첨가한 제품도 점착성이나 부서짐성 값이 너무 높게 나타나 제품으로서 적당하지 않았다. 하지만 전분을 \( 8 \% \) 첨가한 제품에서는 시판품과 비교하여 모든 항목에서 유사한 값들을 가지는 것을 확인하였다. 따라서 오리 기계발골 육을 이용한 소시지 제조에서는 gluten \(3\%\)와 전분 \( 8 \% \)를 첨가하는 것이 적당한 것으로 결정하였다. Ryu 등은 고급연제품이나 맛살류를 제외하고 증량 및 탄력 보강을 위해 전분을 첨가하면 가열 중 육단백질로부터 유리되는 수분을 흡수하여 호화하면서 수분을 부동화(不動化)시키고, 또한 이러한 전분호(漖粉糊)가 육단백질 분자 사이에 끼어 들면서 풀어지고 손상된 단백질 구조를 서로 연결시켜 망상구조를 강화시킨다고 설명하고 있다.</p><p>한편 전처리를 통해 오리 기계발골육 중에 들어있는 불포화지방산을 다소 제거하였기 때문에 풍미와 입안에서의 부드러운 느낌이 부족하였다. 따라서 \( 8 \% \) 전분, \( 7 \% \) 대두단백, \( 7 \% \) 난백 및 \(3\%\) gluten을 첨가하고, 돈지를 10,15,20 및 \( 25 \% \) 첨가하여 제품을 만들고, texture와 관능검사를 실시하여 그 결과를 Table 7과 8 에 각각 나타내었다. 물성값들은 돈지를 첨가하지 않았을 때 보다 첨가량이 증가함에 따라 모든 값이 감소하는 것으로 나타났고 \( 20 \% \)이상 첨가시에서 견고성, 탄력성 및 부서짐성 등이 급격히 저하하는 것을 나타내었다. 한편 이들 제품의 관능검사 결과 모든 항목에서 돈지를 \( 10 \% \) 첨가한 제품이 좋은 점수를 받았다. 특히 풍미와 조직감에서 좋은 점수를 받아 오리 기계발골육을 이용한 소시지 제조에서 돈지를 \( 10 \% \) 정도 첨가하는것이 바람직할 것으로 판단하였다.</p><h2>제품의 품질</h2><p>이상의 결과에서 최적의 전처리 조건 및 부원료 혼합비에 의해 제조한 오리 MDM 소시지의 일반성분 등을 분석하여 Table 9에 나타내었다. 오리 기계발골육을 이용한 최종소시지 제품의 수분함량은 \( 54.38 \% \)이었고, 조단백질함량은 \( 23.91 \% \), 지방함량은 \( 12.32 \% \)였으며 \( \mathrm{pH} \)는 6.25였다. 그리고 색차 측정에서는 L값이 46이었고 색소의 첨가에 의해 a값은 68로 비교적 적색에 가까웠으며, b값은 24로 황색으로 치우쳐 있었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>원료의 가공적성</h2><p>오리육 및 기계발골육의 일반성분 함량을 Table 2에 나타내었다. 수분함량은 오리육이 \( 61.43 \% \)인데 비해 기계발골육은 \( 80.41 \% \)로 높은 함량을 보였다. 이는 수압식에 의해 육을 발골할 때 수분이 다량 혼입되었기 때문이다. 지방의 경우에도 기계발골육은 \( 7.58 \% \)(건중량 \( 38.69 \% \))로 상당히 높은 함량을 나타내었다. 기계발골육만으로 소시지를 제조하고자 할 때 이처럼 높은 수분과 지방함량은 가공적성에 부적합할 것으로 생각되었다.</p><p>오리육과 기계발골육의 지방산 조성을 Table 3에 나타 내었는데, 그 조성과 함량은 두 육 모두 비슷하였으며, 특히 oleic acid와 linoleic acid 같은 융점이 낮아 실온이하에서도 액상으로 존재하는 불포화지방산이 전체의 \( 60 \% \) 이상을 차지하고 있었다. 이와 같은 결과는 Nam의 오리육의 지방산 조성이 포화지방산 약 \( 20 \% \), 불포화지방산은 약 \( 70 \% \)였다는 보고와 유사하였다. 그리고 이들 불포화 지방산은 소시지 성형 후 열처리 과정에서 바깥으로 스며 나와 제품화가 곤란하므로 약간의 제거가 요구된다.</p><h2>전처리 조건</h2><p>원료의 가공적성에서 보았듯이 오리 기계발골육은 수분과 지방함량이 높고, 특히 융점이 낮은 불포화지방산의 비율이 매우 높기 때문에 이들의 함량 조절이 필요하다. 그리고 기계발골육온 일반적으로 일반 근육조직보다 품질이 나쁘고 제조과정 중 위생상 문제가 있는 경우도 있으므로 수세처리 하여 품질을 높일 필요가 있다. 여러 가지 방법으로 수분과 지방함량을 낮추는 조작을 실시한 후 육의 일반성분 함량을 Table 4에 나타내었다. 원료육을 해동시킨 후 그대로 원심탈수한 경우는 수분은 상당히 감소하였으나 지방은 \( 44.90 \% \)(건중량)정도로 거의 대부분 잔존하여 지방을 제거하기 위한 다른 처리가 필요하였다. \( 10^{\circ} \mathrm{C} \)의 물에서 12시간 교반◦침지시킨 후 원심탈수시킨 경우에는 수분과 지방 모두 제거율이 상당히 낮았는데, 이는 물에 너무 오래 침지하여 수화성이 증가하기 때문인 것으로 판단된다. 같은 방법으로 4시간 침지시킨 경우 수분은 \( 75.35 \% \)로 상당히 제거되었고, 지방도 \( 39.47 \% \)(건중량)로 육을 수세하지 않고 탈수한 경우보다 약 \(5\%\) 이상이 제거되었다. 일반적으로 어육연제품 제조시 사용되는 알칼리수세법(\(0.2 \% \) \( \mathrm{NaHCO}_{3} \)와 \( 0.15 \%\) \( \mathrm{NaCl} \) 혼합액)으로 4시간 침지◦교반시킨 후 원심탈수한 경우에는 수분함량 \( 75.33 \% \)과 지방함량\( 28.50 \% \)(건중량)로 상당히 높은 제거율을 보였는데, 수세하지 않고 탈수한 경우보다 특히 지방은 약 2배에 가까운 제거율을 보여 원료를 전처리하는데 있어 알칼리수세법이 지방과 수분함량을 조절하는데 효과적이었다. Kim 등은 물, 인산염, 중탄산나트륨 용액으로 수세하였을 때 원래 발골육에 비해 뼈나 지방이 제거되고 단백질이 정제되었다고 하였으며, 또한 오리육을 알칼리수로 침지시키면 연화효과도 있다고 보고하였다.</p>	생명
분자생물학적 방법을 이용한 Moniliella속과 Trichosporonoides속의 분류학적 고찰	<h1>서론</h1> <p>Moniliella 속[2]과 Trichosporonoides 속[3]은 답자성 yeast-likc fungi에 속하며 매우 유사한 분류학적 특성을 나타내고 있다. 이러한 특성의 예로는 arthroconidia와 blastoconidia 의 생산, urea 분해, diazonium blue B 염색의 양성 반응, multilamellar 형태의 cell wall 구조와 dolipore septa 구조 등이 보고되어 있다. 또한 Walker가 실헙한 55 염 기서열 분석 결과에서도 Moniliella acetobutans와 Trichosopor-onoides oedocephalis는 같은 분류군을 형성하였다. 그러나 두 속(genus)은 형태학적 특성인 blastic conidia의 크기에 근 거하여 서로 다튼 속으로 구분(differenciation)되어 왔으며, 일반적으로 blastic conidia의 크기가 \( 10 \mu \mathrm { m } \) 이상인 경우는 Moniliella 속으로 \( 10 \mu \mathrm { m } \) 이하익 겅우는 Trichosoporonoides 속으로 동정하고 있다.</p> <p>한편 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) pattern 분석, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 분석과 특정 유전자의 염기서열분석 등 다양한 분자생물학적 기법을 응용하는 분자분류학이 발전되면서, 균주 (strain)에 따라 다른 결과를 나타내기도 하는 생리 - 생화학적 특성 차이에 근거하는 분류 및 동정이 지양되고, 분석결과의 재현성이 높고 data base 확립이 용이한 분자분류학적 결과를 토대로 하는 새로운 분류 및 동정 체계가 정착 되어가고 있다.</p> <p>본 연구는 이러한 미생물 분류관련 연구방법의 변화를 yeast-like fungi 분류에 적용하여, 형태적 분류결과에 기초하여 서로 다른 분류군으로 나누어져 있는 Moniliella속과 Tichosoporonoides속 균주들을 대상으로 효모의 분자분류학적 key로 최근 널리 이용되고 있는 large subunit rDNA D1/D2 변이 영역의 엽기서열을 분석하여 그 결과를 data base화하고 이를 동정을 위한 key로 이용하고자 하며 또한 두 속에 포함되어 있는 균주들의 분자분류 결과와 형태 및 셍리학적 결과를 비교 분석하여 두 속의 분류학적 연관관계를 제고해 보고자 한다.</p> <h1>재료 및 밤법</h1> <p>Moniliella속 및 Trichosporonoides속 균주들 사이에 존재하는 분자 분류학적 연관관계를 알아보기 위하여 두 속에 속하는 9개 종과 yeast-like fungi에 속하는 4속 (Aureobasidium, Exophiala, Phaeococcomyces, 및 Rhinocladiella속)의 균주 6종을 선발하였다. 실험에 사용한 15개의 균주는 도두 Centraal-bureau voor Schimmelcultures (CBS)에서 구입하였으며 Table 1에 명시하였다. 이들 중 Moniliella속 5층과 Tricho-sporonoides속 4종은 모두 표준 균주를 사용하였다.</p> <p>염기서열분석에 이용할 염색체 DNA를 분리하기 위하여 Malt extract agar (DIFCO Laboratories, Detroit, USA)에 균주를 점종하고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3 일간 배양하였다. 배양된 균체로부터 Kurtzman과 Robnett의 방법으로 DNA롤 분리하여 large subunit rDNA의 D1/D2 영역을 증폭하였다.PCR 로 증폭한 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하고 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing 반응을 수행하였으며, 생산된 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (PERKIN ELMER, New Jersey, (SA)를 이용하여 분석하였다.</p> <p>실험한 시료들이 나타내는 분자 진화적인 관계를 살펴보 기 위하여 Moniliella 속과 Trichosporonoides속 9균주의 large subunit rDNA D1/D2 변이 영역의 염기 서열들을 multiple-sequence alignment program인 clustal X 를 사용하여 성렬하였다. 분석에 사용한 outgroup인 Sacchromyces cerevisiae 균주의 염기배열은 The National Center for Biotechnology Information \( ( \mathrm { NCBI } ) \) 의 nucleotide data base에서 받아 사용 하였다. 시로들의 D1/D2 변이 영역 염기배열의 유사도는 alignment 결과로부터 계산하였으며 evolutionary distances 는 clustal X package에 포함되어 있는 Kimura two-parameter correction방법으로 도출하였다. 시료들 사이에 존재하는 연 관관계믈 나타내는 계통수 (phylogenetic tree)는 distance matrix 값을 이용하여 neighbour-joining 방법 으로 도 식화하였다. 계통수 분석율 위한 계산에서 염기서열에 포 함된 gap들과 미결정된 염기(unidentified base)들은 배제 하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>Yeast-like fungi로 분류되는 6속 15균주의 염기서열 분석결과 엍어진 large subunit rDNA D1/D2 변이 영역의 염기서열둘은 NCBI의 GenBank 뉴클레오타이드 염기서열 data base에 등록하였고 가 균주에서 조사된 염기서열의 accession number는 Table 1에 나타내었다.</p> <p>또한 Moniliella속 및 Trichosporonoides속 9개 균주의 D1/ \( \mathrm { D } 2 \) 변이 영역의 염기서열을 비기하여 퍼센트로 나타낸 염 기서열 유사도(sequence similarity)는 Table 2에 정리하였다.</p> <p>두 속에 속하는 균주들의 염기서열 유사도를 비교해 본 결과 Moniliella속 5종들 사이에 촌제하는 유사도는 \( 45.4 \% \) (M. pollinis와 M. suaveolens var. suaveolens의 유사도)에서 \( 100 \%(M \). suaveolens var. nigra와 \( M \). suaveolens var. suav-eolens)로 나타났으며 Trichosporonoides속 4종들 사이에 존재 하는 유사도는 \( 45.2 \% \) (T. madida와 T. spathulata)에서 \( 84.4 \% \) (T. oedocephalis와 T. spathulata)로 나타넜다. 또한 Moniliella 속 종과 Trichosporonoides속 총둘 사이에 염기서열 유사도 를 조사해 본 결과 \( 45.6 \% \) (M. suaveolens var. suaveolens와 T. spathulata)에서 \( 90.1 \% \) (M. pollinis와 T. oedocephalis)로 나타났다. 이와 같이 염기서열 유사도 분석결과 large subunit rDNA D1/D2 변이 영역의 염기 서열을 토대로 한 분자분륚 결과에서, 각 속내 종들간에 유사도 값이 서로 다론 쵞의 종둘과의 유사들 값과 비교하여 볼 때 높지 않옴을 알 수 있었으며 이런 결과는 두 속이 서로 다른 분류군으로 명확히 구분되지 윦는다는 것을 시사한다. 그러므로 blastoconidia의 크기를 기준으로 두 속을 구분한 형태학적 분류 결과와 large subunit \( \mathrm { rDNA } \mathrm { D } 1 / \mathrm { D } 2 \) 변이 영역의 염기 서열을 토대로 한 분자분류 결과는 상이한 결과흘 나타내었다.</p> <p>결론적으로 D1/D2 변이 영역의 염기서열분석 결과를 토대로 Moniliella속과 Trichosporonoides속의 분자 분류학적 연관관계를 조사해 본 결과 두 속은 명확히 다른 분류군으 로 구분되지 않았으며, 이와 같은 결과는 두 속을 분자분 류학적 관점에서 같은 분류군으로 묶을 수 있음을 의피하. 며, blastoconidia 크기에 따라 다른 속으로 구분한 형태적 분류 결과와는 상이하였다. 그러나 다양한 탄소원의 이용성 및 55 염기서열분석에 의한 clustering 결과 \( [9,13] \) 와 본 연구의 large subunit rDNA D1/D2 변이 영역의 염기서열 분석 결과를 총합하면Moniliella속과 Trichosporonoides속은 하나의 속 (single genus)으로 통합되어야 한다고 사료되며 이를 위헤서는 여러 가지 다양한 분류학적 기법을 응용한 심도 있는 고찰이 보완될 푈요가 있다.</p> <h1>요약</h1> <p>형태 낓 생리적으로 유사한 yeast-like hyphomycetes인 Moniliella속과 Trichosporonoides속의 분자분류학적 연관관계 들 조사하기 위하여 Moniliella속 및 Trichosporonoides속 9개 의 표준 균주와 yeast-like fungi인 Aureobasidium, Exophiala,Phaeococcomyces, 및 Rhinoclaatiella속 6 균주의 large subunit rDNA D1/D2 영역의 뉴톨레오타이드 염기서열을 분석하 고 이 결과를 형태 핓 생리적 분류결과와 비교 분석하였다. 분석결과 15개의 균주들은 두 개의 major group으로 분리되었다. Moniliella속과 Trichosporonoides속의 9균주는 모두 한 개의 major group을 형성하였으며 각 속의 균주들은 그룹 내에 혼재되어 촌제하였으며 서로 다른 분류군으로 명확히 구분되지 않았다. D1/D2 영역의 뉴클레오타이드 염기서열 유사도를 바고해 본 결과 Moniliella속 5종간에는 \( 45.4 \%-100 \% \), Trichosporonoides속 4 종간에는 \( 45.2 \%-84.4 \% \), Moniliella속과 Trichosporonoides속의 종들 사이에는 \( 45.6 \% \) \( 90.1 \% \) 의 유사도를 나타내었다. 또한 M. suaveolens의 두 va-riety균주인 \( M \). suaveolens var. nigra와 \( M \). suaveolens var. suaveolens는 \( 100 \% \) 의 염기서열 유사도를 나타내어 분자분 류학적 결과에서 두 variety 균주는 같은 분류군일 가능성 을 시사하였다. 또한 M. mellis와 M. acetoabutens은 두 속 (Moniliella속과 Trichosporonoides속)의 다른 균주둘과 별개 의 소그룹을 형성하였다.</p> <p>Moniliella속과 Trichosporonoides속의 분자분류학적 연관 관계를 조사해 본 결과 다양한 탄소원의 이용성 분석에 의 한 결과와 일치하였으며 이러한 결과툴 바탕으로 두 속을 하나의 속으로 통합할 필요가 있음을 알 수 있었다.</p> <p>한편, Saccharomyces cerevisiae의 표준균주를 outgroup으로 사용하여 각 균주들 사이의 진화적 거리를 계산하여 도식화한 계통수 (Fig. 1)에서 15개의 yeast-like fungi 균주들은 두 개의 major group으로 분리되었으며, 첫 번쩨 그룹은 Moniliella속 5종과Trichosporonoides속 균주 4 종울 포함 하고 있었으며 두 번째 그룹은 두 속을 제외한 4속 (Aureo-basidium, Exophiala,Phaeococcomyces, 및 Rhinocladiella속)의 6균주를 포함하고 있었다. 계통수를 기초로 한 분자진화적 연관 관계에서 Moniliella속과 Trichosporonoides속 균주들은 다른 4속의 yeast-like fungi 균주들과는 별개로 단계통 분 류군 (monophyletic group)을 형성하여 두 속이 별개의 계 통 분류군으로 진화하지 않았음을 알 수 있었다.</p> <p>또한 첫 번째 그툽은 다시 두 개의 소그룹으로 분리되었 으며 첫 번째 소그룹은 \( M \) mellis와 \( M \). acetoabutens를 포함하 고 있었고, 두 번쩨 소그룹은 Moniliella 속과 Trichosporonoides 속 균주들이 혼재되어 있었다. M. mellis 와 M. acetoabutens</p> <p>는 large subunit rDNA의 D1/D2 영역의 엳기서열 분석결 과 두 속의 다른 쥰주들과 별개의 속ㄹ룹을 형성하였으나, 현재까지 보고된 두 균주의 분류화적 정보는 생리적 결과 만을 포함하무로 정확한 분류학적 위치를 규명하기 위해서 는 다상적 분류 (polyphasic classification)방법으로 고찰해 볼 필요가 있음을 알 수 있었다.</p> <p>한편 Martínez등 은 24개의 yeast-like hyphomycetes 균주들율 대상으로 다양한 탄소원의 이용 및 발효특성을 조사하고 이 결과를 dendrogram으로 나타내었는데, 분석결과 Hyalodendron속의 5 균주는 하나의 그룹으로 묶여 졌으나 Monitiella속과 richosporonoides속의 5개 총 14 균주들은 한 그룹 내에 혼재되어 존재하였다. 그러므로 본 연구의 Moniliella속퐈 Trichosporonoides속 표준균주를 대상으로 조사한 D1/D2 영역의 염기서열 분석에 의한 분자분류 결과 와 Martinez 등 이 탄소원 이용성을 토대로 즌사한 연관 관계는 서로 일치하였다.</p> <p>M. suaveolens var. nigra와 \( M \). suaveolens var. suaveolens 의 경우는 M. suaveolens 종의 variety 균주들로 보고 되어 있으나 본 연구 결과 염기 서열 유사도가 \( 100 \% \) 로 나타 나 두 균주 사이에 분류학적 차이가 없음울 알 수 있었다. 그러나 두 variety 균주들의 정확한 분류학적 관계를 규명 하기 위해서는 small subunit rDNA full sequencing, 염색체 DNA의 hybridization 등 다양한 분류학적 수단 (taxo-nomic tools)을 사용하여 종합적으로 평가할 펼요가 있으리라 사료된다.</p>	생명
백선의 형태적 특성, 항균 효과 및 분자 세포학적 분석	<p>백선의 꽃 색깔은 연분홍색 및 흰색의 두 종류로서 개화기는 남부 지방에서는 5월 1일에서 6월 1일 사이로 개화 최성기는 대략 5월 17일 전후이며, 성숙했을 때(7월 17일경) 초장은 약 \( 74 \mathrm{~cm} \), 총 본엽수는 8.7개, 화경장은 \( 36.6 \mathrm{~cm} \), 화경절수 17마디, 총 화수는 15.3개, 협수는 11개, 결협율은 \( 71.9 \% \), 성숙일수는 47일로 관찰 되었다.</p><p>Fig. 2 에서와 같이 생장 속도는 S 곡선의 생장 곡선을 나타낸다. 2월 20일경 출아가 시작되어 3월 10일경까지 \( 11 \mathrm{~cm} \) 정도의 완만한 생장을 보이다가 3월 20일부터 5월 20일까지 두 달간 약 \( 70 \mathrm{~cm} \)까지 생장이 촉진 되고, 6월 10일부터 7월 1일까지 성숙 단계로서 열매가 형성되며, 그 이후 고사가 진행되는 6개월간의 생육기간을 나타내었다.</p><p>백선 염색체는 \( 2 n=2 x=36 \)으로, 기본 염색체수는 \( x=18 \)로 관찰 되었다. 중기에서 염색체 크기는 벼의 염색체 보다는 크고 밀이나 보리보다는 작은 \( 4.2 \sim 8.1 \mu \mathrm{m} \)의 크기를 보였다. 염색체 크기에 따라서 분석을 해본 결과 이배체임이 입증 되었다. 만약 4배체 일 경우 같은 크기의 염색체가 두 쌍씩 존재해야하나 Fig. 3에서 보는 바와 같이 부수체를 가진 가장 큰 염색체가 한 쌍만 존재함으로 이배체임이 확인 되었다.</p><p>Fig. 4에서와 같이 훌로워 싸이토매트리를 이용한 백선 잎의 핵 DNA량(게놈 크기)은 \(1.93\mathrm{pg} / 2 \mathrm{C} \) 로 나타났다. 콩은 잎의 크기에 따라서 \( 4.6 \% \)의 DNA량의 변이를 나타냈고, 옥수수는 \( 8.2 \% \)의 게놈 크기의 변이를 나타냈다. 그러나, 벼, 보리 밀 등 곡류는 각 품종 간 게놈 크기의 차이가 심하지 않다. 본 연구에서도 백선 각 개체 간 게놈 크기는 변이가 없는 것으로 나타났다. 일반적으로 염색체의 크기와 DNA량과는 정의 상관관계를 보이는데, 백선의 염색체는 크기나 수에서 콩보다 크고, \( 2 n=36 \)개로서 콩의 \( 2 n=20 \)개보다 많은 데에도 불구하고 게놈 크기는 콩보다 적은 것은 염색체 분열중기에서 염색체의 응축이 콩보다 느슨할 것으로 추측 된다.</p><p>백선 추출액의 항균 효과를 검정하기 위하여 원액, 10배액, 100배액으로 희석 한 후 잿빛 곰팡이의 길항작용을 측정한 결과는 Fig. 5에서 보는바와 같다. 100배액에서는 약간의 길항 효과를 보였고, 10배액에서는 곰팡이의 생존이 거의 없었으며, 원액을 사용 했을 때는 완전한 항균 효과를 나타냈다.</p> <h1>백선의 형태적 특성, 항균 효과 및 분자 세포학적 분석</h1><p>최근 들어 고 부가가치를 창출 할 수 있는 신약 개발 분야에서 식물자원의 중요성이 첨단 생명과학의 발전과 더불어 새롭게 부각되고 있으며, 미국 및 선진국들은 이미 기존의 단편적인 식물자원의 성분연구에 최첨단 BT 연구기법을 접목시킴으로써 특정한 생리활성을 가지는 신약 후보물질을 창출하는 연구를 실시하여, 이미 식물로부터 항암제를 개발하는 연구를 수행해 좋은 성과를 얻고 있다. 특히 유럽과 아시아에서도 정부 주도로 기능성소재나 신약의 개발을 위한 식물자원 연구에 주력하고 있다.</p><p>백선 (Dictamnus dasycarpus Turcz.)은 운향과에 속하는 다년생 숙근초로서 한국, 중국 및 동부 시베리아 등지의 양지쪽 산기슦의 반음지인 숲 속에서 자생하는 식물이다. 원줄기는 1~3번으로 초장은 90cm 내외이며 잎은 호생하고, 7~9매의 기수 우상 복엽이고, 엽맥의 중측에는 좁은 날개 모양의 깃이 달려 있으며, 꽃은 5~7월에 피고 2.5 cm 크기의 꽃은 5개의 꽃잎과 한 개의 암술과 10개의 긴 자루의 수술이 있고, 자웅 동화이며 총상화서이다. 자방은 7월경 완숙하며, 별 모양을 한 5실의 삭과는 5갈래로 갈라져 있으며, 종실은 1실에 1~2개이고, 완숙되면 내피가 용수철처럼 뒤틀리며 종실을 터트려서 먼 거리에까지 튕겨 보낸다. 꽃은 향기가 뛰어나고 관상가치가 있으므로 화단용 식물로 이용이 가능하며, 지하부가 튼튼하여 토양을 고정시키는 능력이 강하므로 절사면 녹화용 식물로 적합하고, 뿌리를 지상으로 노출시켜 초본분재로 이용하여도 좋다. 동의보감에 의하면 백선은 풍병, 제풍, 조습, 청열, 해독, 통관절, 이소장에 유효하며, 특히 중풍, 두풍, 미발달락, 부인음중종통, 산후여병, 소아경간, 습열창독 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 뿌리에는 dictam-nine, dictamnolacton, trigonellin, sitosterol, obacunonicacid, choline, fraxinellone 등이 함유되어 있고 지상부분에는 psoralen과 xanthofoxin 등의 성분이 들어 있다. 백선과 같이 국내 자생 식물자원에는 새로운 기능성 소재 및 신약 개 발을 위한 신 물질이 다량 함유되어 있으며, 약용, 향신료, 염료, 원예 및 조경용 등으로 다양하게 이용 할 수 있다. 백선은 약용식물로서의 가치가 높이 인정되고 있음에도 불구하고, 아직까지 형태, 재배, 효능, 분자 세포유전학적 연구가 전무 한 실정이다. 따라서, 본 연구는 야생 약용 식물자원 중에 하나인 백선의 형태적 특징, 항균 효과 및 분자세포학적 분석을 통하여 신 물질 개발을 위한 기초 자료를 마련하기 위하여 수행되었다.</p> <p>실험에 사용한 공시 재료는 동아대학교 주변 승학산 기숡에 자생 군락지화 되어 있는 백선을 2004년 2월 10일경부터 7욀 31일까지 100개체를 관찰 및 채취하여 사용하였다. 체세포 분열 중기의 염색체 관찰을 위하여 야외에서 채집한 백선의 왕성하게 자라는 뿌리에서 채취한 근단을 끝에서 \(1\sim2 \mathrm{cm}\) 정도를 취하여, 방추사 형성 억제를 통한 중기 염색체를 지닌 세포 수의 증가를 위하여 전 처리를 하였다. 얼음과 차가운 물 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)을 작은 용기에 채우고 근단을 넣어 냉장고에서 24시간 동안 전 처리를 하여 염색체의 응축을 진행시켰다. 염색체 고정을 위하여 매회 새로 제조한 카노이 용액 I (빙초산 \( 1 \mathrm{vol}\), \(100 \% \) 에탄올 \( 3 \mathrm{vol}) \)에 \( 1 \mathrm{~g} / 10 \mathrm{ml} \) 정도의 염화철 \( \left(\mathrm{FeCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \)을 가하여 24시간 염색체를 고정 시켰다. 염색체의 모양과 구조를 관찰하기 위하여 아세트산 카민 염색액(카민 \( 1 \mathrm{~g} \), 빙초산 \( 45 \mathrm{ml} \), 증류수 \( 55 \mathrm{ml} \))을 꿇인 후 실온에서 식힌 다음 여과하여 사용 하였다.</p><p>백선 잎의 세포핵은 Lee et al.의 방법을 이용하여 추출하였다. 간단히 설명을 하면, 약 \( 2 \mathrm{~g} \) 정도의 백선 어린잎을 수술용 칼을 이용하여 세포핵 추출 용액 \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{~MgSO} 4\), \(5 \mathrm{mM} \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(5 \mathrm{mM} \) Hepes, \( 2 \mathrm{mM} \) dithio-threitol, \( 0.2 \% \) Triton \( X-100,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) propidium iodide)에서 잘게 썬 후 \( 100 \mu \mathrm{m} \) 나일론 매쉬를 이용하여 여과 한 후 약 30분 동안 얼음물에서 염색을 한 뒤 FACScan flow cy-tometry (Becton Dickinson, USA)로 2C DNA 함량을 분석하였다. 각각 10개의 개체에서 세포핵을 추출 한 후 각각 샘플에서 약 2,000개의 G1 핵을 분석하여 DNA 함량을 측정하였다. 백선 DNA 함량 측정을 위하여 콩의 세포핵의 DNA 함량\((2.5 \mathrm{pg} / 2 \mathrm{C})\) 을 기준으로 하여 계산을 하였다.</p><p>잿빛곰팡이 (Botrytis cinerea)에 대한 살균 효과를 실험하기 위하여 신선한 \( 30 \mathrm{~g} \)의 백선 뿌리에서 약 \( 2 \mathrm{ml} \)의 즙을 내어 원액, 10배액, 100배액으로 희석하여 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 배양한 곰팡이에 살포하여 살균 효과를 측정하였다. 배양한 곰팡이를 가로 세로 \( 1 \mathrm{~cm} \) 절편을 떼어 내어 PDA 배지가 들어 있는 petri-dish 가장자리에서 \(3 \mathrm{cm} \) 되는 곳에 놓아 둔 후, 백선 추출액을 농도별로 \( 30 \mu \mathrm{l} \)씩 paper disk에 을려놓고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에 일주일간 배양한 후 항균 효과를 관찰 했다.</p>	생명
젖산균 발효를 통한 녹차 추출물의 Epigallocatechin 함량의 증대	<p>선발한 젖산균을 이용하여 초임계 녹차추출물의 발효물을 제작하고 젖산균 발효에 의한 EGCG, EGC, ECG, EC 등 카테킨의 함량 변화를 측정하였다. EGCG, ECG, EC의 함량은 젖산균 발효에 의하여 유의적인 변화는 없었으나, EGC 의 함량은 9 종의 젖산균 발효에 의하여 모두 유의적으로 증가하였다. 그 중에서도 MBE1424, MBE1429 및 MBE 1440 균주에 의한 발효물에서 EGC 의 함량이 각각 \( 60 \% \),\( 50 \% \), \( 38 \% \) 증가하였다. 박 등은 1종의 Lactobacillus graminis, 2 종의 Leuconostoc mesenteroides 등의 젖산균을 이용하여 녹차 추출물을 발효하였으나, EGC 의 함량은 증가하지 않았다. 김 등은 Lactobacillus brevis 유래의 \( \beta \) - glucuronidase를 이용하여 배당체인 baicalin과 wogonoside를 비배당체인 baicalein과 wogonoside로 생물전환한 결과를 보고하였다. 배추김치에서 분리한 MBE1424 균주는 녹차에 함유된 카테킨 중에서 EGC 의 함량을 증가시켰으며, 이러한 결과는 \( \beta \)-glucuronidase를 포함하는 생물전환계에 의하여 에스테르형 카테킨인 ECG와 EGCG가 가수분해되어 유리형태인 EGC의 함량이 증가하는 것으로 추정되며, 보다 명확한 원인을 규명하기 위한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.</p> <p>발효에 의하여 EGC의 함량을 가장 현저히 증가시킨 MBE1424 균주를 Leuconostoc mesenteroides MBE1424로 명명하고 한국미생물보존센터에 기탁하였다. 카테킨 중 EC 은 본 연구에서 사용한 대다수의 젖산균 발효 물에서 함량이 다소 감소하는 경향을 나타났으나, MBE1424 균주를 이용하여 제작한 발효물에서는 함량이 약 \( 8 \% \) 증가하였다.</p> <p>젓산균을 이용한 초임계 녹차 추출물 발효에서 \( \beta \) - glucuronidase 효소활성이 우수하였던 MBE1424로 명명된 Leuconostoc mesenteroides 균주가 녹차의 카테킨 함량을 증대시키는 것으로 나타났으며 녹차 추출물 발효공정에 가장 적합한 균주로 판단되었다. \( \beta \)-glucuronidase를 활용한 생물 전환 기술에 대한 연구는 현재까지 미미한 수준이나, Amin 등은 Aspergillus terreus의 \( \beta \)-glucuronidase에 의한 가수분해반응을 통하여 감초에 함유된 glycyrrhizin의 생물전환에 대하여 보고하였다.</p> <p>Leuconostoc mesenteroides MBE1424 균주의 생육 특성을 조사하기 위하여 배양 온도와 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 조절하여 배양하였다. MBE1424 균주를 다양한 온도에서 배양하고 비성장속도를 측정하였는데 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 비성장속도가 \( 0.99 \pm 0.55(1 / \mathrm{h}) \)로 상대적으로 가장 우수하였다(Fig. 1A). 기존에 보고된 Leuconostoc mesenteroides A02 균주는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가장 높은 성장속도를 나타냈으며, Leuconostoc mesenteroides JFY 균주는 \( 34^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서 균주의 생육이 억제되었다. 본 연구에서 분리된 \( \mathrm{MBE} 1424 \) 균주는 문헌에 보고된 기존의 Leuconostoc mesenteroides 균주보다 열내성이 우수한 균주로 판단되며 산업적 이용이 기대된다. MBE1424 균주를 초기 \( \mathrm{pH} \)가 조절된 MRS 배지에서 배양하고 비성장속도를 측정하였다. 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 6 또는 8로 조절하였을 때, 유사한 수준의 비성장속도를 나타냈으며, \( \mathrm{pH} 4 \) 로 조절한 MRS 배지에서 비성장속도가 \( 0.59 \pm 0.03(1 / \mathrm{h}) \) 으로 다른 \( \mathrm{pH} \) 에서 보다 상대적으로 가장 낮은 수준을 나타내었다.</p> <p>녹차를 자연발효한 시료의 성분 분석을 통하여 총 카테킨의 함량 감소가 보고된 바 있으며, 김 등은 Lactobacillus bulgaricus를 이용한 발효차에서 카테킨의 함량 변화를 조사하였으나 유의적인 차이는 없었다. 또한, 박 등은 Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum 등의젖산균을 이용하여 녹차 발효물을 제작한 결과 EGCG, EGC등의 카테킨이 \( 50 \% \) 가량 감소하고, gallocatechin gallate와 gallocatechin의 함량이 증가되는 것을 보고하였다.</p> <p>본 연구를 통하여 배추김치로부터 \( \beta \)-glucuronidase 효소 활성이 우수한 Leuconostoc mesenteroides MBE1424 균주를 분리하였으며, 이 균주는 녹차 추출물의 카테킨 중 EGC의 함량을 약 \( 60 \% \) 증가시켰으며, 대조구 균주와 비교하여 상대적으로 내열성이 우수하였다. 초임계 녹차 추출물에 함유된 카테킨 중 EGC 의 함량을 증가시키는 생물전환 효소계가 \( \beta \)-glucuronidase와 관련이 있을 것으로 추정되며, 선발 균주의 산업적 응용을 위하여 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.</p> <p>차는 오랜 전통을 지닌 음료로 동백과(Theaceae), 동백속(Camellia)에 속하는 차나무(Camellia sinensis)의 싹이나 잎을 가공한 것으로 제조에 사용된 발효공정의 차이에 의해 녹차, 우롱차, 홍차로 구분된다. 차의 주요 성분으로는 플라보노이드, 카페인, 아미노산, 비타민 및 무기질 등이 있으며 항산화, 항암, 콜레스테롤 제, 당뇨완화, 충치 예방 등의 효능이 보고되었다. 그 중에서도 플라보노이드는 polyphenolic 물질로 구조에 따라서 플라본(flavones), 플라보논(flavanones), 플라보놀(flavonols), 카테킨(catechin) 등으로 분류되며, 구조에 따라서 체내 흡수율이나 활성이 상이한 것으로 보고되고 있다. 녹차에 많이 함유되어 있는 카테킨류는 flavan-3-ol 구조로 주로 epicatechin 형태로 존재하며 유리형인 EC, EGC와 에스테르형인 ECG, EGCG가 주를 이룬다. 카테킨은 주로 열수 또는 에탄올 등을 이용한 용매추출법을 사용하여 생산하는데, 추출 및 정제과정이 복잡하며 수율이 낮고 가격이 비싸다는 단점이 있다.</p> <p>초임계 추출법은 임계온도가 낮은 기체를 추출 용매로 사용하기 때문에 열에 불안정한 성분을 최대한 손실없이 추출할 수 있다는 장점이 있으며, 적절한 압력과 온도의 선택으로 추출 단계와 분리단계를 최적화 할 수 있고, 첨가제를 이용하여 용해도와 선택도를 증가시킬 수 있는 장점이 있다. 초임계 유체에 극성 물질을 첨가하는 경우 녹차의 유용성분인 EGCG의 추출 효율이 증가하는 것으로 보고되었으며, 이산화탄소를 이용한 초임계 녹차 추출물을 포유동물 세포주에 첨가한 후 염색체 이상빈도를 측정하여 녹차의 안전성을 확인한 연구결과도 보고된 바 있다.</p> <p>김치, 된장, 식초 등 전통 발효식품에 풍부하게 존재하는 젖산균은 오랫동안 산업적으로 이용된 중요한 스타터 균주로서, 이들 균주가 생산하는 박테리오신에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 젖산균을 생물전환용 스타터 균주로 이용하기 위하여 pectin esterase, \( \beta \)-glucosidase, \( \beta \)-xylosidase, \( \quad \beta \)-galactosidase, \( \quad \beta \)-arabinofuranosidase등의 효소 활성에 대한 연구가 보고되었다. 심 등은 Leuconostoc mesenteroides YLB8 균주를 이용하여 홍삼의 배당체 진세노사이드에 결합되어 있는 당쇄부위를 제거하여 비배당체 진세노사이드로 구조로 전환시켜 진세노사이드의 흡수율이 향상되는 것을 확인하였다. 양 등은 Lactobacillus plantarum 균주에 의하여 생물전환된 갈근탕의 성분변화를 보고하였으며, 박 등은 생물전환을 통한 플라보노이드의 인체 흡수율 증가에 대하여 보고하였다.</p> <p>본 연구에서는 김치를 비롯한 전통 발효식품으로부터 젖산균을 분리하고, \( \beta \)-glucosidase, \( \beta \)-glucuronidase, \( \beta \) -xylosidase, \( \beta \)-galactosidase, \( \beta \)-arabinofuranosidase, \( \beta \)-arabinopyranosidase, \( \beta \)-arabinosidase 등 기존에 알려진 생물전환과 관련된 효소의 활성을 평가하여 우수 젖산균을 선발하였다. 선발된 젖산균을 녹차 추출물의 발효에 적용한 후 카테킨의 함량 변화를 조사하였고, 카테킨 중 EGC의 함량을 유의적으로 증대시키는 균주를 선정한 후 배양조건에 따른 생육특성을 조사하여 최적배양 조건을 위한 기초 자료를 확보하고자 하였다.</p> <p>강원도를 포함한 전국에서 수집된 김치를 비롯한 총 40 점의 발효식품으로부터 젖산균을 분리하기 위하여 채취된 시료를 멸균된 생리식염수 \( (0.85 \% \mathrm{NaCl}) \) 에 현탁한 후, 적정농도로 희석하여 MRS(deMan, Rogosa and Sharpe medium, BD, Detroit, MI, USA) 평판배지에 도말하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 동안 배양하였다. 단일집락을 bromocresol purple \( (0.015 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{BD}) \) 이 함유된 \( \mathrm{MRS} \) 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 동안 배양한 후 오렌지색으로 변하는 균주를 2 차 선별하여 동결 보관하였다. 분리한 젖산균은 MRS 배지를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양한 후 \( \beta \)-glucosidase (E.C. 3.2.1.21)와 \( \beta \)-xylosidase(E.C. 3.2.1.37) 효소활성은 장 등의 방법으로, \( \beta \)-glucuronidase (E.C. 3.2.1.31), \( \beta \)-arabinosidase (E.C. 3.2.1.88), \( \beta \)-arabinofuranosidase(E.C. 3.2.1.55), \( \beta \) - galactosidase(E.C. 3.2.1.23), \( \beta \)-arabinopyranosidase(E.C. \( 3.2 .1 .99) \) 는 문헌에 보고된 방법을 이용하여 세포 외 효소활성을 측정하였다.</p> <p>젖산균 배양액 중의 단백질 농도는 Bradford Dye Reagent(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 적정 농도로 희석된 bovine serum albumin(BSA, Bio-Rad)을 이용하여 검량선을 작성하였다. 발효식품으로부터 분리된 젖산균은 효소활성을 측정한 후 가장 우수한 효소활성을 나타낸 젖산균을 박 등이 보고한 방법으로 동정하였다. 선발한 균주의 생육특성을 조사하기 위하여 배양 온도 및 배로 명명된 균주와 \( \beta \)-arabinosidase, \( \beta \)-arabinofuranosidase 효소활성이 각각 우수하였던 MBE1429, MBE1440 균주는 기존에 보고된 Leuconostoc mesenteroides와 16S rDNA 유전자의 염기서열이 99% 이상의 상동성을 나타내었다. Leuconostoc mesenteroides MBE1424 균주는 배추김치에서 분리되었고, 세포 외 \( \beta \)-glucuronidase \( (0.59 \pm 0.19 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) protein) 효소활성이 분리된 균주 중에서 가장 우수하였으며, MBE1429와 MBE1440 균주는 각각 \( \beta \)-arabinosidase, \( \beta \)-arabinofuranosidase 효소활성이 우수하였다.</p> <p>\( \beta \)-Glucosidase 활성이 우수한 것으로 나타난 MBE 1456과 MBE1982 균주는 Lactobacillus plantarum과 16S rDNA 유전자 염기서열이 \( 100 \% \) 상동성을 나타냈다. \( \beta \) - arabinofuranosidase, \( \beta \)-galactosidase, \( \beta \)-arabinopyranosidase, \( \beta \)-xylosidase 효소활성이 우수한 균주로 선발된 MBE1518, MBE1558, MBE1563, MBE1573 균주는 각각 Pediocccus pentosaceus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sp., Leuconostoc lactis로 동정되었다.</p>	생명
젓갈에서 분리한 Bacillus subtilis SW-1의 항암활성	<p>동서양을 막론하고 성인병은 국민의 생명과 복지를 위협하는 가장 중요한 요인으로 지목되고 있다. 특히 산업화가 이루어진 많은 국가에서는 암이 사망원인의 수위를 차지하고 있으며, 이를 조절하기 위한 꾸준한 연구개발에도 불구하고 지난 30여년간 그 발생률에는 별 차이를 보이지 않고 있다. 암의 발생은 \( 90 \% \) 이상이 특정한 환경요인에 의하여 발생하며 이러한 요인 중 \( 40 \sim 60 \% \) 는 식이와 관련된다. 이에 기초하여 최근 식생활과 연관된 암의 원인물질을 검색하는 연구가 진행중이며, 한편으로는 식품 중에서 항암을소유한 물질들의 개발에 대한 연구도 다양하게 이루어지고 있다.</p> <p>항암제 screening 방법에는 종양 system과 미생물 및 생화학적인 방법을 이용한 in vitro system이 있다. In vitro에서 활성이 있던 물질이 in vivo에서 활성을 갖지 못하는 경우도 있지만, Foley와 Epstein은 in vitro에서 사용되고 있는 screening 방법 중 human carcinoma cell을 이용하는 방법에서, cell line은 생체내 암세포가 나타내는 계속적인 성장 - 분열의 특성을 가진다는 점에서 항암물질의 개발에 많이 사용되고 있다고 밝히고 있다. 이런 방법으로 개발된 250 개 항암 물질의 \( 82 \% \) 가 in vivo에서도 활성이 있다고 밝혀, 현재 많이 밝혀지지 않은 미생물로부터 항암물질을 screening 하는 예비 방법으로 in vitro system을 사용할 수 있음을 시사하고 있다.</p> <p>미생물을 이용한 항암 활성에 관한 연구는 1978년 Azuma 등과 Milas등, 그리고 Yamaue 등이 미생물의 세포 성분이 실험동물과 사람에게 현저한 항암 효과를 나타낸다는 보고를 한 이래, 이들을 이용한 암 치료용 약제가 개발되어 시판 되고 있으나 이 미생물들의 균체는 가끔 질병을 일 으키고 임상적용을 가로막는 부작용을 야기 하고 있다.</p> <p>따라서 최근에는 유산균이 동물 실험에서 높은 항암 효과를 나타낸다는 보고 이후, 지난 10년간 유산균의 항암효과에 관한 연구가 활발히 진행 되어왔다. 유산균은 옛부터 요구르트와 같은 발효 유제품에 이용되어 온 그람 양성의비 병원성 균으로 인체에 독성이 없는 것으로 인식되어 왔다.</p> <p>많은 연구에서, 유산균이 실험동물에서 육종(Sarcoma), 유종암(Carcinoma) 및 백혈병(Leukemia)의 성장을 강력하게 억제하는 것으로 보고 되었다. 하지만 국내에서는 김등이 유산균에 대한 항암 효과 등을 보고 한 것이 있으나 식품 미생물에 대한 항암 관련 연구는 거의 전무라 할 수 있다.</p> <p>본 연구에서는 한국고유의 전통 발효 식품인 젓갈로부터 항암 활성을 갖는 미생물을 순수 분리, 동정하고 항암활성물질 생산을 위한 최적배양조건 및 항암제로서의 이용 가능성을 조사하였다.</p> <h2>항암물질 생산균주의 동정</h2> <p>항암활성을 갖는 미생물의 동정을 위하여 균의 형태학적 생리학적 특성을 조사하였다. 형태학적 특성은 Scanning Electron Microscope (SEM)로 표면형태, 크기, sclerotia의 형태, 유무등으로 관찰하였고, 정확한 동정을 위해 한국 미생물보 존센터에 의뢰하여 16srRNA sequence를 분석하여 유전자 간의 상동성을 비교하여 동정하였다.</p> <h2>최적 배지조성 및 배양조건의 결정</h2> <p>미생물 생육 최적 탄소원은 최소배지인 \( \mathrm{M} 9[\mathrm{Na} 2 \mathrm{HPO} 40.6 \% \), KH2PO4 0.3\%, \( \mathrm{NH} 4 \mathrm{Cl} \mathrm{0.1 \%}, \mathrm{NaCl} \mathrm{0.05 \%}, \mathrm{MgSO} 4 \cdot 7 \mathrm{H} 2 \mathrm{O} \) solution \( (246.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}) 0.1 \% \), Thiamine \( \cdot \mathrm{HCl} \) solution \( (\mathrm{g} / \mathrm{L}) \) \( 0.1 \%, \mathrm{CaCl} 2 \) solution (14.7g/L) 0.1\%] 배지에 각종 탄소원을 \( 1.0 \% \) 로 첨가하였고, 최적 질소원은 각종 질소원을 \( 1.0 \% \) 로 첨가하여 생균수를 관찰하여 결정하였다. 또한 각각의 탄소원, 질소원 농도를 변화시키면서 균의 배양 상등액의 항암활성을 관찰하여 최적 배지조성을 결정하였다. 최적 배지 초기 \( \mathrm{pH} \) 는 위에서 결정된 최적 배지의 \( \mathrm{pH} \) 를 3.0 11.0으로 변화시키면서 결정하였고, 최적 배양온도는 온도를 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 변화시키면서, 그 활성을 측정하여 결정하였다.</p> <h2>분리 균주의 항암 활성</h2> <p>암세포는 폐암세포(A549)와 난소암(SK-OV3) 및 백혈구 암세포(HL-60)를 사용하였으며 항암제 Control로 현재 병원에서 사용중인 taxol \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 을 사용하여 활성을 비교하였다. 암세포는 95\% 습도, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 온도 조건에서 배양하였으며, 배지는 \( 10 \% \mathrm{FBS} \) 가 든 \( \alpha \)-DMEM을 사용하였고 48시간 간격으로 배지를 교체하였다. 배양액 처리 전 24 시간에 \( 1 \% \) FBS로 바꿨으며 Cell 수는 \( 5 \times 10^{4} \) cell/ \( \mathrm{ml} \) 일때를 사용하였으며 농도별, 시간별 암세포의 사멸율을 typhan blue로 염색후 counting 하였다.</p> <h2>DNA fragmentation assay</h2> <p>암세포에 대한 항암활성미생물의 apoptosis(계획된 세포 죽임)를 조사하기 위하여 암세포배양액에 항암 활성 미생물의 배양 상등액을 농도별 \( 0,10 \mu l / \mathrm{ml}, 30 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml}, 50 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 되게 처리하고 24시간 후 chromosomal DNA를 분리하여 agar-ose gel electrophoresis를 실시하여 DNA분해 양상을 조사하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>항암성 물질 생산균주의 분리</h2> <p>멸균수로 희석한 한국전통 젓갈을 LB배지에 도말하여 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양후 나타난 각 colony를 LB액체배지에 접종하고 24시간 배양하여 그 상등액을 항암활성 측정에 이용하였다.</p> <p>젓갈로부터 분리한 약 2,000개의 colony 중에 1차적으로 항암활성이 강한 6균주를 선발하였고, 그 중 암세포 A549에 강한 세포독성을 나타내는 균주를 선별하여 이 균주를 SW-1이라고 명명하였다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>최종 분리 선정한 미생물 SW-1의 형태학적 규명을 위해 현미경 관찰 및 SEM 촬영 결과를 살펴 볼 때, 그람양성으로써 rod의 형태를 보였으며, 크기는 \( 0.6 \times 1.9 \mu \mathrm{m} \) 였고, 운동성이 있었다. 또한 호기성의 불규칙한 cream형태의 흰색 colony를 생성하였다. 정확한 동정을 위해 \( 16 \mathrm{~s} \) rRNA sequence롤 결정하여 기존의 알려진 미생물과의 비교 결과 Bacillus subtilis와 99\% 유사성을 나타냈다. 이상의 실험 결과로부터 젓갈류에서 분리한 항암 활성을 갖는 미생물을 Bacillus subtilis로 최종 동정하여, Bacillus subtilis SW-1로 명명하였다.</p> <h2>분리 균주의 항암 활성</h2> <p>Bacillus subtilis SW-1의 항암활성을 검토한 결과 A549, SK-0V3 세포의 경우 전반적으로 배양시간과 농도 의존적으로 세포생육을 억제하는 것으로 나타났다. A549인 경우 \( 30 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) (SW-1 배양상등액/암세포 배양배지)의 배양상등액의 농도에서 \( \mathrm{IC}_{50} \) 를 나타내었으며 SK-OV3인 경우 \( 50 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 그리고 HL60 cell인 경우 거의 세포독성을 나타내지 않았다.</p> <h2>항암물질생성 최적배양조건</h2> <p>배양온도에 따른 항암활성: 배양온도에 따른 항암활성의 변화를 보기 위하여 \( 20,25,30,35,40,45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 각각 배양하여 비교해 본 결과는 Fig. 5와 같았다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 그 활성이 가장 우수하였다. 젓갈류에서 분리된 균주는 중온 발효시키기 때문에 대부분의 균주가 \( 30 \sim 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 생육과 활성이 좋은 것으로 나타났고, Bacillus subtilis SW-1은 멸치젓에서 분리된 균주로써 중온인 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 가 최적으로 나타났다.</p> <p>초기 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 항암 활성: 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 2.0,3.0,4.0,5.0, 6.0,7.0,8.0,9.0으로 조정된 배양 배지에 SW-1 균주를 접종하여 배양 하였을 때 초기 \( \mathrm{pH} \) 가 4~6인 배지에서 항암활성이 가장 우수하였다. 이 결과로 볼때 본 균주는 약산성 쪽에서 활성을 나타내는 호산성 균주인 것으로 생각된다.</p> <p>탄소원에 따른 항암활성: 항암 활성에 미치는 탄소원의 영향을 검토하기 위하여 기본 배지에 탄소원의 종류를 달리하여 첨가한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 진탕 배양하여 항암 활성에 미치는 영향을 검토한 결과를 Table 2에 제시하였다. 탄소원의 경우, 항암 활성은 Soluble starch을 사용 하였을 때가 가장 좋았으며, 그 최적농도는 \( 3.0 \% \) 이었다.</p> <p>질소원에 따른 항암 활성: 항암 활성에 미치는 질소원의 영향을 검토하기 위하여 기본 배지에 질소원의 종류를 달리하여 첨가한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 진탕 배양하여 항암활성에 미치는 영향을 검토한 결과 Table 2에 제시하였다. Yeast extract를 \( 0,1,2,3,4,5,6 \% \) 에서 검토한 결과 Yeast extract 의 최적 농도는 \( 1.0 \% \) 이었다.</p> <p>무기염에 따른 항암 활성: 무기염의 경우는 활성에 그다지 영향을 미치지 않았다.</p> <p>배양시간에 따른 항암활성: 이상에서 검토한 최적 배지 조성을 사용하여 \( 1 \% \) 의 접종량으로 균주의 생육과 항암활성의 상관관계는 Fig. 6과 같다. 위에서 조사한 최적조건에서 배양하는 동안 균의 생육과 항암 활성을 검토한 결과, 접종 후 7시간이 경과하면서 대수증식기에 들어갔으며 18시간이 지나면서 정지기 및 사멸기에 도달하였고, 항암물질의 생산은 14시간이 지나면서 증가하기 시작하여 25시간이 경과한 후 최대 활성을 보였다.</p> <p>DNA fragmentation assay 항암제로서의 개발 가능성을 조사하는 실험단계로, DNA fragmentation assay가 있다. 일반적으로 암세포가 항암제에 의해 사멸할 때 apoptosis(계획된 세포죽음)의 현상으로 chro-mosomal DNA의 사닥다리모양으로 단편화가 주로 일어나며 이 관찰로 항암제로서의 이용 가능성을 확인한다. 본 미생물에서 분비된 항암활성물질은 본 실험에서 Fig. 7에서 보여주듯이 Bacillus subtilis SW-1 배양상등액의 \( 50 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 의 처리시 ladder모양으로 chromosome이 분해된 것이 확인되었으며 따라서 B. subtilis SW-1이 분비하는 항암활성물질은 항암제로써의 이용가능성이 있는 것으로 판단된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>젓갈로부터 항암물질 생산 미생물의 탐색</h2> <p>균주의 분리를 위하여 한국전통식품, 젓갈을 멸균수로 시험관( \( 180 \mathrm{~mm} \times 18 \mathrm{~mm}) \) 에 순차적으로 희석하여 Luria Bertani (LB) plate에 도말하여 single colony를 유도한 다음 각각의 colony들을 LB broth \( 5 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양하였다. 그 배양액을 항암활성이 높은 균주를 선발하기 위해 사용하였다.</p> <h2>암세포 배양</h2> <p>세포독성 측정을 위해 사용한 인체암세포인 A549 (lung cancer cell line, ATCC CLL-185), SK-OV3 (ovarian cancer cell line, ATCC HTB-77) 그리고 HL60 (promyelocytic leu-kemia, ATCC CCL-240)를 ATCC에서 구입하여 사용하였고, 이들 세포주는 Dulbecco's Modifide Eagles Medium (DMEM) (Gibco, Rockville, MD, USA)에 10\%(v/v) Fetal Bovine Serum (Gibco), 0.37\% sodium bicarbonate (Sigma, St. louis, MO, USA)을 혼합한 배지에 100unit의 streptomycin/penicillin 을 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다. 세포를 배양용기에서 분리하기 위한 trypsin 용액은 Hank's bal-anced salts solution (HBSS)에 \( 0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) trypsin과 \( 0.53 \) \( \mathrm{mM} \) EDTA가 첨가된 것을 사용하였고 배양세포의 세척 등 에는 HBSS를 사용하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>세포수의 측정에는 hemacytometer와 trypan blue 염색법을 이용하였다. 분리한 세포배양액 \( 10 \mu l \) trypan blue so-lution ( \( 0.4 \% \) trypan blue, \( 0.8 \% \mathrm{NaCl}, 0.06 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.05 \% \) methyl-p-hydroxybenzoate, pH7.2) \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 잘 혼합한 후 혼합액의 \( 10 \mu l \) 를 hemacytometer에 취해 inverted microscope 를 이용해 세포수롤 측정하였다.</p> <p>세포독성은 1 차적으로 세포의 형태변화를 관찰하여 항암활성을 확인하였고, 암세포에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위하여 Carmichael의 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 암세포를 96 well plate에 \( 1 \times 10^{4} \) cell/well이 되게하여 \( 160 \mu 1 \) 씩 분주하고 배양상등액 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기로 24 시간 배양하였다. 여기에 인산생리식염수에 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 제조한 MTT 용액 \( 20 \mu 1 \) 를 첨가하고 동 배양조건에서 4 시간 더 배양하였다. 이를 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 각 well당 DMSO \( 150 \mu \) 를 가하여 30 분간 교반한 후 ELISA reader (Molecular Device Co.)로 550nm에서 흡광도를 측정하여 성장억제효과(Growth inhibitory effect(\%)=[(대조구의 흡광도- 시료처리구의 흡광도)/대조구의 흡광도) \( ] \times 100) \) 를 구하여 세포독성 활성의 지표로 하였다. 또한, 암세포의 성장을 대조구에 비하여 \( 50 \% \) 억제하는 시료의 농도를 \( \mathrm{IC}_{50} \) 으로 나타내었다. 대조구는 시료대신 대장균의 배양액을 첨가한 것으로 하였다.</p>	생명
Rhodotorula sp. CL-83 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 라세믹 Styrene Oxide 입체특이성 가수분해 조건 최적화	<h1>결과 및 토론</h1><h2>반응표면 분석법을 이용한 반응조건 최적화</h2><p>Lab culture collection에서 선별한 에폭사이드 가수분해능이 우수한 Rhodotorula sp. CL-82 유래의 EH 활성을 이용하여 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 이용하여 키랄 (S)-styrene oxide 제조함에 있어서 반응표면 분석법(response surface analysis)을 이용하여 \( \mathrm{pH} \), 온도 및 cosolvent 비율 등 반응조건 최적화를 실시하였다. \( \mathrm{pH} \), 반응온도, cosolvent 등 세개의 실험인자의 변화가 입체선택적 가수분해에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험점들은 중심합성계획법(central composite design)을 이용하여 결정하였으며, 실험조건과 (R)-styrene oxide 가수분해 속도와의 함수관계를 설명해줄 수 있는 2차 회귀 모형의 계수는 Statistical Analysis System(SAS)을 이용한 회귀분석을 통해 결정하였다.</p><p>세 가지 반응조건을 각각 -2, -1, 0, 1, 2등의 다섯 단계의 실험수준으로 나누고 (Table 1), 중심합성 계획법에 따라 총 \( 2^{\mathrm{K}}+2 \mathrm{~K}+\mathrm{N}_{0}\)\(\left(\mathrm{~K}\right. \) : 변수 개수, \( \mathrm{N}_{0} \) : 중심점 갯수)개의 실험점에서 각각 2번 반복 실험을 실시하여 입체선택적 가수분해 속도에 대한 실험 결과를 얻었다. 실험 평균값에 대하여 SAS 프로그램을 사용하여 회귀분석을 실시한 결과, \( \mathrm{pH} \), 온도, cosolvent 첨가량에 따른 Rhodotorula sp. CL-82 생촉매의 입체선택적 가수분해 속도를 나타내주는 반응표면(response surface)에 대한 2차 회귀분석식은 아래와 같이 결정할 수 있었다.</p><p>\( \begin{aligned} y=& 0.00233+0.00010 X_{1}+0.00008 X_{2}-0.00001 X_{3}-\\ & 0.00035 X_{1}{ }^{2}+0.00027 X_{1} X_{2}-0.00027 X_{2}{ }^{2}+0.00012 X_{1} X_{3} \\ &-0.00008 X_{2} X_{3}-0.00030 X_{3}{ }^{2} \end{aligned} \)</p><p>여기서 \( \mathrm{y} \)는 생촉매의 입체선택적 가수분해 속도 \( (\mathrm{mM} / \) \( \mathrm{mg} \cdot \mathrm{min}) \)이며 \( \mathrm{X}_{1}\), \(\mathrm{X}_{2}\),\( \mathrm{X}_{3} \)는 각각 \( \mathrm{pH} \), 반응온도 \( \left({ }^{\circ} \mathrm{C}\right) \), cosolvent 첨가량 \( (\%(\mathrm{v} / \mathrm{v})) \) 이며 \( \beta_{0} \)는 절편, \( \beta_{n} \)은 회귀계수이다.</p><p>2차 회귀분석을 통해 결정된 Rhodotorula sp. CL-82 생촉매의 입체선택적 가수분해 속도를 나타내주는 반응표면 곡선에 대한 eigenvalues 값들이 세가지 변수에 대해 모두 음의 값들이 나와 최대점이 존재함을 알 수 있었다. F-ratio 값이 가장 적게 나온 실험인자인 cosolvent 첨가량을 \( 3 \% \) \(\mathrm{v} / \mathrm{v})\)으로 결정하고, \( \mathrm{pH} \) 및 반응온도 변화에 따른 입체선택적 가수분해 속도 변화를 분석하였다. Fig. 1 에서와 같이 최대점을 가진 3차원 반응표면을 얻을 수 있었으며, 최대점에서의 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 반응온도는 각각 7.6, 33.3\(^{\circ} \mathrm{C} \)로 결정할 수 있었다.<h2>최적조건에서의 라세믹 styrene oxide에 대한 입체선택성 가수분해 반응</h2><p>반응표면 분석에서 셜정한 최적조건에서 Rhodotorula sp. CL-82 균체를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 최적조건으로 결정된 \( \mathrm{pH} 7.6 \), 온도 \( 33.3^{\circ} \mathrm{C} \), cosolvent 첨가량 \( 3 \%\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)에서 건조중량 \( 300 \mathrm{mg} \) 의 Rhodotorula sp. CL-82 균체를 \(80 \mathrm{mM} \)의 라세믹 styrene oxide가 들어 있는 \( 10 \mathrm{ml} \) reaction vessel에 넣고 shaking을 해주면서 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 약 4시간 정도의 반응 시간 경과 후 \( 20 \% \) 수율(이론 수율 대비 \( 40 \% \) ) 수준으로 광학적으로 순수한 (ee >\(99\%\)) (S)-styrene oxide을 얻을 수 있었다.</p> <h1>서 론</h1> <p>에폭사이드(epoxide)는 반응성이 우수한 oxirane 링구조로 인하여 친전자성반응, 친핵성반응 등 다양한 반응을 유도할 수 있어 유기합성용 중간체로 널리 사용되고 있다. 특히, 광학활성을 가지는 키랄 에폭사이드는 고부가가치 광학활성 의약품 합성용 핵심중간체로써의 중요성이 증대 되고 있다.</p> <p>생촉매를 이용하여 키랄 에폭사이드를 제조하는 방법으로는 monooxygenase 등의 산화환원효소를 이용하여 이중결합에 직접 oxirane 링을 도입하는 방법과 라세믹 에폭사이드 기질의 각 광학이성질체에 대한 생촉매의 선택적 가수분해능을 이용하여 단일 광학이성질체만을 분리하는 기술이 있다. (R), (S)-이성질체로 혼합되어 있는 라세믹에폭사이드 기질로부터 특정 광학이성질체만을 선택적으로 diol로 가수분해시켜줌으로써 궁극적으로 한 종류의 에폭사이드만을 제조할 수 있는 효소가 에폭사이드 가수분해 효소(epoxide hydrolase, EH)이다. EH는 monooxygenase에 비해 cofactor 재순환이 요구되지 않으며, 비교적 안정된 구조를 가지고 있다는 장점이 있다.</p> <p>본 논문에서는 EH 활성이 우수한 Rhodotorula sp. 균체를 생촉매로 이용하여 라세믹 (R, S)-styrene oxide로부터 (R)-styrene oxide만을 입체선텍적으로 가수분해시켜 제거 함으로써 광학순도 \( 99 \% \) 이상의 (S)-styrene oxide를 제조함에 있어 주요 반응 조건인 \( \mathrm { pH } \), 온도 및 기질 용해도 향상을 위한 유기용매 첨가량 등이 미치는 영향을 분석하고 반응 표면 분석법을 이용하여 생산조건을 최적화하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>Rhodotorula sp. CL-82를 배양하기 위한 배지로는 \( 1 \% \) \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) yeast, \( 1 \% \) \(( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose를 포함하는 최소배지 (Peptone \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { NaCl } 2 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.147 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } 1.3 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 4.4 \mathrm { ~g } / 1 \)를 사용하였으며, 배양 온도 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(250 \mathrm { rpm } \) 에서 48시간 진탕 배양하였다. 배양된 세포는 원심분리 후 \( 100 \mathrm { mM } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))로 두 번 세척한 다음 생촉매로 사용하였다.</p> <h2>입체선택성 가수분해반응</h2> <p>세포 \( 300 \mathrm { mg } \) (건조중량기준)을 \( 10 \mathrm { ml } \)의 \( 100 \mathrm { mM } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))에 현탁시킨 다음 \( 20-80 \mathrm { mM } \) 라세믹 styrene oxide를 주입하였다. 반응기로는 screw-cap vessel을 사용하였으며, \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(250 \mathrm { rpm } \) 의 진탕배양기에서 30분 동안 가수분해 반응을 실시하여 초기 가수분해속도를 결정하였다. 반응 종료 후 반응액을 cyclohexane으로 추출한 후, 유기용매 층을 chiral GC로 분석하여 초기 가수분해속도와 광학순도(enantiomeric excess, ee \( = [S-R] /[S + R] \times 100 \%) \)를 결정하였다.</p> <h2>\( \mathrm { pH } \), 온도 및 cosolvent의 영향</h2> <p>반응표면 분석법을 이용한 입체선택적 가수분해효소 반응조건 최적화를 위하여반응용액의 \( \mathrm { pH } \)를 6.5-8.5, 온도를 \( 27.5-37.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 그리고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 \( 1-5 \% \) \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)까지 변화시키면서 광학분할 실험을 수행하였다.</p>	생명
시스플라틴에 의한 염증성 사이토카인의 청각유모세포 사멸 효과	<h2>Cisplatin이 렛트 코르티기관의 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향</h2> <p>렛트 청가기관에서 cisplatin에 의한 염증성 사이토카인 생성을 확인하기 위하여 렛트 와우에서 분리 배양한 cochle-ar explant에 cisplatin을 처리한 후 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \) 및 IL-6 분비를 ELISA 방법으로 조사하였다. Cisplatin \( 30 ~ \mu \mathrm { M } \)을 30시간 처리한 상충액으로부터 염증성 사이토카인을 정량하였다. Cisplatin 처리는 렛트 코르티기관의 염증성 사이토카인 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \) 및 IL-6 분비를 현저히 증가시킴을 확인할 수 있었다.</p> <h2>Cisplatin 및 염증성 사이토카인이 청각세포 손상에 미치는 영향</h2> <p>염증성 사이토카인이 청각세포에 미치는 직접적인 영향을 조사하기 위하여, 렛트에서 분리한 organ of Corti 배양액에 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \) 및 IL-6 등을 처리한 후 청각세포의 stereocilia에 결합하는 phalloidin-TRITC 염색을 시행하였다. 정상 조직은 세 줄의 외측 청각유모세포(outcr hair cell)와 한 줄의 내측 청각유모세포(inner hair cell) 배열로 이루어져 있으나, \( 30 ~ \mu \mathrm { M } \) cisplatin 처리는 청가유모세포 손상에 의한 세포층 배열의 이상을 초래하였다. 또한 염증성 사이토카인 TNF- \( \alpha \) \( (200 \mathrm { ~ng } / \mathrm { ml } ) \), IL-1 \( \beta(200 \mathrm { ~ng } / \mathrm { ml } ) \) 및 IL-6 \( (200 \mathrm { ~ng } / \mathrm { ml } ) \)을 각각 처리한 실험군에서도 cisplatin 세포독성과 유사한 청각유모세포 배열의 파괴를 초래하였다. 이들 세 염증성 사이토카인의 병용처리는 상승효과를 나타내서 더욱 현저한 청각 유모세포 손상을 초래하였다. Fig. 4B는 각 실험군에서 임의로 정한 3개의 구역에서 청각유모세포의 수로 정량화하여 그래프로 표시하였다.</p> <h2>염증성 사이토카인의 중화(neutralization)가 cisplatin에 의한 코르티기관 청각유모세포 손상에 미치는 효과</h2> <p>염증성 사이토카인이 cisplatin에 의한 코르티기관 청각유모세포 손상에 미치는 효과를 조사하기 위하여 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \) 및 IL-6에 대한 중화항체를 전 처리한 후, phalloidin-TRITC 염색을 시행하였다. Cisplatin \( (30 ~ \mu \mathrm { M } ) \) 처리는 칭각유모세포 stereocilia 손상을 초래하여, cisplatin에 의해 파괴된 외측 및 내축 청각유모세포의 배열은 anti-TNF- \( \alpha \) ( \(1.5 \mathrm { ~ug } / \mathrm { ml } \)), an-ti-IL-1 \( \beta \) \( (1.5 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 및 anti-IL-6 \( (1.5 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 항체의 전처리에 의하여 현저히 보호되었다. Fig. 5B에서는 각 실험군에서 임의로 정한 3개의 구역에서 anti-TNF- \( \alpha \) \( (1.5 ~ \mu \mathrm { g } \) \( / \mathrm { ml } ) \), anti-IL-1 \( \beta \) \((1.5 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 및 anti-IL-6 \( (1.5 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 항체 전처리에 의한 청각유모세포의 보호 효과를 phalloi-din-TRITC 염색 세포수로 정량화하여 도식화 한 결과이다.</p> <h1>서 론</h1> <p>Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum II: CDDP)은 다양한 암의 치료에 널리 사용되고 있는 유용한 항암제 임에도 불구하고 임상적으로 이명(tinnitus), 고주파 청력손실 (high frequency hearing loss) 및 청력 감소 등의 청각기능 손상과 신장독성 등의 부작용을 유발한다. Cisplatin에 의한 이독성은 코르티기관의 외측 청각유모세포(outer haircell; OHC)의 손상에 기인한다. 특히 cisplatin은 세포내에서 DNA adduct 형성과 활성산소종 과생성을 유도하여 최종적으로 감각 유모세포의 세포자멸사(apoptosis)나 세포괴사(necrosis)를 초래한다. Cisplatin의 세포독성 유발기전에 근거하여 cisplatin의 이독성과 신장독성등의 부작용을 예방할 수 있는 다양한 약물탐색 연구가 진행되고 있다.</p> <p>염중반응이란 생체 조직의 손상에 대해 반응하는 능동적인 과정으로서 세포나 조직이 어떤 원인에 의하여 손상을 받으면 이에 대한 반응을 유발하여 손상을 극소화하고, 손상된 부위를 수복하는 정상적인 생체 기능의 하나다. 염증반응은 호중구를 포함한 염증세포에서 생성한 cytokines, prosta-glandin E2 (PG-E2), lysosomal enzyme, 및 free radical 등 다양한 인자의 상호 작용에 의하여 이뤄진다. 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 interleukin-1 \( \beta \) (IL-1 \( \beta \))와 tumor necrosis factor-alpha (TNF- \( \alpha \))는 호중구의 활성화와 염증 부위로 이동을 유도하며, IL-1 \( \beta \)는 PG-E2 생성에 의한 발열반응을 유발하여 TNF- \( \alpha \)와 함께 염증반응의 주된 매개자로 작용하는 일산화질소(Nitric Oxide: NO) 및 super-oxide anion 등의 형성을 유도한다.</p> <p>TNF- \( \alpha \)는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 여러 면역반응에 참여함과 동시에 multiple sclerosis와 같은 중추신경계내의 염증성 탈수초 질환(inflammatory demyelinating dis-eases)을 유발하는 주요 인자로 알려져 있다. 중추신경계 내의 주된 교세포(glial cells)인 astrocyte는 TNF- \( \alpha \) 자신을 포함한 여러 사이토카인에 반응하여 TNF- \( \alpha \)를 생성, 분비함으로써 질환의 병인인자로 직접 작용한다. 또한 Nuclear fac-tor-kappa B (NF-kB)는 세포내 신호전달을 수행하는 전사인자로서 여러 cytokine 유전자의 promotor 부위에 결합하여 염증성 사이토카인과 chemokine 유전자의 발현을 조절한다. 그러나 지금까지 cisplatin에 의한 이독성에서 염증반응의 중요성에 대한 연구가 거의 없는 실정이다.</p> <p>본 연구에서는 청각세포주 HEI-OC1세포와 neonatal rat cochlear explant의 배양에서 cisplatin에 의한 청각세포 손상기전을 밝히기 위하여, 염증성 사이토카인의 분비와 이들 사이토카인이 세포 손상에 미치는 영향을 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포주</h2> <p>마우스 와우기관 코르티기관에서 유래한 청각세포주 HEI-OC1는 미국 House Ear Institute (Los Angeles, CA, USA)의 Kalinec 박사로부터 분양받아 실험에 사용하였다.</p> <h2>Sprague-Dawley rat</h2> <p>Sprague-Dawley rat은 다물싸이언스(대전)에서 생 후 2일령을 분양받아 실험에 사용하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>우태아혈청과 trypsin은 GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA.), 흡광도계 측정용 96 well plate, 배양용기 12 well plate, 24 well plate 그리고 \( 10 \mathrm { ~cm } \) dish는 Falcon사(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA.), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Phalloidin-TRITC, Basal Medium Eagal (BME), dimethyl sulfoxide (DMSO), Cisplatin, 3-[4,5-dime-thylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 및 Collagen (Type I ; from rat tail)은 Sigma사(St. Louis, Missouri, USA.), anti-TNF \( \alpha \), anti-IL-1 \( \beta \), anti-IL-6, 사이토카인(TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6), RNAlater 및 pro-inflammatory cyto-kine assay kit은 R&D system (Minnepolis, USA.)의 제품을 사용하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>HEI-OC1 세포는 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포배양기 \( \left (33 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \right ) \) 에서 항생제 첨가 없이 \( 10 \% \) 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM으로 배양하였으며, 2-3일 간격으로 계대 배양하여 log phase에 있는 세포를 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포생존율 측정</h2> <p>세포생존율은 MTT 방법으로 측정하였다. 세포 \((5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cells/ml } \))는 세포 배양판 24 well plate에 \( 1 \mathrm { ~ml } \)씩 분주하여 12시간 이상 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포 배양기에서 부착시킨 후, 각각의 조건에 따라 시료를 처리하였다. 조건에 맞취 배양한 후 각각의 well에 MTT 용액 \( (5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \) in PBS)을 배양액 최종부피의 1/10이 되도록 첨가하였다. 반응 4시간 후 상층액을 제거하여 바닥에 부착된 불용성의 보라색 formazan을 완전히 건조 시킨다. \( 500 ~ \mu \mathrm { I } \)의 DMSO로 용해시킨 후에 \( 100 ~ \mu \mathrm { I } \)를 96 well plate에 넣어 분광광도계(ELISA reader, Molecular Devices Co. Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 정상 대조군과 비교하여 백분율 \(( \%) \)로 표시하였다.</p> <h2>Sprague-Dawley rat에서 cochlea 분리 및 배양</h2> <p>생후 2일이 지난 렛트를 알코올로 소독한 후 clean bench에서 모든 분리작업을 수행하였다. 실험도구는 알코올에 소독한 후 사용하였으며, 렛트 두경부를 통하여 두개골을 절단하고 bullar를 노출 시킨 후 냉 생리식염수로 세척 후에 와우기관을 분리하였다. 와우기관의 배양은 collagen으로 코팅한 coverslip을 이용하였다. 먼저, coverslip을 알코올로 소독해서 12 well plate에 넣고, Type I rat-tail collagen ( \(3.76 \mathrm { ~mg } \) \( / \mathrm { ml } \) in \(0.002 ~N \) acetic acid), 10x basal medium Eagle (BME) 그리고 \(2 \% \) sodium carbonate를 9:1:1의 비율로 혼합하여 coverslip에 \( 15 ~ \mu \mathrm { l } \)씩 분주한다. 실온에서 15분 반응하여 colla-gen matrix가 완성되면 media를 첨가하였다. 와우기관 에서 분리한 코르티기관은 base, middle, apex의 세 부분으로 구분하였으며 이 연구에서는 basal turn만을 실험에 사용하였다. 코르티기관 basal turn은 12 well plate의 coverslip에 부착한 후 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>염증성 사이토카인 분비 측정</h2> <p>Cisplatin에 의한 염증성 사이토카인의 생성은 \( 30 ~ \mu \mathrm { M } \)의 cisplatin을 처리한 세포배양 상층액에서 pro-inflammatory cytokine assay kit (R \&D System Inc., Minneopolis, USA)를 이용하여 ELISA 방법으로 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), 및 IL-6의 사이토카인을 정량하였다.</p> <h2>Total RNA의 분리</h2> <p>배양 세포로부터 total RNA의 분리는 TRizol \( ^ {\circledR } \)을 이용하였다. 세포는 냉 생리식염수로 세척하여 \( 1.5 \mathrm { ~ml } \) microtube로 옮긴 후 \( 3,000 \mathrm { ~rpm } \)에서 5분 원심분리하여, 침전물을 \( 1 \mathrm { ~ml } \) TRIzol \( ^ {\circledR } \)로 용해시킨 후, \( 200 ~ \mu \mathrm { l } \) chloroform을 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 원심분리하였다. 새로운 microtube에 옮긴 상충액은 동량의 isopropanol과 혼합하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 반응하여 \( 13,000 \mathrm { ~rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 원심분리하여 침전물은 \( 80 \% \) 에탄올로 세척하였다. 세척한 RNA는 건조 후 DEPC를 처리하여 RNase 활성이 제거된 증류수로 용해시켰다. Total RNA양을 정량하기 위하여 Nano drop (Nano Drop Technologies Inc., USA)을 이용하여 시료의 total RNA의 양을 정량하였다.</p> <p>TNF- \( \alpha \)는 염증반응에서 가장 중요한 염증성 사이토카인으로서 염증반응과 다양한 면역질환의 병인으로 잘 알려져 있으며 세포자멸사 뿐만 아니라 세포괴사의 원인이 된다. 또한, TNF는 세포 면역물질이면서 종양을 괴사시키는 특수한 성질 때문에 다방면으로 연구되어져 왔다. 세포가 방출하는TNF- \( \alpha \)와 같은 염증성 사이토카인은 세포가 가진 수용체를 통하여 근접 세포내로 신호가 전달되어진다. 세포 표면에는 death receptor가 존재하며, 이들은 세포를 죽음으로 유도하는 물질들을 인지하고, 수용하여 세포내로 신호를 전달하는 기능을 한다.</p> <p>IL-1 \( \beta \)는 호중구를 활성화시켜 염증부위로 이동시키며 Prostaglandin E2 (PG-E2) 생성유도에 의해 발열을 유발하여 TNF- \( \alpha \)와 함께 염증반응의 주된 매개자로 작용하는 NO를 비롯한 superoxide anion등의 형성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 염중반응이 일어나면 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \)와 같은 초기 염증반응 사이토카인을 분비한다. IL-2, IL-4, IL-6와 같은 후기 염증반응 사이토카인은 염증 반응을 더욱 심하게 만든다.</p> <p>이 연구에서는 cisplatin에 의한 이독성이 염증성 사이토카인과 관련되어 있는지에 대하여 조사하였다. Cisplatin 처리는 cochlear explant에서 TNF- \( \alpha \) 발현을 유도하였다. TNF- \( \alpha \) 발현은 주로 Deiters 및 Hensen's 세포에 현저하게 증가되어 있었으며, 외측 및 내측 청각유모세포를 지지하는 pha-langeal 세포와 inner/outer pillar 세포, Interdental 세포, 및 limbus에서도 관찰되었다. 그러나, cochlear nerve에서는 TNF- \( \alpha \) 발현이 미미하였으며, Claudius 세포에서는 TNF- \( \alpha \) 발현을 관찰할 수 없었다. TNF- \( \alpha \) 발현의 근원세포나 조직을 규명하기 위해서는 추가적인 in situ hybridization 실험이 추가적으로 요구된다. TNF가 수용체에 결합하게 되면 phos-phatidylcholine-specific phospholipase C와 acidic, neutral spingomyclinase를 활성화시켜 ceramide를 생성시키고, ce-ramide는 proline-directed kinase (CAPK, MAPK)를 활성화시킨다. CAPK, MAPK에 의해 phospholipase A2가 방출되고, phospholipase A2는 arachidonic acid롤 생성하여 대사과정 중에 산소라디칼이 형성된다. 이와 같이 TNF는 유해활성산소를 생성시키는 여러 효소의 생성을 촉진하여 세포 내 독성을 유도함이 보고되어져 있다. 이와 같은 보고에 의하여 염증반응의 주된 매개자로 작용하는 활성산소종을 항산화제로 감소시켰을 경우에 코르티기관의 청각유모세포에 미치는 영향을 조사하였다. 이 실힘에서 대표적인 항산화제 GSH와 NAC는 cisplatin에 의한 청각 유모세포의 사멸을 완벽하게 억제 할 수 있었다.</p> <p>Cisplatin에 의한 염증성 사이토카인의 생성 증가는 신장세포에서 보고되었지만, 이들 염증성 사이토카인이 청각가능 상실의 원인으로 작용할 수 있다는 연구는 대단히 중요하다. 그러나 cisplatin에 의한 염증성 사이토카인 발현 유도기전에 대한 연구와 염증성 사이토카인과 활성산소종의 상관관계에 대한 추후 연구가 필요하다고 생각된다.</p> <h2>Primer Sequences</h2> <ol type = start=1><li>TNF- \( a \) 5'-CAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3' 5'-CTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3'</li> <li>IL-1 \( \beta \) 5'-TCA TGG GAT GAT GAT GAT AAC CTG CT-3' 5'-CCC ATA CTT TAG GAA GAC AGG GAT TT-3'</li> <li>IL-6 5'-TTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3' 5'-TTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3'</li></ol> <h2>Phalloidin 염색</h2> <p>배양한 cochlear explant는 시약 처리 후, \( 4 \% \) paraf-ormaldehyde로 30분 고정하고 생리식염수로 세척한 후 \( 0.1 \% \) Triton X- 100으로 5분 실온에서 반응하였다. TRITC-la-beled phalloidin (Sigma P1951, 1:4,000)으로 30분 실온에서 반응한 후 PBS로 3회 세척하고 표본 제작하여 헝광현미경으로 관찰하였다.</p> <h2>Immunocytochemistry</h2> <p>배양된 cochlear explant를 PBS로 3번 세척하여 \( 4 \% \) paraf-ormaldehyde로 30분 고정한 후 PBS로 세척하였다. Blocking solution ( \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) of normal goat serum, \( 5 ~ \mu \mathrm { l } \) of \( 10 \% \) Triton X-100 및 \( 895~ \mu \mathrm { l } \) of PBS)에 2시간 실온에서 반응하였다. Cochlear explant는 1차 항체 anti-TNF- \( \alpha \) ( \(2 ~ \mu \mathrm { l } \) goat anti TNF-a antibody, \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) Triton X-100 \((10 \%) \), \(6 ~ \mu \mathrm { l } \) normal goat serum, \( 190 ~ \mu \mathrm { I } \) PBS)를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 반응하였다. 이 검체는 PBS로 3번 세척한 후에 2차 항체인 anti-goat IgG FTTC ( \(1 ~ \mu \mathrm { l } \) FITC-labeled phalloidin, \( 12 ~ \mu \mathrm { l } \) normal goat serum, \(4 ~ \mu \mathrm { l } \) Triton X-100 \((10 \%) \) and \( 383 ~ \mu \mathrm { l } \) PBS)와 상온에서 90분 반응하고, PBS로 각각 10분 3번 세척하였다. 최종적으로 검체는 \(50 \% \) glycerin을 이용하여 slide에 mounting한 후에 형광현미경으로 관찰하였다. 필요한 경우에 검체는 Phalloidin-TRITC와 DAPI를 동시에 염색하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>표시된 결과는 3번 이상의 독립적인 실험결과이며, 이들의 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, S.D)를 산출하여 결과를 표시하였다. 실험결과의 통계처리는 Student's t-test와 One-way ANOVA 분석을 통하여 처리하였으며 p-value가 최대치 \( 0.05(p<0.05) \) 미만인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>Cisplatin이 청각세포주 HEl-OC1 세포생존율에 미치는 영향</h2> <p>Cisplatin에 대한 HEI-OC1세포의 세포독성을 조사하기 위하여 다양한 농도의 cisplatin을 24시간 처리 후 MTT 방법으로 세포생존율을 측정하였다. 그 결과 cisplatin은 \( 10 ~ \mu \mathrm { M } \)의 농도에서 약 \( 17 \%, 20 ~ \mu \mathrm { M } \)의 농도에서 약 \( 50 \% \)의 세포 죽음을 유도하여 처리 농도에 의존적인 세포독성을 나타냈다. 또한 세포생존율은 \( 20 ~ \mu \mathrm { M } \) cisplatin을 다양한 시간 처리한 결과, 처리 18시간 후부터 감소하기 시작하여 처리 24시간 후 현저히 감소하여 약 \( 50 \% \) 의 세포생존율을 나타냈다. 이상의 결과에서 cisplatin에 의한 세포독성은 HEI-OC1세포에서 농도 및 시간 의존적으로 증가함을 관찰할 수 있었다. 또한, \(20 ~ \mu \mathrm { M } \) 농도의 cisplatin을 24시간까지 처리한 후 시간에 따른 염증성 사이토카인 mRNA 발현 변화를 RT-PCR 방법으로 측정하였다. 염증성 사이토카인 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \) 및 IL-6의 mRNA는 cisplatin 처리 12시간에 관찰 할 수 있었으며, 처리 시간에 비례하여 발현양이 증가하였다. 그러나 이들 사이토카인의 발현 시기는 사이토카인의 종류에 따라 차이가 있었다(미발표 결과).</p> <h2>염증성 사이토카인 중화(neutralization)에 의한 cisplatin 세포독성 예방 효과</h2> <p>Cisplatin에 의해서 생성된 염증성 사이토카인의 기능을 확인하기 위하여 HEI-OC1세포에 anti-TNF- \( \alpha \), anti-IL-1 \( \beta \) 및 anti-IL-6 항체 \( 1.5 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)과 \( 20 ~ \mu \mathrm { M } \) cisplatin을 24시간 처리한 후 세포생존율을 MTT 방법으로 조사하였다. Anti-TNF- \( \alpha \) 항체의 전처리는 cisplatin 세포독성을 예방하여 세포생존율이 cisplatin 단독 처리군의 \( 50 \% \) 수준에서 \( 70 \% \)로 증가하였다. 그러나 anti-IL-13 및 anti-IL-6 항체의 전처리는 cisplatin에 의한 HEI-OC1 청각세포의 생존율 회복에 유의한 변화를 나타내지 않았다. 또한, 이들 염증성 사이토카인 모두를 중화할 수 있는 anti-TNF- \( \alpha \), anti-IL-1 \( \beta \) 및 anti-IL-6 항체를 동시 전처리한 실험군의 cisplatin 세포독성 억제효과는 anti-TNF- \( \alpha \) 항체만을 단독 전처리한 실험군과 유의한 차이가 없었다. 이상의 결과에서 염증성 사이토카인 TNF- \( \alpha \) 가 cisplatin에 의한 청각세포 손상의 중요한 인자로 작용하고 있음을 확인할 수 있었다.</p> <h2>항산화제가 cisplatin에 의한 organ of Corti의 청각 유모세포 손상에 미치는 영향</h2> <p>Cisplatin에 의한 활성산소종의 과생성은 산화적 스트레스기전을 통하여 세포 손상을 초래한다. 렛트에서 분리한 organ of Corti의 청각유모세포 손상에 대한 활성산소종의 역할을 확인하기 위하여 대표적 항산화제인 GSH \( (15 \mathrm { ~mM } ) \)와 NAC \((15 \mathrm { ~mM } ) \)를 각각 1시간 전처리하고, 다양한 농도의 cisplatin \( (20-50 ~ \mu \mathrm { M } ) \)을 30 시간 처리한 후에 phalloidin-TRITC 염색을 시행하였다. 항산화제 GSH와 NAC의 전처리는 다양한 농도의 cisplatin에 의하여 유발된 청각 유모세포의 손상과 배열의 파괴를 현저히 보호하였다. Fig. 6B에서는 각 실험군에서 임의로 정한 3개의 구역에서 GSH와 NAC에 의한 organ of Corti 청각 유모세포의 보호 효과를 phalloidin-TRITC 염색 세포 수로 정량화하여 도식화 한 결과이다.</p> <h2>Cisplatin처리에 의한 청각유모세포의 TNF- \( \alpha \) 발현</h2> <p>Cisplatin에 의한 청각유모세포 손상은 염증성 사이토카인 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \) 및 IL-6 등의 분비와 유관함을 확인하였기 때문에, cisplatin을 처리한 cochlear explant에서 cisplatin에 의한TNF- \( \alpha \)의 발현을 immunocytochemistry 방법을 통하여 조사하였다. 렛트 코르티기관 청각유모세포는 palloidin-TRTTC, DAPI 그리고 anti-TNF- \( \alpha \) 항체를 이용하여 면역형광을 시행한 후에 형광현미경으로 관찰하였다. Cisplatin에 의한 TNF- \( \alpha \) 발현은 cochlear explant의 Hair cell zone에 위치한 Deiters 세포(white arrow)와 Hensen's 세포(red arrow)에 현저하였으며, 외측 및 내측 Pillar 세포, spiral ganglion neurons, 및 cochlear nerve에서도 관찰되었다. 그러나 claudius 세포에서 TNF- \( \alpha \) 발현은 관찰할 수 없었다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>청각유모세포는 최종적인 세포 분화 이후에 소음, 이독성 약물 및 노화 등에 의한 손상으로부터 영원히 재생하지 않는 특징을 가진다. 중추신경계의 신경세포와도 유사한 특징을 가진 청각유모세포는 성장, 분화 그리고 사멸 기전이 아직까지 명확히 밝혀져 있지 않다. Cisplatin은 다양한 종류의 항암치료에 사용하고 있으나 이독성과 신장독성 등의 심각한 부작용을 초래할 수 있기 때문에 효과적인 암치료를 위한 사용에 제한을 받고 있다. Cisplatin의 이독성에 관련된 연구는 in vitro, ex vivo 및 in vivo 에서 활발하게 진행되고 있다. Cisplatin에 의한 이독성 기전은 활성산소종 생성에 의한 lip-id peroxydation 증가, 미토콘드리아 기능 이상, DNA 손상등이 잘 밝혀져 있다. 그러나, cisplatin에 의한 염증성 사이토카인 생성과 이에 연관된 청각 유모세포 손상에 대한 연구는 아직까지 미비하다.</p> <h2>역전사 중합효소 연쇄반응</h2> <p>역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 하기 위하여 cDNA를 먼저 합성하였다. cDNA는 \( 2 ~ \mu \mathrm { g } \) total RNA와 Reverse Transcriptase (Superscript II, Invitrogen, USA)를 이용하여 합성하였다. Total RNA를 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 변성한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 급랭하였다. 역전사 반응에 의한 cDNA의 합성은 total RNA \( (2 ~ \mu \mathrm { g } ), 1 ~ \mu \mathrm { l } \) oligo d T, \(2 ~ \mu \mathrm { l } \) DNTP \((10 \mathrm { ~mM } ) \), \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) Superscript II reverse transcriptase \( (5 \mathrm { ~U } / \mu \mathrm { l } ) \), DTT \( (10 \) \( \mathrm { mM } ) \), 및 RNasin \( (1 ~ \mu \mathrm { l } ) \)을 최종적으로 \( 20 ~ \mu \mathrm { l } \) 완충용액 ( \(50 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { Tris-Cl } \) \( \mathrm { pH } \) 8.3, \( 75 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~KCl } , 3 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~MgCl_2 } \))과 혼합하여 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 60분 반응시켰다. cDNA는 1/10으로 희석하여 RT-PCR에 사용하였으며 특정 유전자 증폭을 위한 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은 \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) cDNA, \(2 ~ \mu \mathrm { l } \) 역전사 반응액, \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) dNTP \( (2.5 \mathrm { ~mM } ), 2.5 ~ \mu \mathrm { l } \) sense 와 antisense primer \( (1.1 ~ \mu \mathrm { M } ) \), Taq DNA polymerase (0.6 U; TAKARA)가 함유된 최종 30 \( ~ \mu \mathrm { l } \) 반응액 \( (20 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { Tris-Cl } \) \( \mathrm { pH } \) 8.0, \( 100 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { KCI } \), \(0.1 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { ~mM } \) DTT)을 이용하였다. 이 때 사용한 각 유전자에 대한 sense 및 antisense primer 서열 및 반응조건은 다음과 같다.</p>	생명
Research Trends of Fermented Medicinal Herbs - Based on Their Clinical Efficacy and Safety Assessment	<h3>발표 홍삼</h3> <p>발효 홍삼이 정상인의 신체에 미치는 영향을 조사하기 위해서 심장 질환이나 고혈압의 과거력이 없는 20 대의 건강한 남자 10 명을 선발 하였다[9]. 2 주 동안, 4 번의 방문을 통해서 시험약으로 3 가지와 대조약으로 1 가지 중 무작위로 한 가지씩 복용하고 잔여 효과를 최소화하기 위해 한 가지 약물에 대한 연구가 완료된 후 3 일이 지난 다음 재방문하여 다른 약물에 대한 연구를 진행하였다. 연구에는 인삼 제제, 홍삼 제제, 발효 홍삼 제제로 충진된 캡슐을 이용하였고 덱스트린을 담은 캡슐은 대조약으로 사용되었다. 발효 홍삼군에서, 투여 2 시간 후에 뇌혈관 반응도가 유의 \( (p=0.035) \) 하게 증가하였다. 이려한 결과는 뇌 혈류의 증가에서 기인하기 때문에 임상적으로 뇌 혈류 개선 효과가 확인되었으며 이를 통해 발효 홍삼이 뇌 혈류 개선 또는 뇌 혈관 질환 예방 목적으로 유용하게 적용될 수 있을 것으로 예상된다(Table 4).</p> <h3>중약 발효 온구</h3> <p>100 명의 환자를 무작위로 치료군 50 명에게는 중약 발효 온구와 침 치료를 병행하고, 대조군 50 명에게는 침 치.료만을 4 주 동안 실시한 후 어체(淤滯)형 견관절 주위염에 미치는 치료 효과를 비교하였다[5]. 치료군의 총 유효율이 \( 94.0 \% \) 이며 대조군의 경우 \( 68.0 \% \) 로서 통계학적으로 두 그룹간의 차이\( (p<0.05) \) 가 상당하여 중약 발효 온구와 침자 요법의 결합이 어체형 견관절 주위염에 현저한 치료 효과가 있는 것으로 나타났다(Table 4). 또한 80 명의 환자를 치료군과 대조군 각 40명으로 무작위로 분류하여 치료군에는 중약 발효 온구 요법을, 대조군에는 온침구 요법을 실시하여 만성 천표성 위염에 대한 중약 발효 온구의 치료 효과를 조사하였다[44]. 위완통(胃脘痛)，비만(痞滿)，납소(納少), 반산(反酸)，애기(噯氣) 등 5개의 증상에 대하여 치료 전, 후의 두 그룹간의 효과는 통계학적으로 현저한 차이를 보였다 \( (p<0.01) \). 비만 증상과 위완통 증상은 치료군이 대조군에 비하여 현저하게 치료 효과가 개선되었고 \( (p<0.01) \). 그러나 두 그룹 모두 총 누적 변화와 총 유효율을 비교했을 때 큰 차이는 없는 것으로 나타났다 \( (p>0.05) \). 따라 서 중약 발효 온구 요법은 만성 천표성 위염에 임상적으로 상당한 치료 효과가 있는 것으로 나타났다(Table 4).</p> <h3>발표 격부자간접구</h3> <p>발효 격부자간접구와 전통 격부자간접구의 신양허형 전립선 비대로 인한 배뇨곤란에 대한 임상 효능 연구에서, 93 명의 환자를 무작위로 분류하여 치료군에 속한 47 명 환자의 관원혈에는 발효 격부자간접구를, 대조군 46 명의 환자에는 전통적인 격부자간접구 치료를 실시하였다[43]. 두 그룹 모두 한번의 치료는 45 분간, 매주 5 차례, 6 주 간 실시하였다. 치료 전과 치료 후, 국제전립선증상지수(International Prostate Symptom Score, I-PSS), 최대 요류율, 배뇨후 잔뇨량의 변화등을 관찰하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 치료군의 I-PSS가 개선되었고, 최대 요류율은 높아졌으며, 배뇨후 잔뇨량은 감소하여 발효 격부자간접구 치료군의 치료 효과가 통계학적으로 높았다 \( (p \times 0.01) \). 치료군의 총 유효율은 \( 83.0 \% \) 이고 대조군은 \( 63.0 \% \) 로 나타나 그룹간에는 통계학적으로 유의한 차이\( (p<0.05) \) 가 있는 것으로 나타났다. 따라서 전통적인 격부자간 접구를 발효한 발효 격부자간접구는 전통 격부자간접구에 비하여 신양허형 전립선 비대 배뇨곤란에 임상적으로 유효한 효과가 있었다(Table 4).</p> <h2>발표 한약의 유효성</h2> <p>연구에서 조사한 발효 한약의 유효성에 대한 검토는 무작위 대조군 임상연구(RCT)를 중심으로 발효 한약과 발효 추출물을 대상으로 조사하였다.</p> <h3>겨우살이 발효 추출물</h3> <p>\( \mathrm{HIV} \) 양성인 환자 \( [(\mathrm{HIV}(+)] \) 와 정상인 사람[HIV(-)]들의 피하에 겨우살이 추출액을 18 주 동안 투여하여 나타난 국소염증 반응을 조사하였다[36]. 겨우살이 추출액을 발효한 약물을 투여한 치료군(IQuS)과 발효하지 않은 약물을 투여한 대조군\( (\mathrm{VaQuFrF}) \) 에 대하여 효과를 비교하였다. \( \mathrm{HIV}(+) 15 \) 명과\( \mathrm{HIV}(-) 9 \) 명으로 구성된 군에는 VaQuFrF를, \( \mathrm{HIV}(+) 15 \) 명과 \( \mathrm{HIV}(-) 8 \) 명으로 구성된 군에게는 \( \mathrm{IQuS} \) 를 투여하여 임상시험을 실시하였다. 일주일에 2 번씩 약물을 투여하고 14 일 마다 결과를 검사하였다. \( 1.0 \mathrm{mg} \) 이하의 함량을 투여하였을 때,\( \mathrm{VaQuFrF} \) 를 투여한 군이 IQus를 투여한 군보다 흥반이나 통증이 더 높은 빈도로 나타나 겨우살이 추출액을 발효하여 투여하는 경우에서 더 빠르고 빈번하게 국소반응을 나타내는것으로 보고되었다. 또한 Mistletoe lectin 항체의 형성은 IQuS를 투여한 군에서 현저하게 낮게 나타났다. 따라서 항체 형성 과 T-lymphocyte의 활동 사이의 상관관계는 VaQuFrF를 사용하는 군에서 더 현저하게 효과가 나타나, 겨우살이 발효 추출물이 HIV 양성 환자의 국소 염증반응에 효능이 있는 것으로 나타났다(Table 4).</p> <h3>흑효모 배양액 분말</h3> <p>국내에서 실시된 무작위 배정 임상연구로서 흑효모 배양액 분말의 효과를 검증하기 위해서 임상시험심사위원회의 선정 기준을 만족하는 총 56 명의 특별한 질병이 없는 건강한 남녀(20 60 세)를 대상으로 흑효모 배양액 분말 투여 \( (I F 28) \) 과 위약 투여(IF28)의 두 개 군으로 나누었다[2]. 각 군에 대하여 4 주간 하루 한 번, 식사 30 분 후에 경구로 2 정을 복용시킨 후,투여 전, 후의 혈액내 면역인자의 변화를 비교 평가하였다.\( \mathrm{TNF}-\mathrm{a} \) 는 시험군과 위약군 모두 투여 후 유의 \( (p<0.001) \) 하게 증가하였고, interferon- \( a \) 는 시험군과 위약군 모두 증가하였으나 위약군의 경우에만 통계적으로 유의하였다. IL-2는 시험군\( (p<0.01) \) 과 위약군 \( (p<0.05) \) 모두 유의하게 감소하였고, \( \mathrm{IL}-4 \) 는 시험군의 경우 유의 \( (p<0.05) \) 하게 증가하였으나 위약군의 경우에는 감소하였다. 따라서 알러지 반응과 관련된 사이토카인의 조절에 있어서 위약군은 투여 후 증가된 반면 시험군은 감소하여 흑효모 배양액 분말이 알러지와 관련된 면역 인자의 개선에 효과가 있는 것으로 나타났다(Table 4).</p> <h3>발효 동충하초</h3> <p>당뇨성 신병증에 대한 발효 동충하초의 치료 효과를 검증하기 위해 신장 기능이 정상인 38 명을 대조군으로, 신장 기능 장애가 있는 22 명의 환자를 치료군으로 무작위로 선별하였다[35]. 치료군의 환자에는 기존의 치료에 병행하여 발효 동충하초 가루를 투여하고, 대조군에는 기존의 치료제인 valsartan만을 투여한 후 16 주 동안 관찰하였다. 치료 전후의 urinary albumin excretion rate (UAER), serum creatinine (SCr),blood urea nitrogen (BUN), 24시간 뇨단백을 측정하였다. 대조군에 비해 치료군의 UAER와 \( \mathrm{SCr} \) 수치는 통계적으로 현저히 낮아졌다 \( (p<0.05) \). 따라서 발효 동충하초 가루는 UAER을 감소시키고 신장 기능을 개선시키며 당뇨성 신병증의 치료에 효과가 있는 것으로 나타났다(Table 4). 또한 원발성 고혈압 환자의 혈중 요산과 혈청 지질에 미치는 영향을 조사하기 위해, 고혈압 치료를 받고 있는 원발성 고혈압 환자를 무작위로 2 개 군으로 나누었다[24]. 대조군은 기본적인 고혈압 약물 치료를 받도록 하고 치료군은 매 회 5 알, 1 일 3 회, 12 주 동안 발효 동충하초를 부가적으로 투여하였다. 치료 후, 혈중 요산과 트리글리세리드의 값은 현저하게 낮아졌고 \( (p<0.05) \) high-density lipoprotein (HDL)는 현저하게 높아졌다 \( (p<0.01) \). 따라서 발효 동충하초를 원발성 고혈압 환자에게 적용할 경우,환자의 혈중 요산과 트리글리세리드의 값은 낮추고 HDL의 수준은 높여주어 고혈압 환자의 치료 및 질환 예방 목적으로적용할 수 있을 것으로 기대된다(Table 4).</p> <h3>고삼 발효물</h3> <p>만성 B형 간염 환자에 대한 고삼 발효물의 효능 연구에서 치료군은 110 명의 환자를 대상으로 고삼을 동충하초로 발효 시킨 캡슐 제제를 하루 세 번 복용시켰다[1]. 110 명의 대조군은 고삼 캡슐을 치료군과 동일한 방법으로 투여하였다. 치료 전과 치료 2 주, \( 1,3,6 \) 개월 후의 ALT, HBsAg, HBsAb,\( \mathrm{HBeAg} \), HBV-DNA, 환자의 증상, 신체 징후, 약물 불량반응 등을 관찰하고 핍력, 식욕부진, 복창, 협통, 간비종대 등을 대상으로 평가하였다. 모든 군에서 치료 전, 후 모든 항목에서 통계학적으로 의미 있는 차이 \( (p<0.05) \) 가 있었고, 대조군과 비교해서 치료군은 핍력, 협통 등의 항목 \( (p \times 0.05) \) 과 간 기능 정상회복 지표인 ALT 수치 \( (p<0.01) \) 에서 통계학적으로 치료 효과가 관찰되었다. \( \mathrm{HBeAg} \) 와 \( \mathrm{HBV}-\mathrm{DNA} \) 의 값에 있어서 대조군은 치료군과의 비교시 통계학적으로 차이 \( (0.025<p<0.05) \) 가 있는 것으로 나타났다(Table 4). 따라서 고삼을 동충하초로 발효한 한약은 간 기능에 대한 치료 효과를 보여 만성 \( \mathrm{B} \) 형 간염 환자에 효과적인 것으로 나타났다.</p> <h3>중약 발효고의 효과</h3> <p>전립선 비대증 환자를 무작위로 분류하여 치료군 45 명과 대조군 45 명에 대한 중약 발효고의 효과를 조사하였다[42]. 부자, 숙지, 산약, 산수유, 택사, 복령, 목단피, 육계 등으로 이루어진 중약 발효고를 테이프로 관원혈에 부착하고, 6 시간 경과 후 때어내는 치료를 하루 한 번, 매 주 5 차례씩 30 회를 하나의 치료 과정으로 하였다. 대조군은 관원혈에 침 치료를 실시하고 득기 후 침감이 요도나 회음부로 방사하게 한 후 30 분간 유침시키고 치료군과 같은 방법으로 실시하였다. 치료 과정 경과 후, I-PSS와 최대 요류율, 배뇨 후 잔뇨량 등의 항목에서 치료군과 대조군 모두 치료 전과 비교시 통계학적으로 의미가 있는 치료 효과를 보였으나 \( (p<0.05) \), 치료군과 대조군을 비교하면 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다 \( (p>0.05) \)(Table 4). 따라서 중약 발효고와 침 치료에 있어서 치료 효과의 차이가 없었으나 그 자체만으로도 전립선 비대증에 치료 효과가 있는 것으로 나타났다.</p> <p>애엽의 발효에는 조효소제인 a-Herbzyme \( 3 \mathrm{~g} \) 에 증류수 \( 100 \mathrm{ml} \) 를 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 침출하여 여과시킨 후 그여액을 조효소액으로 사용하였다. 열수 추출하여 건조한 애엽 (3.0 g, pH 5.44)을 tube에 \( 0.95 \mathrm{~g} \) 을 넣고 미리 추출된 조효소액을 \( 2.2 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 반응하였다. 멸균 후,S. cerevisiae STV89를 애엽에 \( 4 \% \) 씩 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 일간 배양하고, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 열처리하였다[7]. 녹용을 발효한경우, 녹용을 분쇄하여 중량의 \( 5 ~ 10 \) 배 양의 물을 넣고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2 시간 추출하고 추출액을 \( 1 \mu \mathrm{m} \) 여과지로 여과한 후Bacillus sp.를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 시간 동안 발효하였다. 발효 종료 후 \( 0.25 \mu \mathrm{m} \) 여과지로 여과한 다음 여과액이 30 Brix가 되도록 감압 농축하여 녹용 발효추출물을 제조하였다[23].</p> <h3>복합 한약재를 이용한 발효</h3> <p>애엽과 음양곽 혼합 발효에서는 애엽과 음양곽 추출물을 이용하여 각각 다음과 같은 방법을 통하여 발효 애엽과 발효 음양곽을 얻었다. 열수 추출하여 건조한 애엽 \( (3.0 \mathrm{~g}, \mathrm{pH} 5.44) \)과 음양곽 \( (3.0 \mathrm{~g}, \mathrm{pH} 4.82) \) 을 tube에 각각 \( 0.95 \mathrm{~g} \) 을 넣고 미리 추출된 조효소액을 \( 2.2 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 반응 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 살균하였다. S. cerevisiae STV89를 애엽과 음양곽 혼합액에 \( 4 \% \) 씩 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 일간 배양하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분 간 열처리하였다[33]. 또한 황기, 맥문동,금은화, 백련초, 길경, 어성초, 단삼 등에서 추출한 파우더형의 한약재에 12 시간 동안 미리 혐기적인 배지에서 배양한 L. case를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 동안 \( 180 \mathrm{rpm} \) 의 속도로 진탕하여 발효하였다[34]. 복합적인 발효 한약 추출물을 만드는 또 다른 방법으로는, 인진호, 금은화, 지구자로 구성된 숙취 해소용 한방 제제에 뽕잎, 호박, 도라지, 은행잎, 당근, 메주,찹쌀, 맥아, 포도당, 토마토, 감자 등으로 이루어진 일반 식품류를 일정 비율로 혼합하여 제조하는 것이다. 먼저 일반 식품 원료 혼합물을 35 일간 발효하고 여기에 숙취 해소용 한방 제제를 첨가하여 다시 15 일을 발효시킴으로써 총 60 일간의 숙성과정을 거쳐 발효물을 제조하였다[11]. 상지, 상백피, 상엽 약침액의 발효 방법은 \( 50 \mathrm{~g} \) 의 약재에 \( 94 \% \) 에탄올을 100\( \mathrm{ml} \) 넣고 72 시간 추출하였다. 추출물을 여과하고 회전식evaporator를 사용하여 농축한 뒤, A. oryzae를 이용하여 48시간 동안 발효하였다[30].</p> <h3>전탕된 한약재를 이용한 발효</h3> <p>전탕 추출법에 의해 추출된 오적산을 \( 1 \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{NaOH} \) 로 \( \mathrm{pH} \)를 \( 8.0 \) 으로 조정한 후 가압 멸균하였다. 상온에서 냉각시켜 L. fermentum을 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 접종하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온실에서 48시간 동안 통기성으로 배양하여 액체상으로 발효하였다[39].발효 육미지황탕의 경우, L. gasseri를 발효 뉸주로 접종하였고 그 외 발효 방법은 앞의 내용과 동일하였다[29]. 쌍화탕의 발효시에는 접종 균주인 영지버섯을 평판배지에서 배양하고\( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하면서 30 일 간격으로 계대 배양하였다. 균사체의 성장을 위하여 항온 배양기에서 평판배지를 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도에서 20 일간 배양한 후, 액체 배지에 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 120 \)\( \mathrm{rpm} \) 에서 7 일간 배양하여 액체 종균을 생산하였다. 최종적으로 쌍화탕에 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 수준으로 접종하여 생육 온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 상대 습도 \( 80 \% \) 를 유지하면서 30 일간 배양하여 발효물을 제조하였다[40].</p> <h1>서 론</h1> <p>세계 기능성 식품 시장 동향은 통계 기관별로 다소 차이가 있으나 \( \mathrm{NBJ} \) 의 보고에 따르면 2000년 1,435 억 불 규모에서 2008년에는 2,697 억 불로 놎은 성장률을 보이고 있으며 2014년에는 3,973 억 불의 시장을 형성할 것으로 전망된다[26]. 발효 한약은 기능성 식품 중 차지하는 비중이 아직은 높지 않으나 항염 [18,25], 항암[32], 항고혈압 \( [24] \), 항당뇨 \( [6,16,13] \) 등 다양한 효과들이 지속적으로 보고되고 있고 이와 더불어 일반인의 인식이나 선호도 역시 매년 개선되고 있다[4,37]. 기능성 식품의 기능성 중에서도 천연 재료, 친환경적 재료, 질병 예방식품 즉, 발효 식품, 효소 식품, 웰빙 식품, 유기농 식품 등에 대한 관심은 갈수록 증대되고 있다.</p> <p>일반적으로 발효라고 하는 과정은 기질인 유기 화합물이 분해되고 그 분해 산물이 상호적으로 산화, 환원되어 일어 나는 ATP 생성 반응이다. 따라서 산화, 환원의 균형이 정확하게 유지되어야 하기 때문에 한정된 범위 내의 유기 화합물만이 발효의 기질이 될 수 있다. 발효 한약은 문헌상으로는 조선 초기에 처음으로 등장하기 시작하는데 의학, 미생물학, 식품학 등이 결합된 형태로서 질병을 치료하는 과정에서 최대의 치료 효과를 얻기 위해 당시의 여러 실용적인 발효 기술을 한약에 동시에 구현하는 형태로 다양하게 시도 되었다[27].</p> <p>최근 국내 한약재는 임상에서 다양한 제형으로 사용되고 있으나, 지금까지 실시된 발효 방식으로 한약 제형의 개발이 나 적용된 사례는 그다지 많지 않았다. 이는 발효의 유기 화학적 조건을 충족시키는 한약재가 많지 않았을 뿐 만 아니라, 화학적 변형에서 발생되는 부산물에 대한 인체 독성 반응에 대한 연구가 미흡하였기 때문이기도 하였다. 또한 현재 한의<p>학 의 임상 분야에서는 한약재의 발효에 대해 체계적으로 정립된 방법이 없어서 각 임상 의사의 개별적인 방법에 따라 발효 한약이 만들어지고 있는 실정이다. 따라서 아직까지도 표준화된 제조법 등에 대한 과학적 기반이 충분하지 않으며 기술적 환경도 매우 어려운 수준으로 과학적이고 체계적인 발효 공정, GMP 수준의 발효 제품 제조, 제조 완료와 제품 출시 후의 관리 등에 대한 정보화가 시급하다고 할 수 있다. 무엇보다도 발효 한약의 개별적인 제조 기술의 개발이 필요하 며 그에 따른 명확한 정의, 위생, 안전 기준의 확립 또한 필요할 것으로 사료된다.</p> <p>본 연구는 국내 한의학 저널과 국외 database (DB)인 China National Knowledge Infrastructure (CNKI)와 PubMed를 통해 randomized controlled trials (RCTs)를 포함한 발효 한약연구들을 조사함으로써 발효 균주와 방법, 발효 한약의 안전성과 유효성을 비롯한 활용 방향과 임상적 기대 효과에 대해 고찰하여 현재의 발효 한약에 대한 현황을 정리하고 향후 발효 한약의 다양한 응용을 위한 기초 자료로 삼고자 한다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>최근 건강에 대한 관심이 높아지면서 식품에 대한 일반인들의 인식이나 선호도 또한 현저하게 달라지고 있는데 이러한 현상은 우리나라의 전통 발효 음식에 대한 관심으로 자연스럽게 이어져서 식품업계는 발효 산업을 하나의 성장 동력으로서 육성하고 있으며, 발효음식 관련 미생물 시장 또한 매년 대단히 빠르게 성장하고 있다[37]. 발효 산업은 건강기능식품, 바이오 연료, 의약품 분야에서도 각광받고 있으며 한의학계 또한 발효에 대한 잠재력을 높이 평가하고 관련 학술 행사를 개최하는 등 발효 한약을 산업화, 과학화하기 위해 힘쓰고 있다.</p> <p>국내에서는 발효 한약이 건강한 사람의 활력 징후와 면역체계에 미치는 영향에 대한 연구가 많이 수행되었다. 유럽의 경우, 항암 효과를 가진 상기생에 대한 관심이 높으며 중국에서는 영지, 동충하초균을 이용한 발효 연구가 다수 진행되어 견관절 주위염, 만성 천표성 위염, 전립성 비대증, 당뇨성 신병증, 만성 B형 간염 등의 질환에 대한 발효 한약의 치료 효과를검증하였고, 그 외의 국가에서 식물의 추출액을 발효 한약으로 국소 염증반응과 혈액 검사를 통한 변화를 알아보는 연구 와 식도암의 원인에 대한 연구가 보고되었다.</p> <p>이러한 국내외의 분위기에도 불구하고 한의학 내에서 발효 한약에 대한 연구나 학술적 활동은 다소 제한적이다. 단적으로 발효 한약에 대한 용어 정의가 아직 정립되지 못한 실정이며, 발효 균주에 대한 효능과 주의점 등이 명확하게 구분되어 있지 않고 발효 후 생성되는 물질에 대한 독성 실험이나 안전성에 대한 검증도 동물 실험에 국한되어 발효 한약의 안전성,유효성은 임상적으로 검증된 부분이 미비한 실정이다. 또한 기존의 전탕된 한약과 발효 처리 후의 한약의 효능과 조치가 동등한 것인가에 대한 고려도 연구가 되어야 한다. 이는 발효과정에서 기존 한약재의 유기물의 변화로 의도하지 않는 반응 이 초래될 수 있으나 기재에 해당되는 한약재의 종류가 다양하여 개별 연구를 통한 검증이 어렵기 때문으로 볼 수 있다. 다만 발효법을 통한 한약재 수치가 일반적이지 않으며, 민간에서 관습적, 문화적으로 복용되어 왔던 발효 한약에 대한 연 구는 보고되고 있어 본 연구에서는 이들 연구 중 이상 반응 보고들을 통해 특정 발효 한약의 안전성에 대한 정보를 정리 하여 보았고 발효에 사용되는 균주와 발효 방법에 대하여 조사하였다. 아울러, 발효 한약에 관련된 임상적 활용 분야와</p> <p>식도암을 유발할 수 있는 발효된 빈랑나무 열매에 대한 연구[32]가 안전성에 있어 문제를 제기하였지만, 동물을 대 상으로 실험한 대다수의 연구 결과는 독성이 없는 것으로 나타났다. 반면에 상황버섯 균사체 발효주를 이용한 연구[3]와 오배자 발효에 대한 중약 연구[41]에서는 독성 반응을 감소시키는 결과 등이 보고되었다. 간 독성에 미치는 효과에 대해서 진균 발효 쌍화탕[31] 실험에서는 치료 기능이 일부 강화되고 효모균 발효 애엽 추출물 실험 연구[21]에서는 간 조직 세포 손상을 완화하는 효능을 보였다. 흑효모 배양액 [36]의 임상연구에서는 이상 반응이 나타났으나 일시적인 증상으로 소실된 경우가 대부분이어서 인과관계가 성립되지 않았으며 혈액 검사 상에서도 유의한 이상소견이 보이지 않아 안전한 것으로 밝혀졌다.</p> <h2>발효 한약의 안전성</h2> <p>본 연구에서 조사한 발효 한약의 안전성에 대한 검토는 총 8 편의 연구사례를 통해 전임상과 임상으로 나누어 조사하 였다.</p> <h3>전임상 연구</h3> <p>전임상 연구 6 편에서 사용된 발효 한약은 영지버섯 균사체로 배양한 발효 쌍화탕[40], L. fermentum을 접종하여 배양한 발효 쌍화탕[22], L plantarum을 접종하여 배양한 발효 방풍통성산[20], L. fermentum을 접종하여 배양한 발효 오적산[39],L. gasseri를 접종하여 배양한 발효 육미지황탕[29], L. fermentum을 접종하여 배양한 십전대보탕 발효물[19] 등이 있었다.이 들 발효물을 이용하여 마우스에 경구 투여한 후 임상 증상을 관찰하였고, 설정된 투여 용량은 "의약품 등의 독성시험기준(식품의약품 안전청 고시 제2005-60호, 2005.10.21.)"에 따른 급성독성 한계 용량인 \( 2,000 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 을 초과하는 \( 5,000 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)의 고농도를 기준으로 하여 정하였다. 시험 기간 동안 실험 동물의 체중 변화를 측정하고 최종 일에 해부하여 모든 장기에 대한 육안적 병변을 관찰하였으나 특이 사항이 관찰되지 않았다. 따라서 전임상에 사용된 발효 한약에서는 특이적인 독성 반응이나 병변이 관찰되지 않아 안전한 것으로 판명되어 앞으로 발효 한약을 민간에 사용하는데 있어서 안전성에서는 문제가 없을 것으로 사료된다.</p> <h3>임상 연구</h3> <p>2 편의 임상 연구에서 사용된 발효 한약으로는 발효 빈랑나무 열매[32]와 흑효모 배양액[2]이 보고되었다. 인도 아쌈 지역에서 빈랑나무 열매를 씹는 습관으로 장기간 구강 섭취시 식도암이 유발될 수 있는 것으로 보고되었다. 358 명의 남성과 144 명의 여성을 대상으로 빈랑나무 열매를 씹는 습관과 관련된 식도암 발병 가능성 연구에서 odds ratio는 남성(M)의 경우\( 2.6(p=0.045) \) 과 여성(F)의 경우 \( 3.7(p \times 0.001) \) 로서 통계학적으로 남성과 여성의 발병 빈도에서 차이가 있는 것으로 나타났다. 발효한 빈랑나무 열매를 씹은 후 삼키면 odds ratio는 \( 3.9 \)\( (\mathrm{M}) \) 과 \( 4.3(\mathrm{~F}) \), 입에 머금고 있는 경우 odds ratios는 \( 5.9(\mathrm{M}) \) 과\( 3.1 \) (F), 삼키는 것과 머금고 있는 것을 동시에 할 경우, oddsratio는 \( 6.3(\mathrm{M}) \) 과 \( 2.9(\mathrm{~F}) \) 로서 특히 남성에게 식도암을 유발될가능성이 높아지는 것으로 나타났다. 따라서 식도암의 잠재적인 위험요소로서 빈랑나무 열매를 씹는 습관 등을 조절할 필요성이 있다고 보고되었다. 흑효모 배양액에 대한 안전도 평가에서 시험제품을 14 일간 투여하고 시험 종료 시점에서 이상 반응을 확인한 결과, 혈액학적 검사, 요검사, 혈청학적 검사에서 투여 전, 후 유의한 차이가 없었다. 그러나 콧물, 기침,전신통, 몸살, 어지럼증, 설사 등에서 이상 반응이 나타나는것으로 보고되었으나, 이는 일시적인 증상으로서 대조군과 비교하여 통계적 유의성 없는 것으로 나타났다.</p> <p>기재로 쓰인 한약재에 따라 발효 한약의 임상적 활용도는 다양한 편으로, 소염[25,28], 항암[32], 비만 치료[12], 건강한 사람의 활력 징후[9], 견관절 주위염[5], 전립선 비대증[24,43],만성 천표성 위염[44], 당뇨성 신병증[35], 만성 B형 간염[42]등의 분야에서 치료 효과가 유효한 것으로 보고되었다. 특히 항암에 관련된 발효 한약은 겨우살이풀 추출물에 대한 연구가 전임상에서 많이 다루어지고 있었으며, RCT 연구에서는 겨우살이풀의 항염 효과가 보고되었다[36]. 겨우살이풀은 상기생으로 한약재 중 평(平), 고감(苦甘)한 성미(性味)가 있어 임상에서도 풍습비통, 요슬산연, 고혈압 등을 치료하기 위해 자주 쓰이고 있다[38]. 비만[12]과 피부 보습[14]에 대한 연구 결과는 통계학적으로 유의하지는 않았으나 발효 한약이 치료에 보조적으로 사용할 수 있는 하나의 예를 제시하는 것으로 보인다.본 연구 결과 발효 한약은 적절한 균주의 선택을 통해 안정적으로 발효가 이루어지는 경우, 안전하며, 피부, 비만, 항암,항염증을 비롯하여 만성 위염, 견관절 주위염, 전립선 비대증, 만성 간염 등의 질환 등에서 폭넓게 사용이 가능할 것으로 보인다. 다만, 각 연구에 대해 질 평가(Jadad score)를 시행하였을 때, 대부분의 연구가 0-1 점으로 낮았으며, 은닉할당이 되어 있지 못한 한계가 있어 이를 보완할 수 있는 많은 추가 연구들이 필요할 것으로 보인다. 또한, 국내 연구에서 사용하는 발효 한약은 단미제에 대한 연구도 다수 있었지만, 혼합제제에 대한 발효 방식에 대하여 연구한 것이 특징적이어서 단미제에 대한 연구가 주를 이루는 국외 연구 동향과도 달랐다. 이는 혼합 제제에 대한 임상적 성과물이 누적된 상태에서 발효라는 추가적 제형 변화를 검증하고자 하는 것으로 볼 수 있다. 하지만, 이는 발효의 특징, 즉 유기적 변화가 초래될 수 있다는 점에서 발효 과정의 정형화나 발효 후 효과의 재현성에 대한 예측이 어렵다는 문제가 있다. 이를 보완하기 위해서는 상용하는 단미제 위주의 발효 한약 연구가 혼합 제제를 이용한 발효와 동시에 병행 추진되어 발효 특성 및 최종 산물에 대한 분석 등의 정보들이 많이 공유되어야 한다는 것이 제안되었다.</p> <p>이상의 연구들을 종합해 보았을 때 발표 한약은 비나, 노인성 질환, 퇴행성 질환 등의 치료면에서 기존의 일반적인 한약에 비해서 더 효과적인 것으로 사료되며 만성 난치성 질환에 대한 예방적인 차원에서도 활용할 수 있을 것으로 보인다. 이것은 양방에서 사용되는 약물을 대체할 수 있는 역할을 할수 있는 것으로 장기 복용으로 인하여 야기되는 많은 부작용 에 대한 위험을 줄일 수 있는 방안 중의 하나가 될 수 있을것이다. 본 연구에서 기준으로 선정한 최근 10 년 간의 국내와 국외 연구들에서 발효에 대한 연구는 대부분 국외에서 이루어진 것이었다. 발효 시장 확대에 대비한 정부 및 출연 연구기관 에서의 관련 연구는 성과만을 놓고 볼 때 아직까지는 상당히 부족한 수준이라는 평가를 면하기 어려운 실정이다. 그러나 발효 한약은 제형의 혁신적 변화를 꾀하기도 용이하며 그러면서도 한의학적 이론 기반과 환자들을 통해 확인할 수 있는 임상적 효과를 모두 충족시킬 수 있기 때문에 국내외 발효시장에서 경쟁력은 지속적으로 증대될 것으로 기대된다. 따라 서 발효 한약에 대한 연구에 임상 의사들을 포함한 많은 연구를 지속해야 할 것이며 아울러 정부와 관련 연구기관의 지속 적 관심과 확대된 지원 역시 절대적으로 필요하다고 볼 수 있다.</p> <h1>문헌 검색</h1> <p>발효 한약에 대한 문헌 조사는 2000년에서 2011년 사이에 출간된 대한한의학회 소속 저널과 CNKI, Pubmed의 DB 검색을 통해 시행하였고 인터넷판 또는 인쇄본으로 출간된 연구를 대상으로 하였다. 검색어는 발효(發酵; Fermentation; Fremented 등 MeSH term)와 한약(Herb) 두 가지를 검색어로 선정하여 이 둘을 동시에 만족하는 문헌을 채택하여 조사하였다. 최종 선정된 문헌들은 연구 방법에 따라 전임상 연구(invitrofin vivo), 단순 증례보고(case study, case series), 증례 대조군 연구(case controlled trials), 무작위 대조군 임상연구(randomized controlled trials, RCT)로 분류하였고 보고된 문헌에 서술되어 있는 이상반응 여부도 병행하여 조사하였다.최종적으로 포함된 무작위 대조군 임상연구는 Jadad Score [8]에 따라 질 평가를 수행하였다(Table 1). 검색된 문헌은 375편이었으며, 발효 한약에 대한 이상 반응 보고는 총 12 편이었으며 문헌 고찰 연구, 전임상 연구(in vitrofin vivo), 증례보고 연구, 대조군 임상 연구 364 편과 무작위 대조군 임상 연구 11 편 등이 선별되었다(Fig. 1).</p> <h2>발효 한약의 제조</h2> <h3>발효 미생물의 종류 및 특성</h3> <p>검색된 문헌에서 고찰 연구를 제외한 338 편 중, 시판되는 발효 약물을 사용한 연구, 발효 방법이나 발효 균주에 대하여 기재되지 않은 경우를 제외하고 발효 균주에 대한 서술이 표현되어 있는 연구는 270 편이었다(Table 2). 그 중 한약재의 발효에 2 가지 이상의 균주를 사용한 연구가 38 편이었으며, 그 외의 연구에서는 하나의 균주를 이용하여 한약재를 발효하였다.</p> <p>가장 높은 빈도로 사용된 균주는 영지버섯(靈芝, Ganoderma lucidum)으로서 45 편의 연구에서 사용되었다. 누룩에서 분리되는 Aspergillus sp., Monascus sp., Rhizopus sp., Trichoderma\( \mathrm{sp} \). 등의 곰팡이가 20 여 종이 사용되었으며, Bacillus \( \mathrm{sp} \).,Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Leuconostoc sp., Acetobacter sp., Clostridium sp., Gluconobacter sp., Lactococcussp., Pediococus sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,Weissella sp. 등의 유산균이 80 여 종 사용되었다. 일반적으로 알코올 발효에 사용되는 Saccharomyces cerevisiae를 포함한 30여 종의 Saccharomyces sp.도 한약재의 발효에 이용되었다.</p> <p>한편 207 편의 연구에서 버섯이 사용되어 가장 많은 발효빈도를 보였으며, 그 중 동충하초류에서근 54 편, 영지 버섯류에서는 62 편, 상황버섯류에서는 7 편의 발효 연구가 보고되었다. 그 외에도 신령버섯, 팽이버섯, 잎새버섯, 표고버섯, 목이 버섯, 운지버섯, 차가버섯, 느타리버섯, 송이버섯을 이용한 한약재의 발효 연구도 다수 있었다.</p> <h3>한약재의 발효</h3> <p>한약재의 발효에 있어서 구체적으로 정형화된 방법은 아직 정립되어 있지 않으나, 한약재별로는 단미 한약재, 복합 한약재, 또는 전탕된 한약재를 사용하였고, 세균, 곰팡이, 버섯류를 사용하여 호기성 혹은 혐기성의 조건에서 액체 혹은 고체의 형태로 발효하는 등 다양한 방법이 제시되었다(Table 3).</p> <h3>단미 한약재를 이용한 발효</h3> <p>동백의 잎과 꽃을 그늘에 15 시간 방치한 후, 30 분 정도 비빈 다음 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 85 \% \) 의 수분 조건에서 4 시간 정도 발효 과정을 거친 후, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분 동안 건조하여 제품을 만들었다[15]. 오가피를 발효하는 방법으로는 오가피 추출물 11 에 포도당 \( 10 \mathrm{~g} \) 을 가해 멸균하고 유산균액 \( 10 \mathrm{ml} \) 를 가하여 \( 30 \sim 32^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지하면서 30 일간 배양하였다. 이를 다시 멸균한 다음, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)이하에서 진공 건조하여 오가피 발효물로 제작하였다[6].</p> <p>배는 육질 부분을 제거하고 과피와 씨방만을 이용하여 알코올 발효하였다. 이러한 과정은 배의 과피와 씨방을 세척한 후 이를 파쇄, 압착하여 배즙을 형성하는 착즙 단계와 배즙에 설탕을 첨가하여 \( 25^{\circ} \) Brix로 당도를 높이는 보당 단계를 거쳐,효모를 \( 0.5 \sim 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가하고 \( 23 \sim 25^{\circ} \mathrm{C} \) 의 혐기적인 조건에서 \( 4 \sim 5 \) 일간 배양하는 알코올 발효 단계를 거친다. 알코올 발효가 완료된 배즙을 \( 1.5 \) 기압, \( 90 \sim 95^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건에서 알코올을 제거하고, \( 20 \mu \mathrm{m}, 5 \mu \mathrm{m}, 2 \mu \mathrm{m}, 0.45 \mu \mathrm{m} \) 기공의 여과기로 순차적으로 여과한 후, 저온 살균을 통해 발효물을 제조하였다[14]. 상황버섯의 균사체를 이용하여 알코올의 수득율을 높이기 위해 쌀을 기본으로 한 발효 배지를 사용하였다. 우선A. oryzae를 멸균된 \( 1.2 \mathrm{~kg} \) 의 쌀에 접종하여 충분히 균사체를 형성시킨 후, \( 3 \mathrm{~kg} \) 의 멸균된 쌀과 \( 90 \mathrm{~g} \) 의 P. linteus 균사체를 혼합하고 멸균된 물을 부어 총 51 가 되게 하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 11 일간 발효시켰다[10].</p> <p>석창포의 발효 시에는 누룩 활성화액에 포함된 미생물을 과일과 곡류의 혼합물, 당류 및 물로 이루어진 혼합 배지에서1 차, 2 차 및 3 차 발효시켜서 최적의 활성도를 갖는 미생물을 사용하였다. 혼합 표준용액에 누룩 활성화액 또는 증류수를각각 \( 80 \%, 60 \%, 50 \% \) 의 비율로 첨가하여 발효에 사용하였다 [28]. 송이버섯과 동충하초로 발효한 경우를 보면, 한약 재료를 정선하여 혼합한 후 \( 1.2 \) 배의 증류수를 넣고 멸균, 냉각시킨 후 송이버섯 균사체와 동충하초 균사체 현탁액을 각각 \( 5 \% \) \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 씩 접종하여 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 일간 통기성으로 암 배양하였다. 배양액을 재차 멸간하고 유산균과 효모를 각각 \( 0.5 \% \) 씩 접종하여 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 36 48 시간 발효(최종 \( \mathrm{pH} 4.0 \) )하여 추출에 사용하였다[17].</p>	생명
혼합폐기물 및 폴리우레탄 담체를 충전한 연속회분식공정을 이용한 생물학적 수소생산	<p>Fig. 3에는 실험에 사용한 폴리우레탄 담체의 운전 전, 후의 모습들을 나타내었다. Fig. 3(A)는 새 담체, (B)는 운전 중 담체, (C)는 운전 종료 후, 담체 표면 외부(200배 확대), (D)는 담체 내부의 모습( 200 배 확대)이다. 운전 중의 담체 표면에서 부착미생물과 공극에서 발생하는 기포, 즉, 바이오가스의 모습을 관찰할 수 있었다. 또한, 담체 외부에서 상대적으로 두껍게 부착된 고형물층을 관찰하였다.</p> <p>Table 1에는 M-HSBR 반응조 내에서 바이오매스 위치별 수소발생특성을 나타내었다. 바이오매스 분포 위치는 담체표면, 내부 및 반응조 내 부유하는 지점으로 크게 3군데이다. 실험 종료 후, 담체를 회수하여 담체 표면 부착 및 내부 바이오매스를 확보하였고, 부유바이오매스는 반응조 내 정치 된 슬러지 층에서 수확하였다. 회분식 실험을 통해 비수소생 산속도 및 수소생산수율을 측정하여 비교하였다. 실험결과, 부유바이오매스에 의한 비수소생산속도가 \( 241 \pm 4 \mathrm{ml}-\mathrm{H}_{2} / \mathrm{g} \) VSS/d로서 가장 높게 나타났고, 이어서 담체 표면 부착바이오매스(133 \( \pm 10 \mathrm{ml}-\mathrm{H}_{2} / \mathrm{g} \) VSS \( \left./ \mathrm{d}\right) \), 담체 내부 부착바이오매스 \( \left(95 \pm 14 \mathrm{ml}-\mathrm{H}_{2} / \mathrm{g} \mathrm{VSS} / \mathrm{d}\right) \) 순서로 나타났다. 수소생산수율 역시, 동일한 순서로 나타났다. 담체 부착바이오매스에는 슬러지 체류시간이 상대적으로 길어서 수소생성미생물 외에 종속영양미생물이 다량 존재할 것으로 예상된다. 담체 부착미생물 중, 수소생성미생물의 빠른 성장 및 생물막 탈리 현상 으로 인해 부유성 바이오매스에서 수소생성활성이 높았던 것으로 사료된다. 하지만, 구체적인 원인 분석은 미생물 군집 분석을 통해 가능하다고 판단된다.</p> <p>회분식 실험을 통해 산출한 담체 부착바이오매스량을 M-HSBR 반응조 전체에 적용하여, 반응 종료 시점을 기준으로 반응조 내 위치별 바이오매스량 및 구성비율을 나타내었다 (Table 1). 반응조 내 부유바이오매스량은 \( 6.15 \pm 0.21 \mathrm{~g} \mathrm{VSS} \)로 가장 높았고, 담체 표면 부착바이오매스량과 내부 부착바이오매스량은 각각 \( 3.50 \pm 0.3 \) 및 \( 2.33 \pm 0.5 \mathrm{~g} \mathrm{VSS} \) 로 상대적으로 낮았다. 반응조 내 총 바이오매스량 중에서 부유바이오매스량이 차지하는 비율은 \( 51.4 \% \) 이었다. 수소발생특성을 동시에 비교해보면, 미생물 군집 위치별 반응조 활성과 바이오매스량 구성비율이 서로 비례하는 것을 알 수 있다.</p> <p>\( \mathrm{M}-\mathrm{HSBR} \) 의 유기물 \( (\mathrm{COD}) \) 질량수지에서, 유입 \( \mathrm{COD} \) 부하량은 유입유량 및 유입기질 농도를 이용하여 산출하였다(70.3 g COD/d). 유출수의 \( \mathrm{COD} \) 량은 반응조에서 고액분리</p> <p>되어 배출되는 상등액의 유량 및 \( \mathrm{COD} \) 농도를 측정하여 계산하였다 \( (65.1 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d}) \). 한편, 식 (1)에 근거하여 글루코스 \( 192 \mathrm{~g} \mathrm{COD} \) 가 \( 2 \mathrm{~mol} \)의 아세트산(128 g COD)으로 분해될 때 제거되는 유기물 단위 질량당 수소발생량은 \( 0.7 \mathrm{~L} \)이다. 반면에 암모늄이온을 질소원으로 사용하여 세포합성을 포함할 경우, 식 (2)를 이용할 수 있다. 세포 호흡에 소비된 유기물량은 유기물 단위 질량당 수소발생량 계수 \( \left(0.58 \mathrm{~L}^{2} \mathrm{H}_{2} / \mathrm{g} \mathrm{COD} /\right. \)d)를 실제 수소발생량 \( (0.59 \mathrm{~L} / \mathrm{d}) \)으로 나누어 구할 수 있다 \( (1.03 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d}) \). 따라서, 반응조 내에서 세포합성 및 담체 부착에 의해 축적되는 양은 유입 유기물량 \( (70.3 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d}) \)에서 부산물에 의한 유출수 내 유기물량 \( (65.1 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d}) \)과 세포 호흡에 의한 유기물량 \( (1.03 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d}) \)을 차감한 \( 4.16 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d} \)이다. 여기에서, 세포성장에 의한 셀 합성에 소비된 \( \mathrm{COD} \) 량은 반응조 축적량 \( 4.16 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d} \)에서 담체에 흡착된 유기물량 \( (1.28 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d} \), 회분식 실험 결과 \( ) \)을 뺀 값인 \( 2.88 \mathrm{~g} \) \( \mathrm{COD} / \mathrm{d} \)이다. 이는 식 (2)를 근거로 한 이론적 세포합성량 ( \( 2.77 \mathrm{~g} \mathrm{COD} / \mathrm{d}) \) 대비 \( 3.9 \% \) 정도의 오차를 나타낸다.</p> <p>\( \mathrm{C}_{6} \mathrm{H}_{12} \mathrm{O}_{6}+6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \rightarrow 2 \mathrm{CH}_{3} \mathrm{COO}^{-}+2 \mathrm{H}^{+}+2 \mathrm{CO}_{2}+4 \mathrm{H}_{2} \)<caption>(1)</caption></p> <p>\( \mathrm{C}_{6} \mathrm{H}_{12} \mathrm{O}_{6}+048 \mathrm{NH}_{4}^{+}+2.26 \mathrm{HCO}_{3}^{-} \) \( \quad 1.79 \mathrm{CH}_{3} \mathrm{COO}^{-}+2.26 \mathrm{CO}_{2}+0.48 \mathrm{C}_{5} \mathrm{H}_{7} \mathrm{O}_{2} \mathrm{~N}+3.69 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)<caption>(2)</caption></p> <p>결론적으로, 수소를 생산하는 HSBR 운전에서, 담체를 주입함으로써, 바이오매스 유실을 방지할 수 있었다. 또한, 반응조 내 부착바이오매스량과 부유바이오매스량은 거의 비슷한 구성비율을 보인 반면, 부유바이오매스의 수소생성활성이 훨씬 높았다. 이는 수소생성미생물의 빠른 성장 및 생물막 탈리에 의해 반응조 내 부유바이오매스의 활성이 높게 나타난 것으로 사료된다.</p> <h1>혼합폐기물 및 폴리우레탄 담체를 충전한 연속회분식공정을 이용한 생물학적 수소생산</h1> <p>유기성폐기물은 생물학적 발효를 통해 수소와 메탄 등의 바이오가스를 생산할 수 있는 중요한 자원이다. 특히, 수소는 단위 질량당 에너지 함량이 높고, 연소 후 이산화탄소 등의 온실가스를 배출하지 않으므로 청정에너지 또는 화석연료를 대체하는 신에너지원으로 각광받고 있다.</p> <p>발효에 의한 생물학적 수소생산은 주로 환원당을 함유하는 탄수화물계 폐기물을 이용하는 것이 유리하지만, 지속적인 수소생산을 달성하기 위해서는 원료가 되는 폐기물이 질소, 인 등의 영양염류를 충분히 포함해야 한다. 수소생성미생물이 시스템 내에서 지속적으로 성장하기 위해서는 필수 영양성분의 꾸준한 공급이 필요하기 때문이다. 따라서, 다양한 폐기물의 발생 및 처리에 대한 필요성과 더불어 지속적인 수소생산을 달성하기 위해 혼합폐기물을 대상으로 수소를 생산하는 연구가 활발히 진행되고 있다.</p> <p>수소생산효율을 높이기 위해 시스템의 수리학적체류시간 (Hydraulic retention time, HRT)을 낮춤으로써, 유입기질부 하량을 증대시키는 연구가 많이 진행되었다. 하지만, 미생물 유실로 인해 오히려 효율이 떨어지는 사례가 종종 발생하였다. 이 문제를 해결하기 위해 담체 및 자가고정기술 등을 이용하여 수소생성관련 미생물을 시스템 내에 안정적으로 확보하는 방안이 강구되었다 \( [5,9] \). 완전혼합반응조(Completed stirred tank reactor, CSTR) 후단에 침전조를 별도로 설치하는 경우, 현장 적용 시, 넓은 부지를 요구할 뿐 아니라, 슬러지 반송 및 유지관리에 대한 애로사항을 유발할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 소규모 수처리 시스템에서 별도의 침전조를 두지 않고, 유입부하변동에 상대적으로 대응이 유리한 연속회분식공정(Sequencing batch reactor, SBR)을 수소생산시스템(Hydrogen SBR, HSBR)에 적용하기도 하였다. SBR은 하나의 반응조에서 기질 유입, 반응, 침전 및 배출 등의 순서를 반복적으로 실시한다. 하지만, 수소생성과정에서 발생가스로 말미암아 침전효율이 저하되고, 완 벽한 고액분리를 위해 반응시간 대비, 침전시간을 상당히 길게 운전하는 경향이 있다. 따라서, 본 연구에서는 담체를 HSBR 반응조에 넣어 미생물을 고정하여 시스템 내 수소생성미생물의 유실을 방지하고, 고액분리에 의한 침전율을 높이는 연구를 실시하였다(Media-HSBR (M-HSBR)). 한편, 수소생성미생물은 상대적으로 높은 성장속도를 유지하기 때문에 반응조 내에서 고정화된 미생물 외에 벌크용액 내에서 부유하고 있는 미생물의 특성을 동시에 조사하는 것이 중요하다. 따라서, 부착미생물에 대한 수소생산특성만 다룬 기존 연구와 달리, 본 연구에서는 시스템 내에서 부착미생물 외에 부유미생물에 대한 수소발생에 대한 기여율 조사를 처음으로 시도하였다.</p> <p>국내 식품가공회사(C사) 및 \( \mathrm{J} \) 하수처리장에서 당밀폐수 및 하수슬러지를 각각 제공받아 유입기질로 사용하였다. 당밀폐수 원수의 TCOD, SCOD, TS, VS, T-N 농도는 각각 128,400 mg/l, 119,200 mg/l, 89,700 mg/l, 86,200 mg/l 및 \( 30 \mathrm{mg} / \)이고, 하수슬러지 원수의 TCOD, SCOD, TS, VS, T-N 농도는 각각 \( 17,800 \mathrm{mg} / \mathrm{l}, 120 \mathrm{mg} /, 44,000 \mathrm{mg} / \mathrm{l}, 32,200 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 및 \( 1,800 \mathrm{mg} / \)이었다. 유입폐기물은 선행연구를 통해 얻은 최적 희석비(13.3배) 및 혼합비율(당밀 : 하수슬러지 \( =8: 1 \), \( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 적용하여 사용하였다. 구체적으로 당밀 \( 2 \mathrm{~L} \), 하수슬러지 \( 0.25 \mathrm{~L} \)를 \( 20 \mathrm{~L} \) 용기에 넣고, 20 분간 질소로 퍼징한 수돗물로 나머지 공간을 채웠다. 식종슬러지는 본 실험실에서 이미 가동 중인 수소생성반응조(CSTR) 내 바이오매스 \( (0.2 \mathrm{~L}) \)와 열처리한 하수처리장 소화조 슬러지 \( 0.2 \mathrm{~L} \)를 혼합하여 이용하였다.</p> <p>수소함량은 capillary 컬럼 \( (30 \mathrm{~m} \times 0.32 \) ID \( \mathrm{mm} \times 0.45 \) \( \mathrm{OD} \mathrm{mm} \), Agilent, CP-Molsieve 5A)이 장착된 가스크로마토 그래피(Agilent Technologies, USA)를 이용하여 측정하였다. 이때, 오븐, 주입구 및 검출기 온도는 각각 50,80 및 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \)이었고, 분당 \( 3 \mathrm{ml} \)의 헬륨을 유동상으로 사용하였다. 연속 및 회분식 실험에서 시료에 대한 \( \mathrm{COD} \) 농도는 \( \mathrm{COD} \) kits (HACH Co., USA)와 분광광도계(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)를 이용하여 측정하였고, VSS 및 VS는 Standard methods를 따라 분석하였다.</p> <p>Fig. 1에 운전시간대별 유입기질과 유출수의 \( \mathrm{pH}, \mathrm{HRT} \), 가스함량 및 가스발생량을 나타내었다. 초기 운전단계에서 유입수 \( \mathrm{pH} \)가 8 정도인 반면, 유출수(반응조 내) \( \mathrm{pH} \) 가 6 이하로 다소 낮았다. HRT를 12시간 및 6시간으로 낮추었을 때, \( \mathrm{pH} \) 가 상승하였는데 이는 수소 및 유기산 생성반응이 약화되면서 동시에 유입기질의 높은 \( \mathrm{pH} \)가 반응조 상태에 영향을 준 것으로 사료된다. 수소생성효율을 증대시키기 위해 HRT를 다시 증가시켰으나, 바이오가스 내 수소함량은 \( 20 \% \) 이하 로 낮게 측정되었고, 운전 말기에는 수소가 거의 검출되지 않았다. 반응조 정치 후, 내부를 관찰한 결과, 바이오매스 대부분이 유실되었다. 침전된 슬러지층에서 꾸준히 가스가 발생하였고, 이 가스로 인해 반응조 침전성분이 부상하였다. 반응조 재운전을 위해 우선, 외부로 유출된 바이오매스를 회수</p> <p>하여, 초기 식종바이오매스와 함께 혼합하여 반응조에 공급하였다. 담체를 이용한 부착미생물막을 적용하기 위해 반응조 내 10개의 폴리우레탄 담체를 주입하였다. 초기 \( \mathrm{HRT} \)를 24시간으로 조정하여 운전한 후, 12시간으로 단축시켰다. 유출수 \( \mathrm{pH} \)는 4.5-5.0 정도로 유지되었고, 수소함량 및 수소발생속도는 각각 \( 20 \%, 0.4 \mathrm{~L}-\mathrm{H}_{2} / \mathrm{l} / \mathrm{d} \)로 안정적이었다. 본 연구에서 수소발생속도가 다른 연구자들에 의한 연구결과보다 다소 낮게 나타났는데 이는 수소발생속도는 대상 폐기물의 종류에 따라 서로 다른 값을 나타내기 때문이다. 당밀폐수만 사용한 경우는 0.8-3.6 L- \( \mathrm{H}_{2} / \mathrm{l} / \mathrm{d} \), 음식물쓰레기와 하수슬러지를 병합 처리한 경우는 \( 0.48-2.03 \mathrm{~L}-\mathrm{H}_{2} / \mathrm{l} / \mathrm{d} \)으로 보고되었다 \( [8,14] \). 각 폐기물 내에 존재하는 미생물의 종류뿐만 아니라, 공정에서 적응하는 미생물 군집구조가 다를 것으로 판단된다.</p> <p>Fig. 2에는 HSBR과 M-HSBR 운전 기간 중, 동일한 HRT 조건(12시간)에서 침전시간대별 반응조 내 슬러지층의 높이변화를 나타내었다. 담체를 주입하고 운전하였을 때 침전 시간 1분이 경과하자 슬러지층의 높이가 급격히 감소하여 \( 3 \mathrm{~cm} \) 가 되었다. 반면, 담체를 주입하지 않은 경우, 슬러지층의 높이는 완만하게 감소하였고, 3 분 이후에는 감소폭이 크게 떨어져 거의 일정하게 유지되었다. 침전기간 중, 발생가스에의 해재부유하는 바이오매스가 반응조 중간에 위치한 담체층에 흡착된 것으로 판단된다. 따라서, 담체를 주입한 상황에서 상대적으로 슬러지 침전성이 양호하게 나타날 수 있었다. Jo 등(2008)은 폴리우레탄 담체를 실린더형태의 상향류식 고정상 반응조에 투입하여 글루코스로부터 수소를 생산하는 연구를 하였다. HRT를 24시간에서 1시간으로 단축시키면서 수소를 발생시켰으며, \( \mathrm{HRT} \) 를 1 시간으로 단축시켰음에도 불구하고 반응조 외부로 미생물이 유실되지 않았다. Wu등(2008)은 HRT 4시간에서 CSTR을 운전했을 때, 미생물이 유실함으로써, 반응조 내 바이오매스량이 \( 1.63 \mathrm{~g} \) VSS/l으로 아주 낮았다. 반면, 분말활성탄을 이용하여 미생물을 고정했을 때는 바이오매스량이 \( 10.3 \mathrm{~g} \mathrm{VSS} / 1 \) 로 상대적으로 높았고, 그에 따라 수소발생속도도 증가하였다. 비록 본 연구에서 적용된 반응조의 형태가 달랐지만 미생물을 담체에 고정화시킴으로써, 짧은 HRT에서도 안정적인 수소생산을 달성 할 수 있었다.</p> <p>반응조 내경 \( 0.08 \mathrm{~m} \), 높이 \( 0.3 \mathrm{~m} \)이며, 유효용적 \( 1 \mathrm{~L} \)인 원통형의 아크릴 반응조를 제작하였다. 반응조에 식종슬러지 \( 0.4 \mathrm{~L} \)를 접종하고 나머지 공간에는 유입기질인 혼합폐기물 (당밀/열처리 하수슬러지)을 채웠다. 담체를 주입한 실험 기간 동안에는 Seilsponge 회사에서 제공하는 직경 \( 0.02 \mathrm{~m} \) 정방형의 폴리우레탄 담체 10개를 별도로 주입하였다. 담체의 함수율, \( \mathrm{pH} \), 부피밀도, 공극율 및 표면적은 각각 \( 5,700 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \), \( 7.0,0.015 \mathrm{~g} / \mathrm{cm}^{3}, 98.9 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 및 \( 76.8 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g} \)이었다. 담체가 위로 부상하지 않도록 반응조 중간 지점에 아크릴로 제작한 거름망 구조물을 장착하였다. 기질의 \( \mathrm{pH} \)는 \( 2 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 용액과 \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 \( \mathrm{NaHCO}_{3} \)를 이용하여 7-8로 조절하였다. 반응조의 온도는 인큐베이터를 이용하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지하였다. HRT는 48시간에서 약 3일의 적응기간을 두었고, 점차 12시간 및 8시간으로 단축시켰다. HSBR 및 M-HSBR의 운전방법은 HRT 12시간 기준으로, 유입(5분), 반응(200분), 침전(30분) 및 배출(5분) 순서로 총 240분/1회이며, 운전주기는 하루에 6회이었다.</p> <p>M-HSBR의 운전 종료 후, 담체 외부, 내부 부착바이오매스 및 반응조 내 부유바이오매스 수소생산특성을 관찰하기 위해, 반응조 내 담체를 취하여 동일한 유입기질 \( 50 \mathrm{ml} \)가 담긴 실린지를 이용하여 표면에 부착된 바이오매스를 수 회 탈리시켰다(담체 외부 부착바이오매스). 표면의 부착 바이오매스가 탈리된 담체를 4등분하여 \( 50 \mathrm{ml} \) 유입기질을 포함하고있는 플라스틱 튜브에 넣고 10분간 진동시켜 내부에 부착된 바이오매스를 탈리시켰다(담체 내부 부착바이오매스). 상기부착바이오매스가 포함된 유입기질을 \( 100 \mathrm{ml} \) 시험병에 넣고 하룻동안 회분식 수소발생을 관찰하였다. M-HSBR 반응조 내 부유액 \( 10 \mathrm{ml} \)를 유입기질 \( 50 \mathrm{ml} \)가 담긴 동일한 시험관에 넣고 반응을 관찰하였다(부유바이오매스). 시험관의 상부를 질소로 5분간 퍼징한 후, 고무마개로 막고 \( 30 \mathrm{ml} \) 가스실린지 4개를 마개에 장착하여 발생하는 가스량을 측정하였다. \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 인큐베이터에서 자력교반하였고, 재현성을 위해 2회 반복 실험하였다.</p> <p>담체가 기질 내 유기물을 흡착하는 현상을 조사하기 위해새 담체를 \( 50 \mathrm{ml} \)의 유입기질(혼합폐기물)이 담긴 \( 100 \mathrm{ml} \) 시험병에 넣고, 1일간 인큐베이터에서 교반시키면서 반응시켰다. 담체를 넣지 않은 실험을 대조군으로 실험하였고(2회 반복), 운전 종료 후, 각 유출수 내 유기물의 화학적산소요구량 (Chemical oxygen demand, COD)을 측정하여 비교하였다.</p>	생명
음용수로부터 동화성 유기물질의 제거를 위한 생물학적 공정개발	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>회분식 실험</h2> <p>UV 처리를 하지 않은 원시료의 미생물 접종 여부에 따른 생분해 정도를 비교 해보기 위하여 \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 농도로 농축된 NOM을 증류수로 희석하여 \( 8 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)의 농도로 만든 다음 부피가 \( 300 \mathrm{~mL} \)인 BOD병을 10개씩 2개조로 나누어 채운 다음 1개조는 위의 실험방법에서와 같이 멤브레인 여과지에 걸러진 미생물을 접종하고 나머지 조는 미생물을 접종하지 않았다. 이를 일정 온도로 유지된 배양기에 넣은 다음 25일 동안 일정 시간 간격으로 하나씩 끄집어내어 분석에 사용하였다.</p> <p>Fig. 2는 DO 결과를 나타낸 것이다. 그림에서 보면 미생물을 접종하지 않은 경우에도 DO가 소비됨으로써 약간의 분해가 일어났는데, 이는 원 NOM 용액 중에 미생물이 일부 함유되어 있거나 또는 조작 중에 외부의 미생물이 계내에 유입됨으로 인해 분해가 일어 나는 것으로 생각되었다. 그러나 이때의 분해능은 미생물을 접종한 경우에 비해 낮은데 이것은 미생물을 접종하지 않은 원 NOM 중에 함유된 미생물의 개체수가 미생물을 접종한 경우에 비해 작기때문으로 생각되었다.</p> <p>회분식 실험은 biofilter에서의 생분해 가능한 DOC의 제거 효율을 평가하는 자료를 얻기 위하여 행하여 졌다. NOM의 화학적 구성은 NOM의 생분해 정도와 속도에 영향을 미치는 주요한 인자 중의 하나이다. NOM의 화학적 구성에 대한 UV 처리의 영향은 UV 처리시간에 따른 \( \mathrm{UV}_{254} \)와 DOC 변화를 비교함으로써 얻을 수 있다. UV 처리를 하게 되면 복잡한 분자구조의 NOM이 단순한 구조의 물질로 분해됨으로서 활성탄에 의한 흡착능과 미생물에 의한 분해능이 향상될 것으로 기대되어 UV 처리시간에 따른 DOC 제거능을 살펴보았다. 일정농도의 원 시료를 각각 0, 18, 24, 30, 48 시간동안 UV 처리한 다음 각 시료들의 DOC 농도를 \( 13.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)로 일정하게 하고 미생물을 접종하여 회분식 실험을 행한 결과는 Table 2 및 Fig. 3과 같았다. 결과로부터 NOM 중의 일부 DOC는 UV 처리를 함에 의해 직접적으로 화학적 산화 반응을 일으켜 일부 유기 탄소가 제거됨을 알 수 있었다. 일반적으로 UV 처리 시간과 \( \mathrm{UV}_{254} \) 및 DOC의 변화량이 직선적인 상관관계를 나타낼 것으로 기대되었으나 본 실험의 경우 단순한 선형의 상관관계를 나타내지는 않았다. UV 광은 유기화합물 중에서 주로 불포화 탄소-탄소 결합에 의해 흡수되며, 미생물은 포화 유기화합물의 일부를 분해시킨다. Fig. 3에서 보여 지는 바와 같이 DOC 및 \( \mathrm{UV}_{254} \)의 제거율을 살펴보면 24 시간에서 가장 높은 제거율을 보였다. 이는 UV 처리 시간이 24시간까지는 분자량이 큰 화합물에서 보다 유기물의 생분해성을 증가시키는 분자량이 작은 화합물로의 전환이 이루어졌으나 그 이상의 처리 경우에 오히려 \( \mathrm{UV}_{254} \) 및 DOC의 제거율이 낮아지는 현상은 분자량이 작은 성분의 선택적인 생분해 가능성이 예상된다.</p> <h2>연속식 실험</h2> <p>체류시간에 따른 제거능을 살펴보기 위하여 Table 3과 같은 운전조건에서 연속식 실험을 행하였다. 최근 생물 여과 공정에 많은 관심이 주어지고 있으며 최근 연구는 운전인자 특히 공탑접촉시간(EBCT)와 같은 운전 인자들이 유기 탄소의 제거능에 미치는 영향에 대해 집중되고 있다. LeChevallier 등은 오존 처리 공정 후에 GAC - 모래 여과기에서 TOC 및 AOC의 제거를 EBCT의 함수로서 조사하여 TOC의 제거능이 향상됨을 보고하였다. Sonheimer와 Hubele은 생물활성 GAC 여과기에서 체류시간을 5분에서 20분으로 증가시킴에 따라 DOC의 제거율이 \( 27 \% \)에서 \( 41 \% \) 로 증가한다고 하였다. Fig. 4에서 보여지는 바와 같이 본 연구에서 EBCT를 10, 20, 40분으로 증가시킴에 따라 DOC 제거율은 \(30.4, 34.1, 46.1\%\)로 증가하는 결과를 보임으로써 유사한 결과를 나타내었다.</p> <p>\( \mathrm{UV}_{254} \)와 DOC를 측정한 자료를 바탕으로\( \mathrm{UV}_{254} / \mathrm{DOC} \) 비를 나타낼 수 있는데, 이것은 원수내 유기화합물의 포화정도를 나타내는 지표가 된다. 이 비가 높으면 유기 탄소량당 불포화된 탄소 결합이 많음을 의미하고 NOM이 보다 복잡하고 높은 방향성을 띠고 있음을 나타낸다. 반면에 이 비가 낮으면 NOM이 포화된 지방족 탄소로 이루어져 있음을 나타내고, 유기탄소의 생분해 가능한 화합물이 많음을 의미한다.</p> <p>Fig. 5는 시간에 따른 \( \mathrm{UV}_{254} / \mathrm{DOC} \) 비의 변화를 검토한 결과이다. 그림에서 보여지듯이 DOC가 생분해됨에 따라 \( \mathrm{UV}_{254} / \mathrm{DOC} \)의 비는 증가하는데, 이는 생물여과 반응기에서 나가는 유출수에 대한 \( \mathrm{UV}_{254} / \mathrm{DOC} \) 의 비가 반응기에 공급되는 원료중의 \( \mathrm{UV}_{254} / \mathrm{DOC} \) 비에 비해 증가하는 것은 생분해에 의해 제거된 DOC는 그다지 UV에 의해 흡수되는 물질이 아니라는 것을 의미한다. 또한 유출수의 \( \mathrm{UV}_{254} \) / \( \mathrm{DOC} \) 비가 증가한 것은 반응기를 통해 DOC가 감소하기 때문에 일어나는 것으로 Fig. 6에서 보여지는 바와 같이 원료와 유출수에 있어서의 UV 흡수도의 차이가 시간에 따라 그다지 크게 변하지 않기 때문이다. 이러한 결과는 시료중 에 함유되어 있는 NOM은 분자량이 큰 보다 복잡한 방향족 화합물이 아니라 acetate 또는 oxalate와 같은 저분자량의 지방족 화합물이 함유되어 있으며 이들이 생분해된다는 것을 의미한다.</p> <p>순환비에 따른 제거능을 살펴보기 위하여 Table 4와 같은 운전조건에서 연속식 실험을 행하였다. 3개의 반응기에 대해 EBCT, 원료의 농도, 원료의 공급유량 및 층깊이는 일정하게 하고 순환비를 달리한 실험을 행하였다. Fig. 7에서 보여 지는 것과 같이 순환비가 0, 3, 10 의 비로 증가할수록 DOC와 \( \mathrm{UV}_{254} \)의 제거율은 감소하는 것을 알 수 있다. 이는 순환비가 커질수록 유체의 전단응력이 커지게 되어 반응기 내 메디아에 부착된 미생물이 탈착되기 때문에 일어나는 결과로 보여겼다. 순환비가 달라짐에 따라 \( \mathrm{UV}_{254} \)는 감소하는 경향이 적으나 DOC의 경우에는 순환비 영향이 상당히 큰 것으로 생각되었다.</p> <p>초기 농도의 변화에 따른 제거능을 살펴보기 위하여 Table 5와 같은 운전조건에서 UV 처리를 하지 않은 원수의 농도를 \( 6 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)로 한 경우와 24 시간 UV 처리한 시료의 초기 농도를 6, 8, 10 \(\mathrm{mg} / \mathrm{L} \)로 변화시켜 연속식 실험을 행하였다. 실험결과는 Fig. 8에 나타내었다. 그림에서 보여지는 바와 같이 UV 처리를 하지 않은 경우는 UV 처리를 한 경우에 비해 제거율이 낮았으며, UV 처리한 시료의 경우는 초기 농도의 변화에 대해 제거율은 그다지 큰 차이를 보이지는 않지만 DOC의 제거는 약간 감소하는 경향을 보였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>상수원수중 존재하는 천연 유기물질(NOM: Natural Or-ganic Matter)은 유기물질의 총체로서 일반적으로 토양내의 유기물로부터 유출되거나, 인간의 활동으로 인한 오염을 통해 수계에 존재하게 된다. 용존성 유기탄소(DOC: Dis-solved Organic Carbon)는 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 보다 작은 유기탄소화합물을 말하며, DOC의 주성분은 humic 물질이라고 하는 고분자 물질로서, NOM의 대부분을 차지한다. 생물체군의 퇴화 및 분해에 그 생성 근원을 가지는 humic 물질은 DOC의 약 \( 50 \% \) 이상을 차지하고, 상수원수내 맛과 냄새로 인한 심미적 영향, 미생물 재성장으로 인한 공중 위생에 미치는 잠재적 유해성, 물의 염소처리 과정에서 THM(trihalomethane)과 같은 소독부산물의 전구물질 형성 등의 문제점을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 humic 물질은 급수과정에서 관로의 미생물 성장에 있어서 영양염으로 작용되어 관망을 부식시키는 원인물질이 되기도 하며, 수도수의 불쾌한 맛과 냄새를 유발하는 등 많은 악영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.</p> <p>Humic 물질의 제거에 대해서는 오래 전부터 수처리의 주요 관심 대상이 되어 왔으며, 이 humic 물질은 수처리 시 특히 지표수 처리에서 방해작용을 많이 하기 때문에 정수처리 공정에서 수중의 humic 물질과 산화과정의 상호관계를 고려해서 가장 광범위하게 연구되고 또한 실제 적용되고 있는 공정은 염소처리와 오존처리이다.</p> <p>현재 국내에서 사용되고 있는 정수처리방법에는 염소처리와 물리적 화학적 처리, 여과사를 통한 응집과 침전 및 여과를 주요공정으로 하고 있다. 이러한 공정에서는 입자상 물질의 제거가 주로 일어나므로 용존성 물질의 경우에는 거의 제거가 일어나지 않는다.</p> <p>합성 유기화학물질이나 trihalomethanes의 전구물질 즉, NOM을 제거하는데 있어서 GAC (granular activated carbon) 공정이 많이 활용되고 있다. 또한 NOM은 목적하는 미소 오염물질(micropollutants)를 제거하는데 있어서 활성탄을 사용할 때 활성탄의 흡착능을 저하시킬 뿐만 아니라 미생물의 성장을 촉진시키는 원인이 되기도 한다. 비록 흡착법이 광범위한 유기화합물들을 제거하는데 있어 효과적인 공정으로 널리 인식되고는 있으나 GAC에 흡착된 유기화합물들이 미생물의 성장에 유용한 환경을 만들기 때문에 흡착 표면에서의 생분해(biodegradation)도 간과할 수 없다.</p> <p>음용수 처리에 생물학적 공정을 활용하는데 있어서 가장 경제적인 방법은 생물학 처리 공정만을 사용하여 처리하기보다는 기존의 물리학적 단위 공정에 생물학적 처리를 더하는 병합공정이라 생각된다. Bouwer와 Crowe는 부착 성장 미생물공정을 사용하여 TOC(total organic carbon)의 \(5\sim 75\%\) 제거할 수 있음을 보임으로써 TOC 제거에 생물학적 활성을 사용하는 것이 매우 경제적이라는 것을 증명해 주었다. 그러나 생물학적 활성을 지닌 GAC 공정에서 흡착과 생분해간의 상호 작용은 아직 완전히 규명되지 않고 있다. 생물막에 의한 생분해에서 NOM의 역할은 매우 중요한데, NOM은 박테리아의 대사의 기질원으로써 사용될 수 있기 때문에 생물막의 성장을 촉진시켜 주며, 이 생물막에 의해 NOM의 농도를 더 낮출 수 있게 된다.</p> <p>LeChevallier 등은 오존 처리 공정 후에 GAC와 모래를 충전한 여과기에서 TOC 및 AOC의 제거를 EBCT의 함수로서 조사하여 TOC의 제거능이 향상됨을 보고하였으며, 최근 생물 여과 공정에 많은 관심이 주어지고 있으며 최근 연구는 운전 인자 특히 공탑접촉시간(EBCT)과 같은 운전인자들이 유기 탄소의 제거능에 미치는 영향에 대해 집중되고 있다. 그러나 오존으로 전처리를 하는 경우에는 생물학적 분해가 어려운 유기물을 분해가 가능한 유기물로 전환시키며, 비루스 등의 세균의 효소를 산화시키는 살균 효과도 동반한다. 오존으로 전처리를 하는 경우에 대다수 유기물이나 비루스 등에 대한 산화반응은 우수하지만 오존이 잔류하지 않음으로써 미생물이 배수시스템에서 일정조건하에서 증식하여 여러 가지 형태의 문제를 유발시킬 뿐만 아니라, 유지비가 많이 든다는 단점을 가지고 있어 오존만에 의한 최종처리는 부적합한 것으로 알려져 있다. 그러나 UV 처리법은 염소에 비하여 지속성이 떨어지긴 하지만 미생물의 살균 및 수중에 잔류하지 않는 잇점을 가지고 있다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 음용수 처리에 있어서 유기탄소의 제거수단으로써 생물여과(biofiltration) 방법을 검토하고자 하는 것으로, UV 처리를 한 NOM과 UV처리를 하지 않은 NOM을 GAC층을 통과시킬 경우에 있어서 생분해 특성을 검토하였다. 원료 NOM의 생분해 정도와 활성탄을 생물막의 매체로 사용한 연속식 운전에서의 운전 인자 특히, 공탑접촉시간(EBCT), 순환비 등과 같은 운전 인자들이 유기 탄소의 제거능에 미치는 영향에 대해 검토하고, UV 처리가 DOC 생분해에 미치는 영향을 검토하였다.</p> <h1>실험장치 및 방법</h1> <p>본 실험에 사용된 NOM 시료는 강에서 채취한 원시료를 음이온 교환 수지를 이용하여 \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)의 농도로 농축한 것으로 호주의 Adelaide에 위치한 Water Quality Centre(AWQC)에서 제공한 것을 사용하였다. 미생물은 호주 빅토리아주 Geelong에 위치한 Moorabool reservoir에서 채취한 원수를 멤브레인 여과장치(Millipore Corporation, Bedford, Massachusette, Cat. No. HAWG047S1)로 여과하여 멤브레인 필터에 걸러진 것을 사용하였다. 실험에 사용된 GAC(grannular activated carbon)는 호주의 빅토리아주에서 생산되는 석탄을 원료로 하여 제조된 것으로 입경이 약 \( 1 \mathrm{~mm} \)의 것을 선별하여 사용하였다. DO, \(\mathrm{UV}_{254} \) 및 DOC는 각각 DO meter(ATi orion Model 830)와 UV/Vis spectrometer(Unicam model UV2), TOC Instrument (Total carbon 01 Analytical has an Automatic sample injector)를 측정하였다. DOC 분석은 멤브레인 여과장치(Millipore Cor-poration, Bedford, Massachusette, Cat. No. HAWG047S1)를 사용하여 전처리 한 다음 행하였으며, 오염을 방지하기 위하여 여과장치는 사용할 때마다 항상 증류수로 세척하여 사용하였다.</p> <p>본 연구는 회분식과 연속식으로 나누어 수행하였다. 호기조건하에서 회분식 실험을 수행함으로써 NOM의 생분해 정도를 알아보고자 하였다. UV 처리는 Fig. 1 에서 보여지는 바와 같이 먼저 저장조에 \( 15 \mathrm{~L} \)의 원수를 채운다음 펌프로 \( 60 \mathrm{~W} \) 용량의 UV 램프가 설치된 장치(폭 \( 5 \mathrm{~cm} \), 너비 \( 6 \mathrm{~cm} \), 높이 \( 60 \mathrm{~cm} \) )내로 연속적으로 공급하고 처리된 물은 다시 저장조로 순환되게 함으로써 0, 18, 24, 30 및 48 시간 동안 연속 처리한 것을 시료로 사용하였다. Table 1과 같은 조성의 nutrients를 사용하여 유기탄소가 생분해 반응에서 제한 반응이 되도록 하였다. DO의 농도는 충분히 포화시킴으로써 배양기에서 incubation 시키는 동안 호기 조건이 유지되게끔 하였다.</p> <p>연속식 실험은 운전 파라미터인 원료 농도, 공탑접촉시간(Empty Bed Contact Time : EBCT) 및 순환비를 변화 시켜 행함으로써 UV 처리한 NOM이 생물막 성장을 향상시키는 지와 그리고 이 NOM에 의해 성장된 생물막이 흡착및 생분해에 의한 제거능에 미치는 영향에 대해 살펴보았다. Fig. 1에 보여지는 바와 같이 직경 \( 2.5 \mathrm{~cm} \) 높이 \( 20 \mathrm{~cm} \)인 pyrex 유리관을 사용하여 직경이 약 \( 1 \mathrm{~mm} \)인 GAC를 \( 100 \mathrm{~cm}^{3} \) 채워 상향 흐름으로 운전하였으며, nutrients는 회분식과 동일하게 주입하였다. 원료의 농도는 6, 8, 10 \(\mathrm{mg} / \mathrm{L} \), 체류시간(EBCT)은 10, 20, 30\(\mathrm{min} \) 으로, 그리고 순환비를 0, 3, 10으로 변화시킴에 따른 유출수의 농도 변화를 살펴보았다.</p>	생명
과수 형질전환 국내 연구 동향 및 전망	<h1>결 론</h1> <p>국내 과수 형질전환 기술 및 형질전환체 개발에 관한 연구 사례 및 동향에 대해 살펴보았다. 대부분 아그로박테리움을 이용하여 연구되어 왔으며 아직도 형질전환 기술 개발 단계에 머물러 있는 것으로 나타났다. 사과에서 가장 활발하게 형질전환 연구가 진행되어 주요 재배품종에 대한 형질전환 기술이 실용화 수준으로 확립되어 있다. 최근에는 일부 형질전환체에 대해서는 기내 발현 분석에서 벗어나 온실 등의 포장에서의 발현분석으로 전환되는 단계에 이르렀다. 그러나 감귤 및 참다래에서는 형질전환 효율 증진의 기술개발 단계에 와 있고, 포도 등의 타 과수에서는 형질전환 기술개발의 초기 단계에 머물러 있다. 또한 실용화 조기 구현을 위한 항생제 대체 선발기술 개발, 대목에 대한 연구개발, 식물체 부위와 생육시기에 따른 발현조절 등의 과제를 안고 있다.</p> <p>과수는 유년성, 자가불화합성, 자식열세, 다배성, 무핵, 배수성 등 다양한 요인이 교배육종의 효율성을 저하시키고 있다. 국내 과수산업의 경쟁력은 소비자와 생산자가 모두 만족하는 품종의 조기 공급에 있을 것이다. 더욱이 과수에서 있어서의 과실은 다양한 형태와 특성이 존재한 저장기관이므로 형질전환에 의한 고부가가치 기능성 성분 및 의약품 생산소재로의 높은 잠재력을 가지고 있다. 그러므로 과수의 형질전환 연구 및 기술개발의 투자 가치는 충분하다고 판단된다.</p> <p>그럼에도 불구하고 과수에서는 국내 형질전환 기술 수준은 선진국과 비교할 때 상당히 뒤쳐져 있다고 할 수 있다. 이는 연구결과가 초본성에 비해 상대적으로 매우 늦게 나타나기 때문에 상대적으로 연구자와 연구투자자 모두의 입지는 좁아지고, 연구인력의 부족으로 이어지고 있는 것으로 생각된다. 그러나 이에 대한 고려가 충분히 이루어질 수 있다면 상당히 빠른 속도로 발전을 기대할 수 있을 것으로 판단된다.</p> <h1>적 요</h1> <p>국내 과수분야의 형질전환 연구동향과 전망에 대해 살펴보았다. 과수에서 형질전환 기술은 교배욱종의 한계를 극복하고 보완할 수 있는 기술의 하나로 여겨지고 있고 1990년 초반 이래 기술개발에 대한 연구가 수행되어 오고 있다. 사과에서는 후지, 감홍 등의 주요 재배품종에 대한 형질전환 기술이 확립되어 있고, 포장 발현분석 단계로 진입하고 있는 중이다. 감귤과 참다래는 형질전환 기술이 일부 개발되었으나, 다양한 품종으로 확대하여 적용하는 단게까지는 이르지 못한 상태이다. 포도 등의 타 과수에서는 형질전환 성공사례가 보고된 바 없으며, 현재 기술개발 연구단계에 머물러 있는 것으로 판단된다. 또한 항생제 선발 대체, 형질전환 대목, 부위 및 생육시기에 따른 조절 기술 개발 등은 실용화를 조기에 앞당기기 위한 선결조건으로 여겨지고 있다.</p> <p>아그로박테리움을 이용한 형질전환은 벡터로부터 목적 유전자의 식물 세포로의 전이와 식물세포로부터 신초 재분화 과정을 거치게 된다. 국내에서도 이 두 과정에서의 작용과 관련하여 몇가지 요인들의 효과에 대해 연구되어 왔다. 특히 접종에 사용하는 식물체 기원 (Kim et al. 2004; Seong and Song 2008; Song et al. 2001b), 균주의 밀도와 활력 (Song et al. 2001a; Seong et al. 2003), 균주 밀도와 품종과의 작용 (Seong et al. 2003), 공동배양 단계에서의 acetosyringon (AS) 농도 및 배양기간 (Seong and Song 2008), 재분화 과정에서의 선발강도 및 에틸렌 발생 (Seong et al. 2005; Song et al. 2000) 등이 중요하게 작용하는 것으로 밝혀졌다.</p> <p>현재 국내에서 확립된 사과 형질전환 방법의 개요는 Fig. 1과 같다. 먼저 형질전환 재료로 쓰일 식물체를 준비하고 접종하고자 하는 목적 절편체를 제조한다. 접종 재료로 얼마나 적절한 단계의 식물체를 이용하는가 하는 것이 형질전환의 효율을 좌우하는 가장 큰 요인 중의 하나이다. 경정배양을 통해 기내 도입하여 증식배양 중인 신초로부터 완전히 전개된 유엽을 사용한다. 유엽은 엽병 부위가 부착되지 않게 사각으로 자르며, 접종 하루 전날 아그로박테리움을 항생제가 포함된 배지에서 배양하여 접종원으로 이용하게 된다. 접종 당일 준비된 절편체를 접종원인 아그로박테리움 현탁액에 10분간 침지 처리한 후 멸균된 여과지를 이용하여 절편체 표면의 아그로박테리움 현탁액을 제거한 후 공동배양 배지에 치상하여 3일간 암 배양한다. 이후 항생제가 첨가된 MS 선발 재분화 배지로 옮긴 후 암 배양하면서 신초 재분화를 유도한다.</p> <p>최근에는 다양한 품종으로 확대하여 형질전환 계통을 대량 양성한 후 우량한 개체의 선발을 시도하는 단계로 접어들었다. 현재 기내 혹은 격리 온실 단계에서 유전자 발현 검정 중인 형질전환체로는 개화조절 유전자가 도입된 갈라 (Song et al. 2001b), 착색관련 유전자가 도입된 후 지 및 맥킨토쉬위직 (Kim et al. 2002), 칼슘 수송에 관여하는 유전자가 도입된 감홍 (Kim et al. 2008), 발근 촉진유전자가 도입된 사과 M26 대목 (Kim et al. 2009) 등이 있다. 후지와 맥킨토쉬위직에 과실 착색 증진에 관여하는 유전자인 DFR과 B-Peru를 도입하여 우량 착색 계통의 사과 육성을 시도해 오고 있다 (Kim et al. 2002). 착색조절 유전자가 도입된 식물체는 기내 배양 과정 중 안토시아닌 색소가 발현된 모습을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 착색조절 유전자의 도입이 확인된 식물체의 안토시아닌 분석을 수행하였는데, 잎과 뿌리에서 대조구에 비해 2~7 배까지 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (Table 1). 사과 재배에서 품종 선택만큼 중요한 것이 대목의 선택인데 국내에서 가장 많이 사용 중인 대목의 하나는 M26이다. 준 왜성 대목인 M26의 경우 토양 지지력이 약해 지주 재배를 해야 하는 단점이 있는데, 이러한 왜성 대목의 단점을 보완하고 국내 기후 풍토에 알맞고 발근력도 우수한 대목 선발을 위해 발근 및 왜화 관련 유전자인 rolC 유전자 를 도입하였다. rolC 유전자 전환체의 기내에서의 발근 상태를 조사한 결과, 대조구에 비해 뿌리수가 증가되었고, 발근 상태도 양호한 것으로 나타났다 (Fig. 3). 포장에서의 발근력 확인을 위해 접목 후 성토법인 묻어떼기를 한 후 5 개월째에 대조구와 rolC 형질전환체의 발근 상태를 확인한 결과 Fig. 4와 같이 대조구에 비해 발근이 현저히 향상되었음을 확인할 수 있었다 (Kim et al. 2009).</p> <p>온주밀감의 형질전환은 미성숙 종자를 이용한 체세포 배발생 재분화 체계를 구축한 후 고빈도 체세포배발생 캘러스를 선발하여 아그로박테리움을 접종하게 된다. 접종 후 멸균여과지로 여액을 제거하고 암조건 하에서 공동배양 한 다음, 체세포배 유도와 자엽 유도과정를 거친 후 신초를 유도하게 된다. 이 과정에서 사과에서와 같이 균 밀도, 공동배양 기간, AS 농도 등이 중요하게 작용하는 것으로 나타났다(Song et al. 2007c).</p> <p>감귤 미성숙 종자의 체세포배 형질전환에 있어서는 유년성 재현으로 개화 결실까지의 기간이 길어지는 단점이 나타나게 되어 최근 외국의 경우 성숙 줄기를 이용한 체세포배 형질전환으로 연구가 급속히 진행되고 있다(Penaet al. 2004). 그러므로 국내에서도 이에 대한 연구가 시급한 실정이다. 또한 궁천조생 온주밀감에서 확립된 기술을 만다린 계통으로의 적용이 가능한지 여부를 검토하여 연구로 시급히 확대해 나가야 할 것이다.</p> <h1>기타 과수 형질전환</h1> <p>포도는 배수성이 다양하고 자식열세 현상이 나타나며, 무핵 품종에서와 같이 종자가 형성되지 않은 경우도 있어서 교배육종이 쉽지 않다. 그러므로 형질전환에 대한 관심과 연구가 오래 전부터 진행되어 왔다. 외국의 경우 Nakano et al.(1994)에 의해 아그로박테리움 형질전환 보고가 이루어진 이래 형질전환에 대한 많은 연구가 보고되어 왔다(Dheneky et al. 2009). 이러한 많은 연구에도 불구하고 주요 재배 품종의 재분화 체계가 아직 확립되어 있지 못한 경우가 많고, 또한 국내에서도 포도 재분화 연구 (Kwon et al. 2000)에 이어, 일부 형질전환 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고 아직까지 성공사례가 보고된 바는 없다 (Lee 2007).</p> <p>한편 참다래는 배수성이 다양하고 종내 분화가 많이 되어 있지 못하기 때문에 교배육종에 의한 품종육종이 쉽지 않은 편이며, 외국의 경우 형질전환 연구가 사과 못지 않게 일찍 시작된 편이다. 국내에서도 재분화 연구가 일찍 시작되었으나(Kim and Oh 1998), 형질전환의 성공 사례는 최근에야 보고 (Kim et al. 2010)되었다. 참다래 형질전환은 기내배양 식물의 줄기로부터 미세절단에 의한 조제된 절편체에 아그로박테리움을 접종한 후 2일 간 공동배양한 다음 재분화 배지에서 형질전환 재분화 개체를 선발할 수 있었다. 그 결과 형질전환 효율이 접종절편체의 \(3\sim22 \%\) 내외로 높게 나타나서, 안정적이고 효율적인 형질전환 체계가 확립된 것으로 나타났다. 향후 다양한 유전자 전이를 통한 형질전환체 발현분석이 이루어질 수 있을 것으로 보여지나 실용화를 조기에 이루기 위해서는 품종보다는 대목의 활용에 더 중점을 두어야 할 것으로 생각된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>과수는 목본성 영년생 원예작물로서 초본성 일년생 또는 다년생의 채소 또는 화훼와는 다른 특성을 지닌다. 과수의 종자에서 발아한 식물체는 개화 결실에 이르기까지 6~7년 이상의 기간이 필요하여 과실 특성의 평가와 선발 에 따른 육종 기간이 길다. 수관 크기가 커서 포장면적도 많이 필요하다. 그러므로 소비자와 생산자가 만족할만한 새로운 품종을 육성하기까지는 육종기간, 포장면적, 노동력, 자본 등이 많이 소요된다.</p> <p>더욱이 개화 및 결실 습성, 당도, 산도 등 대부분의 유용 형질에 대한 유전특성 정보가 잘 알려져 있지 않다. 자가불화합성에 기인하여 많은 형질들의 유전자 조성은 이형으로 되어 있어, 다수의 우수한 우성 유전자들을 집적하기 위한 작업이 매우 어렵다. 그러므로 기존의 우량표현형들은 대부분 유지하고 내병성 등 개량이 필요한 소수 형질들에 대해서만 개선을 유도할 수 있는 형질전환 기술은 과수에 있어서 매우 매력적인 육종기술로 인식되고 있다.</p> <p>특히 과수는 영년생 작물로 식물체는 유지되면서 매년 과실을 결실시키는데, 과실은 \( 80 \% \) 내외의 많은 수분을 함유하고 있으며, 건과 및 액상과도 다양하게 존재하기 때문에 다양한 이용목적을 충족시키기에 충분하다. 그러므로 기능성 성분 또는 의약품 생산 등 고부가가치 창출 형질전환 소재로서의 잠재력도 매우 높은 편이다. 그러나 과수는 목본특성상 재분화가 어렵고 특성 평가에 대한 기간도 오래 걸리기 때문에 채소 및 화훼 등 다른 원예작물에 비해 상대적으로 연구가 늦게 시작되었다.</p> <p>한편 그간의 국내 과수산업에 있어서 품목별 중요도를 보면 사과, 감귤, 포도, 배, 복숭아의 순이며, 세계적으로는 포도, 감귤, 사과 순의 중요도가 가장 높다. 새로운 연구 개발에 대한 관심과 투자도 작목의 중요도를 반영하는데, 외국에서는 과수의 형질전환에 대한 연구가 사과, 감귤, 포도에서 가장 활발히 전개되고 있고 나머지 과수는 단편적인 연구 수준에 머물고 있는 실정이다. 국내에 서는 사과가 가장 활발히 형질전환 연구가 진행되어 왔고 감귤, 포도, 참다래는 부분적으로 진행되어 왔다. 본 논문에서는 그 동안 수행되어 온 국내 과수 형질전환 연구의 동향을 살펴보고 또한 향후 전망에 대해서 고찰해 보고자 한다.</p> <h1>사과 형질전환</h1> <p>사과 형질전환은 영국의 East Malling 연구소에서 세계 최초로 보고된 이후 (James et al. 1989), 다양한 품종에서 주로 아그로박테리움을 이용한 형질전환 기술이 국내외적으로 개발되어 왔다 (Song 2007a). 국내에서는 1990년대 초반부터 사과 잎의 재분화 연구를 시작하면서 동시에 아그로박테리움 이용 형질전환 기술을 개발하기 시작하였다. 그러나 국내에서의 사과 형질전환은 2000 년에 이르러 성공 사례가 최초 보고되었다 (Song et al. 2000). 이후, 아그로박테리움을 이용한 사과 형질전환 효율에 영향을 미치는 요인들에 대해서 상당한 연구가 수행되었다.</p> <p>현재 사과 형질전환 연구는 고효율의 형질전환 체계를 바탕으로 포장상태에서의 전이유전자발현 분석 및 평가 단계로 발전하고 있다. 형질전환의 실용화를 위해서는 도입 유전자의 지속적이고 안정적인 발현 여부 확인, 환경 및 인체 위해성을 포함한 안전성 평가 심사까지의 많은 절차가 남아 있다. 또한 특정 시기와 부위에서의 발현을 조절하여 식물체 전체적으로 볼 때 효율성이 유지되도록 조절하는 기술도 검토해야 할 과제이다. 그 외에도 상업적인 이용화를 조기에 앞당기기 위해서 사과의 형질 전환에 현재까지 사용된 항생제 저항성 마커 유전자들을 대체하는 보다 더 안전한 선발 마커의 개발이 시급히 보완하여 할 분야로 여겨진다.</p> <h1>감귤 형질전환</h1> <p>온주밀감, 오렌지, 자몽 등의 감귤에서는 배우체 불임과 자가불화합성이 존재하여 종자를 잘 형성하지 못하고, 다배성 (polyembryony)으로 인해 설령 종자가 형성되었다고 하더라도 종자에서 발아한 식물체의 대부분은 교잡 실생이 아닌 종자친과 유전적 특성이 동일한 실생이다. 그러므로 이들 감귤에서 교잡육종은 매우 어려워 체세포 잡종과 형질전환 육종에 대한 기대가 큰 편이다 (Song 2007b). 체세포잡종 및 형질전환 식물의 개발에는 기관분화 또는 체세포배 유도 및 식물체 분화 과정이 필수적이다.</p> <p>감귤의 기관분화는 주로 줄기조직을 이용해서 연구되어 왔고 (Moreira-Dias et al. 2000), 체세포배발생 및 재분화는 주로 미발육종자 또는 줄기조직을 이용하여 연구되어 왔다 (Ikeda et al. 2000; Jin et al. 2007; Perez et al. 1998; Rangan et al. 1968; Yun et al. 2006). 감귤의 형질전환 성공 사례는 PEG법에 의해 오렌지에서 최초 보고 (Kobayashi and Uchimiya 1989)되었으나, 곧이어 아그로박테리움 이용 형질전환 성공이 보고 (Hidaka et al. 1990)되면서 대부분 이 방법에 의한 연구가 집중되어 왔다. 일부 연구팀들은 유묘의 전이유전자 발현특성을 보고하고 있으나 (Cardoso et al. 2009), 아직도 일부 오렌지 품종이나 온주밀감 등의 일부 종에 있어서는 고효율 형질전환 기술 개발에 대한 연구가 계속되고 있다 (Dutt and Grosser 2009).</p> <p>이에 반해 국내 연구진은 재분화 및 형질전환에 대한 연구가 극히 미미한 실정이다 (Han et al. 2002; Jin et al. 2007; Song et al. 2007b; Yun et al. 2006). 국내 감귤의 대부분은 온주밀감으로 이루어져 있기 때문에 온주밀감의 재분화 및 형질전환에 대한 연구가 오랫동안 지속되어 왔다. 그러나 최근 국내에서 온주밀감 형질전환 성공 사례가 보고 (Song et al. 2007c)된 바 있으나, 일본에서조차 온주 밀감의 형질전환에 대한 성공사례가 보고되고 있지 못한 것으로 보아, 형질전환이 극히 어려운 종으로 생각되며, 적정 조건의 확립이 시급한 실정으로 보여 진다.</p>	생명
Bacillus megaterium N4에 의한 들깨 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum)의 생물학적 방제	<h1>고찰</h1> <p>들깨 균핵병을 일으키는 S. Sclerotiorum은 매우 다양한 기주작물에 침입하며, 비교적 저온이고 습도가 높을 때 많이 발생한다. 보통 벙환부에 헝성된 균핵이 땅으로 떨어져 토양 표면에서 월동하는데 환경이 적합하면 균핵은 균사로 직접 발아하여 줄기의 지체부나 과실 혹은 배추 등의 밑둥을 직접 침입하거나 자낭반을 만들어 그 안에 형성된 자낭포자가 비바람에 날려 식물체의 지상부를 침입하여 1 차 전염을 한다.이 병원균은 분생포자를 형성하지 않기 때문에 주로 균사에의해 2 차 전염을 하는데, 2 차 전염은 타 병해와 같이 대발생되는 경우가 적고 주로 1 차 전염원인 자낭포자의 비산에 의해 생기는 경우가 많다. 또한, 감염된 기주의 종류나 기주의감염부위 그리고 환경조건에 따라 솜털씽음병(cottony \( \mathrm { rot } ) \), 횐곰팡이병(white mold), 물렁썩음병(watery soft rot), 줄기썩음병(stem rot), 초관쌕음병(crown rot), 꽃마름병(blossomblight) 등의 다양한 병징을 나타낸다[2]. 전형적인 균핵병의초기 병징은 하얀 솜털 균사가 나타나고 시간이 지나면 여기에 크고 단단한 휴면체인 균핵이 나타나며, 다즙성 식물의 줄기가 감염되면 초기에는 기부에 담갈색 또는 암갈색 병반이 나타나다가 횐 솜털 같은 균사로 뒤덮히며, 만연하면 줄기가 썩고 병반 위쪽의 잎이 빠르게 말라죽는데, 어떤 경우는 잎이 먼저 감염된 후 줄기로 이동하기도 한다[11]. 본 연구에서 조사된 들께 균핵병의 병장 역시 잎과 줄기에 갈색의 수침상 병반이 형성되고 무름증상과 썩음증상이 나타나며 횐색의 균사로 덮히는 등 전형적인 균핵병 증상을 보였다.</p> <p>Kohn[14]은 S. sclerotiorum율 60과 360 종의 넓은 기주 범위를 가지는 다범성균으로 보고하였으나 들깨는 이 기주 범위에 포함되지 않았다. 또한, Sclerotinia속 균의 동정에 있어서 Scleritinia속 분류에 관한 기존의 동정기준을 수정하여 과거의 Sclerotinia속이었던 많은 종들올 다른 속으로 개명하고, 식물 병원성인 S. sclerotiorum, S. triforiorum, S. minor 3종 만을 기록하고 있다[14]. 이들 3종을 결정하는데에는 자낭포자의 길이와 폭의 비, 자낭포자내의 핵 수, 동일 자낭내 자낭포자 크기 차이의 유무, 균핵의 내외부 형태 등에 따라 구분하였다[14,16,23,25]. 본 연구에서도 공시균인 S2 균주의 유성세대인 자낭을 형성시켜 자낭과 자낭포자 등의 특징을 관찰한 결과, 자낭내에 8개의 자낭포자가 형성되고 자낭포자의 핵수는 2핵이었으며 자낭포자의 길이와 폭의 비는 2.2였고, 8 개자낭포자의 크기가 모두 동일하였다. 이 결과를 Sclerotinia속3 종의 톡징과 비교해 보면[14], 자낭포자의 길이와 폭의 비가 S. sclerotiorum은 \( 2.1 \sim 2.4 \) 로서 \( 2.0 \) 보다 크고, S. minor는 \( 2.0 \) 보다 작거나 크며, S. trifoliorum은 \( 2.0 \) 보다 작다. 자낭내 헥 수는 S. minor와 S. trifoliorum은 4 핵인데 반해 S. sclerotiorum 은 2핵이었으며, 자낭내 8개 자낭포자의 크기에 대해서도 \( S \). trofoliorum 은 자낭포자 크기가 대, 소 2종이 \( 4: 4 \) 의 비로 나타 난 반면, S. minor와 S. sclerotiorum은 모두 동일하다고 기술하였는데, 이상의 모든 톡징들을 종합하여 보면, 본 공시균인 \( \mathrm { S } 2 \) 균주는 S. sclerotiorum으로 동정되었으며 이미 보고된 들깨 균핵병균과 동일하였다[7]].</p> <p>이 외에 첨가된 dextrose는 병원균보다 길항균에 유용하게 작용하는 영양원이며, 미량원소인 \( \mathrm { CaCO } _ { 3 } , \mathrm { FeSO } 4 \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \), \( \mathrm { MnCl } _ { 2 } \cdot 4 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 는 길항균의 생장에 필요한 무기영양 염류로 효력증진제 역할을 하는데, 이는 정 등[13]의 미생물농약 개발과 복[4]의 무공해 생물농약 개발 그리고 이 등[18]에 의한 연구에서와 동일한 결과이다.</p> <p>미생물 농약을 상품화하고 실용화되기 위해서는 반드시 보관상의 안정성과 안전성 등에 관한 조사가 수반되어야 하는데, 장기간 보존을 위한 보조제 사용에 관한 실험과 약효. 약해 검정 등이 추후 보완되어야 할 것이다.</p> <h1>요약</h1> <p>부산시 강서구 강동동 지역의 들깨 하우스내에서 들깨의 잎에 갈색내지 흑갈색의 병반이 형성되고 습도가 높을 시에 는 잎에 무름증상과 줄기에 잘록증상이 나타나며, 심하면 주전체가 고사하여 횐색의 균사로 뒤덮하고 균핵이 형성되는 병해가 발생하여 1998년 5월에 자연발생된 균핵병 발병율을 조사한 결과 약 \( 8.1 \sim 28.3 \% \) 로서 평균 \( 13.9 \% \) 였다. 이러한 중상을 띄는 병반으로부터 분리된 16 균주를 균사절편 접종법으로 병원성 검정한 결과, 접종 1 일 후부터 발병되기 시작하여 자연발생된 병징과 동일한 증상을 나타내었으며 16 균주 모두 \( 80.0 \% \) 이상의 발병율을 나타내었다. 그 중 병원성이 가장 강한 S2 균주를 공시선발하고, 형태적 및 배양적 특성 등 을 조사하여 동정한 결과, 들깨 균핵병균 Sclerotinia sclerotiorum 으로 동정되었다. 생물학적 방제를 위해 길항세균인 N1 등 6균주를 공시하고 병원균 S2균주와 균사생육 억제효과 및 생육상내 포트검정을 통해 방제효과를 검정한 결과, N4 균 주에 의한 균사생육 억제효과와 방제 효과가 가장 우수하였 으며, 발병예방 및 치료효과 검정시 길항균을 병원균처리 \( 1 \sim 3 \) 일 전에 처리할 경우 \( 80.0 \% \) 이상의 방제가를 보여 치료 효과보다는 발병예방효과가 효과적인 것으로 확인되었다. 길항균 N4 균주를 Bergey's manual과 API system을 이용하여 동정한 결과, Bacillus megaterium으로 동정되었으며, 이를 수 화제형인 미생물농약 \( \mathrm { N } 4 \) 제제로 제조하여 유기합성 농약인 베노말수화제와 발병예방 및 치료효과를 비교하였다. 그 결과, 병원균처리 3일 전에 처리할 경우 \( \mathrm { N } 4 \) 수화형 제제의 방제가가 \( 98.0 \% \) 로 베노밀수화제에 의한 \( 78.0 \% \) 보다 방제가가 높았다.</p> <p>일차로 선발한 두 균주를 생육상내 포트 검정을 통해 방제효과가 가장 높은 균주를 우수길항균으로 최종선발하였다. 이때, 방제효과 검정은 NB (Nutrient Broth, Difco, USA)배지에서 1 일간 진탕배양하여 \( 10 ^ { 7 } \mathrm { cfu } / \mathrm { ml } \) 로 조정한 세균부유액을 들깨 잎의 앞, 뒷면에 골고루 분무접종하고, 접증 1 일후 PDA 평판배지에서 1 주일간 배양한 직경 \( 8 \mathrm { ~mm } \) 의 공시병원균의 균사절편을 잎의 뒷면에 부착하여 상대습도 \( 90 \% \) 이상, \( 20 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 생육상에서 보관하면서 접종 1 일 후 균사절편을 떼어내고 2일 후부터 발병도를 조사하였다. 각 처리구는 5포트씩 5반복으로 3회 조사되었으며, 이하의 모든 실험에서 방제가는 다음과 같이 환산하였다[17].<h2>선발 길항균에 의한 발병예방 및 치료효과 검정</h2> <p>우수 길항균으로 최종 선발되어 병원균에 대해 발병 억제효과가 가장 큰 것으로 확인된 N4 균주의 예방효과 및 치료효과를 규명하였는데, 먼저 길항균 \( \mathrm { N } 4 \) 균주의 세균부유액을 병원균 접종 3 일, 2일, 1 일, 0 일 전에 각각 포트에 재식한 들깨 잎의 앞, 뒷면에 골고루 분무접종하고, 병원균의 균사절편을 부착하여 접종한 후 발병도를 조사하여 예방효과를 검정하였다. 반면, 치료효과는 병원균 접종 후 0 일, 1 일, 2 일, 3 일 후에 각각 세균부유액을 처리하여 발병도를 조사하였다. 접종방법은 앞서의 생육상내 포트검정과 동일하게 수행하였다.</p> <h2>길항균 동정</h2> <p>선발된 길항세균을 동정하가 위해 배양, 생리 및 생화학적 톡성을 Bergey's manual에 따라 조사하였고, 형태는 \( 1 \% \) PTA Negative staining하여 투과전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM)으로 관찰하였으며, 아울러 API 20E와 \( 50 \mathrm { CHB } \) kit를 동정에 이용하였다.</p> <h2>공시 길항세균의 제제화</h2> <p>선발된 길항세균의 제제화를 위해서 \( 7 \mathrm { ~L } \) 발효기에 \( \mathrm { NB } \) 배지 \( 4 \mathrm { ~L } \) 을 넣고 종균배양된 \( \mathrm { N } 4 \) 균주 \( 400 \mathrm { ml } \) 을 접종하여 3일간 배양 \( \left (30 ^ {\circ } \mathrm { C } 300 \mathrm { rpm } \right ) \) 하였다. 배양액 \( 1 \mathrm { ~L } \) 당 예비실험에서 선발된 옥수수전분, 밀가루, 콩가루, 쌀가루 등의 고분자 재료 중 방제효과가 확인된 옥수수전분 \( 200 \mathrm { ~g } \), 밀가루 \( 200 \mathrm { ~g } \), dextrose \( 4.0 \mathrm { ~g } , \mathrm { CaCO } _ { 3 } 2.0 \mathrm { ~g } , \mathrm { FeSO } 4 \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.1 \mathrm { ~g } , \mathrm { MnCl } _ { 2 } \). \( 4 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.02 \mathrm { ~g } \) 을 첨가하여 잘 섞은 다음, 철판에 엷게 깔고 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 동안 건조 후 블라인더로 분쇄하여, 수화제형 미생물농약인 \( \mathrm { N } 4 \) 제제를 제조하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>병징 밎 발병율 조사</h2> <p>1997년 1월부터 1998년 5월 중순까지 부산시 강서구 강동동 지역의 돌깨 재배 플라스틱하우스 내에서 들깨에 나타나는 균핵병의 병징을 수시로 관찰하였다. 발병율은 들깨잎 수확말기인 1998년 5월에 강동동 지역내의 2개 하우스 재배지에서 1하우스당 6 개 구역, 구당 \( 120 \times 100 \mathrm { ~cm } \) 를 임의 선정하고 구역내의 총 들깨 조사 주수(약 230 주 \( \times 12 \) 구역)에 대한 이병주율을 조사하였다.</p> <h2>병원균의 분리</h2> <p>들깨 재배 하우스내에서 잎무름 증상 및 줄기썩음 증상을 띄고 있는 병든 들깨를 채집하고 각 발병부위로부터 병원균을 분리하였다. 병든 조직 절편을 \( 5.25 \% \) sodium hypo-chloride에 약 1 분간 표면살균 후 멸균수로 3 회 세척하여 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco, USA) 평판배지 위에 놓아 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 암조건하에서 2 일간 배양하였다. 신장한 균사절편을 PDA 평퐌배지에 이식하고 3회 반복하여 순수분리하였다. 잎무름 증상 및 줄기썩음 증상을 띄는 병반으로부터 병원균 \( \mathrm { S } 1 \) 등 16 균주를 분리하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 저온 배양기에 보존하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>병원성 검정 및 동정</h2> <p>분리된 16 균주의 들깨에 대한 병원성을 검정하기 위해, PDA 평판배지에 1 주일간 배양 후 직경 \( 8 \mathrm { ~mm } \) 의 균사절편을 포트내 재식한 들깨 잎과 줄기에 접종하여 상대습도 \( 90 \% \) 이상, \( 20 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 생육상에 보관하면서 접종 1 일 후에 균사절편을 때어내고 2 일째부터 발병율을 조사하였다. 이때, 5 포트씩 5반복으로 3 회 실시하였다. 병원성 검정 견과, 병원성이 가장 강한 균주의 형태적, 배양적 특성 등을 조사하여 이를 동정하고 이하의 모든 실헙에 공시 균주로 이용하였다.</p> <h2>길항균 선발</h2> <p>부산시 강동동 지역의 들깨 플라스틱 하우스내 들깨잎과 근권토양에서 분리하여 이미 들깨 잿빛곰팡이병균 및 잎마름병균에 대해 균사생장 억제효과가 우수한 것으로 보고[20,24]된 N1 균주 등 6균주를 공시하여 PDA 평판배지 상에</p> <p>서 균핵병원균과 대치배양 후 병원균의 균사생육 저지대를 조사하여 가장 효과적인 공시 두 균주를 일차로 선발하였다.</p> <p>들깨 잎과 근권 토양에서 분리한 세균 균주 중 병원균과의 대치배양 및 생육상내 포트검정을 통해 균사생육 억제효과와 방제효과가 우수한 공시 길항균 B. megaterium N4 균주를 선발하여 발병예방효과와 치료효과를 검정하였는데 이 경우, 병원균 처리 \( 1 \sim 3 \) 일 전에 길항균을 처리한 예방효과가 치료효과보다 우수하였다. 이는 B. megaterium에 의한 항진균활성 물질 분비 및 siderphore에 의한 \( \mathrm { Fe } ^ { 3 + } \) 에 대한 경쟁과 외막가수분해효소 등에 의한 기작과 관련이 있을 것으로 추정되며[12], 그밖에도 B. subtilis와 마찬가지로 내생포자를 형성하여 불리한 환경조건에서도 잘 생육하며 유기영양세균으로서 광합성세균의 질소고정작용을 촉진하는 등, 유기인의 유효도를 증가시켜 작물생장을 촉진한다는 보고[3,5] 등과도 일치할 것으로 사료된다. 그러나, siderphore나 외막가수분해효소에 의한 기작은 항생물질에 비해 방제효과가 다소 낮으므로 실제 N4 균주의 예방효과는 병원균과의 영양물질 경합 및 항균물질의 다량 분비에 의해 높은 방제효과를 보인 것으로 생각된다.</p> <p>균핵병의 방제는 경종적 방법과 약제 살포에 의존하며, 이 병원균에 대해 강한 저항성을 보이는 품종은 거의 없으므로 온실에서는 훈증법으로 병원균을 제거하고, 감수성 작물의 재식 밀도를 낮추어 심고 잡초 관리를 잘 해야 한다[22]. 특히, 온실의 투광도를 높이고 질소비료 과용을 삼가야 하는데 토양을 전면 멀칭하고 점적관수하는 방법은 균핵병 뿐만 아니라 잿빛곰팡이의 발생을 억제하는 수단도 된다. 균핵은 최소 3년 동안 생존하므로 감염된 포장에서 감수성 작물을 다시 식재하기 위해서는 최소 3 년 동안은 화곡류 같은 비감수성 작물을 키워야 한다[1]. 또한, 화학적 방제로는 유기합성 농약인 benomyl, dickloran, thiophanate-methyl 등을 이용하나 만족할만한 효과를 보지 못하고 있으며, 들깨는 잎을 식용으로 하기 때문에 유기합성 농약 사용에 큰 어려움이 따르므로 결국 환경친화적 방제 방법이 요구된다.</p> <p>본 연구에서는 제제화를 위한 bio-gel을 천연고분자 재료인 옥수수전분과 밀가루를 사용하였는데, 이는 전착제로서의 기능 뿐 만 아니라 약효중진 및 길항균 생존에 필요한 영양원으로도 작용하여 방제에 매우 효과적이었다고 생각된다. 본 연구자에 의해 기보고된 돌깨잿빛곰팡이병 방제용 soy 제제에서는 콩가루와 쌀가루를 이용하여 높은 방제효과률 검정하였으며[15], 가지잿빛곰팡이병 방제용 미생물농약 제조에서는 콩가루, 밀가루, 비지가루, 옥수수전분, 쌀가루,찹쌀가루 등을 다양하게 이용하여 이들의 우수함을 보고하였다[21]. 타연구자들에 의하면, 복[4]은 전착제로 콩가루와 쌀전분을 이용하였는데 이는 높은 고정화와 수분홉착도를 나타낸다고 하였으며, 이 등[18]도 콩가루와 전분을 전착제로 선발하여 그 효과를 증명하였다. 본 연구에서 사용한 옥수수전분은 일반적으로 시중에 판매되는 옥수수전분과는 달리 옥수수에서 배아, 옥피, 글루텐 등을 고도로 정제한 비매품을 사용한 것이므로 타연구자와 다른 점이라고 할 수 있다. 일반적으로 옥수수전분은 식품이나 공업용으로 증량제및 제지용 사이즈제와 접착제용 등으로 많이 이용되어 왔으나, 본 연구에서는 미생물농약의 제제화에 옹용하여 우수한 천연고분자 물질로 선발하게 되었다. 본 연구자는 지속적인 미생물농약의 개발로 토마토, 딸기 및 결구상추 잿빛곰팡이병 방제용, 결구상추 균핵병과 밑등썩음병 방제용 및 토마토 이곰팡이병 방제용 미생물농약을 제제화하여 그들의 방제효과를 검정 중에 있다(미발표).</p> <h2>미생물제제의 방제효과 검정</h2> <p>\( \mathrm { N } 4 \) 균주의 \( \mathrm { N } 4 \) 제제에 의한 들깨 균핵병의 방제효과를 플라스틱 하우스내의 포트검정을 통하여 화학농약과 비교하였다. 이때, 수화제형 미생물농약인 N4제제는 수돗물로 100 배 희석 \( \left (4 \times 10 ^ { 8 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \right ) \) 하였고, 대조구인 농야은 상추균핵병의 방제약제로 품목고시된 벤지미다졸계의 베노밀수화제 2000배 회석액을 공시하여, 앞서의 예방 및 치료효과 검정과 동일한 방법으로 검정하였으며, 5포트씩 5반복으로 3회 평균하였다.</p> <h1>결과</h1> <h2>발병율 밎 병징 조사</h2> <p>1997년 1월부터 1998년 5월 중순까지 부산시 강서구 강동동 지역의 들깨 플라스틱 하우스 내에 자연발생한 균핵병의피해정도를 조사하기 위해, 2개의 플라스틱 하우스(강동I, 강동II)를 임의 선정하여 각 6 구 \( ( \mathrm { A } , \mathrm { B } , \mathrm { C } , \mathrm { D } , \mathrm { E } , \mathrm { F } ) \) 씩 총 12 구를 대상으로 발병율을 조사하였다. 그 결과, 최소 \( 8.1 \% \) 에서 최대 \( 28.3 \% \) 까지 평균 \( 13.9 \% \) 의 발병율이 조사되었다(Table 1).들깨 균핵병의 병징을 관찰한 결과, 처음에는 들깨 어린 줄기의 지제부와 잎에 수침상의 병반이 형성되어 차즘 갈색 내지 흑갈색으로 변하다가, 습도가 높아지면서 잎의 무름 증상과 줄기 잘록 현상이 심해져 병반이 차츰 확대되었고, 병반부는 횐색의 균사로 뒤덮혀 결국 주 전체가 고사하였다. 오래된 병든 줄기에는 혹색 균핵이 다수 형성하여 병든 잎이 탈락되거나 줄기가 껵여 쓰러지면서 부근의 건전한 들깨와 접촉하여 감엄되었다(Fig. 1A).</p> <h2>병원성 검정 및 동정</h2> <p>분리된 병원균 16 균주의 들깨에 대한 병원성 검정에서 균사절편을 들께 잎에 치상한 뒤 접종 1일 후부터 발병되기 시작하여 접종 7일 후에는 공시한 16 균주 모두 \( 80 \% \) 이상의 발병율을 나타내었으며(Fig. 2), 이들 중 S2 균주가 병진전이 가장 빠르고 병원성이 강하였으며, 자연발병에서와 동일한 병징을 나타내었다(Fig. 1B). 또한, 이들 각 병반으로부터 동일한 병원균이 재분리되었는데, 이들의 형태적, 배양적 특성을 조사한 결과, 조 등[7]에 의해 이미 보고된 들깨 균핵병균 Sclerotinia sclerotiorum으로 동정되었다. 따라서, 이하의 모든 실험에 S. sclerotiorum S2 균주를 공시 병원균으로 이용하였다.</p> <h2>길항균 선발</h2> <p>공시 길항균인 N1 균주 등 6균주의 본 병원균에 대한 균사생육 억제효과를 대치배양을 통해 검정한 결과, N1과 \( \mathrm { N } 4 \) 균주에 의한 저지대가 각각 \( 22.0 \mathrm { ~mm } \) 와 \( 28.0 \mathrm { ~mm } \) 로 가장 높아 이들 두 균주를 길항균으로 일차 선발하였다(Table 2, Fig. 3). 일차 선발된 이 두 균주의 생육상내 포트에서 방제효과 검정 결과, \( \mathrm { N } 4 \) 균주의 방제가가 \( 89.5 \% \) 로 \( \mathrm { N } 1 \) 균주의 방제가 \( 55.5 \% \) 보다 월등히 우수하여, \( \mathrm { N } 4 \) 균주롤 본 들깨 균핵병원균 \( \mathrm { S } 2 \) 균주에 대한 우수길항균으로 최종 선발하였다(Fig. 4).</p> <h2>선발 길항균에 의한 발병예방 및 치료효과</h2> <p>생육상내 포트검정에서 높은 발병억제 효과가 확인된 \( \mathrm { N } 4 \) 균주에 의한 발병예방 및 치료효과를 검정한 결과, 길항균과 병원균을 동시 접종하거나 길항균을 병원균보다 1 일 3일 전처리할 경우 \( 88.4 \sim 91.5 \% \) 로 모두 \( 80.0 \% \) 이상의 방제가를 보여 발병 예방효과가 높았다. 하지만, 길항균을 후처리할 경우 \( 0 \sim 14.7 \% \) 로 매우 낮은 방제가를 보여 선발 길항균에 의한 본 병원균의 치료효과는 나타나지 않았다(Table 3).</p> <h2>길항균 동정</h2> <p>병원균과의 대치배양 및 생육상내 포트 검정을 통해 최종선발된 우수길항균인 N4 균주블 배양, 생리 및 생화학적 븍성 조사 및 투과전자현미경(TEM) 하에서의 형태의 관찰을 통해 Bergey's manual에 따라 동정한 결과, N4 균주는 Bacillus megaterium으로 동정되었다(Table 4, Fig. 5). 동정의 정화성을 기하기 위해 API system으로 동정한 결과, 역시 유사도 \( 83.3 \% \) 로 Bergey's manual의 결과와 일치하였다.</p> <h2>미생물제제의 방제효과 검정</h2> <p>예비실험을 통해 B. megaterium \( \mathrm { N } 4 \) 균주의 길항력 제고에 효과가 확인된 옥수수전분 등을 첨가하여 수화제형 \( \mathrm { N } 4 \) 제제로 제제화하고 본 병원균에 대한 방제효과를 쌩육상내 포트 검정을 실시하였는데, 유기합성 능약인 배노밀수화제 처리와 비교한 결과, 앞서의 발병예방 및 치료효과에서와 마찬가지로 치료효과는 높지 않았으나, \( \mathrm { N } 4 \) 제제의 3 일 전처리에서는 \( 98.0 \% \) 로 높은 방제가를 보여 네노밀수화제 처리보다 효과적이고 예방효과가 전반적으로 높았다(Table 5, Fig. 6).</p> <p>들깨(Perilla frutescens Britton var. japonica Hara)는 꿀풀과에 속하는 유료작물로서 동부 아시아 지역이 원산지이며 [23] 예로부터 우리나라를 비롯하여 인도, 일본, 중국 등지에서 재배되고 있다. 들깨 종실은 주로 강정, 차, 제과, 건강식품 제조에 쓰이며, 기롬은 튀김용과 사라다용으로, 공업용으로는 페인트, 잉크, 칠감, 가루비누, 방수용구 등에 활용된다.</p> <p>최근 육류의 소비 중가와 건강식에 대한 퐌심 증대로 신선 잎채소의 들깨의 소비가 증가하여, 전국 잎들깨의 시설하우스와 노지재배 면적은 각각 약 \( 900 \mathrm { ha } \) 와 약 \( 300 \mathrm { ha } \) 로 경상남도 밀양, 부산, 경상북도 경산 등 영남권이 전국 잎들깨 면적의 \( 65 \% \) 를 차지하고 있다[8]. 그러나, 들깨 수요 증가에 따른 생산량의 증대로 농가에서는 농약과 화학비료를 과다 시비하여 농산품질관리원의 농약잔류 허용치 초과 작물로 분류되었으며, 약제 저항성균도 출현하였다[8]. 또한, 하우스내의 고온다습한 환경조건과 연작으로 인해 새로운 병해가 출현하여 들깨 수량 및 품질이 저하되는 등 농가에서는 많은 경제적 패해를 입고 있다[7,19 21,24].</p> <p>들깨의 주요 병으로서 1994년 조[7] 둥에 의해 들깨 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum)이 신병해로 보고된 후, 문 등[6,19]에 의해 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea)과 잎마름병(Alternaria)이 국내에서는 처음 보고되었다. 앞서 보고한 두 병해 이외에도 점무늬병(Cercospora perillae) 녹병(Puccinia spp.) 등이 있으며, 최근에는 탄저병(Colletotrichum perillae) 둥의 새로운 병해가 국내에서 발생하고 있다. 이외에도 외국의 경우, Coryn-espora cassiicola에 의한 점무늬병과 Ralstonia solanacearum에 의한 풋마름병도 보고된 바 있다[9,10].</p> <p>들깨는 생채를 주로 이용하는 경우가 많아 농약의 사용이 매우 까다롭고 사용할 수 있는 농약 또한 제한적이어서 현재 품목고시된 화학농약조차 보고된 바가 없고, 대부분 들깨에 관한 연구들은 종실과 유지 함량 및 품종 개량에 관한 것들로 들깨 병에 관한 기초 연구 및 방제에 관한 연구가 전무하여 본 병의 방제대책은 시급한 실정에 있다. 지금까지 들께 균핵병 방제에 이용된 미생물은 Bacillus subtilis, Burkholderia sp. 등의 균주가 보고되었으나[8], 이를 이용한 미생물제제의 제형화는 보고된 바가 없다. 현재까지 생물농약 개발에 이용된 균주는 Pseudomonas spp. Trichoderma harzianum, B. subtilis</p> <p>등이 있으며, 선진외국에서는 Trichodex, Kodiak, Mycostop 등의 상품명으로 생물농약이 시판되고 있다. 생물농약의 불안전성과 비경제성 등으로 많은 어려움들이 있으나 생물농약의 개발은 필수적이다.</p> <p>따라서, 본 연구에서는 부산시 강동동 지역에 발생한 들깨균핵병의 발생정도를 조사하고, 이의 생물학적 방제를 위해 우수길항균으로 확인된 B. megaterium N4 균주를 미생물제 제로 제형화하여 이들의 방제효과를 구명하고자 하였다.</p>	생명
	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 곰취(Ligularia fischeri), 미역취(Solidago virga-aurea), 삼나물(Aruncus dioicus)은 울릉웰빙식품에서 2009년 4, 5월경에서 건조된 잎을 구입하여 실험재료로 사용하였다.</p> <h2>시료 추출</h2> <p>시료의 추출은 시료 \( 300 \mathrm { ~g } \)을 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 추출물은 원심 분리 및 여과, 농축 후 동결건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>세포 배양액인 dulbeco's modifide eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin 등의 세포배양용 시약들은 invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sul-fate (SDS), acrylamide, bis-acrylamide는 Bio-rad사(Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, NP-40, protease inhibitor, ripa buffer, griess reagent 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD bioscience (Sanjose, CA, USA) COX-2 cayman (Ann ar-bor, MI, USA), \( \beta \)-actin과 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horse-radish peroxidase (HRP)-conjugated antibody (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하였다. \( PGE_ { 2 } \), cytokine 측정을 위한 ELISA kit는 R&D systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 \(10 \% \) FBS과 \(1 \% \) penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>울릉도 자생 식물의 세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다. Raw 264.7 cell \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ \( \mathrm { ml } \)를 96 well plate에 분주하고 울릉도 자생 식물 추출물을 농도별 (0,1,10,100, \( 1000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \))로 24시간 동안 처리하였다. Well당 \( 20 \mu \mathrm { l } \)의 MTT 용액을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율울 백분율로 표시하였다.</p> <h2>Nitric Oxide 생성량 측정</h2> <p>\( \mathrm { NO } \)의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 1, 10, 100 \( \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 울릉도 자생추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다</p> <h2>Prostaglandin \(E_ { 2 } \), TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6 생성량 측정</h2> <p>세포배양액 내의 \( PGE_ { 2 } \), TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm {\mu } \) \( \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 0, 1, 10, 100 \( \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 울릉도 자생식물 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 배지를 취하여 \( PGE_ { 2 } \)를 측정하였다.</p> <h2>Immunoblotting</h2> <p>배양이 끝난 세포를 수집하여 PBS (phosphate buffer sal-ine)로 세척한 후 \( 100 \mu \mathrm { L } \)의 lysis buffer을 첨가하여 30분간 lysis 시킨 후 \( 13,000 \mathrm { rpm } \)에서 20분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 총 \( 30 \mu \mathrm { g } \) protein을 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 분리하여 이를 PVDF (polyvinylidenedifluoride) membrane에 \( 55 \mathrm { ~V } \)로 90분간 transfer하였다. 그리고 PVDF membrane을 \( 5 \% \) skim milk에서 1 시간 방치한 뒤 primary antibody에서 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 overnight하여 준다. 다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척한 뒤 ECL kit와 반응시켜 LAS 4000 chem-iluinescence detection system (Fuii, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상 및 정량을 하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 10.0 프로그램을 이용하여 각 처리구 간의 유의성 \( (p<0.05,0.01) \) 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 tukey test로 다중비교를 실시하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Raw 264.7 cell에 대한 독성</h2> <p>마우스 대식세포인 Raw 264.7 cell에 대한 울릉도 자생식물의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 울 릉도 자생식물 추출물을 농도별 \( (0, 1, 10, 100, 1000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)로 24시간 동안 처리한 결과 \( 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 농도까지는 독성이 나타나지 않았지만, \( 1000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서는 세포의 생존율을 \( 20 \% \) 감소 시켰다. 울릉도 자생식물 추출물은 \( 100 \mathrm { lg } / \) \( \mathrm { ml } \)이하의 농도에서는 세포독성이 낮아 세포의 생존율에 영향을 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다. 즉, 울릉도 자생식물 추출물의 항염증 효과가 단순한 세포의 사멸에 의한 세포 염증성 매개물질의 생성억제가 아니라 울릉도 자생식물 추출물의 고유한 효과라는 점을 의미한다.</p> <h2>Nitric oxide (NO) 생성억제 효과</h2> <p>NO는 NO합성효소에 의해 l-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다. LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 염증반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 발현이 증가되어 있음이 보고되어 있다. 활성 산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO생성에 대한 울릉도 자생식물 추출물 효과를 알아보았다. 생성된 NO 양을 griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 \( \mathrm { NO } _ { 2 } { } ^ { - } \)의 형태로 측정하였다. 그 결과 Raw 264.7 cell에 LPS를 처리한 후 울릉도 자생식물 추출물을 처리한 NO 생성량의 변화는 Fig. 2에 나타내었다. LPS 처리후NO 생성량은 정상세포에 비하여 약 4배 이상 증가되었다. 울릉도 자생 식물 추출물을 \( 1 \mathrm { lg } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리한 군에서는 LPS로 증가된 NO 생성량이 LPS 처리군에 비하여 큰 차이가 없었으나 \( 10 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 \( 20 \% \) 이상의 감소율을 나타내었으며, \( 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서는 \( 60 \% \) 이상의 NO 생성 저해를 일으키는 것을 확인 할 수 있었다.</p> <h2>\( PGE_ { 2 } \) 생성 억제 효과</h2> <p>LPS로 유도 되어진 Raw 264.7 cell의 monocyte에서 pro-in-flammatory cytokine들을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 염증매개 물질의 형성은 phospholipase A2의 활성으로 인해 arachidonic acid가 prostaglandin으로 바뀌는 과정 및 NO 형성 과정으로 이어지게 된다. 체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 \( PGE_ { 2 } \) 등의 염증인자가 iNOS 및 COX-2에 의해 형성된다. 이 중 \( PGE_ { 2 } \)는 염증반응, 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여 하고 있는 것으로 알려져 있다. Raw 264.7 세포에서 염증성 \( PGE_ { 2 } \) 억제효과를 ELISA kit로 측정하였다. Raw 264.7 세포에 LPS \( (1 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } ) \)를 처리하여 \( PGE_ { 2 } \) 의 생성을 유도한 후 울릉도 자생식물 추출물 \( 1, 10, 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도로 처리하여 \( PGE_ { 2 } \) 생성억제를 측정한 결과 Fig. 3과 같이 \( 10 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 \( 20 \% \), \( 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 \( 60 \% \)에 가까운 높은 억제 효과를 나타내었다. 이는 울릉도 자생식물 추출물이 LPS에 의해 발현 되는 \( PGE_ { 2 } \) 생성을 농도 의존적으로 억제 시켜준다는 것을 의미한다.</p> <h2>TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6 생성 억제 효과</h2> <p>염증 관련 cytokine 중, IL-1B는 monocyte, macrophage, B-cell, dendritic cell, 간세포 등에서 분비되며, TNF- \( \ alpha \), IL-6와 함께 pro-inflammatory cytokine으로서 여러 면역학적 작용들과 연관되어 있다. 특히, TNF- \( \alpha \)는 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하며 macrophage와 mast cell 등에서 분비되며, LPS반응의 주요 매개체로서 내재면역에 있어서도 중요한 역할을 하며 만성 염증서 반응과도 관련되어 있다. IL-1 \( \beta \)는 T-cell 의 활성화, B-cell의 성숙, NK cell의 activity를 활성화 하며, IL-6는 림프구를 활성화시켜 항체생산을 증가시키는 것으로, IL-6의 level은 염증성 병변에서 항상 증가하는 것으로 보고되고 있다. 본 실험에서 LPS는 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 생성을 증가 시켰지만 울릉도 자생 식물 추출물을 농도별로 처리한 결과 TNF- \( \alpha \)는 \(60 \% \) 생성 억제를 IL-1 \( \beta \), IL-6는 각각 \(50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 \( 50 \% \), \(55 \% \)의 생성 억제 효과를 나타내었다. 일반적으로 LPS는 macrophage에 작용하여, TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 생성 분비를 촉진시켜 염증반응을 유도하지만, 울릉도자생식물 추출물은 이 세가지의 cytokine을 유의성 있게 억제하였으므로 염증성 질환의 치료에 유의할 것으로 생각 되어진다.</p> <h1>서 론</h1> <p>염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상 부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발하지만 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 여러 질환을 발생시키는 원인이 된다. 대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 nitric oxide (NO)와 cytokine을 생산하여 감염 초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다. 포유동물 세포의 nitric oxide synthase (NOS)의 경우, 유사형태가 3가지 존재하는데 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), 그리고 inducinle NOS (iNOS)이다. 그 중에서 특히 iNOS가 염증 반응에 관여한다. nNOS와 eNOS는 항상 발현되어 있으며, iNOS의 경우 interferon-8, lipopolysaccharide (LPS), 그리고 여러 가지 염증 사이토카인의 자극이 있을 때 발현된다. 또한 NO는 급성, 만성 염증반응을 조절하기도 한다. PGE \(_ { 2 } \)는 cyclo-oxygenase (COX)에 의해서 arachidonic acid로부터 생산된다. COX에 대해서는 1990년대 초반에 주로 연구되었는데, 이 또한 유사형태가 2가지 존재한다. COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, prostagrandin을 생산하여 신장의 혈액흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적인 기능을 조절한다. 반대로 COX-2의 경우는 미생물에 의한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 대식세포(macrophage)에서 발현된다. 즉 iNOS와 COX-2의 발현과 NO, prostaglandin \( E_ { 2 } \left (PGE_ { 2 } \right ) \)는 면역세포의 대표적인 염증인자이다. 또한 염증인자로 염증 사이토카인 (proinflammatory cytokines) 인 tumor necrosis factor \( - \alpha \) (TNF \( - \alpha \)), interleukin-1 \( \beta \) (IL-1 \( \beta \)), interleukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant pro-tein-1 (MCP-1) 등이 포함된다.</p> <p>울릉도 지질은 화산암이고 기후는 해양성이어서 식물분포가 국내의 다른 지역과는 달리 해양식물에서 고산식물에 이르기까지 다양하며 자생식물이 유명하다. 최근 천연 및 건강 식품, 기능성 화장품에 대한 사회적 관심 증가와 더불어 자생식물의 소비가 증가 하고 있으며 이들의 생리활성 검증을 통한 기능성 소재 개발이 필요하다. 곰취(Ligularia fischeri) 는 취나물의 일종으로 습하고 그늘진 곳과 경사진 벌판에서 주로 자라며 곰취의 어린잎은 향취와 맛이 좋아 나물로 먹고, 뿌리는 타박상, 요통, 진해, 거담, 객혈, 염증 등의 치료에 사용되어 왔으며, 울릉 미역취(Solidago virga-aurea)는 국화과에 속하는 취나물의 일종이며 이뇨, 해열, 진통, 건위, 신장염, 방광염, 감기, 두통, 황달, 폐렴, 항암 등의 치료제로 쓰인다. 삼나물(Aruncus dioicus)은 장미과에 속하는 식물로서 해독, 편도선염, 지혈 및 정력보강에 효과가 있다. 따라서 본 연구에 서는 곰취, 미역취, 삼나물을 혼합 추출하여 LPS로 활성된 Raw 264.7 cell에서 항염효과를 나타내는 기전을 연구하였으며 염증에 관련된 다양한 단백질 발현을 측정하였다.</p> <h2>iNOS,COX-2의 단백질 발현 저해 효과</h2> <p>iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증 반응을 촉진 시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져있다. COX는 cyclooxygenase와 peroxidase 활성을 모두 가지고 있는 효소이다. Cyclooxygenase 기능으로서 arach-idonic acid를 prostagland로 변환하고, peroxidase기능으로서는 endoperoxide를 prostaglandin로 변환시키며, prosta-glanin는 prostaglandins, thromboxane 및 prostacyclins의 전구체로 사용된다.COX-1은 모든 세포에 존재하면서, 정상세포의 항상성을 유지하며, COX-2는 급성염증반응에서 prosta-gladins의 합성에 관여하고, LPS 및 cytokine에 의해 발현이 유도된다. 울릉도 자생식물 추출물에 의한 NO 생성 저해 기전을 확인하기 위해 western blot을 실시하여 iNOS의 단백질 발현을 측정하였으며, \( PGE_ { 2 } \)의 형성 저해 기전을 확인 하기 위해 western blot을 이용하여 COX-2 의 발현을 측정하였다. 그 결과 LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 양이 농도 의존적으로 유의성 있게 감소되며, \( \beta \)-actin의 band density 비율에 따라 iNOS 단백질 생성을 \( 60 \% \)와 COX-2의 단백질 발현을 \( 60 \% \) 저해함을 확인 하였다. 이를 통해 울릉도 자생식물 추출물은 iNOS를 저해함으로써 NO 생성을 저해함을 알 수 있었으며 \( PGE_ { 2 } \)의 합성 억제를 나타내는 것은 COX-2의 활성 저해에 의한 것임을 알 수 있었다.</p> <h1>초록 : 곰취(Ligularia fischer), 미역취(Solidago virga-aurea), 삼나물(Aruncus dioicus) 복합 추출물의 항염증 효과</h1> <p>본 연구에서는 울릉도 특산 약용 작물 추출물이 항염증에 대한 실험연구가 이루어져 있지 않은 것에 착안하여 LPS에 의해 활성화된 대식세포로부터 유도되는 염증반응에 대한 억제효과를 조사하였다. 울릉도 자생 식물인 곰취, 미역취, 삼나물의 세가지 식물 추출물을 이용하여 피부 염증에 대하여 연구를 하였다. 산화질소와 cytokine의 생산은 면역세포의 대표적인 염증인자이다. 세포는 LPS 처리 후 한 시간 뒤에 곰취, 미역취, 삼나물 \( 70 \% \) 아세톤 추출물을 처리를 하였다. 세포 독성이 나타나지 않는 농도인 \( 1, 10, 100 \mathrm { ug } / \mathrm { ml } \)를 사용하였다. 곰취, 미역취, 삼나물 \( 70 \% \) 아세톤 추출물은 NO, PGE 2, \(TNF- \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6, iNOS, COX-2의 생성을 저해 시켰다. PGE는 100 \( \mathrm { ug } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 \( 60 \% \)에 가까운 저해율을 나타내었다. iNOS와 COX-2 역시 \( 100 \mathrm { ug } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 각각 \( 54 \% \), \( 65 \% \)가 저해가 되었다. 게다가 곰취, 미역취, 삼나물 \( 70 \% \) 아세톤 추출물은 염증성 사이토 카인인 \(TNF- \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 생성을 감소 시켰다. 이러한 결과로 곰취, 미역취, 삼나물 추출물은 염증 예방과 치료에 효과적임을 확인 할 수 있었다.</p>	생명
유산소 트레이닝과 식사조절 병행이 비만아동의 혈중지질과 아포지단백에 미치는 효과	<h3>유산소 트레이닝 프로그램 및 식사 조절</h3> <p>유산소 트레이닝 프로그램은 등산과 축구 및 농구 드리블 을 최대심박수(HRmax)의 60-70%의 강도로 1 일 100 분 내외, 주 5회, 9주간 실시하는 것으로 구성하였다. 등산은 아침에 초등학교 부근 야산 등산로를 이용하여 40 분간 실시하였고, 축구와 농구 드리블 운동은 운동 전.후에 각각 5 분 내외의 가볍게 걷기 및 스트레칭을 준비운동과 정리운동을 포함하 여 학교 운동장에 앞뒤 간격은 \( 3 \mathrm { ~m } \) 옆 간격은 \( 4 \mathrm { ~m } \) 로 하여 2줄로 평행하게 각각 7 개씩 총 14 개의 포인터를 설치하여 왼 쪽에서 출발하여 지그재그 드리블로 14 개의 포인터를 통과 하는 방법으로 2 가지 운동을 60 분간 실시하였다. 1 주일간의 적응기간을 두어 피험자들이 농구와 축구 드리블의 기본동 작을 익히게 하였으며, 목표 심박수 범위 대에서 운동을 수 행할 수 있도록 하기 위해 X-trainer (Polar. Co. Finland)를 이용하여 자신의 목표심박수 범위를 인식할 수 있게 하였으 며, 축구와 농구 드리블은 체육전공 보조자와 연구자가 함께 지도하였다.</p> <p>식사 조절은 한국인 남자 10-12세에게 권장되는 1일 영양 권장량 \( 2,200 \mathrm { kcal } \) 에 준하는 \( 2,100 \mathrm { kcal } \)를 피험자들에게 필요 한 필수영양소를 충분히 포함시킨 9주간의 식단(탄수화물 \( 65 \% \), 지방 \( 20 \% \), 단백질 \( 15 \%) \) 을 전문영양사의 도움을 받아 작성하여 제공하였다(한국영양학회, 2000).</p> <h2>자료 처리</h2> <p>수집된 자료는 SPSS Ver. \( 12.0 \) 패키지를 이용하여 각 측정 항목에 대한 평균값 \( ( \mathrm { M } ) \) 과 표준편차(SD)를 산출하였다. 프로 그램 실시에 따른 사전과 사후 평균치 변화 대한 차이검정은 paired t-test를 이용하였으며, 통계적 유의수준은 \( \alpha = 0.05 \) 로 하였다.</p> <h1>연구 결과</h1> <h2>혈중지질과 지단백의 변화</h2> <p>9주간 프로그램 실시에 따른 혈중지질과 지단백의 변화결과는 Table 2와 같다. \( \mathrm { TC } ( \mathrm { p }<0.05) \) 와 \( \mathrm { TG } ( \mathrm { p }<0.01) \) 농도는사전에 비해 사후에 각각 \( 29.4,14.9 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 감소하였으며, \( \mathrm { HDL-C } ( \mathrm { p }<0.001) \) 농도는 사전에 비해 사후에 \( 7.2 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 증가하였고, \( \mathrm { TC } / \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 비 \( ( \mathrm { p }<0.001) \) 는 \( 3.5 \pm 0.5 \) 에서 \( 2.5 \pm 0.3 \) 으로감소하였으나 LDL-C \( ( \mathrm { p } >0.05) \) 농도는 변화가 없는 것으로 나타났다.</p> <p>한편 Apo A의 이 같은 감소는 Woof-May 등이 걷 기운동을 18 주간 실시한 결과 감소하였다는 보고와는 유사 하였으나, Williams 등이 식사조절과 유산소성 운동을 실시한 결과 증가하였다는 보고와는 상반되었다. Apo AI 의 지단백 대사 측면에서 볼 때 이 같은 감소 결과는 긍정적인 변화를 가져온 것으로 해석할 수 있지만, 아직 Apo AI의 대사적 기능과 \( \mathrm { CHD } \) 에 미치는 작용에 대한 연구가 진행 중에 있음으로 본 연구결과를 뒷받침할 후속연구가 더 필요 한 것으로 생각된다.</p> <p>Apo B는 Apo B-48과 Apo B- 100 의 2가지 형태가 있지만 일반적으로 2가지를 합친 총 Apo B 농도를 동맥경화성 질환을 평가하는 지표로 이용하고 있으며, \( \mathrm { LDL } \), 중간밀도지단백(IDL), 초저밀도지단백(VLDL) 입자를 구성하는 주요단백질로 LDL 수용체에 LDL 입자를 결합시커 세포의 콜레스테롤 흡수를 돕는 작용을 한다. 또한 혈중 높은 Apo B 농도는 동맥경화증을 유발 악화시키는 주요인자로 알려져 있다.</p> <p>본 연구결과 \( \mathrm { Apo } \) \( \mathrm { B } \) 는 감소하였다. 이 같은 결과는 Crouse 등이 고콜레스테롤혈증 성인을 대상으로 유산소운동을 실시한 결과 Apo B가 감소하였다는 보고, Janseen 등 폐경전 비만여성을 대상으로 유산소성 운동과 식사제한을 실시한 결과 감소하였다는 보고와 유사하였다. 따라서 이 같은 결과는 유산소 트레이닝과 식사조절 병행이 성인의 경우와 유사하게 비만 남자아동들에게도 동맥경화성 질환의 예방에 효과적인 방법이 될 수 있음을 증명하는 결과라고 생각된다.</p> <p>Apo C는 CI, CI, CIII로 나누어지고 유미지립 (Chylomicron), VLDL, HDL-C를 구성하는 단백질이다. 이 중 Apo CI는 지단백리파제를 활성화시켜 \( \mathrm { TG } \) 의 가수분해를 자극하여 혈중 \( \mathrm { TG } \) 농도를 조절하는 것으로 알려져 있다. Apo CIII는 지단백 리파제의 활성을 억제함으로써 TG 분해과정을 지연시킴과 동시에 순환계에서 \( \mathrm { TG } \) 제거를 방해하여 혈중 \( \mathrm { TG } \) 농도를 증가시키며, 혈중 높은 Apo CIII 농도는 동맥화증의 발생 위험성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.</p> <p>본 연구결과 Apo C와 \( \mathrm { CII } \) 는 감소하였다. 이 같은 결과는 유산소성 트레이닝에 따른 변화를 연구한 선행연구가 아직 없어 운동에 따른 변화를 해석하는데 어려움이 있다. 그렇지만 Apo \( \mathrm { C } \) 와 \( \mathrm { CIII } \) 에 관련된 대사적 작용과 임상 사례군(case) 즉 \( \mathrm { CHD } \) 환자와 대조군(control) 즉 정상인을 대상으로 진행된 역학적 연구결과를 바탕으로 본 연구결과를 해석해 보고자 한다. 먼저 Apo CD의 변화는 대사적 측면에서볼 때는 부정적인 반응으로 해석 할 수 있지만, Geber 등이 임상 사례군으로 \( \mathrm { CHD } \) 환자 352명과 대조군으로 건강한성인 395명의 Apo CD 농도를 비교한 결과 사례군의 농도가 대조군보다 유의하게 \( (5.3 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \mathrm { vs } 4.2 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } ) \) 높았다는 보고를 고려해 볼 때는 긍정적인 반응이라고 볼 수도 있을 것 같다. 따라서 본 연구의 Apo CI의 변화는 아직 부정적 또는 긍정적 반응이라고 단정하기에는 의문점이 존재하는 것으로 생각된다. 다음으로 본 연구에서 Apo CIII가 감소한 결과는 Onat 등과 Geber 등이 CHD 임상 사례군과 대조군을 대상으로 실시한 연구결과 사례군이 대조군보다undefined 면에서도 Apo CIII의 감소는 바람직한 반응으로 볼 수 있으므로 긍정적인 결과라고 해석할 수 있을 것으로 생각된다. 하지만 아직 까지 Apo CIII에 대한 명확한 대사적 메커니즘이 밝혀지지 않은 상태이고 운동에 따른 반응에 대한 연구도 부족하기 때문에 해석에는 주의를 기울이 필요성이 있는 것 으로 생각된다.</p> <p>Apo는 여러 형태의 지단백을 구성하는 주요단백질로 인 체조직 수용체들의 리간드(ligand) 역할을 통한 지질의 운반 및 재분배 기능과 지단백 대사에 관련된 여러 효소들의 활성 을 촉진 또는 억제시키는 조효소 작용을 하는 것으로 알려져 있다[8]. Apo A는 A I, AII, AIV로 나누어지고 HDL-C를 구성하는 주요단백질이다. 이 중 Apo A I 은 HDL-C와 정적인 상관관계가 있으며 Apo A I 의 발현정도는 혈중 HDL-C 농도를 결정하고, 인체조직의 지나친 콜레스테롤의 제거와 \( \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 에 콜레스테롤을 이동 - 결합시켜 간으로 역수송시키 는 기능을 지닌 lecitin cholesterol acly transferase (LCAT)를 활성화시키는 조효소 작용을 한다. 한편 Apo AII는 형질전환 쥐(mice)를 대상으로 실시한 연구결과 간 리파제와 지단백 리파제의 활성을 억제시켜 혈중 TG 농도는 증가시키 고 \( \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 농도는 감소시키는 기능을 하는 것으로 밝혀졌으며, 지단백 대사과정에서 Apo AП는 동맥경화를 예방하 는 작용은 없으며 적어도 \( \mathrm { CHD } \) 의 발병과 관련하여 그 농도 의 증가는 오히려 해롭다고 하였다.</p> <p>본 연구결과 Apo A I 과 A II 감소하였고, Apo A I / A II 비는 감소하였지만 통계학적인 유의성은 없었다. Apo A \( \mathrm { I } \) 의 이 같은 감소는 선행 연구결과 유산소 트레이닝 후 증가하였다는 보고, 변화가 없었다는 보고 및 감소하였다는 보고가 있어 운동에 따른 반응이 일치하고 있지 않지만, 대사적인 측면에서 Apo A I 의 항 동맥경화 작용을 고려해 볼 때 부정적인 결과로 해석할 수 있다. 일반적으로 Apo AI 는 정상인의 경우 유산소성 트레이닝에 의해 합성작용(synthesis)은 증가하고, 이화작용(catabolism)은 감소하여 증가하는 것으로 알려져 있다. 아직 비만아동을 대상으로 Apo A I 역동성(kinetic)을 연구한 결과는 없지만 고중성지방혈증을 지닌 성인의 경우 이들의 Apo A I 합성속도가 정상인보다 느리다는 보고와 비만성인과 정상인을 대상으로 Apo A I 역동성을 비교한 결과 비만인이 정상인들보다 Apo AI 의 합성속도와 분획의 이화속도가 유의하게 빠르고, 또한 비만인은 Apo A I 합성속도에 비례하여 과다이화반응(hypercatabolism)을 보이는 것으로 나타나 비만인의Apo AI 농도를 결정하는 인자는 합성속도라는 것이 밝혀졌다. 따라서 본 연구의 Apo A I 의 감소는 Apo AI 의합성속도와 관련이 있을 것으로 추정되지만 현재로는 비만아동에 관련된 자료는 부족한 실정이다.</p> <p>유산소 트레이닝 또는 유산소 트레이닝과 식사조절을 병 행한 프로그램의 실시에 따른 혈중지질과 지단백 반응에 대 한 연구는 성인과 아동 및 청소년에 있어서는 다수 보고되었 지만, 혈중 \( \mathrm { Apo } \) 의 반응에 대한 연구는 성인의 경우는 몇 편의 연구가 실시되었으나 아동의 경 우는 Ferguson 등이 연구한 것을 제외하면 매우 미흡한 실정인데 대부분의 연구가 Apo A I, AD, B, Apo A I / AD ratio, Apo B/A I ratio의 변화를 비교 분석 하였을 분 Apo CⅡ와 CⅢ의 변화를 비교분석한 연구결과는 아직 없다. 따 라서 본 연구는 9주간 유산소 트레이닝과 식사조절을 병행 한 체중조절 프로그램을 초등학교 비만 남학생에게 적용하여 이들의 혈중지질과 지단백 및 \( \mathrm { Apo } \) 에 미치는 효과를 규명하기 위해 실시하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>연구 대상</h2> <p>본 연구의 대상은 초등학교 4,5 학년 남학생 중 연령과 성 별에 따른 체질량지수 백분위수가 95 이상( 10 세: \( \geq 22.7,11 \)세: \( \geq 23.9 \mathrm { ~kg } / \mathrm { m } ^ { 2 } \); 대한아소과학회, 1998)에 해당하는 비만아동으로서 본 연구의 취지와 실험내용에 동의한 지원자 가운데 부모의 동의를 받아 건강상태를 전문의의 문진을 실시하 여 이상이 없다고 판정된 16 명으로 하였다. 실험 시작 전 6 개월 이내에 규칙적인 운동에 참여하였거나 비만 관련합병증으로 치료를 받고 있는 학생은 본 연구에서 제외하였다. 이들은 실험 기간 9주 동안 합숙생활을 하였으며 대상자들의신체적 특징은 Table 1 과 같다.</p> <h2>측정 항목 및 방법</h2> <h3>인체 측정</h3> <p>신장은 이동식 신장계를 이용하여 \( 0.1 \mathrm { ~cm } \) 단위까지, 체중 은 디지털체중계(CASS digital. Korea)를 이용하여 \( 0.1 \mathrm { ~kg } \) 단 위까지 측정하였으며, 체질량지수는 체중 \( ( \mathrm { kg } ) \) 을 신장의 제곱 값 \( \left ( \mathrm { m } ^ { 2 } \right ) \) 으로 나누어 구하였다.</p> <h3>혈 액 검사</h3> <p>12시간 이상 공복 상태에서 전완 주정맥으로부터 정맥혈 \( 10 \mathrm { ml } \) 를 채혈하여 자동혈 액분석기(Hitachi 736-20, Japan)를이용하여 \( \mathrm { TC } , \mathrm { TG } , \mathrm { LDL } - \mathrm { C } \) 농도는 효소비색법으로, \( \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 농도는 침전법으로 분석하였으며, Apo A I 과 B는 micropippet을 이용하여 면역비탁법으로, Apo AⅡ, CⅡ, CIII는 small test tube를 이용하여 면역확산법으로 분석하였다. 모든 혈액 검사 는 S 임상검사센터에 의뢰하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>오늘날 사회 . 경제적 여건의 향상과 영양과잉 및 신체활 동부족 등에 의해 비만아동과 청소년들이 선진국과 개발도 상국을 가릴 것 없이 증가함에 따라 세계적인 문제로 대두되 고 있다. 비만아동의 경우 이들의 약 \( 40 \% \) 정도가 성인이 되어서도 여전히 비만상태에 머물고, 이상지혈증, 고혈 압, 제2형 당뇨병과 같은 관상동맥 심장질환(coronary heart disease; CHD) 위험인자의 발병 위험을 증가시킨다. 이 같은 비만아동의 \( \mathrm { CHD } \) 발병 위험성은 부검연구를 통해 동맥 경화성 병변과 소인이 확인됨으로서 입증되었다.</p> <p>Freedman 등이 Bogalusa Heart Study (1973 1994)의 5-17세 사이의 아동과 청소년 9,167명의 자료를 바탕으로 \( \mathrm { CHD } \) 위험인자와 과체중 및 비만과의 관련성을 분석한 결과 체질량지수 백분위수(body mass index; BMI) 85이상인 아동과 청소년의 총 콜레스테롤(total cholesterol; TC), 저밀도지단백 콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol; LDL-C),고밀도지단백 콜레스테롤(high density lipoprotein cholester-ol; HDL-C), 중성지방(triglyceride; TG), 혈압이 정상아동과청소년보다 비정상적인 수치를 나타낼 위험성(odds ratio)이각각 \( 2.4,3.0,3.4,7.1,4.5 \) 배 높은 것으로 나타났다. 더군다나보다 최근의 연구결과에 따르면 BMI가 99이상인 고도 비만아동은 이들의 \( 59 \% \) 가 2가지 이상의 \( \mathrm { CHD } \) 위험인자를 가지고 있으며 매우 위험한 인체의 생화학적 이상을 보이고, 고도 성인비만의 증상을 나타내는 것으로 밝혀져 매우 적극적인 아동비만 처치의 필요성이 제기되고 있다.</p> <p>Epstein과 Goldfield 는 아동비만의 예방과 치료에는 규칙적인 운동과 함께 식사조절 및 행동수정요법이 중심이 되어야한다고 하였다. 특히 유산소 트레이닝은 비만아동과 청소년 및 비만성인의 혈중지질과 지단백인 \( \mathrm { TC } , \mathrm { TG } \), HDL-C, LDL-C 등을 바람직한 방향으로 조절 . 개선시켜 순 환계 질환을 예방할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 한편 Leon과 Sanchez 는 운동 또는 운동과 식사조절을 병행한 프로그램 실시에 따른 혈청지질과 지단백의 반응에 대한 메 타분석 연구에서 일반적으로 TC, LDL-C의 감소를 동반한 \( \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 의 증가현상을 보인다고 하였지만, 개선정도는 일치 하지 않았고 용량-반응(dose- response)의 관련성은 없었다 고 하였다.</p> <p>지난 30여 년간 높은 \( \mathrm { TC } \) 농도 그 중 특히 높은 \( \mathrm { LDL-C } \) 농 도가 \( \mathrm { CHD } \) 의 발병에 있어 주요 위험인자로 인식되어져 왔지 만 최근 여러 연구결과 지단백의 기능과 대사에 대한 이해가 확대되면서 \( \mathrm { LDL-C } \) 농도가 동맥경화성 \( \mathrm { CHD } \) 발병에 관련된 유일한 주요 예측인자가 아님이 확인되었으며, 또한 Alaupovic 는 \( \mathrm { CHD } \) 의 예측에 있어 전통적인 위험인자인 \( \mathrm { TC } \), TG, HDL-C, LDL-C의 농도를 측정하는 것보다 혈중지질과 지단백을 구성하는 아포지단백(apolipoproteins; Apo) 들의 농도를 측정하는 것이 그 예측력이 더 높다고 하였다.</p> <h2>혈중 Apo의 변화</h2> <p>9주간 프로그램 실시에 따른 혈중 Apo의 변화 결과는Table 3과 같다. Apo AI ( \( p<0.001) \), AII ( \( p<0.01) \), B ( \( p<0.001) \), \( \mathrm { CII } ( \mathrm { p }<0.05), \mathrm { CIII } ( \mathrm { p }<0.01) \) 의 농도는 모두 사전에 비해 사후 에 각각 \( 86.9,6.8,40.9,1.1,1.2 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 감소하였으며, Apo A \( \mathrm { II } / \mathrm { AI } \) 와 Apo B/A I 비는 감소하였지만 유의성은 없는 것 으로 나타났다.</p> <h2>고 찰</h2> <p>규칙적인 유산소성 운동에 따른 혈중지질과 지단백에 미치 는 영향은 잘 알려져 있다. 일반적으로 \( \mathrm { TC } \) 는 트레이닝에 의해잘 감소하지 않으며 기저 농도나 운동 기간에도 영향을 받지 않는 것으로 보고되고 있지만, 체중과 체지방의 감량 및 식이성 지방 섭취량의 감소와 더불어 유산소성 트레이닝을 실시한 경우에는 감소하기도 한다. \( \mathrm { TG } \) 는 일반적으로 유산소성트레이닝에 의해 감소하며 특히 기저 농도가 높았던 비활동적인 사람들에서 더 많이 감소하는 것으로 알려져 있다. \( \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 는 에너지소비량과 비례하여 증가하는 것으로 알려져있지만 항상 증가하는 것은 아니며, 식사조절과 병행하여 체중과 체지방량이 감소하는 경우에는 더 증가하는 것으로알려져 있다. LDL-C는 전통적인 \( \mathrm { CHD } \) 위험인자로서 고지방 식사를 하는 이들에게서 높게 나타나며, 일반적으로 잘 감소하지 않지만 그렇지 않는 경우도 있다.</p> <p>본 연구결과 TC, TG, TC/HDL-C비는 감소하였고 HDL-C 는 증가하였으나 LDL-C는 변화가 없었다. 이와 같은 결과를 Sasaki 등이 비만아동을 대상으로 유산소성 운동을 실시 한 결과 \( \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 는 증가하였으나 TC, TG는 변화가 없었다는 보고, Becque 등이 비만청소년을 대상으로 운동과 식사조 절을 병행한 프로그램을 실시한 결과 \( \mathrm { HDL } - \mathrm { C } \) 는 증가하였지 만 TC, TG, LDL-C는 변화가 없었다는 보고, Tolfrey 등 이 초등학생들을 대상으로 12 주간 유산소성 운동을 실시한 결과 TC, TG, LDL-C, HDL-C 모두 변화가 없었다는 보고 와 비교해 볼 때, 유산소성 운동 단독 또는 유산소성 운동과 식사조절을 병행한 프로그램 실시에 따른 혈중지질과 지단백 의 반응이 서로 일치하지 않음을 알 수 있다. 이 같은 반응의 차이는 일상생활에서의 신체활동의 정도, 트레이닝의 양, 체지방률, 운동 강도, 기저 지질과 지단백의 농도 차이, 식사조절, 유전적 요인 등에 영향을 받기 때문인 것으로 알려져 있다. 그렇지만 Epstein과 Goldfield 가 비만아동을 대상으로 체중 조절 프로그램을 적용한 연구들을 고찰한 연 구에 의하면 적절한 식사 조절을 병행한 운동프로그램이 운 동만 실시한 프로그램보다 혈중지질 반응이 더 긍정적이었 다고 하였다. 따라서 본 연구의 이 같은 결과는 비만아동일 경우라도 규칙적인 운동과 이들의 성별과 연령에 따른 1 일 영양권장량에 준하는 에너지섭취 \( (2,100 \mathrm { kcal } ) \) 가 체중감량 과 더불어 \( \mathrm { CHD } \) 위험인자인 혈중지질과 지단백에 긍정적인 효과를 미칠 수 있음을 확인하였다.</p>	생명
발효 대두 식품의 Superoxide dismutase(SOD) 활성	<h2>Superoxide dismutase(SOD) 활성 측정</h2> <p>SOD의 활성 측정은 Fridovich 방법에 준해서 측정하였다. Xanthine/xanthine oxidase 반응으로 생성된 sup-eroxide anion에 의해 cytochrome c가 환원되는 것을 측정하였고, SOD에 의하여 superoxide anion의 양이 감소하여 cytochrome c의 변화속도가 감소하는 것으로 SOD 활성을 측정하였다.</p> <p>Cyochrome c, \( 38 \mathrm { mg } \), \(2 \mu \mathrm { M } \) xanthine \( 10 \mathrm { ~mL } \)( \(0.001 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \)), \(50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH 7.8 } \), \(0.1 \mathrm { mM } \) EDTA) \( 100 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합한 기질액 \( 2 \mathrm { ~mL } \) 에 희석한 시료를 넣고 2분간 안정화 시킨 후 xanthine oxidase ( \( 0.2 \mathrm { unit } / \mathrm { mL } \), \( 0.1 \mathrm { mM } \) EDTA) \( 50 \mu \mathrm { L } \) 를 cuvette에 넣고 혼합하여 spec-trophotometer(UV-2100, Shimagu cO. Japan)를 이용하여 \( 550 \mathrm { ~nm } \) 에서 2분간 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Peroxide value(POV) 측정</h2> <p>시료의 지질 과산화물 생성 억제 효과를 linoleic acid를 기질로 사용하여 Nose의 방법에 따라 POV를 측정하였다. Linoleic acid \( 100 \mu \mathrm { L } \) 와 각 시료 ( \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \)) \(10 \mu \mathrm { L } \)를 \( 1.6 \mathrm { ~cm } \times 6 \mathrm { ~cm } \) 의 시험관에 넣어 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온기에서 24시간 저장하여 산화를 촉진시킨 후 chloroform/acetic acid( \(2:3, \mathrm { v } / \mathrm { v } \)) \(35 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하고 1분간 격렬하게 혼합한 후 암소에서 5분간 방치시키고, 여기에 증류수 \( 75 \mathrm { ~mL } \) 와 전분 시액 \(1 \mathrm { mL } \) 를 첨가하고, \( 0.01 \mathrm { ~N } \) sodium thiosulfate 용액으로 요오드를 역적정하여 POV를 측정하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>대두(Glycine var Merrill)를 수세하고 선별 한 후 \( 105 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20분간 증자 한 후 Bacillus sp. BH-99를 접종한 다음 \( 38 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3일간 배양한 후 동결 건조한 후 분말로 만들어 저온에 보관하였다. 이때 사용한 배지조성은 \( 0.5 \% \) glu-cose, \( 0.5 \% \) polypeptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.02 \% \) \( \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \), \( 0.002 \% \) \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \), \(0.001 \% \) \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \(0.001 \% \) \( \mathrm { MnSO } _ { 4 } \cdot 5 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 를 증류수에 녹여 멸균한 후 사용하였다. 시료분말을 \( 80 \% \) 메탄올로 추출한 후 여과한 다음 농축하여 시료로 사용하였다.</p> <p>Catechin 및 quercetin은 Aldlich Co.에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>실험 동물 및 사료 조성</h2> <p>본 실험에 사용된 Sprague-Dawley(SD)계 수컷 rat는 화학 연구소에서 분양받아 2주 이상 실험 사육장의 환경에 적응시킨 후 7마리씩 4군으로 나누어 삼양 유지의 기본사료(control group)로써 사육하면서 데두 발효식품 농축액을 SD계 rat에 하루 200 및 \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 씩 각각 사료에 첨가하여 사육하였다. SD 수컷 rat는 몸무게 \( 200 \sim 220 \mathrm { g } \)의 암컷, 8주령 되는 것을 사용하였고, 동물 사육실은 항온 항습 ( \( 22 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(65 \pm 2 \% \mathrm { RH } \)) 하에서 삼양유지의 마우스용 pellets 사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 하고, 12시간 cycle의 조건하에서 실험하였다.</p>	생명
마디풀 추출물의 세포 보호 효과 및 주성분 분석	<h2>루미놀 발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-EDTA \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에 있어서 활성산소 소거 활성(총항산화능)</h2> <p>\( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에서는 \( \mathrm{Fe}^{3+} \)-EDTA의 촉매 작용으로 대부분의 \( \operatorname{ROS}\left(\mathrm{O}_{2}^{{ }^{--}}, \cdot \mathrm{OH}, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 가 생성된다. 이렇게 생성 된 ROS의 검출은 루미놀을 첨가하여 ROS와 루미놀이 반응할 때 방출되는 화학발광으로 측정할 수 있다. ROS 소거 활성은 루미놀-의존성 화학발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에서 측정하였다. 화학발광 측정용 튜브에 증류수 \( 1.78 \mathrm{ml} \) 를 넣고 다양한 농도의 추출물을 넣었다. 여기에 \( 2.5 \mathrm{mM} \mathrm{EDTA} 40 \mu \mathrm{l} \) 및 \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{FeCl}{ }_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 10 \mu \mathrm{l} \) 을 가한 후 \( 35 \mathrm{mM} \) 루미놀 \( 80 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 흔들어 섞어 주었다. 이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 5min 동안 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 로 항온시킨 후 \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{H} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} 40 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 화학발광을 25min 동안 측정하였다. ROS 소거 활성 \( \left(\mathrm{OSC}_{50}\right) \) 은 ROS 의 \( 50 \% \) 가 소거되는데 필요한 시료의 농도로 정의된다.</p> <h2>Photohemolysis 법을 이용한 세포보호 효과 측정</h2> <p>적혈구 현탁액 제조: 사람으로부터 얻은 피는 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5 min 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다. 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer 적혈구 현탁액(15.0 million cells \( / \mathrm{ml} \) )을 준비하기 위해서 \( \mathrm{pH} \) 7.4, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \). \( 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 9.6 \mathrm{mM}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1.6 \mathrm{mM} \) 로 세척하여 원심분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 모든 실험은 채혈 후 12 h 이내에 행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D.가 0.6 이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 이었다.</p> <p>마디풀 추출물의 광용혈 억제 효과: 적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm{ml} \) 를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 추출물을 농도별로 각각 \( 50 \mu 1 \) 씩 첨가하였다. 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal \( (12 \mu \mathrm{M}) 0.5 \mathrm{ml} \)를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사 하였다. 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \mathrm{~cm} \times 20 \mathrm{~cm} \times \) \( 25 \mathrm{~cm} \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm{~W} \) 형광등을 장치하고, 형광등 으로부터 \( 5 \mathrm{~cm} \) 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험 관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 \( 15 \mathrm{~min} \) 간격으로 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 투광도(transmittance, \%)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비 례한다. 모든 실험은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 항온실에서 행하였다. 마디풀 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시 간인 \( \tau_{50} \) 을 구하여 비교하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>기기 및 시약</h2> <p>UV-visible spectrophotometer는 Varian (Astralia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT, 적혈구 광용혈에 사용한 pectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, \( \mathrm{pH} \) meter는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다. 마디풀 성분분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet silica gel 60 F254 \( (0.2 \mathrm{~mm}) \) 로 Merck (USA)에서 구입하였고, HPLC는 Shimadzu (Japan)사의 제품을 사용하였다. LC/ESIMS (Applied Biosystems, USA)는 서울대학교 농생명과학공동 기기원에 분석 의뢰하였다.</p> <p>(+)- \( \alpha \)-Tocopherol (1,000 IU vitamin \( \mathrm{E} / \mathrm{g}) \), L-ascorbic acid, EDTA, 루미놀, 혜파린, 증감제로 사용된 rose-bengal, 자유 라디칼 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea) 제품을 사용하였다. 완충용액제조에 사용된 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \). \( 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{NaCl} \), 그리고 에탄올(EtOH), 메탄올 \( (\mathrm{MeOH}) \), 에틸아세테이트(EtOAc) 등 각종 용매는 시판특급 시약을 사용하였다. 본 실험에 사용한 건조된 마디풀은 경동시장으로부터 구입하였다.</p> <h2>마디풀의 추출 및 용매 분획</h2> <p>건조된 마디풀 \( 500 \mathrm{~g} \) 을 잘게 자른 후 \( 50 \% \) 에탄올 \( 5 \mathrm{~L} \) 를 이용하여 추출하였다. \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 감압 농축한 후 물과 헥산을 이용하여 비극성 성분을 제거하고 이후 에틸 아세테이트 분획을 감압-농축하여 파우더를 얻었다. 또한, 에틸 아세테이트 분획에서 아글리콘 분획을 얻기 위해 산 가수분해 반응을 이용하였다. 실험방법은 에틸 아세테이트 가용분 일정량에 \( 5 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 및 아세톤 용액을 넣고 4h동안 중탕 가열하면서 환류 - 냉각시킨다. 환류 시킨 용액을 \( 5 \% \mathrm{KOH}-\mathrm{MeOH} \) 용액으로 중화 적정한다. 중화 적정 후 다시 에틸 아세테이트 층을 분획하고 이를 감압-농축하여 얻 어진 아글리콘 파우더를 \( 100 \% \) 에탄올에 녹여 실험에 사용하였다.</p> <h2>DPPH 법을 이용한 자유라디칼 소거 활성</h2> <p>자유 라디칼은 피부노화의 주된 원인으로 알려져 있다. 따라서 마디풀 추출물에 대한 자유라디칼 소거활성 측정 은 DPPH 를 이용하였다. 자유 라디칼 소거 활성은 1,1- diphenyl-2-picrylhydrawyl (DPPH)를 사용하여 변형된 방법으로 측정하였다. 실험방법은 메탄올에 용해시킨 \( 0.2 \mathrm{mM} \)DPPH 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 에탄올 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 첨가하고 여러 농도의 추출물 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 섞은 다음 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10min 동안 방치 후 자유 라디칼의 양을 분광광도계로 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 소거 활성 \( \left(\mathrm{FSC}_{50}\right) \) 은 자유 라디칼이 \( 50 \% \) 소거되는데 필요한 시료의 농도로 정의된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>태양광선에 노출된 피부에서는 자외선의 작용으로 활성산 소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다. 따라서 ROS로 유도된 피부의 광산화적 손상 위험은 실질적으로 증가하고 있다. ROS의 종류에는 singlet oxygen \( \left({ }^{1} \mathrm{O}_{2}\right) \), superoxide anion radical \( \left(\mathrm{O}_{2}{ }^{\circ}\right) \), hydroxyl radical \( (\cdot \mathrm{OH}) \) 그리고 hydrogen peroxide \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 등이 포함된다. 이들은 광증감반응 및 몇 가지 효소반응을 포함하는 다양한 과정을 거쳐서 세포 및 조직 중에서 생성된다. 생체 내에서 ROS의 과도한 생성은 염증, 돌연변이, 발암 그리고 콜라젠과 엘라스틴의 분해와 같은 단백질의 변성을 유발함으로써 피부 노화를 가속화시킨다. 특히 \( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 은 \( \cdot \mathrm{OH} \) 과 함께 ROS 중에서 반응성이 가장 큰 활성산소종으로 알려져 있으며, 사람 피부 세포에 있어서 지질과 산화물의 생성, 단백질 산화 및 DNA 손상 뿐 만 아니라 UV-A (320-380 nm) 의존성 세포 사멸이나 유전자의 활성화에도 \( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 등이 포함되는 것으로 기술되고 있다. 콜라젠은 피부 진피 층의 매트릭스를 이루는 성분 중 가장 많은 성분이기 때문에 콜라젠의 생합성과 분해의 조절은 피부노화 과정에서 핵심이 되고 있다. 특히 사람 피부 섬유아세포에서 \( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 을 비롯한 ROS는 MMPs (matrix metalloproteinase)의 발현을 유발시키며, UVA로 유도된 MMP-1 (collagenase)의 합성을 \( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 이 매개할 수 있다고 보고되고 있다. 이는 광노화를 방어하고 자외선으로부 터 보호제를 개발하는데 있어서 \( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 을 포함하는 ROS 의 중 요한 역할을 시사하는 것이다. 따라서 이들 ROS가 광노화에 포함되기 때문에, 자외선 노출 후 항산화제에 의한 ROS의 감소는 피부 광노화를 예방하고 최소화시키기 위한 촉망되는 전략임은 분명하다.</p> <p>마디풀속(Polygonum)에 속하는 P. aviculare은 북반구 여러 곳에서 발견할 수 있으며 한국에서는 예로부터 마디풀 전초를 건조하여 황달, 복통, 혈뇨증 및 고혈압을 위한 천연 약재로 사용해 왔다. 항염 등의 활성을 갖는 마디풀의 성분으로는 quercetin 등이 보고되었고, 그 외에 항산화 및 항균 활성 등도 알려져 있다. 그러나 피부 광노화에 있어서 중요한 활성산소인 \( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 으로 유도된 세포손상에 있어서의 세포 보호 작용이나 다양한 ROS가 생성되는 계에서 이들 ROS에 대한 총항산화능에 관한 연구는 아직 되어 있지않다. 따라서 본 저자들은 마디풀 추출물의 flavonoid 분획을 제조하여 이를 대상으로 활성산소 유래 세포막 손상에 대한 보호작용, 총항산화능 및 항노화 활성을 평가하고자 하 였고, 그 활성 성분들을 밝힘으로서 마디풀 추출물을 항산화제 및 기능성 화장품 원료로서의 이용 가능성을 검토하였다.</p> <h1>마디풀 추출물의 성분분석</h1> <p>마디풀 추출물의 플라보노이드 성분을 동정하기 위하여 TLC, HPLC, LC/ESI-MS/MS 및 NMR을 이용하여 분석하였다.</p> <p>TLC 및 HPLC를 이용한 마디풀 추출물의 플라보노이드 분석: TLC 분석에서 전개용매는 에틸 아세테이트 분획의 경우 ethyl acetate:chloroform:formic acid:distilled water = 8: 1: 1: 1, 그리고 아글리콘 분획의 경우 n-hexane: ethyl acetate:acetic acid =21: 14: 1 을 사용하였다. 성분 확인은 플라보노이드 표준물질의Rf 수치와 발색법을 이용한 색상 등으로 확인하였다. HPLC 분석은 \( 2 \% \) acetic acid와 \( 0.5 \% \) acetic acid ( \( 50 \% \) acetonitrile)을 기울기 용리법으로 분리하였고, 이때, HPLC 분리조건은 Table 1 에 나타내었다. 또한, 마디풀 추출물의 성분 분석을 위하여 TLC로 분리된 각각의 띠를 긁은 후 \( 50 \% \) 에탄올로 추출, 여과한 뒤 감압 농축하여 파우더를 얻었다. 이 때 얻어진 파우더 중 일부는 \( 100 \% \) 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Millipore, \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) ) (Chemco Scientific, Japan)로 여과하여 HPLC 분석에 사용 하였다.</p> <p>HPLC 및 LC/ESI-MS를 이용한 마디풀 추출물의 플라 보노이드 분석: LC 분석에 Agilent Model 1100 (Waldbronn, Germany)을 사용하였다. 컬럼은 Pursuit XRs C18 ( \( 2 \times \) \( 50 \mathrm { ~mm } , 3 \mu \mathrm { m } \) ) (Varian, USA)을 사용하였다. 이동상은 \( 0.5 \% \) formic acid (distilled water): \( 50 \% \) formic acid (MeOH: Acetonitrile \( =5: 5)=2: 8 \) 로 하였으며, 유속은 \( 200 \mu \mathrm { J } / \mathrm { min } \) 으로 하였다. MS/MS 분석은 ionspray source을 사용하였고, negative ion model로 capillary voltage 는 \( -3500 \mathrm { ~V } \), nebulizer gas \( \left ( \mathrm { N } _ { 2 } \right ) 10 \) (arbitrary units), collision gas \( \left ( \mathrm { N } _ { 2 } \right ) \) 그리고 ion source temperature는 \( 400 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 행하였다. H-NMR 기기 분석은 Mercury 400 (Varian, USA)를 사용하였으며, 분석 용매는 deuterated methanol \( \left ( \mathrm { CD } _ { 3 } \mathrm { OD } \right ) \) 를 사용하였으며, 내부 표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 기준점 \( \left ( \mathrm { Si } \left ( \mathrm { CH } _ { 3 } \right )_ { 4 } , \delta=0 \right ) \) 으로 하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3 회 반복하였고 통계분석은 \( 5 \% \) 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>DPPH법을 이용한 자유라디칼 소거 활성</h2> <p>마디풀 추출물에 대한 자유라디칼 소거활성 측정은 1,1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical을 이용하였다. 마디풀 추출물 그리고 비교물질인 (+)- \( \alpha \)-tocopherol의 자유 라디칼 소거활성 \( \left(\mathrm{FSC}_{50}\right) \) 측정 결과는Table 2 와 같다. 마디풀 추출물의 에틸 아세테이트 분획의 \( \mathrm{FSC}_{50} \) 은 \( 5.25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), 아글리콘 분획은 \( 5.92 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 을 나타냈으며 이는 비교 물질인 (+)- \( \alpha \)-tocopherol \( (8.98 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 보다도 더 큰 라디칼 소거활성을 나타냈다.</p> <h2>루미놀 발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에 있어서 활성산소 소거 활성(총항산화능)</h2> <p>\( \mathrm{Fe}^{3+} \)-EDTA \( / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계를 이용한 총항산화능 실험 결과, 마디풀 추출물의 활성산소 소거활성 \( \left(\mathrm{OSC}_{50}\right) \) 은 Table 2 에 나타내 었으며 에틸 아세테이트 분획은 \( 0.07 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), 아글리콘 분획은 \( 0.09 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 로 나타났다. 총항산화능은 에틸 아세테이트 분획이 당을 제거시킨 분획보다 높게 나타났다. 모두 비교물질로 사용한 L-ascorbic acid \( (1.50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 보다 큰 소거활성을 보였으며, 결과적으로 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획이 free radical에 대한 매우 큰 환원력이 있음을 알 수 있었다.</p> <h2>\( { }^{1} \mathrm{O}_{2} \) 으로 유도된 사람 적혈구의 파괴에 대한 세포보호 효과</h2> <p>마디풀 추출물의 활성산소에 의한 세포손상에 있어서 보호 효과를 측정한 결과를 Table 3 에 나타내었다. 적혈구 세포가 \( 50 \% \) 파괴되는데 걸리는 시간 \( \left(\tau_{50}\right) \) 은 세포보호활성이 클수록 크게 나타난다. 에틸 아세테이트의 분획의 경우\( 1,5 ,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 농도 의존적으로 세포 파괴를 억제하 였다 (\( \tau_{50} \) 43.69,190.07,314.70 min ). 당을 제거시킨 분획의 세포보호 효과는 \( 1,5,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( \tau_{50} \) 이 각각 50.28, 172.37,264.59min 으로 나타났다. 또한 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 에틸 아세테이트 분획, 그리고 당이 제거된 분획(아글리콘) 모두 비교물질로 사용한 지용성 항산화제인 (+)- \( \alpha \)-tocopherol 보다도 세포보호 효과가 매우 큼을 알 수 있었다.</p> <h3>PA5 (HPLC peak 2 of ethyl acetate fraction):</h3> <p>TLC와 HPLC를 통해 quercetin 배당체로 추정한 PA5 (HPLC peak2)의 LC/MS/MS를 측정하였다. LC/ESI-MS/MS를 이용하여 분석한 결과, negative ion 모드에서 분자 이온 \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)가 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} \) 433에서 나타났으며, glucoside 단위의 소실로 인한 이온 피이크 \( (\mathrm{m} / \mathrm{z} 433 \rightarrow \mathrm{m} / \mathrm{z} 301) \) 를 나타내었다. 또한 보다 정확한 구조 분석을 위하여 \( { }^{1} \mathrm{H}\) NMR 분석을 실시한 결과 (Fig.6), (400 MHz, CD \( \left.{ }_{3} \mathrm{OD}\right) \delta \mathrm{ppm} 7.53(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=1.82 \mathrm{~Hz} \), \( \left.\mathrm{H}-2^{\prime}\right), 7.49\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{dd}, J=8.36,3.91 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-6^{\prime}\right), 6.90(1 \mathrm{H} \), d, \( \left.J=8.36 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-5^{\prime}\right), 6.40(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=1.48 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-8), 6.21 \) (1H, d, \( J=1.72 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-6), 5.47 \) (1H, s, H-1"), \( 4.33 \) (1H, d, \( \left.J=2.61 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-4^{\prime \prime}\right), 3.91\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.84 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-2^{\prime \prime}\right) \), \( 3.87\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=4.11 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-3^{\prime \prime}\right), 3.51(1 \mathrm{H}, \mathrm{dd}, J=3.91 \), \( \left.2.12 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-5^{\prime \prime}\right) \) 로 나타났다. 따라서 PA5는 quercetin-3- \( \alpha \)-L-arabinofuranoside (avicularin)로 확인되었다.</p> <h3>PA6 (HPLC peak 3 of ethyl acetate fraction):</h3> <p>TLC와 HPLC를 통해 quercetin 배당체로 추정한 PA6 (HPLC peak 3)을 LC/ESI-MS/MS를 이용하여 분석한 결과, negative ion 모드에서 분자 이온 \( \left[\mathrm{M}-\mathrm{H}^{-}\right. \)가 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} \) 447에서 나타났으며, glucoside 단위의 소실로 인한 이온 피이크 \( (\mathrm{m} / \mathrm{z} 447 \rightarrow \mathrm{m} / \mathrm{z} \) \( 301) \) 를 나타내었다. 또한 보다 정확한 구조 분석을 위하여 \( { }^{1} \mathrm{H} \)NMR 분석을 실시한 결과(Fig. 7), \( \left(400 \mathrm{MHz}, \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}\right) \) \( \delta \mathrm{ppm} 7.34\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.08 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-2^{\prime}\right), 7.33-7.29(1 \mathrm{H}, \mathrm{m} \), \( \left.\mathrm{H}-6^{\prime}\right), 6.91\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=8.29 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-5^{\prime}\right), 6.38(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J= \) \( 2.09 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-8), 6.21(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.08 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-6), 5.35(1 \mathrm{H} \), d, \( \left.J=1.58 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-1^{\prime \prime}\right), 4.23-4.21\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{m}, \mathrm{H}-2^{\prime \prime}\right), 3.76-3.73 \) (1H, m, H-3"), \( 3.32 \) (2H, m, H-4", 5"), \( 0.94(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J= \) \( 6.10 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-6^{\prime \prime} \) 로 나타났다. 따라서 PA6은 quercetin 3-O- \( \alpha \) -L-rhamnoside (quercitrin)로 확인되었다.</p> <h2>마디풀 추출물의 성분분석</h2> <h3>마디풀 추출물의 TLC 및 HPLC 분석:</h3> <p>마디풀 추출물의 TLC 및 HPLC 분석: \( P \). aviculare 추출물의 TLC chromatogram을 Fig. 1, 3에 나타내었고 HPLC chromatogram은 Fig. 2, 4에 나타내었다. 마디풀 추출물 에틸 아세테이트 분획의 TLC 크로마토그램은 9 의 띠(PA1, PA2, PA3, PA3-1, PA4, PA5, PA6, PA7, PA8)로 분리되었다. \(R_{\mathrm{f}} \) value가 \( 0.84 \) 인 PA1은 kaempferol로, \( \R_{\mathrm{f}} \) value가 0.77인 PA2는 quercetin으로 추정되었다. PA6은 quercetin 3-O- \( \beta \)-L-rhamuoside (quercitrin)로 추정되었다. 분리된 띠를 긁어 HPLC로 분석한 결과, Fig. 1의 TLC(normal phase) 크로마토그램에서 PA1 \( \left(\mathrm{R}_{\mathrm{f}} 0.84\right) \) 은 Fig. 2 의 HPLC (reverse phase) peak 9, PA2는 peak 8, PA3은 peak 7, PA3-1은 peak 5, PA4는 peak 6, PA5는 peak 2, PA6은 peak 3, PA7은 peak 4, PA8은 peak 1 과 일치함을 확인하였다. 또한 표준물질을 사용하여 peak \( 3(11.49 \%) \) 은 quercetin 3-o- \( \beta \) L-rhamnoside, peak \( 8(9.40 \%) \) 는 quercetin, peak \( 9(5.79 \%) \) 는 kaempferolol임을 확인하였다. 그리고 PA7 과 일치하는 peak 4, PA8과 일치하는 peak 1 는 myricetin 배당체, PA3-1과 일치하는 peak 5 는 kaempferol 배당체, peak 2,6 은 각각 PA5, PA4와 일치하므로 quercetin 배당체로 추정되었다. 이어 상대적으로 함량이 많은 PA8 (24.52\%), PA5 (18.16\%), 그리고 PA6 (11.49\%)은 LC/ESI-MS/MS와 NMR 스펙트럼을 분석하여 정확한 구조를 확인하였다. Fig. 3은 마디풀 추출물의 아글리콘 분획의 TLC chromatogram을 나타내었으며 아글리콘 분획은 3 개의 띠(PA-a, PA-b, PA-c)로 분리되었고, 표준물질을 이용하여 HPLC로 확인한 결과 PA-a는 myricetin으로, PA-b는 quercetin, 그리고 PA-c는 kaempferol로 확인되었다.</p> <h2>마디풀 추출물의 HPLC 및 LC/ESI-MS 분석</h2> <h3>PA8 (HPLC peak 1 of ethyl acetate fraction):</h3> <p>TLC 와 HPLC를 통해 PA8 (HPLC peak 1)은 quercetin 또는 myricetin 배당체로 추정, LC/MS/MS와 \( { }^{1} \mathrm{H} \mathrm{NMR} \) 을 이용하여 확인하였다. LC/ESI-MS/MS를 이용하여 분석한 결과, negative ion 모드에서 분자 이온 \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)가 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 463 \) 에서 나타났으며, glucoside 단위의 소실로 인한 이온 피이크 \( (\mathrm{m} / \mathrm{z} 463 \rightarrow \mathrm{m} / \mathrm{z} 316) \)를 나타내었다. 또한 보다 정확한 구조 분석을 위하여 \( { }^{1} \mathrm{H} \mathrm{NMR} \) 분석을 실시한 결과(Fig. 5), (400 MHz, CD \( \left.\mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}\right) \delta \mathrm{ppm} 6.95 \) \( \left(2 \mathrm{H}, \mathrm{s}, \mathrm{H}-2^{2}, 6^{2}\right), 6.37(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.10 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-8), 6.20(1 \mathrm{H}, \mathrm{d} \), \( J=2.08 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-6 \) ), \( 5.32\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=1.54 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-1^{\prime \prime}\right), 4.25-4.21 \) (1H, m, H-2"), \( 3.78 \) (1H, s, H-3"), 3.64-3.49 (2H, m, H-4", 5"), \( 0.96\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=6.18 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-6^{\prime \prime}\right) \) 로 나타났다. 따라서 PA8은 myricetin 3-O-rhamnoside (myricitrin)로 확인되었다.</p>	생명
붉은 털 원숭이의 뇌조직에서 CCDC94 유전자 대체 전사체의 분자적 분석	<h1>서 론</h1> <p>Junk DNA라고 알려져 왔던 유전자 이외의 영역은 Babara McClintock에 의해 옥수수에서 ‘jumping gene’라고 짐작했던 트랜스포존(transposon)이 밝혀짐으로써, 그들의 기능 및 역할의 연구가 가속화되었다. 이들의 특징은 미생물을 비롯한 식물, 동물의 유전체 내에 산재하여, 종의 특징을 구분짓는 표지 역할을 하며, 직접적으로 발현함으로써 단백질로 번역되어 개체에게 질병을 야기하거나, 반대로 개체에게 이로운 역할을 하는 것으로 알려져 왔다. 그들 서열의 특징인 반복적인 염기배열은 유전자 재배열을 통한 유전체 교란을 야기 하고, 스플라이싱 사이트를 제공하여 다양한 전사산물들의 생성한다. 주목 할 만한 것은 트랜스포존이 유전자의 5’UTR에 끼어 들어가, 트랜스포존 스스로가 가진 프로모터에 의해 유전자의 전사를 촉진시킬 수 있으며, 3’UTR에 끼어 들어가 poly adenylation 신호를 제공할수 있음이 밝혀 졌다. 인간 유전체 염기서열이 완성된 이후, 유전자의 생물학적 기능과 유전질환의 원인규명은 현재까지 끊임없이 밝혀지고 있으며, 더 나아가 인간을 대신 할 모델동물을 이용하여, 유전적인 현상과 질환을 해석하려는 노력은 인간과 가장 유사한 종에서 시도 되고 있다. 더욱이 영장류와 같은 원숭이를 이용한 유전체 비교 연구는 유전체를 진화학적으로 해석할 수 있어, 다양한 유전체 내의 이벤트들의 원인과 시기를 해석할 수 있기 때문에, 오늘날 활발하게 연구가 진행되고 있다. 현재 침팬지 유전체는 2006년에 공개 되었으며, 붉은 털 원숭이의 경우 2006년도 유전체 초안이 공개 되었다. 오랑우탄 유전체 역시 2007년도에 유전체 초안이 공개 되었다. 이 가운데 붉은 털 원숭이는 인간과 형태학적, 생리학적, 유전학적으로 가장 유사한 종 중 가장 많이 연구되는 영장류 중 하나이며, 생물의학적으로 적합한 실험 모델로서 보고되고 있다. 본 연구에서는, 붉은 털 원숭이 뇌 조직의 cDNA 라이브러리를 구축하였으며, 이를 통하여 밝혀 지지 않은 전사체의 동정 및 트랜스포존이 삽입되어 형성된 융합 전사체에 대한 구조적인 특징 분석, 유전적 발현 및 진화적인 분석을 고찰하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>붉은 털 원숭이의 뇌 조직 cDNA 라이브러리 구축</h2> <p>붉은 털 원숭이의 뇌 조직에서의 cDNA 라이브러리는 cap trapper method를 사용하여 구축하였으며, 라이브러리 스크리닝을 위하여 클로닝 벡터(pCNS-D2) 양쪽의 서열로부터 Primer쌍 preT7 (5'-CGT GTA CGG TGG GAG GTC TA-3')와 SP6 (5'-CCT ATT CTA TAG TGT CAC CTA AAT-3')을 디자인하여 PCR을 통해 스크리닝 한 다음, pos-itive 클론은 Competent cell에 LB 배지에서 배양하였다.</p> <h2>CCDC94 전사체에서 전위요소분석</h2> <p>\(CCDC94 \) 유전자의 염기서열은 UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu/)의 BLAT (Basic local alignment tool)을 이용하여 분석하였으며, 라이브러리를 통해 밝혀진 전사체 내에 삽입된 전위요소 서열의 분석을 위하여 RepeatMasker 프로그램을 사용 하였다(http://repeatmasker. genome.washington.edu).</p> <h2>Total RNA분리</h2> <p>또한 붉은 털 원승이 뇌 조직의 cDNA 라이브러리를 통해 동정된 \(CCDC94 \) 유전자의 붉은 털 원숭이 내에서의 전사 양상 및 전사의 특징과 인간과의 비교 분석을 위하여 붉은 털 원숭이의 조직 (1, 부신; 2, 소뇌; 3, 대뇌피질; 4, 심장; 5, 신장; 6, 간; 7, 폐; 8, 고환; 9, 골격근; 10, 기관; 11, 비장; 12, 결장; 13, 맹장; 14, 위; 15, 췌장; 16, 타액선; 17, 직장; 18, 방강; 19, 십이지장; 20, 공장에서 RNeasy mini kit (Qiagen)을 이용하여 tota RNA를 분리하였다. 인간 조직, 1.부신; 2, 소뇌; 3, 전 뇌; 4, 심장; 5, 신장; 6, 간; 7, 폐; 8, 고환; 9, 기관; 10, 골수; 11, 태아 뇌; 12, 태아 간; 13, 태반; 14, 전립선; 15, 타액선; 16, 골격근; 17, 척수; 18, 흥선; 19, 갑상선; 20, 골수 유래의 total RNA는 Clontech사로부터 구매하였다.</p> <h2>PCR과 RT-PCR 증폭</h2> <p>붉은 털 원승이 뇌조직으로부터 확립한 full-length cDNA library에서 찾아낸 각 전사체를 인간 및 영장류 ge-nomic DNA를 사용하여 각 전사체의 가동성인자의 삽입시기 분석을 위해 PCR 증폭을 하였다. 이들의 프라이머 정보는 Table 1 에서 보여준다. PCR 분석은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 4 \mathrm { min } \) 35 cycle로 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 40 \mathrm { sec } , 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 40 \mathrm { sec } , 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 3 \mathrm { ~min } \)에서 수행하였다. 추출한 RNA는 cDNA 합성을 위해 DNA-free RNA를 사용했으며, M-MLV (moloney- murine leukemia virus) 역전사 효소(Promega)와 RNase inhibitor(Promega)를 사용하여 합성하였다. 새롭게 찾아낸 각 전사체의 조직 발현을 보기 위해 RT-PCR 증폭을 하였다. 각 유전자들의 프라이머 정보는 Table 1에서 보여준다. RT-PCR 분석은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 4 \mathrm { ~min } \) 35 cycle로 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 40 \mathrm { sec } , \) \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } ^ \sim 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 40 \mathrm { sec } , 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 3 \mathrm { ~min } \)에서 수행하였다. Positive control로서는 housekeeping 유전자인 G3PDH(glyceradehydes-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하였으며, 프라이머 G3PDH-S (GAA ATC CCA TCA CCA TCT TCC AGG)와 G3PDH-AS (GAG CCC CAG CCT TCT CCA TG)를 사용해 G3PDH를 증폭하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>붉은 털 원숭이의 뇌 유래의 cDNA 라이브러리를 통해 발견된 R54 전사체를 인간과 침팬지의 등록된 mRNA 서열 alignmnent를 통하여 비교 분석하였다. 원숭이에서는 인간의 4번 엑손이 존재하지 않은 반면에 LINE 가운데 오래된 패밀리 가운데 하나인 L2A의 엑손화 현상으로 인하여, 인간에서는 존재 하지 않는 7번 엑손이 붉은 털 원숭이 R54 전사체에서 발견 되었다(Fig. 1).</p> <p>붉은 털 원숭이에서 L2A서열을 가진 R54 전사체와 L2A 서열이 존재하지 않는 인간의 전사체의 발현 양상을 비교하기 위하여, 붉은 털 원숭이의 6번과 8번 엑손에 해당하는 영역에서 프라이머(Table 1)를 디자인하여 인간과 붉은 털 원숭이의 조직에서RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 인간의 조직에서는 L2A의 서열이 빠진 길이 \( (150 \mathrm { bp } ) \)의 전사체가 전 조직에서 발현하였으며(Fig. 2A), 특히 흥미롭게도, 인간 DNA에서 reference sequence로 등록되어 있는 것과는 달리 L2A 서열이 존재하는 길이 \( (324 \mathrm { bp } ) \)의 전사체가 몇몇의 조직 (Kidney, Liver, Fetal liver, Placenta, Prostate, Salivery gland, SK-muacle, Spinal cord, Thymus, and Thyroid gland) 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다. 또한 붉은 털 원숭이 조직에서의 발현을 비교해 본 결과 전 조직에서 발현하며, 몇몇의 조직에서는 강하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 그러므로, 붉은 털 원숭이를 비롯한 인간의 \(CCDC94 \) 유전자의 경우, 붉은 털 원숭이의 7번 엑손에 해당하는 영역의 L2A의 삽입은 L2A의 내부의 서열에 의해 alternative splicing을 야기하여 대체 전사체가 조직 특이적인 발현을 야기하는 것으로 추측된다(Fig. 3).</p> <p>EST (Expressed Sequence Tags)와 cDNA와 genomic DNAs의 비교분석은 cassette exon을 포함한 alternative splicing을 예상할 수 있다. 인간과 마우스 사이에서 잘 보존되어 있지 않은 alternatively spliced exons이 나타날 확률이 잘 보존된 alternatively spliced exons이 나타날 확률보다 세 배 더 높은 것으로 보고 되고 있으며, 불규칙한 splicing으로 부터 형성된 잘 보존되어 있지 않은 대부분의 alternative spliced exons은 기능을 하지 않는 것으로 보이나 그들의 진화적인 역할은 중요함에 틀림없다. 새로운 스플라이싱 전사체는 각 조직에 있어 긍정적인 효과(positive effect)를 가져올 수 있으며 진화 과정 동안 고정된다. 예를 들면 \( ADA R B 1 \) 유전자의 Alu유래의 exon은 진화과정 동안 인트론에 삽입되어 새로운 alternative spliced exon으로 고정되었다. 이러한 엑손들은 새로운 단백질을 생성하기 위한 driving force로 작용하여, 진화과정 동안 종 분화를 촉진하는 역할을 할 수 있다. 따라서, 유전자의 암호화 서열 영역(coding sequence region)에서의 이러한 이벤트는 진화 과정 동안의 조직 특이성과 같은 다른 기능들에 있어서의 다양성의 획득뿐만 아니라, 도메인의 변화에 따른 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있다. 더불어 이러한 이벤트에 따른 기능의 변화는 때때로 질병 및 위 유전자화(psuedogenization)를 야기할 수도 있다.</p> <p>새롭게 밝혀낸 붉은 털 원숭이의 R54 전사체는 인간 \(CCDC94 \) (coiled-coil domain containing 94) 유전자와 높은 유사성을 가진다. \( CCDC94 \)유전자는 혈액 응고와 더불어 세포 분열과 세포 성장에 관여하는 전사인자로 알려져 왔으며, 많은 서브패밀리를 가진 \( C C D C \) 유전자 가운데 \( C C D C 134 \)유전자는 세포 안으로 유사분열물질(mitogen)을 활성화시키는 메커니즘으로 대부분 세포 성장을 촉진시키는 유전자로서 다양한 조직에서 발현하는 것으로 보고되었다. \(CCDC98 \)유전자의 경우에는 유방암 조직에서 발현하는 유전자로 알려져있다. 이처럼 인간의 \( C C D C \) 유전자의 많은 서브패밀리 유전자들은 조직 특이적 흑은 다양한 조직에서 발현하여 개체의 생존에 관여하는 것으로 알려져 있다.</p> <p>본 연구를 정리하면, 붉은 털 원숭이의 cDNA 라이브러리를 통하여 R54 전사체 내에 LINE 패밀리인 L2A가 붉은 털 원숭이의 7번 엑손에 삽입되어 엑손화 된 현상을 밝혔다. \( C C D C 94 \)유전자와 높은 유사성을 가진 R54 전사체는 인간과 붉은 털 원숭이의 조직에서 서로 다른 양상의 유전자의 발현을 보였다. 이러한 연구결과들은 가동성 유전인자의 삽입으로 인하여, 다양한 전사체를 야기시켜, 서로 다른 조직에서 생물학적인 기능을 수행하는 것으로 시사된다.</p> <h1>초록 : 붉은 털 원숭이의 뇌조직에서 CCDC94 유전자 대체 전사체의 분자적 분석</h1> <p>붉은 털 원숭이의 유전체는 인간의 것과 \( 93 \% \) 정도로 동일하여, 진화적 연구 및 생물의학적 연구에 널리 활용되고 있다. 숙주 개체 내로 가동성 유전인자(TEs)의 삽입은 유전자 전사체의 다양성과 발현양상을 다르게 만든다. 본 연구에서는 붉은 털 원숭이의 뇌 조직으로부터 만든 cDNA 라이브러리에서 112개 전사체를 동정하여 분석하였다. 하나의 전사체 R54는 인간과 원숭이의 다양한 조직에서 유전자 발현양상을 비교분석 해 본 결과 서로 다른 패턴을 보여 주었다. 이러한 현상은 가동성 유전인자인 L2A의 삽입으로 인한 스플라이싱 도너 사이트가 변화된 것으로 생각된다. 따라서, 영장류의 진화과정에 있어 유전체 내로 TEs의 삽입은 전사체의 다양성과 유전자 발현조절에 변화를 주는 것으로 시사된다.</p>	생명
제초제 Paraquat의 전자수용 및 방출에 대한 영향	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Paraquat의 전자포획 및 방출</h2><h3>Paraquat의 전자포흭</h3><p>Mitochondria를 이용해서 paraquat와의 작용을 검토하는 과정에서 다음과 같은 결과를 얻었다.</p><p>Plate 1의 A에서와 같이 투명한 mitochondria액에 \( 1.0 \mathrm{mM} \) 이상의 paraquat를 첨가한 결과 육안으로도 식별 가능한 청색의 발색현상이 확인되었다. 이러한 발색현상을 해석하기 위해 전극을 설치한 photo cell에 \( 1.0 \mathrm{mM} \)의 paraquat를 넣고 \( 0.1 \mathrm{~mA} \)의 전류를 통하는 실험을 행한 결과 사진의 B와 같이 음극으로부터 청색으로 발색되기 시작하여 전반적으로 청색화됨을 관찰할 수 있었다.</p><p>Paraquat에 의한 산화-환원반응의 가속화 경향은 mitochondria와 paraquat가 반응해서 청색으로 발색되는 현상으로부터 해석될 수 있는 바, paraquat가 전자를 포획한 결과로 판단되었다. Mitochondria와 paraquat와의 반응에 의한 청색화 현상은 mitochondria에서의 물질대사 과정중 발생된 electron을 paraquat가 포획한 결과로 판단된다.</p><h3>Paraquat와 \( \mathrm{NAD}^{+} \)의 전자포획 비교</h3><p>농도별 paraquat에 \( 1.5 \mathrm{~V} \)의 전류를 10분간 처리한 후 \( 340\mathrm{nm} \)에서의 흡광도 변화를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. Paraquat농도가 \( 1.0 \mathrm{mM} \)이하인 경우는 전자포획에 의한 흡광도 증가가 거의 없었으나 \( 1.0 \mathrm{mM} \)이상에서는 전자를 포획하여 흡광도가 직선적으로 증가하였다.</p><p>\( 1.0 \mathrm{mM} \)의 NAD와 paraquat에 대한 동일한 통전실험을 행하여 경시적으로 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도 변화를 비교 측정 한 결과는 Fig. 2와 같다.</p><p>Paraquat와 \( \mathrm{NAD}^{+} \)에 전자를 공급함으로써 수용액 중에 있는 proton을 흡수하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도가 증가 하는 현상이 확인 되었으며 그 경향이 두 물질에 있어서 매우 유사하였다. 차이는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)는 거의 직선적인 증가를 하였으나 paraquat는 통전 후 약 12분경에 변곡점을 가지는 증가를 볼 수 있었다. 이것은 NAD가 electron을 받아들일 수 있는 Nitrogen+이온이 한 개인데 비하여 paraquat는 2개가 존재하기 때문인 것으로 판단된다.</p><p>Paraquat의 electron포획은 paraquat의 식물에 대한 제초효과가 광합성에 의해 생성되는 electron을 paraquat가 흡수함으로서 시발된다는 것과 Liochev등 과 Simon등이 paraquat에 의한 redox-cycle의 activation을 보고한 바와 일치되는 결과이다.</p><p>또한 Paraquat와 NAD가 전자를 포획함에 있어서 서로 경쟁적인 관계라고 판단되며, 만약 paraquat가 전자를 포획만하고 다른 물질에 넘겨줄 수 없다면 NAD(H)의 산화 및 환원반응 중 어느 한쪽은 가속되나 다른 한쪽은 가속되지 않을 가능성이 있다. 그러나 두 반응 모두 가속된 결과로 봐서 electron을 포획한 다음 다른 물질에 넘겨줄 수도 있다고 판단되며 Frank도 paraquat의 전자포획과 방출에 대한 가능성을 언급하였다.</p><p>또한 paraquat의 전자포획 및 방출기능을 이용하여 Klier 등은 paraquat의 독성에 영향을 받지 않은 일부 균주를 이용하여 electrochemical cell에서 paraquat (methyl viologen: \( \mathrm{MV}^{+} \))와 수소를 공급하여 dihydrooxazine의 N-O bond를 환원적으로 절단하여 amino cyclitol을 합성하는 방법이 화학 합성법 보다 효과적임을 보고하였으며 Braun 등, Thanos 등 및 Tidswell 등도 paraquat 내성의 혐기적 세균(Clostridium)을 이용하여 유사한 결과를 보고하였다.</p><h3>Paraquat의 전자포획 및 방출</h3><p>Paraquat에 전자를 넣고 전류를 통하여 발색되는 전자포획 현상을 청색의 특이 흡광파장인 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 timer scanning 하여 추적한 결과는 Fig. 3과 같다.</p><p>Fig. 3A의 경우 paraquat만 넣고 전류를 흘린 결과 초기 \(5 \sim10\)분 사이에 대단히 심한 흡광도 변화를 볼 수 있으며 이후 비교적 안정되는 경향이었다. 이러한 초기의 흡광도 변화의 원인이 paraquat이외의 친 전자성 물질의 공존에 의한, paraquat와의 전자포획의 투쟁에 의한 결과로 판단하고 NaOH를 반응 초기에 첨가하여 친 전자성 물질을 제거한 결과 Fig. 3 B에서와 같이 초기의 불안정한 흡광도 변화는 없어지고 직선적인 흡광도 증가 현상을 볼 수 있었다.</p><p>이러한 현상은 paraquat가 음극으로부터 직접 전자를 받아 간다는 Plate 1과 일치되는 결과이다. 그리고 NAD(H) 산화 및 환원에 대한 효소반응의 결과에서 paraquat에 의한 가속화 현상이 paraquat가 전자를 포획할 뿐만 아니라 다른 물질에 전자를 공급할 수도 있다는 판단아래 B의 \( \downarrow \) 지점에서 proton을 첨가한 결과 첨가직후부터 격렬한 수소 gas발생과 함께 흡광도가 일직선으로 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이 결과로부터 paraquat는 전자를 포획할 뿐만 아니라 다른 물질에 전자를 넘겨줄 수도 있다는 것이 확인되었다.</p><p>또한 paraquat의 독성이 산소 의존성이라는 점에서 paraquat가 산소에 직접 전자를 넘겨줄 수 있는지를 확인하기 위한 실험의 결과는 Fig. 4와 같다. 전자를 공급하여 청색으로 발색된 paraquat에 발생기 산소 및 분자상태의 산소를 공급한 결과 두 경우 모두 급격한 흡광도 감소현상을 볼 수 있었다. 이상의 결과로 부터 paraquat는 전자를 포획할 뿐만 아니라 수소 및 산소에 전자를 넘겨줄 수 있음이 확인되었다.</p><p>효소를 매개로 하지 않은 경우에도 paraquat와 NADH간에 전자포획을 위한 경쟁적 반응이 일어날 수 있다는 가능성이 Fig. 5의 결과로부터 제시되었다. 즉 NADH와 paraquat의 혼합액에서 불안정하고 불규칙한 흡광도 변화가 확인 되었으며 이는 NADH와 paraquat간에 전자가 직접 출입된다는 것을 단정적으로 결론 지을수는 없으나 NADH와 paraquat 사이에는 경쟁적인 반응이 일어나고 있는 것으로 판단된다.</p><p>이상의 결과를 종합하면 Paraquat가 생체내의 catabolic pathway에서 생성된 전자를 포획하여 산화형의 Paraquat가 환원형으로 바뀌어 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 높은 흡광도를 나타내는 구조가 되며, 이는 cyctochrome호흡쇄를 거치지 않고 산소 등에 직접 electron을 넘겨주고 자신은 다시 electron을 받을 수 있는 산화형이 될 수 있는 것으로 판단된다. 산소에 electron을 넘겨줌으로써 superoxide radical들이 다량 생성되고 정상적인 상태에서는 SOD에 의하여 superoxide radical들이 처리되어지나 paraquat에 의해 SOD가 직접적인 저해를 받음으로써 superoxide radical들이 해독작용을 받지 못하고 막의 불포화 지질에 작용하여 지질 과산화물을 축적함으로써 독작용을 나타내는 것으로 추정된다. 그러나 지질 과산화물이 만들어져 생체가 사멸하기까지는 상당한 시간을 요할 것이다. 그러나 paraquat가 산화환원반응에서 포획한 전자를 산소와 같은 물질에 직접 넘겨줌으로서 cytochrome 호흡쇄로의 단계별 전자전달계가 차단된다면 산화적 인산화가 저해되어 생물체에 있어서 SOD 활성저해 이전의 paraquat에 의한 급성독성으로 나타날 것이라 판단된다.</p> <p>Paraquat는 비선택성의 속효성 제초제로 생체세포에 대한 독작용은 SOD활성저해에 기인한 지질과산화물의 축적에 있으나 그 독작용이 확대 해석되고 있는 바, glutathione과의 복합체 형성, paraquat에 의한 collagen의 증가, tryptophan에서 niacin으로의 전환율 감소 밎 NAD합성저해, acetylcholinesterase의 활성저해 및 돌연변이 유발등이 보고되고 있으며, paraquat 독성에 대한 면역학적 치료제인 항체 생산에 대한 연구도 행해지고 있다.</p> <p>Paraquat의 전자전달에 대한 관련성의 연구로는 Liochev 등이 paraquat에 의한 전자흐름의 이상을 보고한바 있고, paraquat가 산화 및 환원 복합체를 가속시킨다는 연구 및 paraguat의 전자공여체로서의 작용 등의 보고가 있다. 그러나, 이러한 paraquat의 전자전달 매체로서의 성질이 세포내 에너지 대사과정 중 연속된 전자전달계로 구성되어 있는 cytochrome 호홉쇄에 미치는 영향에 대해서는 연구가 미흡하다.</p> <p>paraquat가 생체내 이화작용에서 생성되는 전자를 흡수한다면 cytochrome 호흡쇄로의 전자의 흐름에 이상을 초래할 수 있을 것이며 이것은 paraquat의 급성독성의 기작으로 이해될 수 있을 것이다.</p> <p>따라서 본연구는 paraquat의 전자수용 및 방출의 기능을 검토하여 생체내의 전자전달계에 미칠 수 있는 paraquat의 영향을 검토 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>Mitochondria 분리</h2> <p>정상의 쥐(sprague-dawley중 수컷 흰쥐)로부터 채취한 간 조직을 \( 0.9 \% \) saline 용액으로 세척한 후 빙냉한 \( 0.15 \mathrm { M } \)의 KCl 용액에서 잘게 절편한 후 teflon glass homogenizer를 사용하여 \( 10 \% \) \(( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 간조직 균질액을 만들었다. 이 마쇄 균질액을 \( 600 \mathrm { ~g } \)에서 10분간 2회 원심분리 \( (4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(600 \times \mathrm { g } \times 10 \mathrm { ~min } ) \)하여 조직의 미마쇄 획분 및 원형질 막 획분을 제거하고 가아제로 여과한 후 2회 원심분리 \( (4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(10,000 \times \mathrm { g } \times 20 \mathrm { ~min } ) \)하여 얻은 침전물을 mitochondria획분으로 하였다. Mitochondria 획분은 \( \mathrm { ml } \) 당 \( 57 \mathrm { mg } \)의 protein을 함유하였다.</p> <h2>전자수용 및 방출의 반응계</h2> <p>Paraquat 와 NAD의 전자수용 및 방출에 대한 비교실험은 photo cell에 \( 0.1 \mathrm { ~mA } \)의 전류가 흐르도록 동선전극을 장치하고 반응액에 잔존하는 proton의 홉수제로는 sodium hydroxide를, 전해질로는 silver nitrate를 사용한 반응계로 행하였다.</p> <p>전자수용반응은 여기에 \( 1.0 \mathrm { mM } \)의 paraquat 혹은 NAD를 넣고 전류를 통하면서 전자수용에 따른 \( 340 \mathrm { ~nm } \)에서의 흡광도 증가현상을 측정하였으며 전자방출은 동일조건의 photo cell에 \( 1.0 \mathrm { mM } \) 의 paraquat를 넣고 전류를 통하여 청색으로 발색시킨 후 proton 및 발생기 산소와 분자상태의 산소는 hydroperoxide에 catalase를 넣어 생성된 산소를 미세관을 통하여 photo cell에 연결시켜 주입하였다. 반응은 U.V.분광광도계(Ultraviolet Spectrophoto- meter. CECIL)로 \( 340 \mathrm { ~nm } \) 및 \( 660 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다.</p>	생명
매생이 추출물이 난소를 절제한 흰쥐의 혈소판 응집과 혈청 내 지질 조성에 미치는 영향	<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 제조방법</h2><p>본 실험에서 사용 된 매생이(Capsosiphon fulvecense, CF)는 2005년 엔존에서 구입하여 물로 \( 6 \sim 7 \)회 채로 씻어 내어 염분과 불순물의 제거하고 동결 건조, 분쇄하여 사용하였다. 건조시료에 \( 80 \% \) ethanol \( 2 \mathrm{L} \)를 가해 2회 열 추출하여 감압 농축기로 농축한 후 분말로 만들어 증류수에 녹여 동물실험에 사용하였다.</p><h2>실험동물</h2><p>실험동물은 체중이 평균 \( 160 \mathrm{g} \) (6주)되는 Sparaque-dawley계 암컷 흰쥐를 코아텍으로부터 구입하여 본 실험실에서 고형사료(삼양유지)로 사육하였고, 실험 시작 1주일 동안 대조군 식이로 적응시킨 후 동물의 체중에 따라 4군으로 나누었다. 즉 실험동물은 난소절제 대조군(OVX-Control), 비 난소 절제군(Sham), 매생이 추출물 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군 (OVX-CF50) 및 \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군(OVX-CF200)으로 나누어 실험하였다.</p><p>체중은 실험 사육 기간 중에 격일로 일정 시간에 측정하고, 식이 섭취량은 매일 식이 잔량을 측정하여 산출하였다. 동물 실험실의 사육조건은 온도 \( 24 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \sim 60 \% \)을 유지 시키며 물과 식이는 자유 공급하였고, 실험시료는 증류수로 용해하여 매일 \( 1 \mathrm{~mL} \)씩 경구 투여 하였고, 대조군은 동일용량의 증류수를 투여하였다.</p><h2>난소절제시술</h2><p>1주일 동안 주위환경에 적응시켜 난괴법에 의해 군을 나누어 난소 절제 수술을 실시하였다. 수술은 ether 마취 후 심마취기에 이르면 늑골하부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 시술 후 3일부터 매일 매생이 시료를 경구 투여하였다.</p><h2>혈액 채취</h2><p>혈액은 실험동물을 해부 전 24시간 절식 시킨 후 ether 마취 하에서 개복한 후 대동맥에서 채취하였고, 혈청 중의 효소활성 및 지질 농도는 실온에서 한 시간 방치 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 원심분리 하여 분석하였다.</p><h2>혈소판 응집실험</h2><p>흰쥐를 ether로 마취하고 개복하여 복대동맥으로부터 채혈하여 \( 3.2 \% \) sodium citrate용액과 \( 1: 5 \)의 비율로 혼합한 뒤 \( 1,100 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리하여 상층의 platelet rich plasma(PRP)를 취하고, \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 더 원심분리하여 상층의 혈장을 제거한 후 EDTA를 포함하는 washing buffer ( \( 138 \mathrm{mM} ~ \mathrm{ NaCl } \), \( 2.7 \mathrm{mM} ~\mathrm{KCl} \), \( 12 \mathrm{mM} ~\mathrm{NaHCO}_{3} \), \( 0.36 \mathrm{mM}~ \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 5.5 \mathrm{mM} \) glucose, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH}~ 6.5\) ) \( 5 \mathrm{~mL} \)를 가하고 섞어주어 혈소판을 재 현탁시켰다. 이 혈소판을 다시 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 한 후, 세척액을 버리고 잔사인 혈소판을 위의 방법으로 한번 더 세척하였다. 세척 후 suspending buffer( \( 138 \mathrm{mM}~ \mathrm{ NaCl } \), \( 2.7 \mathrm{mM} ~\mathrm{KCl}, \) \( 12\mathrm{mM} ~\mathrm{NaHCO}_{3}, 0.36 \mathrm{mM}~ \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(5.5 ~\mathrm{mM} \) glucose, \( 0.49 \mathrm{mM} ~\mathrm{MgCl}_{2}\), \(0.25 \% \) Gelatin, \( \left.\mathrm{pH} 7.4\right) \)로 재 현탁 시켜 \( 3000\mathrm{rpm}\), 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer로 현탁시켜 washed platelet을 조제하였다. washed platelet는 suspending buffer로 희석하여 혈소판 수가 \( 5 \times 10^{8} / \mathrm{mL} \)이 되도록 하여 Whole blood lumiaggregometer (Chrono-log, U.S.A)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 Optical 방법으로 혈소판 응집을 측정하였다.</p><h2>혈청 중의 지질농도 분석</h2><p>혈 중 triglyceride, total-cholesterol, HDL-cholesterol 함량은 자동 측정용 slide (FU-JI FILM, Japan)를 이용하여 Dry chemistry analyzer 3500i(Fuji, Japan)으로 측정하였다.</p><h2>혈류측정</h2><p>혈류는 Micro Channel Array Flow Analyzer KH-6 (MC Lab, Japan)을 이용하여 채취한 혈액 \( 100 \mathrm{\mu L} \)를 주입하여 측정하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험에 대한 모든 실험의 결과는 mean \( \pm\) SD치로 나타내었고, 통계적 유의성은 student's t-test를 이용하여 상호비교 하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>식이 섭취량, 체중 증가량 및 장기의 중량</h2><p>Table 2는 실험기간 동안 실험동물의 체중 증가량 및 식이효율을 나타낸 것이다. 난소 절제에 의한 estrogen 분비감소가 체중 증가를 가져온 여러 보고와 마찬가지로, 본 실험에서도 난소를 절제한 OVX-control군이 난소를 절제하지 않은 Sham군에 비해 체중이 증가하였다. 일반적으로 난소절제로 인한 estrogen분비 부족은 지방조직의 지 단백 리파아제(lipoprotein lipase)의 활성을 저하시키고 호르몬 민감성 리파아제(hormone sensitive lipase) 활성을 증가시켜 체 지방 축적을 억제한다고 알려져 있다. OVX-control군이 Sham 군에 비해 체중이 증가하는 것은 여성호르몬 부족으로 인한 체내 지방조직의 증가에 의한 것이며, 또한 지방조직에서도 여성호르몬을 생성 할 수 있는 기능을 가지고 있기 때문에, 지방조직에서 난소의 기능을 대체 하고자 하는 체내의 비상대책으로 여겨진다. 난소 절제 후 매생이를 투여한 모든 군에서 Sham군과 비교해 높은 체중 증가량을 나타내어 매생이 추출물이 체중감소에는 크게 영향을 미치지 않았다.</p><h2>매생이가 혈소판 응집에 미치는 영향</h2><p>난소 절제로 인하여 혈 중 지질 함량이 증가한 상태에서 매생이 투여로 인한 혈소판 응집 억제효과를 알아보기 위하여 washed platelet을 분리하고 collagen \( 2 \mu \mathrm{g} \)으로 혈소판 응집을 유도하였다.</p><p>매생이의 혈소판 응집 억제 실험을 한 결과, 매생이를 투여한 군(OVX-CF50, OVX-CF200)이 OVX-control군에 비해 혈소판 응집을 억제하는 것으로 나타났다. Amplitude(\( \% \))의 경우 난소 절제에 의해 OVX-control \( (102.94 \pm 5.57 \%) \)군은 Sham \( (86 \pm 5.20 \%) \)군과 비교하여 증가하였다. 이에 반해 매생이 추출물 투여군이 감소하는 경향을 나타내었는데, 특히 OVX-CF50 \( (96.22 \pm 4.54 \%) \)군에서 유의적으로 감소하였다(\(p<0.05\)). Slop ( \( \Omega / \mathrm{min}) \)은 OVX-control (\(128.26 \pm 19.35 \Omega / \mathrm{min}) \)군이 Sham \( (59.5 \pm 4.33 \Omega / \mathrm{min}) \)군에 비하여 높은 수치를 나타내었으나, 매생이 추출물 투여군인 OVX-CF50 \( (99.16 \pm 7.80 \Omega / \mathrm{min}) \)과 OVX-CF200 \( (97.33 \pm 15.91 \Omega / \mathrm{min}) \)에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 Lag Time (sec)에서 OVX-control \( (48.36 \pm 7.20 \mathrm{sec}) \) 군은 Sham \( (71.66 \pm 32.87 \mathrm{sec} \) )군과 비교하여 감소하였는데 이는 응집제(collagen)첨가에 대한 응집효과가 빨리 나타나 난소절제로 인해 응집효과가 더욱 촉진된 것으로 사료되어 진다. 이에 반해 매생이 추출물 투여군은 증가하는 경향을 나타내었고, 특히 OVX-CF50 \( (58.88 \pm 14.03 \mathrm{sec}) \)군에서 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다 \( ( p<0.05) \). 이러한 결과는 매생이 추출물이 collagen으로 인한 응집을 효율적으로 억제시키는 것으로 생각할 수 있다. 이상의 결과로 미루어 매생이가 동맥경화증, 혈전증 등의 혈관 관련성 질환에 효과가 있을 것으로 기대된다.</p> <h2>혈류 개선 효과</h2><p>혈류의 흐름에 미치는 매생이 추출물의 영향을 검토해보기 위해 Sham, OVX-control, OVX-CF50, OVX-CF200군의 혈액을 각각 채취하여 항응고제인 헤파린 처리 후, 일정한 압력으로 인해 혈액이 모세관을 25, 50, 75, 100 \(\mu \mathrm{L} \) 통과하는 시간을 Micro channel array를 이용하여 측정하였다.</p><p>Sham군이 OVX-control군에 비해 빠른 시간에 모세관을 통과하였다. 이는 난소절제에 의하여 혈 중 지질조성의 변화에 의해 생긴 결과로 보여진다. 그러나 매생이 추출물 투여군의 경우 Sham군 정도의 혈류흐름은 나타나지 않았으나 OVX-control군보다 빠른 시간에 통과한 것으로 미루어 보아 매생이가 혈류의 흐름에 좋은 영향을 줄 것으로 사료되어 진다.</p><h2>혈청 중의 지질 조성의 변화</h2><p>Total-cholesterol은 Sham \( (78.25 \pm 14.06 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL}) \)군이 난소절제를 한 OVX-control \( (107.83 \pm 17.94 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL}) \)군과 비교하여 유의적으로 \( (\mathrm{p}<0.05) \) 낮은 수치를 나타내었다. 이에 반해 난소 절제 후 매생이 추출물의 농도별 투여군 중 OVXCF50군은 \( 96.25 \pm 21.40 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL} \)로 Sham군에 미치지 못하나 OVX-control군에 비해 감소하였.고, OVX-CF 200군 또한 \( 104.00 \pm 6.89 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL} \)로 OVX-control군과 비교해 감소하는 경향을 보였다.</p><p>한편 중성지방 농도는 난소절제에 의해 OVX-control \( (53.00 \pm 23.39 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL}) \)군이 Sham \( (43.67 \pm 25.68 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL}) \)군과 비교해 증가하였다. 이에 반해 난소 절제 후 매생이 추출물의 농도별 투여군 중 OVX-CF 50군은 \( 43.25 \pm 9.88 \) \( \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL} \) 로 Sham군과 비슷한 수치로 감소하였고, 특히 OVX-CF 200군 또한 \( 38.50 \pm 3.21 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL} \)로 Sham군 수치보다 더 감소하는 경향을 나타내었다.</p><p>또한 혈 중 HDL-cholesterol은 난소를 절제한 OVX-control \( (37.20 \pm 18.98 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL}) \)군에 비해 Sham \( (43.50 \pm 4.43 \mathrm{mg} / \) \( 100 \mathrm{~mL} \) )군은 높은 값을 나타냈으며, 매생이 추출물 투여에 의해서 HDL-cholesterol이 OVX-control군에 비교해서 높은 경향을 나타내었는데, OVX-CF50 \( (57.50 \pm 20.47 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL}) \)과 OVX-CF200 \((51.67 \pm 18.62 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~mL}) \)군 모두 Sham군 보다 더 높은 경향을 나타내었다.</p><p>해조류 등의 수산식품이 동맥경화, 심근경색, 고혈압, 협심증, 뇌졸중, 당뇨병 등의 만성 퇴행성 질환으로 알려진 성인병의 예방과 치료에 아주 효과적이란 사실이 과학적으로 입증되고 있고, 해조류 분말을 이용한 흰쥐에서 콜레스테롤 함량에 미치는 영향을 조사한 연구에 의하면 대체로 녹조류와 홍조류는 콜레스테롤을 저하시키는 효과가 있다는 것이 연구 되었다. 또한 폐경기 여성을 대상으로 한 다수의 연구에서 estrogen이 HDL-cholesterol의 농도가 증가시키나, LDL-cholesterol을 감소시켜 혈중 지질 대사에 유익한 변화가 보고 되고 있다. 따라서 난소 절제하여 갱년기 장애를 유도한 흰쥐에 매생이 추출물을 투여하였을 때, total-cholesterol 및 혈 중 중성지방 함량이 낮아지고, HDL-cholesterol 함량이 증가하는 결과로 보아 매생이 추출물 투여가 난소 절제에 의해 소실된 estrogen의 지질대사 불균형에 유익한 영향을 주어 심혈관계 질환 개선에 도움을 줄 것으로 사료된다.</p> <p>최근 경제 수준의 향상으로 평균 수명이 연장됨에 따라 여성의 폐경기 이후의 생활이 평균 여성 수명에서 \( 1 / 3 \)을 차지하게 되었다. 이로 인해 폐경기 이후의 관심이 증가되어 여려 합병증에 대한 인식이 높아짐에 따라 폐경을 단순한 생리현상 보다는 하나의 질병으로 인식되고 있다. 또한 식생활 향상과 식품 패턴의 변화에 의해 전체 국민 중 고혈압, 동맥경화, 혈전증 등 혈액에 관련된 질병을 앓고 있는 환자의 수가 점점 늘어가고 있는 추세이다. 폐경기의 에스트로겐 변화로 발생되는 건강 문제 중 심혈관계질환은 우리나라 사망원인 중 제 3순위를 차지하고 있으며, 그 발생률이 계속 증가하리라는 예측과 함께 그에 대한 관심 또한 더욱 높아지고 있다. 이러한 심혈관계질환에 혈소판이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 혈소판은 혈관이 손상되면 활성화되어 응집함으로써 혈액유실을 방지하자만, 어떤 병적인 증상에 의해 과도하게 활성화 될 경우 응집함으로써 혈전을 생성하여 혈액순환에 장애를 주어 심근경색 등을 유발하기도 한다. 폐경과 지질대사 관계에 있어서 폐경이나 난소 절제 시 estrogen의 감소는 HDL-cholesterol (high density lipoprotein cholesterol) 및 apolipoprotein A-I 의 감소를 초래하고 LDL-cholesterol (low density lipoprotein cholesterol)은 증가하여 심혈관계질환의 발병률이 증가한다. 또한 심혈관계질환은 식이 내 열량과 지방섭취 및 동물성 식품섭취의 증가 등에 의해서도 영향을 받는다고 알려져 있다. 식이 섬유소의 섭취는 인체 내에 콜레스테롤 및 중성지방의 흡수를 저해하는 기능을 가지고 있어 고지방 섭취로 인한 혈관순환기계 질환의 예방과 치료에 효과적이라는 보고가 있다. 해조류는 비소화성 다당류가 다량 함유되어 있어 열량소로서의 큰 각광을 받지 못하여 왔으나, 근래에 들어서 식생활 패턴의 변화로 식이섬유의 생리 기능적인 역할이 중요시됨에 따라 식이섬유소가 비교적 다량 함유되어있는 해조류의 섭취를 통하여 건강장해를 해결하려는 시도가 활발하게 진행되어 오고 있다.</p><p>매생이(Capsosiphon fulvescens, CF)는 녹조식물 갈파래과의 바닷말로 한국에서는 보통 남해안 일대에서 볼 수 있고 전세계에 널리 분포한다. 흔히 김 양식장에 밀생하여 김의 생육에 해를 주기도 한다. 하지만 철분, 칼슘, 요오드 등 각종 무기염류를 다량 함유하고 있어 어린이의 성장 발육촉진이나 골다공증에 효능이 있다고 생각되어지나, 아직 매생이에 대한 연구는 인공채묘나 종묘방법 등의 국한적인 연구만 진행 되어 왔다.</p><p>본 실험에 사용된 실험 model인 흰쥐의 난소절제 시술은 혈 중 estrogen농도를 감소시키는 갱년기 장애유발의 대표적인 방법으로서 골다공증 및 여성의 심혈관계 질환의 연구에서 광범위하게 이용되고 있다. 본 연구는 새로운 해조 식물로 주목받고 있는 매생이를 난소를 절제하여 갱년기 장애를 유도한 흰쥐에 투여함으로써 난소절제에 의한 estrogen결핍에서 발생되는 지질 함량 및 혈소판 응집능에 미치는 영향을 집중적으로 검토하였다. 본 연구를 통하여 매생이 추출물이 난소 절제 흰쥐의 지질 함량 및 혈소판 응집능에 유익한 영향을 줄 수 있다면, 매생이가 estrogen 결핍으로 인한 혈관순환계 질환을 개선하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.</p>	생명
OLETF 당뇨모델동물을 이용한 맥문동 추출물(LP9M80-H)의 당뇨질환에 대한 효능	<p>혈당을 조절하는 인슐린은 LP9M80-H를 처리한 ICR마우스 그리고 증숙된 맥문동의 유수추출물을 처리한 streptozo-tocin (STZ) 유발 당뇨 ICR 마우스에서 모두 증가하였다. 비록 증가량은 각 실험에서 조금씩 차이가 있지만 OLETF 랫드를 이용한 본 실험에서도 인슐린의 분비는 유의적으로 크게 증가하였다. 이러한 결과로부터 맥문동은 추출물의 형태에 상관없이 인슐린 분비를 촉진하는 기능이 있음을 제시할 수 있다. 또한, 표적세포 중에서 3T3-L1 adipocytes는 \( 70 \% \) MeOH 추출물을 처리하여 인슐린 uptake의 증가를 유도하였으나 , 본 실험에서는 확인되지 않아 향후 실험에서 확인이 필요 할 것으로 사료된다.</p> <p>한편, 인슐린 수용체의 발현변화는 오직 하나의 논문에서만 관찰되었다. 맥문동의 \( 70 \% \) MeOH 추출물은 3T3-L1 adipocytes에서 인슐린 수용체와 IRS-1의 발현을 촉진시켰으며, 이러한 결과는 OLETF 모델 동물의 간을 이용한 본 실험에서도 동일하게 관찰되었다. 비록 OLETF 랫드의 간에서 이들 단백질의 발현은 LETO 랫드의 간에서보다 낮지만 LP9M80-H를처리하면 유의적으로 증가되었다. 이러한 결과로부터 인슐린 수용체의 작용이 지방세포와 간세포에서 효과적으로 발생할 수 있음을 확인하였다.</p> <p>Gluts는 인슐린수용체의 신호전달과정을 통해 표적세포에서 발생하는 glucose대사를 조절하는 단벡질이며, 인슐린에 의해 발현양의 변화가 관찰된다. 다양한 Gluts 중에서 본 연구에서는 Glut-2, 3 그리고 4를 관찰하였다. 맥문동의 \( 70 \% \) MeOH추출물을 투여한 실험에서 adipocyte는 Glut-4 발현 증가를 유도하였으며, 이러한 결과는 간세포를 이용한 본 실험결과와 매우 유사하였다. 또한, 본 실험과 동일한 물질을 ICR 마우스에 처리한 실험에서는 Glut-3가 유의적으로 증가하였지만 OLETF 랫드 모델 동물을 이용한 본 연구에서는Glut-3가 감소하는 결과를 관찰하였다. 이러한 차이는 OLETF 랫드가 표적세포의 이상으로 발생하는 제2형 당뇨이기 때문에 간세포에서 정상적인 신호전달과정이 이루어지지 않고 있기 때문인 것으로 사료된다. 증숙 가공된 맥문동을 STZ 유발 당뇨 ICR 마우스에 처리한 경우, Glut-2와 Glut-3가 모두 증가하였다. 그러나 본 연구에서는 Glut-2는 발현량에 변화가 없었으며, Glut-3는 오히려 감소하였다. 이러한 차이도 제1형당노와 제2형당뇨 모델동물의 차이로 해석할 수 있다.</p> <p>이상의 결과를 종합해보면, 맥문동의 MeOH과 hexane 추출물인 LP9M80-H는 지방의 무게를 줄여주는 효과가 우수하며, 인슐린 분비를 촉진시켜 당뇨를 개선하는 기능을 갖고있다. 이러한 결과를 토대로, 맥문동 추출물의 순수성분을 찾아내고 기능과 메카니즘 연구를 병행한다면 항당뇨와 항비만 효능을 갖는 우수한 치료제를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>초록 : OLETF 당뇨모델동물을 이용한 맥문동 추출물(LP9M80-H)의 당뇨질환에 대한 효능</h1> <p>LP9M80-H는 맥문동(Liriope platyphylla)으로부터 메탄올과 헥산을 이용하여 추출한 새로운 추출물로서 ICR 마우스에서 인슐린분비를 촉진하며, 간과 뇌 조직에서 인슐린 신호경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 LP9M80-H가 당뇨와 비만의 치료에 미치는 효과를 조사하기 위하여, OLETF 모델동물에 LP9M80-H를 2주간 투여한 후 당뇨와 비만과 관련된 주요인자의 변화를 관찰하였다. 비록 체중은 두 집단간에 차이가 없었으나 복부 지방량은 vehicle 투여군보다 LP9M80-H 투여군에서 적었다. 또한, 혈중 포도당농도는 P9M80-H를 투여한 OLETF 랫드가 대조군에 비하여 약간 낮았으나 인슐린의 농도는 유의적으로 크게 증가하였다. 혈청 내 3가지 주요 지질의 농도는 LP9M80-H를 투여한 OLETF 랫드에서 유의적으로 감소하였고, 지방의 산화를 촉진하는 아디포넥틴의 농도도 LP9M80-H를 투여한 LETF 랫드에서 감소하였다. 더불어, 체내에 분비된 인슐린이 표적장기에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 간조직에서 인슐린 수용체와 인슐린 수용체기질(IRS)의 발현을 관찰하였으며, 이러한 2가지 단백질은 LP9M80-H를 투여한 OLETF 랫드에서 vehicle 투여군에 비해 유의미하게 감소하였다. 또한, 인슐린 신호 경로의 다운스트림에 위치하는 포도당 수송체 중에서 Glut-2와 Glut-3 발현은 LP9M80-H를 투여한 OLETF 랫드에서 유의미하게 감소하는 반면에, Glut- 4 발현은 일정하게 유지되었다. 따라서 이러한 결과는 LP9M80-H는 포도당 항상성과 지질농도의 조절을 통하여 당뇨와 비만의 증상을 완화시키는데 기여할 것으로 사료된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>맥문동의 표제 및 추출</h2> <p>맥문동은 2009년 5월에 밀양지역에서 재배된 괴근으로 밀양 한약재 판매상으로부터 구입하여 전통적인 방법으로 맥문동 괴근을 찐 다음 햇볕에 말리기를 9회 반복하여 제조한 구증구포 재료(LP9)를 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 시료로 사용하였다. 구증구포한 괴경 \( 1 \mathrm{~kg} \)을 \( 80 \%\) MeOH로 3회 반복 추출한 \( 80 \% \) MeOH 추출물을 회전증발기로 MeOH를 증발한 다음 남은 물층에 \( 1,200 \mathrm{~ml} \)의 hexane을 가한 다음 분획여두로서 hexane 추출물을 3회 분획하여 hexane 추출물 \( 0.410 \mathrm{~g} \)의 LP9M80-H을 얻었다.</p> <h2>동물실험 설계</h2> <p>실험에 사용된 OLETF 랫드는 유전적으로 늦게 발현되는 경증의 비만과 제2형 당뇨의 변화를 나타내어 비만, 당뇨의 약물치료 실험에 많이 이용되는 모델이다. Specified pathogen-free (SPF) 상태의 OLETF 랫드(20주령, \( 300 \pm 30 \mathrm{~g}) \)를 오츠카제약(주)(Japan)에서 제공받았으며, 방사선이 조사된 사료(Purina, Seoungnam, Korea)를 자유급식하도록 하였고, 12시간의 조명주기(08:00 12:00)로 SPF 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 5 \% \) )에서 사육하였다. 또한 본 연구는 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNUIACUC)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인(승인번호: PNU-2010-00098)을 받아 수행되었다.</p> <p>실험동물을 5마리씩 3군(LETO군, OLETF-Vehicle군, OLETF-LP9M80-H 처리군)으로 무작위로 배정하였다. LETO군은 LETO 랫드에 아무것도 처리하지 않았고, Vehicle처리군은 OLEIF 렛드에 olive oil 만을 격일로 2주 동안 \( 2 \mathrm{~ml} \)/회씩 경구 투여하였고, LP9M80-H 처리군은 OLETF 렛드에 LP9M80-H를 \( 40 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \)의 농도로 olive oil에 희석하여 격일로 2주동안 \( 2 \mathrm{~ml} \)/회씩 경구 투여하였다. 2주 경과 후 모든 랫드는 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용해서 안락사하여 혈액과 조직들을 적출하였다.</p> <h2>체중 및 지방무게 측정</h2> <p>랫드의 체중은 경구투여 전과 부검 전에 화학저울(Mettler toledo, Greifensee, Switzerland)을 이용하여 측정하였다. 지방의 무게는 2주 동안 물질을 처리한 후 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용해서 안락사하여 복부지방을 적출하여 측정하였다.</p> <h2>혈당량 측정</h2> <p>랫드의 혈당량은 경구투여 전과 부검 전에 실험동물의 꼬리정맥을 절단하여 혈당측정기(CareSens II, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>인슐린 분비량 측정</h2> <p>LP9M80-H에 의한 인슐린 분비량은 Mercodia사의 Insulin ELISA kit (Cat.10-1113-01)를 이용하여 권장법에 따라 측정하였다. 먼저 렛드의 혈액을 상온에서 30분간 방치한 후 원심분리하여 혈청을 분리한다. 분리된 혈청은 ELISA kit의 각 well에 \(25\ \mu\mathrm{l}\)씩 넣고, \(100\ \mu\mathrm{l}\)의 enzyme conjugate solution을 첨가하여 plate shaker에 1시간 동안 방치하여 항원-항체반응을 유도하였다. 1시간 후 상층액을 제거하고, wash buffer (\(350\ \mu\mathrm{l}\))를 이용하여 비특이적으로 결합된 단백질이나 결합되지 않은 단백질을 세척하였다. 여기에 \(200\ \mu\mathrm{l}\)의 substrate (TMB)을 첨가하여 실온에서 15분 동안 효소반응을 유도한 뒤 \(50\ \mu\mathrm{l}\)의 stop solution을 첨가하여 반응을 종결하였다. 반응종결에 따라 나타난 변화는 ELISA-reader (VERSA max, micro-reader, MDS. Co, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>비정상적인 인슐린 조절, 지질 및 탄수화물 대사 장애가 특징인 당뇨병은 전세계의 주요 건강 문제 중 하나이다. 일반적으로 당뇨병은 고혈당증과 심혈관증과 신장병, 망막병증 및 신경 장애와 관련된 심각한 합병증을 초래한다. 당뇨병의 발병기전으로는 크게 두 가지가 알려져 있으며, 제1형 당뇨병은 췌장베타세포가 기능을 상실하여 인슐린을 제대로 분비하지 못하게 되는 것이다. 제2형 당뇨병은 췌장베타세포에서 인슐린이 정상적으로 생산되지만 이들이 분비되지 못하거나 혹은 표적조직 내에 수용체의 이상으로 정상적인 신호전달과정이 발생하지 못하여 발생하며, 인슐린비의존성당뇨(Non-insulin dependent diabetes)라고 한다. 전체 당뇨환자의 \( 90 \% \)가 제2형 당뇨증상을 나타내기 때문에 많은 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직 효과적인 치료제가 개발되지 못하고 있다. 따라서 본 연구에서도 제2형 당뇨질환에 대한 효과를 평가하기 위해 OLETF 랫드 모델을 이용한 실험을 수행하였다. 현재까지 많은 설치류 당뇨병 모델이 개발되어 있으며, 그 중에서 OLETF 랫드는 인슐린 저항성을 가진 제2형 당뇨병 연구에 널리 사용되는 모델이다. 또한 OLETF 랫드는 과식증, 비만, 고인슐린증에도 널리 사용되고 있다.</p> <p>새로운 당뇨병 치료제를 개발하기 위한 연구 중에서 인슐린 조절에 효과적인 천연식물을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있다. 제2형 당뇨병의 치료에 사용되고 있는 약물인 Troglitazone은 일본에 서식하는 식물에서 추출하여 만든 인슐린 저항성을 감소시키는 것으로 최초로 개발된 약물이다. 하지만 Troglitazone을 투여한 동물실험에서 간 독성이 나타났다. 또한, 둥글레 추출물도 인슐린 민감성을 촉진하여 항고혈당증을 완화시켜 주었다. 옻나무의 주요 플라보노이드인 Sulfuretin은 streptozotocin에 의해 유발된 고혈당증 및 저인슐린혈증을 억제하였다. 본 연구에서 사용된 맥문동은 이전부터 당뇨 및 비만에 대한 치료효능이 있는 것으로 알려지면서 개발 가능성이 매우 높은 후보물질이다. 따라서 본 연구에서는 맥문동의 새로운 치료제로서의 발전 가능성을 기반으로 당뇨 및 비만에서 효능과 기전에 대한 메커니즘을 증명하고자 후보물질로 선정하여 연구를 수행하였다.</p> <p>맥문동의 당뇨 및 비만질환연구를 위해 다양한 형태의 추출물들이 사용되었다. 단순히 물을 이용하여 추출한 유수추출물, \(70\%\) MeOH을 이용하여 추출한 추출물, \( 80 \% \) MeOH과 hexane을 이용하여 추출한 추출물 그리고 맥문동의 일부를 첨가하여 다른 추출물과 혼합한 물질을 이용한 연구 등이 수행되었다. 본 연구에서는 이전에 본 연구실에서 ICR마우스를 이용하여 맥문동의 당뇨 치료효능을 연구하는데 사용한 \( 80 \% \) MeOH과 hexane 추출물인 LP9M80-H를 사용하여 분석하였다.</p> <p>실험동물의 체중은 질병의 변화를 일차적으로 확인할 수 있는 좋은 지표이다. 맥문동이 포함된 경신강제환을 투여한 OLETF 랫드의 체중은 유의적으로 감소하였지만, 본 실험에서는 체중의 변화가 유의적으로 관찰되지 않았다. 이것은 투여물질의 종류, 혹은 투여기간에 기인한 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>당뇨병은 인슐린의 생산 부족 또는 표적 세포의 부적절한 반응으로 일어난 높은 혈당 농도가 특징인 질병이다. 전통적으로 췌도 이식술, 인슐린 섭취, 신약 개발과 같은 많은 치료 전략이 이러한 대사 장애의 치료에 시도되고 있지만, 대부분의 연구는 인슐린 분비 능력 향상과 당뇨병 증상을 개선하기 위한 인슐린 감도를 개선하는 분자를 찾는데 주력하고 있다. 인슐린 신호, 경구 혈당 강하제, 각종 보완 및 대체의학에 포함되는 분자들은 다양한 천연재료에서 화학합성 및 추출로 개발 될 수 있다. 지금까지 천연물의 많은 구성성분들이 당뇨병의 치료에 사용되고 있다. 당뇨병에 사용되고 있는 Liriope platyphylla Wang et Tang, Momardica charantia L., Pterocarpus marsupium Roxb. 그리고 Triganella foenum L. 등을 포함한 410개의 약용 식물이 당뇨병의 치료에 사용되고 있지만 오직 109개의 식물에서만 당뇨 치료의 구체적인 효능과 메커니즘이 알려져 있다.</p> <p>맥문동(Liriope platyphylla)은 북반구의 온대지방에 널리 분포하는 다년생식물로서 근경(vegetative rhizomes)과 종자를 통해 번식할 수 있는 식물이다. 오래 전부터 맥문동은 한국과 중국에서 기침, 가래 등의 질병치료제로 한방에서 주로 사용되어 왔으며, 최근에는 당뇨 \( \cdot \)비만 치료, 기억력 증진, 미생물 성장 억제, 염증억제 등의 기능이 알려져 있다. 이러한 기능 중에서 맥문동의 당뇨와 비만에 대한 효과는 일부 연구에서 확인되었다. 맥문동의 homoisoflavone-enriched fraction을 분리하여 3T3-L1 adipocytes에 처리하면, 인슐린 농도와 glucose uptake가 증가되었다. 이러한 결과는 맥문동의 추출물이 인슐린 sensitizer로서 기능을 제시하고 있다. 또한 OLETF 랫드에 8주 동안 맥문동이 첨가된 경신강제환을 투여하여 체중, leptin 농도, 먹이섭취량, peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPAR- \( \alpha \)) 발현 등의 감소현상을 관찰했다. 그러나 스팀과 건조과정을 반복하여 제조된 가공 맥문동의 hexane 추출물을 비만 \( \cdot \)당뇨 모델 동물에 투여하여 그 효능을 평가한 연구는 아직 수행되지 않고 있다.</p> <p>따라서, 본 논문에서는 증숙된 맥문동에서 MeOH과 hexane을 이용하여 추출한 LP9M80-H가 OLETF 랫드에서 당뇨와 비만에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 그 결과 LP9M80-H 물질이 인슐린 분비를 촉진시키고, 혈중 지방농도를 낮춰주는 효과를 확인함으로써 당뇨와 비만 치료제로서의 가능성을 제시하고 있다.</p> <h2>면역염색</h2> <p>랫드에서 적출한 췌장을 \( 10 \% \) formalin용액에 고정한 뒤, 조직처리기(Thermo Shandon Ltd./Thermo Fisher Scientific, England)와 Paraffin Embedding Station (LEICAMICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 이용하여 블록을 만들어 Rotary Microtome (LEICA MICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 사용하여 박절하였다. 박절된 조직의 면역염색을 실시하기 위하여 xylene과 ethanol에 담근 뒤, \( 3 \%\ \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)에 10분간 배양한 후 \( 1 \times\) PBS로 세척하였다. \( 10 \% \) BSA에 담궈 10분간 blocking 한 뒤에 인슐린항체 Antibody (#4590, Cell Signaling Technology)와 \(1\%\) BSA를 1:100 농도로 희석한 뒤에 슬라이드에 \(100\ \mu\mathrm{l}\)씩 떨어뜨려 밤새 배양하였다. \( 1 \times\) PBS로 세척한 후에 Polink-2 Plus HRP Detection Kit for Rabbit Primary Antibody (with DAB chromogen) (Golden Bridge International, USA)를 이용하여 염색하고 permounting를 실시한 후 현미경을 이용하여 관찰하였다.</p> <h2>혈청 분석</h2> <p>LP9M80-H이 OLETF 랫드의 혈청에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 혈청내 지질의 농도를 관찰하였다. 랫드를 약 8시간동안 절식하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용하여 안락사한 후 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에서 30분 동안 방치한 후 원심분리하여 혈청을 수확하였으며, 혈청 내 단백질의 변화는 혈청분석기(HITACHI 7080 Automatic Analyzer, Japan)를 이용하여 triglyceride, cholesterol, LDL의 3개 항목에 대하여 분석하였다.</p> <h2>Westem Blot 분석</h2> <p>인슐린 수용체 신호전달과정의 변화를 관찰하기 위하여, 실험동물로부터 간 조직을 추출하여 \( 100 \mathrm{~mg} \)에 PRO-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, 17081)을 첨가하여 분쇄한 후 \( 13,000 \mathrm{~rpm} \) 에서 5분 동안 원심분리하여 단백질을 분리하고, SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology, 21071)을 이용하여 단백질을 정량하여 western blot 분석에 사용하였다. \(4-20\%\) SDS-PAGE gel에 \( 50\ \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 전기영동한 후 ECL membrane (Amersham Life Science, RPN2020D)에 전이하고, \(3\%\) skim milk에서 2시간 동안 블로킹하였다. 각 membrane은 Insulin Receptor \( \beta \) (Cellsignaling, 3025s), IRS-1 (Cellsignaling, 3407s), Glut-2 (abcam, ab554460), Glut-3 (abcam, ab15311), Glut-4 (abcam, ab41529)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 밤새 배양한 후 HRP-conjugated secondary antibody를 첨가하여 ECL Kit (Amersham Life Science, RPN2108)를 이용하여 발광량을 측정하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>대조군 LETO 랫드와 OLETF 랫드 사이에 통계적 유의성은 one-way ANOVA 분석(SPSS for windows, Release 10.01; SPSS, USA)을 이용하여 실시하였고, OLETF 렛드 내에서 vehicle 처리군과 LP9M80-H 처리군 간의 통계적 유의성은 T-test를 이용하여 실시하였다. 모든 값은 평균\( \pm \mathrm{SD} \)로 제시하였고, 유의성 값은 \( p \times 0.05 \)로 설정하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>LP9M80-H가 OLETF 랫드의 체중과 복부 지방량에 미치는 영향</h2> <p>LP9M80-H가 비만과 당뇨가 유발된 실험동물인 OLETF 랫드의 체중과 복부 지방량에 어떠한 영향을 미치는지 관찰하기 위하여 경구투여 전과 부검 전에 체중을 측정하였고, 부검시 복부지방을 적출하여 무게를 측정하였다. 그 결과, LETO 랫드에 비해서 OLETF 랫드의 체중은 유의적으로 증가하였다. 그러나 LP9M80-H를 투여한 OLETF 랫드는 vehicle군에 비하여 체중이 약간 감소하는 경향을 나타내었으나 두 집단 사이에서 유의적인 차이는 없었다. 또한, 복부지방의 무게도 OLETF 랫드가 LETO 랫드보다 유의적으로 증가하였다. 그러나 LP9M80-H를 처리한 랫드는 vehicle군에 비하여 유의적으로 복부지방이 약 \( 18 \% \) 정도 감소하였다. 이러한 결과로부터 OLETF 랫드가 비만이 유발된 실험동물임을 확인 할 수 있었고, LP9M80-H 처리는 체중에 유의적인 영향을 미치지않지만 복부지방을 감소시키는 효과가 있음을 나타내고 있다.</p> <h2>LP9M80-H가 OLETF 랫드의 혈당 조절에 미치는 영향</h2> <p>LP9M80-H가 혈당량에 미치는 영향을 평가하기 위해 OLETF 랫드에 마지막으로 추출물을 투여하고 8시간 동안 절식시킨 뒤, 랫드의 혈액을 채취하여 혈당량을 측정하였다. 그 결과, LETO 랫드는 약 \( 110 \mathrm{~mg} / \mathrm{dl} \)이고 OLETF 랫드가 약 \(100 \mathrm{~mg} / \mathrm{dl} \)으로 약간은 감소하였으나 유의적인 차이는 없었다. 그러나 LP9M80-H를 투여한 OLETF 랫드는 vehicle 처리한 랫드에 비해 유의적으로 혈당이 감소하였다. 이러한 결과는 LP9M80-H는 OLETF 랫드의 혈당을 감소시키는 효과를 나타낼 수 있음을 제시하고 있다.</p> <h2>LP9M80-H가 인슐린의 분비에 미치는 영향</h2> <p>인슐린은 체내의 혈당변화를 조절하는 중요한 역할을 하는 인자이다. 따라서, LP9M80-H 처리에 의한 혈당의 변화가 인슐린에 의해 유도되는지 확인하기 위해 혈청내 인슐린의 변화를 ELISA kit를 이용하여 분석하였다. 그 결과, OLETF 렛드는 LETO 렛드와 혈청내 인슐린의 농도에 유의적인 차이가 없었으나, LP9M80-H를 처리한 렛드는 인슐린의 분비량이 급속히 증가하였다. 또한, 이러한 혈청내 인슐린 농도의 변화가 인슐린 분비기관인 췌장조직의 베타-세포에서도 변화를 나타내는지 확인하기 위해 면역염색을 실시하였다. 그 결과, 혈청 내 인슐린 농도의 변화와 유사한 양상이 인슐린 면역염색에서도 관찰되었다. 췌장세포에서 확인된 인슐린 농도는 OLETF 랫드가 LETO 랫드보다 약간 증가하였으며, LP9M80-H를 처리한 OLETF 랫드에서는 급격히 증가하였다. 따라서 이러한 결과는 LP9M80-H는 OLETF 랫드에서 인슐린분비를 촉진시키는 역할을 함을 제시하고 있다.</p> <h2>LP9M80-H가 지방대사에 미치는 영향</h2> <p>Adiponectin은 Adipo 유전자에 의해 발현되는 지방세포에서 분비되는 단백질 호르몬으로 식욕조절 및 체내 지방축적을 조절하고, 인슐린 민감도와 세포생존을 촉진시키며, 염증을 감소시킨다. LP9M80-H가 혈청 내 adiponectin의 농도에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 ELISA kit를 이용하여 LETO 랫드와 OLETF 랫드에서 분리된 혈청에서 adiponectin 농도를 측정하였다. 그 결과, adiponectin의 농도는 OLETF 랫드가 LETO 랫드보다 유의적으로 약 \( 45 \% \) 정도 증가하였으며, LP9M80-H를 처리한 랫드에서는 LETO 랫드의 수준으로 감소하였다. 이러한 결과는 LP9M80-H는 OLETF 랫드의 지방세포에서 adiponectin의 분비를 정상수준으로 회복시켜 주는 기능을 나타냄을 제시하고 있다.</p> <p>또한, LP9M80-H가 혈청 내 지방의 농도에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 실험군의 랫드에서 분리된 혈청을 이용하여 Triglyceride (TG), Cholesterol (Chol), Low Density Lipoprotein (LDL)의 농도변화를 관찰하였다. 그 결과, TG의 농도는 OLETF 랫드가 LETO 랫드보다 급격히 증가하였으며, LP9M80-H을 처리한 랫드에서는 유의적으로 약간 감소하였다. 그러나 Chol과 LDL의 농도는 vehicle을 처리한 OLETF 랫드에서 증가하였으나, LP9M80-H을 처리한 OLETF 랫드에서는 LETO 랫드의 수준으로 감소하였다. 이러한 결과는 LP9M80-H는 OLETF 랫드에서 혈청 내 지방을 효과적으로 감소시키는 효과를 나타냄을 제시하고 있다.</p> <h2>LP9M80-H가 인슐린 수용체 신호전달과정과 Gluts의 발현에 미치는 영향</h2> <p>체내에 분비된 인슐린은 표적장기의 세포표면에 발현되는 인슐린 수용체와 결합하여 IRS-1을 통한 신호를 전달하며, 이러한 신호는 Gluts의 발현을 비롯한 다양한 세포내 신호전달 과정을 조절한다. 따라서 LP9M80-H에 의해서 혈청 내 증가된 인슐린이 표적세포의 인슐린 수용체 신호전달과정과 Gluts에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 간세포를 이용하여 단백질발현의 변화를 관찰하였다. 그 결과, OLETF 랫드의 간세포에서 인슐린 수용체 \( \beta \)의 발현은 LEIO 랫드보다 감소하였으며, LP9M80-H를 처리한 랫드의 간세포에서는 유의적으로 증가하였다. 또한, 인슐린 수용체의 downstream에서 신호를 전달하는 IRS-1의 발현은 인슐린 수용체와 비슷한 발현양상을 나타내었다. Vehicle처리한 OLETF 랫드에서 IRS-1의 발현은 LETO 랫드보다 감소하였으며, LP9M80-H를 처리한 OLETF 랫드에서는 증가되어 LETO 랫드 수준으로 회복되었다. 이러한 결과는 LP9M80-H는 OLETF 랫드에서 발현이 감소된 인슐린 수용체 \( \beta \)와 IRS-1의 발현의 증가를 유도하는 효과가 있음을 제시하고 있다.</p> <p>또한, 간 조직에서 3종류의 Gluts 발현을 분석한 결과, OLETF 랫드에서 Glut-2와 Glut-4의 발현은 LETO 랫드보다 유의적으로 증가하였고, LP9M80-H를 처리한 OLETF 랫드에서는 발현량이 더욱 증가하였다. 그러나 Glut-3발현은 OLETF 랫드와 LETO 랫드에서 유의적인 차이가 없었으나 LP9M80-H를 처리한 랫드에서는 발현이 감소하였다. 이러한 결과는 LP9M80-H는 Gluts발현을 조절할 수 있음을 제시하고 있다.</p>	생명
Enterococcus faecalsis 유래의 신규 L-aspartate β-decarboxylase의 cloning, 정제 및 활성 규명	<p>아미노산은 생리적 역할 외에도 맛과 영양을 가지고 있어 식품용, 사로용, 의약용, 미용원료, 합성원료용 등으로 널리 이용되며 이중 부가가치가 높은 의약용 아미노산은 대부분 일본과 유럽 회사들이 독점 생산하고 있는 실정이다. 알라닌(L-alanine)은 감미료의 개질(改質)제, 화장품 및 의약원료로도 사용되어 전세계적으로 1998년 현재 11,000톤이 생산되었고 향후 그 수요가 증가될 전망이지만[19] 현재 국내에서는 L-alanine의 산업적 생산이 어려워 주로 일본으로부터 전량 수입되고 있는 실정이다.</p> <p>아미노산의 생산은 산(acid) 분해 후의 추출법, 균주를 이용한 발효법, 효소를 이용한 효소법, 화학적으로 합성하는 화합법 등이 있는데 L-alanine의 생산에는 주로 세균을 이용한 미생물 발효법과 ADC (L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase)를 이용하여 저가의 L-aspartic acid로부터 고가의 L-alanine을 생산하는 효소법이 있다. 이중 세균을 이용하는 미생물 발효공정은 낮은 생산수율과 D-form과 L-form의 이성질체가 동시에 생성되어 상품성이 떨어지는 문제가 있어 ADC를 이용한 효소적 전환공정이 채택되어 사용되고 있다. 알라닌 생산 균주를 확보하기 위한 시도가 계속되고 있어 Tetrag-enococcus halophila, Thermococcus profundu, Clostridiumspecies, Thermococcus profundus, Pyrococcus furiosus, Pseudomonas speceis, Lactococcus lactis[6] 등의 균주가 보고되어 있으며, 이들은 고부가가치의 L-alanine 생산을 위한 재조합균주와 효소의 유전자원으로 사용될 수 있다.</p> <p>따라서 ADC를 이용한 L-alanine의 산업적 생산을 위해서는 기존 균주가 아닌 새로운 균주를 이용하는 것이 필요하다고 판단된다. 이에 본연구에서는 새로운 ADC 유전자를 얻기 위하여 전체 유전체 염기서열이 밝혀져 있지만 아직 ADC 유전자에 대한 연구가 이루어져 있지 않은 Enterococcus faecalis 균주로부터 새로운 ADC 유전자를 찾아내고 ADC를 생산하는 재조합 균주를 제조하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, plasmid 및 배양</h2> <p>새로운 ADC 유전자원으로 Enterococcus faecalis 균주(KCTC 2011)를 이용하였고 nutrient broth 배지를 사용하여 진탕배양하였다 \( \left (30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \right ) \). 유전자의 cloning과 발현을 위하여 각각 E. coli DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 \( \mathrm { BL } 21 \) (DE3) (Invitrogen)를 이용하였고, Luria-Bertani (LB) 배지틀 사용하여 진탕배양하였다 \( \left (37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \right ) \). 필요에 따라서 LB 배지에 항생제 ampicillin \( (100~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)을 첨가하여 사용하였다. pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI, USA)와 pTXB1 (New England BioLabs Inc., Beverly, MA,USA)을 각각 cloning 및 발현용 plasmid로 사용하였다.</p> <h2>Primer의 설계</h2> <p>Enterococcus faecalis 균주의 유전체 전체 서열을 확보한 후 MacVector (Accelrys, USA)를 이용하여 유전자 분석을 행하였고, 그 결과를 토대로 L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase 유전자의 증폭을 위해 forward primer EF_ADC02-F (-27/-6 relative to the start codon ATG, 5'-TGA CTG TGT GTG CTT CAG GAG G-3') 및 reverse primer EF_ADC02-R( + 1866/ + 1847, 5'-TGC TTT GTC TCT TGC GGA CC-3')을 제작하여 사용하였다. 클로닝된 유전자를 발현 plasmid에 십 입하기 위한 단편의 증폭을 위해서는 EF_ADC_E2-F ( + 1/ + 21), 5'-CAT ATG ATA ACA AGT GAT GAA TTG-3', 밑줄 은 NdeI site)와 EF_ADC_E2-R ( + 1608/ + 1585, 5'-CTC GAG TTT AAT TGC TTG GCG CTT TTG GCG-3', 밑줄은 Xhol site)을 제작하여 사용하였다. 클로닝에 사용한 primer들은 (주) 바이오니아(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.</p> <h2>L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase 유전자의 발현 및 정제</h2> <p>구축된 ADC 유전자의 발현 플라스미드 pTXB1-EF_ADCE22를 이용하여 대장균 BL21 (DE3)를 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 LB (Amp) broth \( 10 \mathrm{ml} \) 에 접종하고 하룻밤동안 진탕배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \) 한 후 배양액을 LB (Amp) broth \(\mathrm{1 ~L} \)에 재접종하여 3시간동안 추가로 진탕배양(37° \( { }^{\circ}, 250 \)\( \mathrm{rpm} \) 하였다. 여기에 IPTG를 최종농도 \( 0.3 \mathrm{mM} \)이 되도록 첨가하여 다시 3시간동안 진탕배양 \( \left(30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \) 하였다. 배양된 균체를 원심분리 \( (4,000 \times g, 10 \) 분 \( ) \) 하여 균체를 회수한 후,여기에 ice-cold column buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) Tris ( \( \mathrm{pH} \) 7.4), \( 0.5 \mathrm{M} \)\( \mathrm{NaCl}, 0.2 \% \) Triton \( X-100,2 \mathrm{mM} \) EDTA) \( 30 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 현탁한 후, 초음파처리로 균체를 파쇄하고 이를 다시 원심분리 \( (20,000 \times g, 20분 \) \( ) \)하여 상층액을 취하여 세포추출액으로 하였다. 세포추출액을 column buffer로 평형시킨 chitin bead column ( \( 20 \mathrm{ml} \) of set volumes, New England Biolabs, MA,USA)에 주입하여 부착시켰다. Column buffer로 column을 세정한 후, cleavage buffer (column buffer with \( 30~ \mathrm{mM} \) DTT)로 평형시키고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤동안 방치하였다. 정제된 단백질은 column buffer \( 50~ \mathrm{ml} \)로 용출시켰다. 단백질의 양은 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 BCA protein as- say reagent (Pierce Biotechnology, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase의 활성측정</h2> <p>L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase의 활성은 효소반응의 결과 L-aspartate에서 유리되는 \( \mathrm{CO}_{2} \)를 압력계 \( \left(\mathrm{CO}_{2}\right. \) gas analyzer,model CD95)를 이용하여 측정, 정량 하는 방법으로 측정하 였다. 시험관에 효소액(Enzyme 15 or \( 128.6 \mu \mathrm{g}, 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 5.0), \( 2 \mathrm{mM} \) a-ketoglutaric acid, \( 0.86 \mathrm{mM} \) pyridoxal \( 5^{\prime} \)-phosphate, Bovine serum albumin ( 1 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) ) \( 2.5 \mathrm{ml} \) 를 넣고 반응조에서 온도를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 맞춘 후, 여기에 온도를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 맞춘 기질액(40 mM L-aspartic acid, \( \mathrm{pH} \) 5.0) \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 넣고 섞어 반응시킨 후 발생하는 \( \mathrm{CO}_{2} \)를 압력계를 이용하여 반응 1분 후에 측정하고, 이후 5분 간격으로 측정하였다. 대조구는 효소를 제외하고 실험을 진행하였으며 실험구와 대조구의 차이값을 기록하여 활성으로 하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>SDS-PAGE는 \( 11 \% \) polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법으로 행하였다. 효소용액을 sample buffer와 흔합하여 5분간 꿇인 후 gel에 주입하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Enterococcus faecalis의 ADC 유전자의 분석</h2> <p>고순도의 L-alanine 생산을 위해 새로운 균주를 이용한 시도가 많이 있었고 재조합 대장균을 이용한 생산)등도 보고되고 있어 저자들은 신규 ADC (L-aspartate \( \beta \) -decarboxylase) 유전자를 확보하기 위하여 게놈 프로젝트가 완료된 세균들을 대상으로 현재까지 알려진 ADC 유전자 의 염기서열간의 비교를 수행하였지만 상동성을 찾을 수 없 었다. 하지만 아미노산서열로 검색한 결과 Pseudomonas dacunhae 유래의 ADC (NCBI accession #, BAC65229)와 부 분적 상동성을 가진 영역을 Enterococcus faecalis의 게놈서열 에서 확인할 수 있었다. MacVector 프로그램을(Accelrys, USA) 이용하여 상동성을 갖는 부위는 약 \( 1600 \mathrm{bp} \)의 ORF로 구성되어 있으며 게놈서열에서는 아직 기능을 정확히 알 수 없는 putative protein을 발현시키는 유전자로 표시된 것을 확인하였고 연구를 수행하였다. 본 연구에서의 Enterococcus faecalis의 ADC 와 Psudomonas dacunhae의 ADC의 아미노산 서열을 비교한 것으로 약 \( 48 \% \)의 상동성을 나타내 는 것을 알 수 있다.</p> <h2>재조합 ADC 유전자의 발현</h2> <p>EF_ADC02-F/EF_ADC02-R primer set를 이용한 약 1,900 bp의 PCR 산물을 pGEMT-easy vector (Promega, USA)와 연결하고 E. coli DH5a에 형질전환시킨 후 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 EcoRI으로 절단하여 약 \( 1900 \mathrm{bp} \) 크기의 단편을 확인하여(data not shown) pGEMTe-EF_ADC022를 구축하였다.</p> <p>pGEMTe-EF_ADCO22 플라스미드를 주형으로 EF_ADC_E2-F/ EF_ADC_E2-R primer set를 이용하여 DNA 단편을 증폭하고 이를 대장균용 발현벡터에 연결하여 최종적으로 Enter-ococcus faecalis의 ADC 유전자의 발현을 위한 플라스미드인 pTXB-EF_ADCE22를 구축하였다.</p> <p>Fig. 2는 pTXB-EF_ADCE22로 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 를 이용하여 발현된 ADC 단백질을 정제하여 SDS-PAGE 상에서 확인한 것으로 분자량이 약 \( 59~ \mathrm{KDa} \)이며, 불순물을 포함하지 않는 순수한 ADC로 정제된 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>재조합 ADC의 활성</h2> <p>Fig. 3은 정제된 재조합 ADC의 활성을 나타낸 그래프이다. ADC는 aspartate에 작용하여 탈탄산 작용을 통하여 ala-nine을 생산하는데 Fig. 3를 보면 \( 128.6 \mathrm{ug} \)의 효소를 사용하였을 때 \( 15 \mathrm{ug} \)을 사용한 경우와 달리 5 분 이내에 대부분의 반응이 이루어지는 것을 알 수 있었다. 이로써 값이 저렴한 aspartete를 대상으로 1단계의 효소반응으로 부가가치가 높은 alanine의 생산을 기대할 수 있었다. Alanine은 다양한 경로로 생성되지만 aspartate를 이용한 생산이 효과적이며 ADC를 이용한 생산이 가장 효율적인 것으로 보고되어 있다.</p> <p>본 연구는 게놈서열이 완료된 균체를 대상으로 한 신규효소 개발에 이용될 수 있을 것이다. 즉 알려진 유전자와 기능은 알 수 없지만 염기서열이 알려진 게놈과의 비교로 가능성있는 균체를 선정하여 신규효소를 개발하였다. 신규 유전자가 생산하는 단백질의 아미노산 분석 결과와(Fig. 1) 재조합 단백질의 정제률(Fig. 2) 통하여 537개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 \( 59~ \mathrm{KDa} \)의 효소를 얻을 수 있었고 실제로 예상했던 ADC의 기능을 보유하고 있음을 확인한 것은(Fig. 3) 향후 연구의 토대를 마련하였다 할 것이다. 또한 저가의 aspar-tate를 이용한 고부가가치 L-alanine을 생산할 수 있는 신규효소의 개발과 이를 토대를 한 생산균주를 개발할 수 있는것도 의미있는 일이라 할 것이다.</p> <h2>ADC 유전자의 증폭, cloning 및 발현플라스미드의 제작</h2> <p>Genomic DNA isolation kit (Promega)를 사용하여 확보 된 Enterococcus faecalis 균체로부터 genomic DNA를 분리하였다. 분리된 Enterococcus faecalis의 genomic DNA를 주형으로 하여 forward primer EF_ADC02-F와 reverse primer EF_ADC02-R을 이용하여 ADC 유전자 단편의 중폭(PerkinElmer model 2400 thermal cycle, USA)을 행하였다. DNA 단편의 증폭은 정확성을 기하기 위하여 Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하였다. 증폭 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응한 후 30 cycle의 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분을 반복 수행하였고 마지막 extension을 위하여 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 증폭이 끝난 반응액은 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 행하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 목적 DNA 단편을 pGEM-T easy vector (Promega)에 연결하고 대장균(E. coli DH5a)으로 도입하여 형질전환시켰다. 유전자의 cloning과 형질전환에는 Sambrook et al.의 방법을 이용하였다. 클로닝된 재조합체 plasmid를 갖는 E. coli DH5a를 LB (ampicillin, \( 100~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ) broth 배지 \( 4~ \mathrm{ml} \)를 이용하여 배양하고 원심분리 \( (12000 \times g, \) 5분 \( ) \)하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체로부터 Plasmid mini kit (Quiagen, USA)를 이용하여 플라스미드를 분리하고 제한효소 EcoRI으로 절단하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 이렇게 제작된 재조합 플라스미드를 pGEMTe-EF_ADC022라고 명명하였다. 삽입된 DNA 단편에 대한 염기서열 결정은 (주) 바이오 넥스(Seoul, Korea)에 의뢰하여 행하였다.</p> <p>클로닝된 재조합체로부터 Plasmid mini kit (Quiagen,USA)를 이용하여 pGEMTe-EF_ADC022를 분리하고 이를 주형으로 하여 발현 plasmid 제작을 위하여 적절한 위치에서 제한효소를 작용시킬 수 있는 primer set인 EF_ADC_E2-F와 EF_ADC_E2-R를 이용하여 발현 plasmid 제작용 ADC 유전자 단편의 증폭(Perkin-Elmer model 2400 thermal cycle,USA)을 행하였다. DNA 단편의 중폭은 정확성을 기하기 위하여 Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc., Shiga,Japan)를 이용하였다. 증폭 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응한 후 30 cycle의 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분을 반복 수행하였고 마지막 extension을 위하여 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 증폭이 끝난 반응액은 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 행 하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 목적 DNA 단편을 pGEM-T easy vector (Promega)에 연결하고 대장균 \( ( \) E. coli \( \mathrm{DH} 5 \mathrm{a}) \)에 도입하여 형질전환시켰다. 클로닝된 재조합체 plasmid를 갖는 E. coli DH5a를 LB (ampicillin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ) broth 배지 \( 4~ \mathrm{ml} \)를 이용하여 배양하고 원심분리(12000×g, 5 분)하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체로부터 Plasmid mini kit (Quiagen, USA)를 이용하여 플라스미드를 분리하고 제한효소 EcoRI으로 절단하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 이렇게 제작된 재조합 플라스미드를 pGEMTe-EF_ADCE22 라고 명명하였다. 삽입된 DNA 단편에 대한 염기서열 결정 은 (주) 바이오넥스(Seoul, Korea)에 의뢰하여 행하였다. pGEMTe-EF_ADCE22를 제한효소 NdeI과 Xhol으로 절단 하여 agarose gel에서 전기영동을 행하고 \( 1611~ \mathrm{bp} \) DNA 단 편을 gel extraction kit (Quiagen)를 이용하여 agarose gel로 부터 회수하였다. 회수된 DNA 단편을 대장균용 고발현 플 라스미드인 pTXB의 같은 제한효소 부위에 연결하여 ADC 유전자의 발현 플라스미드를 구축하고 이를 pTXB1-EF_ADCE22로 명명하였다.</p>	생명
디젤분진이 페포대식세포에서 nitric oxide의 생성과 inducible nitric oxide synthase의 발현 및 nitrotyrosilated-protein의 형성에 미치는 효과	<h1>결 과</h1> <h2>폐포대식세포의 분리</h2> <p>Fig. 1에서 (A)-a는 정상 흰쥐에서 채집한 폐 내에서 분리된 세포로서 \( 99 \% \) 이상이 폐포대식세포였다. 그리고 (A)-b는 염증성 질환이 있는 흰쥐의 폐 내에서 분리된 백혈구 세포들로 폐포대식세포가 \( 87 \% \) 를 차지했다. 본 실험에서는 염증성 세포의 존재가 확인된 (A)-b의 세포는 실험의 정확성을 위하여 사용하지 않았다.</p> <h2>DEP 및 LPS의 노출에 따른 폐포대식세포의 형태 변화</h2> <p>DEP \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)만 처리한 실험군에서는 폐포대식세포가 DEP를 탐식하고 있는 것을 확인 할 수 있었으나(Fig. 1, (B)-c), 세포의 형태는 대조군의 세포와 큰 차이를 보이지 않았다(Fig. 1, (B)-a). 그러나 LPS \( (10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \)를 처리한 실험군에서는 세포들이 서로 결합하는 것을 관찰 할 수 있었으며 (Fig. 1, (B)-b) 이러한 현상은 LPS와 DEP를 함께 처리한 실험군에서도 관찰되었다(Fig. 1, (B)-d).</p> <h2>DEP 및 LPS의 노출이 폐포대식세포에서 NO의 형성에 미치는 효과</h2> <p>DEP를 처리한 경우 어느 농도에서도 NO 를 형성하는 효과가 없었다. 그러나 LPS의 경우 농도가 증가함에 따라 비례적으로 NO의 형성이 증가하였다 \( (\mathrm{P}<0.005) \) (Fig. 2).</p> <p>대조군에는 배지만을 처리하였고 실험군으로 DEP \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)과 LPS \( (10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 를 개별적으로 처리한 군들을 설정하여 배양시간 6,12,24,36 시간에 따른 효과들을 비교하였다. LPS만 처리한 군과 LPS 및 DEP가 함께 처리된 군들에서 배양시간에 따라 NO의 형성이 증가하는 것을 볼 수 있었다(P<0.005). 또한, LPS와 함께 DEP를 처리한 군에서 NO 형성 효과는 LPS 처리군과 비교하였을 때 시간의 경과에 따라 유의하게 증가하였다(Fig. 3).</p> <p>세포의 배양시간을 24 시간으로 고정하고 DEP 처리 농도를 변화시켰을 때 \( (5,10,20,40,80 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), LPS와 함께 DEP( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도를 처리한 것에서는 LPS의 단독 처리했을 때보다 NO 형성이 유의하게 증가하였으나, DEP의 처리 농도를 점차 증가시켰을 때는 오히려 NO의 형성을 억제하는 효과를 나타내었다 \( (\mathrm{P}<0.05) \) (Fig. 4).</p> <h2>iNOS 형성을 확인하기 위한 세포면역염색과 Western analysis</h2> <p>실험결과 대조군(a)과 DEP 처리군(c)에서는 세포들에 갈색으로 발색된 iNOS가 전혀 발현되지 않았음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여 LPS군(b)에서는 \( 38 \pm 1.52 \% \), LPS+DEP 처리군(d)은 \( 45.3 \pm 0.33 \% \) 으로 iNOS가 많은 세포들의 세포질에 잘 발현된 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 5).</p> <p>면역염색의 결과를 검증하기 위하여 면역염색을 위한 세포배양 조건과 동일한 조건의 시료에서 Western analysis를 실시하였을 때, densitomer로 양을 측정하여 iNOS를 \( \beta \) -actin으로 나눈 값으로 대조군과 DEP 처리군에서는 iNOS 단백질의 발현이 전혀 감지되지 않았다. 반면, LPS 처리군은 \( 0.28 \) 정도이고, LPS+DEP \( (20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 처리군은 \( 0.33 \) 이며, LPS+DEP \( (40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 처리군은 \( 0.30 \) 으로 감지되었다(Fig. 6).</p> <h2>Nitrotyrosilated-protein에 대한 세포면역염색</h2> <p>대조군 (a) 에서는 \( 16.3 \pm 3.18 \% \), DEP 처리군 (c) 은 \( 13 \pm 1.20 \% \) 로 갈색으로 발색된 nitrotyrosilated-protein이 확인되었다. 또한 LPS 처리군 (b) 에서는 \( 49 \pm 1.15 \% \), LPS+DEP 처리군(d)은 \( 50.6 \pm 0.88 \% \) 로 발현되어 정도의 차이는 있으나 모든 군에서 nitrotyrosilated-protein이 형성된 것을 볼 수 있었다(Fig. 7).</p> <p>최근의 연구에 따르면 전 세계적으로 환경오염이 증가하고 있는 추세이다. 여러 환경오염 중 특히 대도시의 대기오염은 점차 악화되.어 일반 시민의 건강을 위협하고, 심◦폐질환의 발병률과 이로 인한 사망률도 증가한다고 한다. 대표적인 대기 오염물질로는 이산화질소, 오존, 미세분진 등이 있는데 이러한 미세분진의 흡입은 알레르기성 비염 및 천식과 같은 알레르기성 질환과 염증성 폐질환을 악화시킨다고 알려져 있다.</p> <p>대도시의 공기 중에 부유하는 디젤분진(diesel exhaust particles, DEP) 은 미세분진의 일종으로 디젤 연료가 불완전하게 연소되어 발생하는 공기오염물로 산업화에 따른 교통량 및 기타 산업시설의 증가로 인하여 발생되는 양이 해마다 증가하고 있는 추세이고, 이에 따라 DEP에 대한 관심은 사람의 건강과 관련하여 점차 높아지고 있다. DEP는 크기가 작아 기도와 폐포에 침전될 수 있으며 이로 인해 새로운 호흡기계 질환의 유발이나 기존의 염증성 호흡기계 질환에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. DEP는 poly-aromatic hydrocarbons, nitroaromatic hydrocarbons, heter-ocyclics, quinones, aldehydes, aliphatic hydrocarbons과 같은 다양한 유기화합물을 포함하는 유기 탄소 핵으로 이루어져 있으며, 사람이 흡입 시 호흡기 내에서 돌연변이 유발 요인이나 발암물질로 작용한다는 보고가 있다. 또한 각종 급-만성 호홉기 질환들을 악화시키고 알레르기 반응을 악화시킨다고 알려져 있다.</p> <p>호흡을 통하여 외부로부터 이물질이 폐 내로 들어왔을 때 이물질의 제거에 중요한 역할을 담당하는 세포로 폐포대식 세포가 있다. DEP에 의한 폐포대식세포의 다양한 기능 조절에 대한 작용은 잘 알려지지 않은 상태이다. 따라서 본 연구는 DEP가 새로운 호흡기계 질환의 유발이나 기존의 염증성 질환에 있어서 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여 배양된 폐포대식세포에서 nitric oxide (NO) 및 그 관련 물질들을 측정하였다. 각종 흡입성 이물질에 의한 폐 질환의 유발에 있어서 NO 및 NO에 의하여 2차적으로 생성되는 것으로 알려진 peroxynitrite anion \( \left(\mathrm{ONOO}^{-}\right) \)이 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. NO는 다양한 생리 및 병리학적 활성을 나타내어 조직 내의 염증반응에 일정한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.</p> <p>본 연구에서는 다른 흡입성 이물질에 의해서는 그 생성이 유도되는 것으로 알려진 NO가 같은 입자성인 DEP에 의해서는 그 형성에 어떤 영향을 받는지를 확인하였다. 아울러 NO와 함께 폐 손상 및 염증과 관련하여 주목을 받고 있는 \( \mathrm{ONOO}^{-} \)의 형성에 대해서도 nitrotyrosilated-proteins의 정량을 통하여 간접적으로 확인하고자 하였다. 또한 DEP에의 노출이 폐의 세균성 염증을 악화시킨다고 보고 된 바 DEP가 기존 폐의 염증성 질환의 증상에 미치는 효과를 NO의 형성을 통하여 알아보기 위해 세균성 내독소로 알려진 lipopolysaccharide (LPS)를 함께 처리하여 그 관계를 확인하였다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>최근 대도시에서는 대기오염의 정도가 점차 악화되고 있고 이로 인한 질환들도 증가하고 있는 실정이다. 대도시의대기오염 물질 중 큰 비중을 차지하고 있는 것이 미세 분진 으로 특히 경유자동차의 배기가스에 포함되어 분출되는 DEP는 그 유해성이 높은 것으로 알려져 있다.</p> <p>DEP의 흡입에 의한 질환과 관련된 연구들에는 기관지 천식 및 염증성 반응에 관련된 연구가 주로 이루어져왔다. 일반적으로 in vivo 실험에서는 DEP를 흰쥐에 호홉을 통하여 노출시키거나 기관지 내로 직접 처리한 후 기관지 폐포 세척액 속에서 pro-inflammatory cytokines이나 chemokines 및 reactive oxygen synthases의 형성을 측정하는 실험들이 주로 이루어졌다. 한편 in vitro 실험에서도 염증과 면역반응에 관련된 연구들이 주로 시도되었다. 하지만 이전의 연구들은 거의 대부분 기관지 상피세포나 폐의 상피세포를 사용하여 연구된 것들이었다. 따라서 본 연구에서는 흰쥐의 폐장에서 분리된 폐포대식세포만을 배양하여 DEP가 NO의 형성이나 NO의 형성에 따른 이차적 생성물의 생성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 또한, 폐에서 염증성 증상의 유발에 효과가 있는 것으로 알려진 LPS의 생물학적 효과에 DEP가 미치는 영향을 NO의 측정을 통하여 간접적으로 알아보고자 하였다.</p> <p>흰쥐에서 분리한 폐포대식세포에 DEP를 단독으로 처리해 본 결과 NO를 형성하는 효과는 어느 처리농도에서도 볼 수 없었다. 하지만 DEP와 LPS를 함께 노출시켰을 때에는 LPS에 의한 세포가 서로 결합하는 것이 관찰되었고, 이러한 형태학적인 변화는 어떤 활성변화 혹은 부착분자의 생성 등과 밀접한 관련이 있을 것이라고 추측된다. 또한 NO 형성 효과를 시간의 증가에 따라서 유의성 있게 증가시켰다(처리 후 12 36시간). 이는 DEP가 폐포대식세포에서도 일정한 시간이 경과한 후에는 간접적으로 LPS의 NO 형성효과에 영향을 미칠 수 있음을 증명한 결과라고 할 수 있다. 여기에 LPS 고정농도와 함께 DEP의 처리 농도를 점차로 증가한 결과 오히려 NO의 형성을 억제하는 효과를 나타내었다. 이는 농도 증가에 따른 DEP에 의한 직접적인 세포독성의 결과일 것으로 추정한다. 따라서 염증성 질환이 없는 건강한 동물이나 사람에서는 DEP의 흡입이 NO의 형성에 미치는 효과가 없거나, 극히 제한적일 것으로 추정한다. 그러나 염증성 폐 질환이 존재할 경우에는 DEP의 흡입은 NO의 형성을 통하여 부분적으로 질환의 정도를 악화시킬 것으로 추정한다. 또한 건강한 폐포대식세포에서 DEP의 탐식은 NO의 형성 이외에 다른 여러 기전을 통하여 면역이나 염증반응을 일으킬 가능성이 있을 것으로 생각한다. 기관지 폐포 세척세포들에서 DEP의 노출이 iNOS의 mRNA 발현을 증가시키는 것으로 발표된 연구결과가 있다. 하지만 Ito 등이 보고한 동일한 자료에 따르면 in vivo 상 DEP 노출은 폐 내에 호중구를 유입시켰다. 따라서 그 결과는 DEP에 의하여 복합적인 염증성 반응이 시작된 상태에서의 결과라고 유추할 수 있다. 또한 동일한 연구자는 기관지 폐포 세척을 통하여 채취한 세포들을 대식세포와 호중구로 분리하여 \( \mathrm{ONOO}^{-} \)의 형성을 별도로 간접적인 방법을 통하여 측정하였던 바 폐포대식세포에서는 호중구에 비하여 그 형성이 아주 낮은 것으로 보고하였다. 즉, 건강한 폐포대식세포는 DEP의 탐식이나 접촉을 통하여 직접적으로 NO 을 형성하는 작용은 없고, 다른 간접적인 과정을 통하여 자극할 것이라고 추정한다.<p>DEP의 단독 처리는 iNOS의 형성을 유발하지 않았으나, LPS의 단독 및 LPS와 DEP를 함께 처리했을 때에는 iNOS의 발현을 유도하였다. 그러나 LPS를 단독처리 하였을 경우와 LPS와 DEP를 함께 처리했을 때에 유발되는 효과 사이에는 뚜렷한 양적인 차이를 확인할 수 없었다. 이는 DEP와 LPS를 함께 처리했을 때가 LPS를 단독으로 처리하였을 때 보다 NO를 형성하는 효과가 높은 수준으로 증가한 것은 아니었기 때문에 Western analysis방법으로는 미약한 차이로 발현되는 iNOS 단백질의 양을 구분할 수 없었거나, DEP의 처리가 이미 발현된 iNOS 단백질의 활성만을 증가시킨 결과였을 것으로 생각한다.</p> <p>\( \mathrm{ONOO}^{-} \)의 형성은 대조군을 포함한 모든 처치 군에서 어느 정도는 모두 검출이 되었으나, 대조군이나 DEP 처리군과 비교하면 LPS 처리군이나 LPS와 DEP 함께 처리한 군에서 염색의 강도나 양성반응을 보인 세포의 수가 유의하게 증가하였다. 그러나 NO를 형성할 가능성이 전혀 없었던 대조군이나 DEP가 단독으로 처리된 처치군에서도 nitrotyrosin antibody 에 대하여 양성반응을 보인 것은 실험에서의 처리 효과로 볼 수 없다. 이미 보고된 바에 따르면 tyrosine의 hydroxyl (OH) 기에 \( \mathrm{ONOO}^{\circ} \) 이 결합하는 반응은 비가역적 반응으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서 아무 것도 처리하지 않은 대조군에서도 nitrotyrosilated-proteins이 검출된 것은 본 실험에 사용되기 이전에 이미 형성되었던 것들이 감지된 것으로 볼 수도 있다. 즉, nitrotyrosilated-proteins의 검출과 각 처치군 사이의 정량적 분석을 위해서는 본 실험에서 이용된 방법보다 좀 더 분석력이 우수한 방법이 필요하다고 판단된다.</p> <p>결론적으로 배양된 흰쥐의 폐포대식세포에 DEP 단독 처리는 NO의 형성 및 iNOS와 nitrotyrosilated-proteins의 발현에 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나 DEP를 LPS와 함 께 처리했을 때에는 LPS에 의한 NO 의 형성을 유의성 있게 상승시켰다. 따라서 폐포대식세포에서 DEP의 노출은 직접적으로 NO의 형성을 유발하지 않고, DEP의 탐식 후 일정한 시간이 경과한 다음 어떤 이차적 경로를 통하여 활성에 영향을 미치는 것으로 추정한다. 또한, 폐에 기존의 세균성 질환이 있는 동물이나 사람이 DEP를 흡입하였을 경우에는 NO의 형성을 통하여 질환을 악화시킬 수 있을 것으로 판단한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>DEP 시료의 확보</h2> <p>DEP는 국립환경연구원 자동차공해연구소에서 확보하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다. 보관된 DEP는 필요한 경우, 녹인 후 30 초 동안 3 번씩 초음파로 분쇄하였고 (in \( 0.05 \% \) dimethyl sulfoxide) 최종적으로 \( 5 \% \) fetal bovine serum (FBS)이 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)에 희석하여 사용하였다.</p> <h2>기관지 폐포 세척술 및 폐포대식세포의 분리</h2> <p>실험동물로는 Sprague-Dawley계 흰쥐을 이용하였으며 고정틀에 고정한 후 \( 70 \% \) 의 에탄올로 피부를 소독하여 개복하였고, 복부 대동맥을 통하여 완전히 사혈시켰다. 이후 폐와 기관지를 노출시킨 후 경부의 기도를 약 \( 1 / 2 \) 로 절개하였고, 18-gauge cannula를 넣고 결찰한 후 폐와 기관지를 흉강에서 완전히 분리하였다. annula를 통해 폐 안으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 phos-phate buffered saline (PBS) \( 7 \mathrm{ml} \) 을 6회 반복 주입한 후 세척을 실시하여 폐 내 세포를 채취하였다. 채취된 세포는 \( 1000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심 분리를 실시하였다. 기관지 폐포 세척술로 채취된 세포를 원심분리 후, 폐나 세포들은 Cytospin \( { }^{{\text{R}}} \) (Shandon, Pittsburgh, PA)을 사용하여 slide glass 위에 부착하였다. 부착된 세포는 완전히 건조한 후 Diff-Quik \( { }^{\text {R }} \) stain (Dade Behring Inc., Newark, DE)을 이용하여 염색을 실시하였고, 현미경하에서 염증성 세포가 없는 것으로 확인된 세포액만을 선택하여 배양 및 각종 실험에 사용하였다.</p> <h2>폐포대식세포에서 NO 형성의 측정</h2> <p>선택된 폐포대식세포를 12-well tissue culture plates에 각 well 당 \( 3 \times 10^{5} / \mathrm{ml} \) 로 seeding한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 에서 2 시간 배양하여 세포들을 plate에 부착시킨 후 DEP에 노출시켰다. 시간별 및 농도별 세포 배양에서 채집한 배지에서 NO의 형성은 oxidation product인 \( \mathrm{NO}_{2}{ }^{} \)을 Griess reaction 방법을 통해서 측정하였다.</p> <h2>iNOS protein와 nitrotyrosilated-protein의 세포면역염색</h2> <p>폐포대식세포를 4-well chamber slides (Lab-Tek, Naperville, IL)에 각 well 당 \( 3 \times 10^{5} / \mathrm{ml} \) 세포로 \( 5 \% \) FBS가 함유된 DMEM으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 에서 2시간 배양하여 세포를 부착시킨 후, DEP \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), lipopolysaccharide (LPS) (10 \( \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 및 LPS + DEP를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 실험에 따라 일정 시간을 배양한 후 \( 10 \% \) 포르말린으로 5 분 동안 상온에서 세포들을 고정한 후 냉장 보관하였고 이후 필요에 따라 각종 면역염색을 실시하였다. 사용된 일차 항체의 특이성을 검증하기 위하여 복수로 준비된 동일한 다른 시료에는 일차 항체를 처리하지 않고 염색반응을 함께 실시하였다.</p> <p>폐포대식세포의 endogenous peroxidase 활성을 억제하기 위해서 \( 3 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액에 15 분간 보관하였다. 그 후 \( 1 \% \) bovine serum albumin (BSA) 용액에서 30분간 blocking을 실시한 후, monoclonal anti-inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein 항체 \( (10 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \); Transduction Laboratories, Lexington, KY), anti-nitrotyrosine 항체 \( (10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)를 상온에서 1 시간 처리하였다. 그 후 DAKO LSBA 2 kit로 이차 항체와 streptavi-din-conjugated peroxidase (DAKO, Carpinteria, CA)을 부착시켰다. 발색은 3, 3'-diaminobenzidine (DAB, Sigma Chemical Co.)를 사용하였다. Slide glass를 완전히 건조한 후 Harris's hematoxylin (Sigma Chemical Co.)으로 대조염색을 실시하였다. 무작위로 300 개의 세포를 세어 발색된 세포의 백분율로써 각 군의 항체 발현정도를 관찰하였다.</p> <h2>iNOS protein 검출을 위한 Western analysis</h2> <p>iNOS 항체 (Transduction Laboratories, Lexington, KY)와\( \beta \)-actin 항체 (Sigma Chemical Co.)를 각기 사용하였다. Western analysis를 위하여 면역염색과 같은 조건으로 배양된 cell을 PBS로 씻어낸 후, radioimmunoprecipitation assay (RIPA) B buffer (0.5 \% Nonidet P-40, \( 20 \mathrm{mM} \) Tris, \( \mathrm{pH} \) 8.0, \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaF}, 100 \mu \mathrm{M} \mathrm{Na}_{3} \mathrm{VO}_{4}, 1 \mathrm{mM} \) di-thiothreitol, \( 50 \quad \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) phenylmethylsulphonylfluoride)로 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 보관하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분 동안 원심 분리하여 단백질을 분리하였고 Bradford methods를 이용하여 정량하였다. \( 8 \% \) SDS-PAGE gel을 사용하여 전기영동을 실시하였고 blotting membrane으로 옮긴 후 \( 5 \% \) skim milk로 blocking을 실시하였다. 일차 항체 (anti-iNOS 1:1000)를 처리한 후, horseradish peroxidase와 이차 항체가 결합된 용액으로 처리하여 \( \mathrm{ECL} \) detection sys-tem (Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 densi-tometer로 양을 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>통계 프로그램인 SPSS \( 10.0 \) for windows를 사용하여 실험 설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처치군들 간의 비교는 Dunkun test를 실시하여 검정하였다. 각 자료는 3 번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였고, \( \mathrm{p}<0.05 \) 인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>	생명
재조합 아밀로수크라아제를 이용한 효율적인 폴리페놀 배당체의 합성	<h1>서 론</h1> <p>식물체에서 생산되는 폴리페놀 물질들은 식물체가 합성하는 이차 대사산물이다. 폴리페놀은 식물체에서 식물 조직을 보호하고 지지하는 역할을 하며 화분 매개자인 곤충, 동물을 유인할 뿐만 아니라 다른 식물의 생장과 발달을 저해하기도한다. 더구나 폴리페놀은 식물과 주위 환경과의 상호 작용에 있어서 신호전달 물질이며 식물이 죽은 뒤에도 몇 주 또는 몇 달간 분해되지 않고 유지되면서 토양에 존재하는 분해자와 분해 과정에 영향을 끼쳐 생태계에서도 중요한 역할을 가진다. 최근 들어 이러한 폴리페놀의 건강식품과 약품으로서 연구가치가 증대되고 있으며, 이미 체내에 유익한 항염증, 항산화와 항암 등의 잠재성이 확인되고 있다. 그러나 폴리페놀의 체내에 적용은 낮은 수용성으로 인해 흡수되는 양 보다 오히려 배설되는 양이 많고 세포독성을 가질 수 있다는 문제점이 한계로 지적된다. 이런 문제점은 폴리페놀의 당화과정(glycosylation)을 통하여 합성된 배당체를 이용하여 극복할 수 있다. 배당체의 합성은 화학적 방법으로 가능하지만, 이런 방법은 고온, 고압을 포함하는 조건이 필수적이고 합성된 아노머(anomer) 물질의 분리 및 환경문제 등을 야기하여 최근에는 생물체가 지니는 당 전이 능력을 갖는 효소를 이용한 당 전이 반응(transglycosylation)을 통하여 빠르고 쉽게 생산하고 있다. 더욱이 효소적 방법은 위치특이적, 입체특이적인 배당체 생산을 만들고 동시에 합성 반응이 일원화된다는 장점을 갖는다.</p> <p>당 전이 효소로는 기존에 당 분해 활성이 있는 glycosidase를 이용하는 방법과 glycosyltransferase를 이용하는 방법이 있는데, glycosidase를 이용한 당 전이 반응은 공여체로 넓은 기질 특이성과 다양한 결합 구조를 갖는 전이산물을 합성할 수 있는 장점이 있는 반면 합성된 배당체가 효소에 의하여 다시 가수분해될 수 있어 전이산물의 수율이 낮다는 문제점이있다. Glycosyltransferase의 경우 전이 산물의 수율이 높은 반면 대부분 알려진 전이효소는 공여체로 산업화하기에는 비싼 기질인 뉴클레오티드가 결합된 복합기질을 이용한다는 점이 단점이다.</p> <p>당 전이 효소 중에서도 뉴클레오티드가 결합된 복합기질이 아닌 sucrose를 기질로 이용하는 효소인 amylosucrase (EC)는 글루코사이드 가수분해효소의 13 번째 family에 속하는 알파 아밀라아제 타입의 효소로서 알파 1,4 글루코사이드 결합을 통하여 다당류인 아밀로오스를 생산한다. 이 효소는 수용체로서 글루칸 뿐만 아니라 카테킨, 살리신, 그리고 알부틴을 수용체로 활용하여 포도당을 전이하는 능력이 있음이 확인되었다. 합성된 배당체의 수율도 기존의 당 전이 효소들에 비하여 월등히 우수하다는 것이 확인되어 차후 다양한 산업적 용도에 적합한 효소로 판단되고있다.</p> <p>본 연구의 목적은 우수한 당 전이 능력을 보유한 효소로 알려진 amylosucrase 가 다양한 형태의 폴리페놀 화합물들을 수용체로 하여 새로운 형태의 배당체를 합성할 수 있는지를 검사하고자 하였다. 더 나아가 본 연구를 통하여 이 효소가 이용할 수 있는 수용체의 화학구조적 특징을 예측하였다.</p> <h2>결과 및 고찰</h2> <p>이전의 연구 결과로부터 당 전이 능력이 우수하다고 판단된 amylosucrase를 이용하여 21 종의 천연물 유래 폴리페놀을 수용체로 하여 다양한 폴리페놀에 대한 배당체 합성 능력을 검사하였다. Aesculin을 수용체로 시간별로 전이시켜 합성된 배당체를 TLC를 통해 확인하였다. 이 효소는 카테킨을 이용한 배당체 합성 연구에서 공여체와 수용체의 비율이 1: 1인 조건에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 12 \) 시간이 최적 당 전이 조건이라고 알려져 있었지만 6시간의 전이 유도 후 얻어진 당 전이 산물은 12 시간에서 생성된 전이 산물의 양과 크게 차이가 없는 것을 확인하였다. Aesculin에 대한 전이 반응은 aesculin의 phenolring이 \( 366 \mathrm{~nm} \) 에서 형광을 나타내는 것을 통해 쉽게 aesculin과 aesculin의 전이 산물을 확인할 수 있었다. Amylosucrase에 관해 알려진 기본적인 특성은 설탕을 기질로 이용하여 arbutin, salicin 등을 수용체로 폴리페놀 중 당이 결합된 위치(sugar moiety)에 포도당 한 개 또는 두 개를 \( a-1,4- \) glucosidic linkage로 전이시켜 배당체를 합성하는 것으로 알려져 있다.</p> <p>본 연구에서는 arbutin과 salicin 등의 구조와 기본적으로 유사한 aesculin 및 polydatin과 같이 당이 결합된 폴리페놀과 당이 결합되어 있지 않은 폴리페놀인 caffeic acid, vanillin, zingerone 등을 이용하여 배당체 합성의 기전을 연구하였다. Aesculin과 arbutin 같이 포도당이 결합된 폴리페놀을 수용체로 사용하였을 경우 하나 이상의 전이 산물이 확인되었으며, vanillin과 zingerone 같이 당이 존재하지 않는 폴리페놀을 수용체로 하였을 경우에도 하나 이상의 전이 산물이 확인되었다. 이것은 amylosucrase가 일반적으로 당을 포함하는 폴리페놀의 경우에는 당 부위(sugar moiety)의 수산기(hydroxyl group)에 우선적으로 당을 전이시키는 능력이 있다는 것을 알 수 있으며, 또한 당이 존재하지 않는 폴리페놀의 경우에도 이 효소가 배당체를 합성할 수 있다는 점을 확인한 연구 결과이다. 우리의 연구 결과는 비당체인 폴리페놀로 알려진 catechin을 수용체로 이전에 배당체를 합성하였다는 연구 결과를 확인하였다. 이렇게 합성된 폴리페놀 배당체는 자연계에서 존재하지 않는 새로운 형태의 배당체를 만들 수 있고, 이러한 새로운 배당체들이 기존의 폴리페놀 화합물들이 갖는 생리활성의 특성을 보다 개선할 수 있다는 점에서 큰 의의를 갖는다고 생각된다.</p> <p>자연계에서 존재하는 당이 결합된 폴리페놀의 구조는 당과 비당체의 결합 형태가 \( \beta \) 형태의 결합 구조를 취하는 반면,이 효소를 이용하여 합성된 배당체는 폴리페놀 비당체 부분에 당이 a 형태의 결합 구조를 갖는다. a 형태로 합성된 폴리페놀 배당체는 자연계에 존재하지 않는 새로운 물질이며, 당 전이를 통해 폴리페놀의 낮은 수용성을 증가시킬 수 있다는 점과 본래의 폴리페놀이 가지는 항산화, 항암, 항염증 및 미백과 같은 생리 활성을 향상시킬 수 있을 것이라 판단 된다. Amylosucrase는 위의 다섯 종류의 폴리페놀을 제외하고 당이 존재 하지 않는 다른 폴리페놀에는 배당체를 합성하지 못하였다(data not shown). 그 중, aloin, baicalin, hesperidin, rutin, 그리고 silymarin과 같은 분자량이 큰 물질은 효소의 기질 결합부위에 수용체가 steric hindrance에 의하여 받아들이기 어렵기 때문에 배당체 합성이 어려운 것으로 생각되며, morin의 경우 저해제로 관여하여 효소의 활성을 저해하여 배당체 합성이 불가능한 것으로 판단된다. 또한 phenol ring에 수산기가 존재하지 않는 cinnamic acid와 theophylline과 같은 폴리페놀에는 당을 전이시킬 수 없었다. 그러나 수산기가 존재하고 분자량도 크지 않은 4-hydroxy-cinnamic acid, ferulicacid, 그리고 linalool과 같은 폴리페놀 경우에도 전이반응이 일어나지 않았다. 전이가 가능한 수용체와 가능하지 않은 수용체의 구조를 정리하여 본 결과 다양한 폴리페놀 화합물에 대한 전이능 분석결과를 바탕으로 amylosucrase가 배당체 합성을 위해 수용체로 이용할 수 있는 폴리페놀들의 공통적인 구조적 특징을 파악할 수 있었다. Cinnamic acid와 4-hydroxycinnamic acid를 수용체로 사용한 전이 반응의 경우, 폴리페놀 전이산물은 합성되지 않았다. 하지만 두 폴리페놀과 구조가 유사하나 phenol ring의 3 번 탄소 위치에 수산기를 하나 더 가지는 caffeic acid의 경우 당 전이 산물을 확인할 수 있었으며, 합성된 배당체는 phenol ring 의 3번 탄소 위치에 당의 전이가 이루어졌을 것이라 예측할 수 있었다. Zingerone 또한 위의 세 폴리페놀과 구조가 유사하나 phe-nol ring의 3 번 탄소 위치에 methoxy기가 존재하는 차이로 인해 4 번 탄소 위치에 당을 전이시킬 수 있었던 것으로 생각된다. Vanillin의 경우 phenol ring과 작용기의 구조적 형태가 zingerone과 유사하여 vanillin의 phenol ring의 4 번 탄소에 당이 전이되었을 것으로 생각된다. Ferulic acid는 zingerone의 구조와 거의 유사하지만 phenol ring의 탄소에 methoxy기가 Z 형태를 이루는 zingerone과 달리 E 형태의 입체배치를 형성하는 차이로 인해 당이 전이 되지 않는 것으로 판단된다.</p> <p>위의 결과를 토대로 amylosucrase를 이용한 신규 배당체 합성시 전이 가능한 폴리페놀의 수용체 구조를 정리하면 당이 존재하는 폴리페놀에는 당부위에 우선 적으로 당을 전이시키고 phenol ring에 수산기가 하나 이상 존재하며 폴리페놀의 입체배치가 Z 이성질체 형태를 이루는 폴리페놀 구조에도 효과적으로 배당체 합성이 가능할 것으로 예상된다. 현재 당을 포함하지 않는 다양한 폴리페놀에 당쇄를 부여하는 효소는 복합기질을 사용하는 glycosyltransferase와 특정 폴리페놀에 특이적인 폴리페놀 당 전이 효소외에는 알려진 것이 없다. 그러므로 이 효소는 다양한 폴리페놀 화합물에 대한 배당체 합성에 매우 효율적인 촉매로 판단된다. 앞으로 배당체 합성 수율을 보다 더 증대시킬 수 있는 방법을 개발한다면 산업화에 활용 가능성이 높은 유용한 효소로 생각된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 amylosucrase는 대장균을 이용하여 재조합 단백질의 형태로 생산하였으며, 사용된 폴리페놀 중 aloin, baicalein, cinnamic acid, ferulic acid, 4-hydroxycin-namic acid, hesperidin, linalool, morin, rutin, silymarin 그리고 theophylline은 부산대학교 노화 조직 은행에서 분양받았고, aesculin, arbutin, baicalin, caffeic acid, polydatin, resver-atrol, vanillin, 그리고 zingerone은 Sigma에서 구매하였다. 또한 salicin은 Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA)에서 구매하였으며, aesculetin은 부산대학교 한의학 전문대학원 하기태 교수 연구실에서 분양받아 사용하였다. 사용한 폴리페놀 화합물들은 Table 1에 정리하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>Amylosucrase의 활성은 \( 40 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 sucrose를 기질로 하여 측정하였다. 반응액은 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.0)를 사용하였고, 효소액을 첨가하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하였다. 효소반응 후, 생성된 fructose의 양은 3,5-dintrosalicylic acid(DNS) 방법 을 이용하여 측정하였다. 효소의 1 unit는 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 fructose를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.</p> <h2>당 전이 반응을 통한 배당체의 합성</h2> <p>Amylosucrase의 배당체 합성 시 수용체인 폴리페놀의 구조적 특징에 따른 전이능을 확인하기 위해, 공여체와 수용체의 비율을 \( 1: 1(\mathrm{~mol} / \mathrm{mol}) \) 로 하여 공여체로 \( 25 \mathrm{mM} \) sucrose와 수용체로 aesculin, arbutin, vanillin, 그리고 zingerone을 각각 \( 25 \mathrm{mM} \) 로 첨가하여 전이 반응을 유도하였다. 반응액은 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.0)를 사용하였고 효소는 반응액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 당 \( 70 \mu \mathrm{g} \) 을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 동안 전이 반응을 유도하였다. 반응시간에 따른 배당체 합성 정도를 측정하기 위해 위와 같은 조건에서 \( 20 \mathrm{mM} \) sucrose와 \( 20 \mathrm{mM} \) aescu-lin을 공여체와 수용체로 각각 반응 하였고, 0,6,12,18, 그리고 24 시간 전이 반응 후 전이 산물을 Thin layer chromatography(TLC)로 확인하였다.</p> <h2>반응산물의 TLC 분석</h2> <p>당 전이 산물의 확인과 분석은 TLC를 이용하였다. TLC는 Whatman K6F silica gel plates (Whatman, Maidstone, UK)를 사용하였으며, 전개용매로 butanol/ethanol/water를 5:3:2\( (\mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 혼합하여 사용하였다. TLC plate에 전이 반응액 1\( \mu \mathrm{l} \) 을 점적 후에 건조시키고, 전개용액에 넣어 일정 시간 동안 전개한 후, 공기 중에서 다시 건조 시켰다. 건조된 plate는 \( 254 \mathrm{~nm} \) 와 \( 366 \mathrm{~nm} \) 파장에서 폴리페놀이 갖는 ring 구조의 발광을 통해 전이산물을 확인하였다. 또한 건조된 plate를 \( 0.3 \% \)(w/v) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine과 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 포함하는 methanol 용액에 빠르게 담근 후 완전히 건조한 다음, \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 구워 전이 반응을 분석하였다.</p>	생명
Ascofuranone에 의한 plasminogen activator inhibitor-1 발현저해 효과	<h2>LPS로 유도된 PAI-1 단백질의 발현에 대한 AF의 억제효과</h2> <p>AF 처리에 의한 PAI-1의 발현 저해효과를 조사하기 위하여 신장섬유아 세포에 LPS 및 AF를 각각 처리하여 PAI-1 발현변화를 확인하였다. 우선 LPS를 처리한 후 PAI-1 발현의 증가현상을 시간 및 농도 의존적으로 확인하였다. 신장섬유아 세포에 LPS \( 2 \mathrm { ~ug/ml } \)을 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 시간 동안 처리한 경우 PAI-1 발현이 시간 의존적으로 유도되었으며, 6 시간 동안 LPS 0, 0.5, 1, 2 \( \mathrm { ~ug/ml } \)의 농도로 처리한 경우에도 농도 의존적으로 PAI-1 발현이 증가됨을 확인하였다. 신장섬유아 세포에서 LPS로 유도된 PAI-1 단백질 레벨이 AF를 농도 의존적으로 처리한 결과 효과적으로 감소되었다. 또한 PAI-1 mRNA 발현 레벨 역시 AF 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다. 따라서 신장섬유아 세포에서 LPS에 의해 증가된 PAI-1 전사 레벨이 AF 처리에 의해 효과적으로 억제되는 사실을 확인 하였다.</p> <h2>AF에 의한 PAI-1 단백질의 발현조절 작용</h2> <p>AF가 LPS로 유도된 PAI-1 발현을 프로모터 활성화 저해를 통한 발현조절임을 확인 하기 위하여 reporter gene assay를 수행하였다. 신장섬유아 세포에 p800-PAI-1-luci reporter gene을 transfection 시킨 후 LPS 처리구와 무처리구, LPS + AF 처리구로 나누어 실험하였다. 약물 처리에 따라 LPS만 처리한 경우 luciferase 활성이 무처리구와 비교하여 3배 정도 증가하였으며, AF와 함께 처리한 경우에는 LPS 처리구와 비교하여 농도 의존적으로 luciferase 활성이 감소하였다. 또한 PAI-1과 더불어 신장섬유화 유도인자로 알려진 fibronectin 단백질 발현도 신장섬유아 세포에 AF 농도 의존적으로 처리한 결과, 효과적으로 저해되는 것으로 확인되었다. 따라서 AF는 신장섬유화 유도인자인 fibronectin과 PAI-1의 단백질 발현을 저해함과 동시에, PAI-1의 경우 프로모터 활성 저해를 통한 발현 조절 현상임을 확인하였다.</p> <h2>AF의 ERK-1/2 인산화 조절을 통한 PAl-1 발현 저해효과</h2> <p>최근 본 연구실에서 AF가 신장섬유아 세포에서 MEK/ERK 기전 조절을 통해 PAI-1의 발현을 억제한다는 연구결과를 발표하였으며, LPS 또한 ERK-1/2 신호전달 기전를 활성화시킨다고 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 LPS에 의해 유도된 PAI-1 발현 레벨이 AF 에 의해 저해되는 PAI-1 발현조절 기전를 해석하였다. 먼저 신장섬유아 세포에 ERK-1/2 상위에 존재하는 MEK inhibitor인 PD98059 및 AF를 각각 처리하여 PAI-1의 발현을 확인한 결과, MEK inhibitor 및 AF 을 처리한 경우 각각 동일하게 PAI-1의 발현 레벨이 감소 하였다. 또한 AF에 대한 MEK/ERK 인산화 조절기전을 조사한 결과, 신장섬유아 세포에 처리한 LPS는 ERK-1/2의 인산화를 증가시켰으며, AF를 처리한 결과 농도 의존적으로 ERK-1/2의 인산화가 감소됨을 확인하였다. 따라서 LPS로 유도된 PAI-1 발현레벨이 AF에 의해 감소되는 현상은 MEK/ERK 기전 조절을 통하여 저해함을 예상 할 수 있다.</p> <h2>WST-1에 의한 세포 증식억제 조사</h2> <p>신장섬유아 세포를 96 wells 플레이트에서 1 일 동안 배양 후 12 시간 동안 AF를 농도 별로 처리하였다. AF 처리 후 WST-1 reagent를 4시간 동안 반응 시켜 ELISA \( 480 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다. Cell proliferation reagent WST-1 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 분석방법에 의해 신장섬유아 세포의 증식에 대해 AF가 미치는 영향을 평가하였다.</p> <h2>SDS-polyacrylamide gel 전기영동 및 면역학적 검색법</h2> <p>신장섬유아 세포를 \( 80-90 \% \) 정도의 밀도가 되도록 배양하였다. 기존의 배양액을 제거하고 LPS와 AF를 농도 별로 처리하여 6 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 배양액을 제거하고 세포를 스크레퍼로 모아 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 12000 \mathrm { rpm } \)으로 5 분간 원심분리를 하여 상등액을 제거하고 IPH lysis buffer [ \( 50 \mathrm { ~mM } \) Tris \( \mathrm { pH } \) 8.0), \( 150 \mathrm { ~mM } \mathrm { NaCl } \), \( 5 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 0.5 \% \) NP40, \( 100 \mathrm { ~mM } \) PMSF, leupeptin \( 1 \mathrm { ~mg/ml } \), aprotinin \( 1 \mathrm { ~mg/ml } \) and \( 1 \mathrm { ~M } \) DTT]로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 30 분 동안 용해시킨 후 \( 12,000 \mathrm { rpm } \)에서 20 분 동안 원심 분리를 하였다. 상등액으로부터 얻어진 단백질을 정량하여 \( 2 \times \)SDS-loading buffer [Trin-Cl ( \( \mathrm { pH } \) 6.8) \( 100 \mathrm { ~mM } \), Glycerol \( 20 \% \), Bromophenol blue \( 0.2 \% \), SDS \(4 \% \), Dithiothreitol \( 200 \mathrm { ~mM } \)]와 섞어 \( 98 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 가열 한 후 SDS-PAGE gel로 전기 영동하여 Immobilon-P-membrane (Millipore, Harrow, Middlesex, UK)에 이동 시켰다. Membrane은 \( 5 \% \) 탈지분유로 blocking 하여 anti-PAI-1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)과 anti-fibronectin (Santa Cruz), anti- \( \beta \)-actin (Santa Cruz)에 각각 반응시켰다. 반응 후 각각의 항체에 단일 혹은 복합 이차항체를 반응 시켜다. 항체들에 대한 발현분석은 Horseradish Peroxidase-Linked 이차항체에 의해 발현되는 enhanced chemiluminescence (ECL) Western Blot Analysis (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, USA) 시스템을 이용하여 결과를 확인하였다.</p> <h1>서론</h1> <p>신장섬유화는 급성 및 만성 신장질환의 대표적인 유발증상으로 그 진행에 따라 신장의 기능부전이 발생된다. 신장섬유화의 특징으로는 혈관 기저막이 두꺼워지거나 세뇨관의 위축, 단핵세포의 침투와 세포외기질의 침착 등이 있다. 신장섬유화를 유도하는 대표적인 인자들로는 Tumor Necrosis Factor (TNF)- \( \alpha \), Interferon (IFN)- \( \gamma \), Lipopolysaccharide (LPS), Transforming Growth Factor-beta 1 (TGF- \( \beta \)1) 등의 촉매제가 알려져 있다. 신장섬유화 유도인자인 LPS는 그람음성 박테리아의 세포벽 구성 성분으로 인체 유해 내독소로 작용하며, 급성 및 만성 신장질환의 병인과 관련되어 있다. 또한 LPS는 대식세포를 자극하여 TNF- \( \alpha \), IL-1과 IL-6와 같은 사이토카인들의 활성 및 발현을 조절하며, 발현된 사이토카인들 또한 신장섬유화를 유도하는 것으로 보고 되었다.</p> <p>Plasminogen activator inhibitor (PAI)-1은 serpin superfamily의 하나로, LPS와 TGF- \( \beta \)1을 비롯한 다양한 인자에 의해 활성화 된다. 활성화된 PAI-1은 단백질분해효소 의존적인 섬유소 용해 작용을 억제하며, 세포외기질의 축적을 증가시킨다. 따라서 PAI-1 발현이 신장섬유화를 포함한 섬유화 진행에 따른 표지인자임으로 향후 신장섬유화를 비롯한 섬유화 치료를 위한 주요한 표적 유전자이다. 또한 PAI-1 발현이 MEK/ERK 기전을 통해 발현이 조절됨이 확인되었으며, LPS도 CD14와 Toll-like receptor (TLR)-4에 결합하여 하위의 MEK/ERK 기전을 활성화 시킨다고 알려져 있어, LPS에 의한 PAI-1 발현이 MEK/ERK 기전을 통해 조절될 가능성이 있음을 예상할 수 있다.</p> <p>이 연구에서 사용한 Ascofuranone (AF)은 불완전한 균류인 Ascochyta visiae에서 분리한 항진균성 플레닐페놀계 항생 물질로, 주로 항바이러스성 효과에 대한 연구와, 피하조직과 관련한 다양한 생리학적 효과에 대한 연구가 보고 되었다. 또한, 고혈압 억제, 제1형 및 제2형 당뇨병 개선 그리고 항암제로서의 활성을 가지는 것으로 보고되었다. 최근에는 신장암세포(Caki-1)에서 AF가 암세포 전이 시 발현되는 matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)의 발현을 억제하고 그 메커니즘을 조사한 결과 extracellular signal regulated kinase-1/2 (ERK-1/2)의 인산화 저해를 통한 activator protein (AP)-1 전사활성의 선택적인 조절로 MMP-9 발현을 억제한다는 연구결과가 발표 되였다. 이 연구에서는 LPS에 의해 유도된 섬유화 표지인자인 PAI-1을 비롯한 섬유화 관련인자들의 발현제어에 대한 AF의 저해효과를 확인하고자 하며 동시에 PAI-1 발현 저해 기전을 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양</h2> <p>신장섬유아(rNRK-49F) 세포는 American culture type collection (ATCC)으로부터 구입하였다. 신장섬유아 세포는 \( 10 \% \) 혈청(Fetal bovine serum: FBS) (Gibco-BRL, Grand Island, NY)과 \( 1 \% \) 항생제(Gibco)를 함유한 DMEM-Low glucose (Dulbecco's modified Eagle's medium)(Gibco) 배지에서 배양하였으며, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \) 이산화탄소 조건 하에 배양하였다. ascofuranone (AF)은 일본 중외제약에서 합성된 물질을 제공받았다.</p> <h1>고찰</h1> <p>PAI-1은 신장섬유화 및 신장암 발생 시 다른 정상조직과 세포에 비해 과발현 되며, 섬유소분해를 억제할 뿐만 아니라 기질과의 긴밀한 상호작용으로 신장섬유화 진행에 있어 주요한 작용인자로 알려져 있다. 이 연구에서 LPS가 PAI-1 발현을 농도 및 시간 의존적으로 증가시킨 연구결과, LPS가 PAI-1 발현을 유도하는 매개인자임을 확인할 수 있었다. 또한 LPS로 증가된 PAI-1 mRNA와 단백질 발현이 AF의 농도 의존적으로 저해되었고, fibronectin 발현 레벨도 AF 처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다. 이러한 결과들은 신장섬유화를 유도하는 PAI-1 발현 조절이 AF에 의해 감소되는 이전의 연구결과와 동일함을 확인할 수 있었다. 또한 AF가 PAI-1의 프로모터 활성을 현저하게 억제되는 사실은 AF가 PAI-1의 전사활성 조절을 통해 발현을 억제함을 알 수 있었다.</p> <p>PAI-1의 발현 조절은 다양한 신호전달 경로가 관여한다. 그 중 대표적인 신호전달 경로로 TGF- \( \beta \)/Samd와 Receptor mediated-mitogen-activated protein kinase (MAPK)가 있다. TGF- \( \beta \)/Samd 신호전달 경로는 TGF- \( \beta \)1이 TGF- \( \beta \) receptor Ⅱ와 결합하여 활성이 개시되면 TGF- \( \beta \) receptor Ⅰ과 결합하여 Smad 기전을 활성화시켜, 전사인자인 Smad가 핵 내로 이동하여 TGF- \( \beta \)1에 의한 하위 신호표적인자를 발현시킨다. Receptor mediated-MAPK 신호전달 경로는 LPS에 민감한 염증반응 기전으로 LPS는 CD14와 Toll-like receptor (TLR)-4에 결합하여 하위의 MEK/ERK 기전을 활성화 시킨다고 알려져 있다. 이 연구에서도 LPS가 ERK-1/2의 인산화를 활성화시켰으며, AF에 의해 농도의존적을 활성화된 ERK-1/2의 발현이 감소되었다. 또한, ERK-1/2 상위에 존재하는 MEK의 inhibitor인 PD98059 처리 시 AF 처리구와 동일하게 PAI-1 발현이 감소하여 PAI-1이 LPS/MAPK 신호전달 경로를 통해 조절됨을 확인 하였다. 이 결과는 최근 발표된 AF에 대한 연구결과와 같이 신장섬유아세포에서 MEK/ERK-1/2 기전 조절을 통해 PAI-1 발현을 조절한다는 결과와 동일한 것으로 확인된다. 또한 LPS에 의한 PAI-1 발현이 receptor-mediated MAPK 기전을 활성화 시켜 PAI-1 발현을 유도함을 알 수 있었다.</p> <p>따라서 이 연구를 통해 LPS로 유도된 PAI-1 발현이 ERK-1/2 신호전달 경로를 통해 조절되는 것을 확인 하였으며, AF가 ERK-1/2의 활성화 저해를 통해 PAI- 1 의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한 AF가 신장섬유화 치료를 위한 유력한 후보 물질임을 예상할 수 있었다.</p> <h1>요약</h1> <p>이 연구는 신장섬유아 세포를 이용하여 LPS에 의해 유도된 신장섬유화 표적유전자인 plasminogen activator inhibitor (PAI-1) 발현과 Ascofuranone (AF)에 의한 신장섬유화 저해효과를 연구하였다. 이 연구를 통해 LPS가 PAI-1의 발현을 농도 및 시간 의존적으로 증가시켜 LPS가 신장섬유화 유도물질임을 확인 할 수 있었다. 또한 LPS로 유도된 PAI-1 mRNA 및 단백질 발현 레벨이 AF에 의해 저해되었으며, 신장섬유화의 또 다른 대표유전자인 fibronectin의 단백질 발현도 AF에 의해 억제되어 AF가 신장섬유화를 저해하는 사실을 확인할 수 있었다. 그리고 AF에 대한 PAI-1 프로모터 활성을 조사하기 위하여 p800-PAI-1-luc을 신장섬유아 세포에 형질전환 시킨 결과, AF가 PAI-1의 전사 활성 조절을 통해 발현을 억제한다는 것을 확인하였다. ERK-1/2의 상위에 존재하는 MEK inhibitor를 처리하여 PAI-1의 발현을 확인한 결과에서도 AF를 처리한 경우와 동일하게 PAI-1 발현이 저해되어 LPS로 유도된 PAI-1의 발현이 ERK-1/2에 의해 조절됨을 알 수 있었다. 또한 LPS로 유도된 ERK-1/2의 인산화가 AF 농도의존적으로 저해된 결과는, AF가 ERK-1/2의 활성저해를 통하여 PAI-1 발현을 조절한다는 사실을 확인 할 수 있었다. 따라서 이러한 연구결과 AF가 신장섬유화를 저해하는 유력한 후보물질로서의 가능성을 제시하였다.</p> <h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>RNA 추출은 TRIzol (Invitrogen Co, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 분리하였으며 \( 1 \mathrm { ug } \)의 RNA를 사용 Moloney murin leukemia virus reverse transcriptase (Promega, Meadison, WI)로 역전사 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 PAI-1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 생성된 결과물은 \( 1 \% \) 아가로즈 겔로 전기 영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 결과를 확인 하였다. PCR에 사용한 PAI-1 primer sequence는 forward: 5'-tgtcctcggtgctggctatgctg-3'; reverse: 5'- tcagacttgtggaacaggcgctg-3'이고, \( \beta \)-actin primer sequence는 forward: 5'-agggtgtgatggtgggtatggg-3'; reverse: 5'-caggatcttcatgaggtagtc-3'이다.</p> <h2>Plamid transfection과 luciferase Reporter gene 분석</h2> <p>AF의 PAI-1 전사제어에 대한 영향을 분석하기 위해 p800neo-luc (PAI-1 luciferase promoter construct)를 사용하였다. 신장섬유아 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm { ~cells/ml } \)로 \( 60 \mathrm { ~mm } \) 플레이트에 하루 동안 배양 후 plasmid constructs \( 2 \mathrm { ~ug } \)과 pCMA- \( \beta \)-galactosidase plasmid \( 1 \mathrm { ~ug } \)을 12 시간 동안 DNA transfection reagent (TransIT-LT1 Transfection reagent, Mirus, Madison, USA)로 co-transfection 시켰다. 12 시간 후 LPS와 AF를 6 시간 동안 처리하여 luciferase 및 \( \beta \)-galactosidase의 활성을 commercial kits (Promega Corp., Madison, WI)를 사용하여 확인하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험 군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 다양성 분석은 Duncan's test에 의해 분석하였다. 통계처리 후 P값이 0.05 미만일 경우 통계적인 유의성이 있다고 판정하였다.</p> <h1>결과</h1> <h2>신장섬유아 세포에서 세포증식에 대한 AF의 영향</h2> <p>신장섬유아 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } / \mathrm { ml } \)로 96 wells 플레이트에서 1 일 동안 배양 후, 혈청 유조건과 혈청 무조건에서 각각 AF를 1, 10, 30, 50 \( \mathrm { ~uM } \) 농도로 12 시간 동안 처리하였다. 12 시간 처리 후 WST-1 reagent를 4 시간 동안 처리하여 AF의 신장섬유아 세포에 대한 세포증식 효과를 조사하였다. AF는 배지의 혈청 유무에 상관없이 세포증식억제 효과가 \( 10 \% \) 미만으로 유의성이 없는 것으로 확인 되었다. 따라서 AF는 세포에 대한 독성 및 증식에는 큰 영향이 없음을 확인하였다.</p>	생명
산수유의 지표성분 함량과 입지환경과의 상관관계 분석	<h2>지표성분과 입지환경과의 상관관계 분석</h2> <p>Park 등이 보고한 산수유 주산지 환경조사 결과에 따르면 산수유는 일교차가 크고, 해발고도 \( 100-400 \mathrm { ~m } \) 내의 남동향 지대에서 결실율이 좋으며 토양조건은 배수가 잘된 사질토로서 약산성 \( \left ( \mathrm { pH } 6.2-6.6 \right ) \)이며 경사 \( 15 ^ {\circ } \) 이내로서 한파의 영항이 크지 않은 지대에 적응하고 있다고 하였다. Morroniside와 loganin의 재배환경간 상관관계 분석한 건과(Table 5), loganin과 토양 데이터 중 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량과 \( \mathrm { pH } \)가 가장 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 토양의 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량은 loganin과 양의 상관관계, \( \mathrm { pH } \) 는 loganin과 음의 상관관계인 것으로 확인되었다. 산수유 지표성분인 Morroniside와 토양 데이터 중 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량, \( \mathrm { Na } ^ { + } \)함량, \( \mathrm { pH } \), 염도, silt 비윤, clay 비율이 가장 큰 영향을 미치는 것으로. 확인되었다. 이러한 인자들은 일반적으로 작물의 양분 흡수와 관련이 있고, 식물의 생육에 영향을 미치므로 지표성분과도 높은 상관관계가 있는 것으로 보인다. 따라서 토양 데이터 중 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량, \( \mathrm { pH } \), clay 비율이 산수유의 지표물질인 morroniside와 loganin의 함량에 높은 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 토양의 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량이 \( 2.93 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \) 이상일 때, \( 0.9 \% \) 이상의 loganin 함량을 나타내고, 토양의 silt 비율이 \( 17.88 \% \) 이하이고, \( \mathrm { K } \) 함량이 \( 0.45 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \) 이하일 때, morroniside 함량이 \( 0.9 \% \) 이상인 것으로 예측된다. 결론적으로 본 연구에서는 산수유의 지역별 지표성분 함량을 분석하였고, 재배 토양환경에 따른 loganin, morroniside 함량의 상관관계를 분석하였다. 이를 통해 산수유나무의 최적의 재배환경요건에 대한 기초자료를 제공할 수 있을 것이다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>지표성분 합량 분석</h2> <p>산수유의 품질 및 특성평가를 위한 지표성분인morroniside는 급성심근경색, 저혈당, 신경세포 보호 효과가 있다고 알려셔 있으며, loganin은 항엽증, 면역 증진, 기억력 증진 및 개선 효과 등의 효능이 있다고 보고되어 있다. 산수유의 지표 성분인 morroniside 및 loganin 표준용액을 이용하여 검량선을 작성한 결과 morroniside 및 loganin의 상관계수 \( \left ( \mathrm { R } ^ { 2 } \right ) \) 값은 모두 0.999 이상으로 우수한 지선성을 보있다. 산수유 추출물의 UPLC chromatogram을 비교하여 패크가 정화히 분리되는지 확인한 결과(Fig. 3), 피크 유지시긴(retention time, RT)은 각각 morroniside 2.7분, loganin 4.2분으로 일치하였다. 또한, 19 지역에서 수집된 산수유의 지표성분 함량을 분석한 결과(Table 2), 수집된 지역에 따라 morroniside와 loganin 성분 함량 차이가 났다. 재배지별로 morroniside의 함량은 적게는 \( 0.37 \% \), 많게는 \( 1.5 \% \) 로. 약 4배 이상 차이가 났고, loganin함량은 적게는 \( 0.27 \% \), 많게는 \( 1.35 \% \)로 약 5 배 차이가 났다.</p> <h2>재배지 토양환경 분석</h2> <p>산수유나무 재배지의 토양 이화학성을 조사한 결과, Table 3 과 같이 유기물함량(organic matter, \( \mathrm { OM } \) )은 0.7-11.36 \( \% \), 전질소 함량 (total nitrogen, TN)은 \( 0.06-0.39 \% \), 유효인산(available phosphate, Av. P)은 \( 35.22-957.07 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \), potassium \( \left ( \mathrm { K } ^ { + } \right ) \) 는 \( 0.10-0.79 \mathrm { cmol } ^ { + } / \) \( \mathrm { kg } \), calcium \( \left ( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \right ) \)는 3.2-12.95 \( \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \), magnesium \( \left ( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \right ) \) 은 \( 0.73-5.87 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \), sodium \( \left ( \mathrm { Na } ^ { + } \right ) \) 는 \( 0.02-0.20 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \), 양이온치환용량(cation exchange capacity, CEC)은 10.08-28.61 \( \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \) 로 나타냈다. Table 4와 같이 \( \mathrm { pH } \) 는 4.97-6.89로 약산성, 전기전도도(cloctrical conductivity)는 \( 0.04-0.21 \mathrm { dS } / \mathrm { m } \), 염도(salinity)는 0.002-0.006 \( \% \), 토성은 양질사토 사양도로. 나타났다.</p>	생명
동백꽃 추출물의 신생혈관생성 및 세포부착 억제 효과	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>신생혈관 형성 억제효과</h2><p>동백꽃의 에탄올 추출물의 분액으로 신생혈관생성억제 효과를 실험한 결과 butanol 추출물이 강한 제어력(\(70.2\%\))를 나타내었고, acetone 층이 \(54.2\%\), 그리고 ethylacetate 층이 \( 37.0 \% \), chloroform 층이 \( 21.2 \% \)의 유의성 있는 제어력을 나타냄이 밝혀져 동백꽃의 butanol층은 신생혈관생성억제제로서 좋은 효과를 보이고 있는 것으로 판단된다. Hexane 추출 과정중 hexane 층이 gel상태로 되어 분획하는 작업이 어려워서 acetone을 첨가하여 gel을 녹인 후 acetone 층을 sample로 사용하였다. 대조군은 신생혈관생성이 뚜렷하게 뻗어있고, 동백꽃 추출물이 첨가된 cell은 신생혈관생성이 저해된다는 것을 알 수 있다. 따라서 동백꽃 추출물의 에탄올 추출물은 신생혈관의 형성을 억제하는 것으로 나타나, 생체에 투여할 수 있는 간단한 추출물로서 항암, 암전이 억제, 류마치스성 관절염 및 항비만 제제 등의 용도로 그 응용가능성이 높을 것으로 판단된다.</p><h2>독성시험</h2><p>동백꽃 butanol 추출물이 신생혈관생성의 효과를 강하게 나타냄으로써 이들 추출물에 대한 독성 시험을 HUVECs를 사용하여 검토한 바 Fig. 3과 같이 나타났다. 그래프에서 보는 바와 같이 동백꽃의 추출물은 \( 200 \mu \mathrm{g} / well\) 에서도 control과 비교하여 독성이 전혀 없는 것으로 나타났다. 이것으로써 동백꽃의 다양한 성분이 독성이 낮은 것으로 판단되며, 다양한 제제로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.</p><h2>ELISA법에 의한 세포부착 억제작용</h2><p>Cell adhesion 분자인 E-selectin, VCAM-1 및 ICAM-1들은 Camellia japonica flower(CJF)의 성분 증가에 따라 발현이 감소되는 것으로 보아 cell adhesion의 저해 효과가 높아짐을 알 수 있었다. Fig. 4(a)에서 보는 바와 같이 cell adhe-sion 분자인 ICAM-1이 동백꽃 추출물의 농도가 증가합에 따라 발현이 감소하여 cell adhesion의 저해 효과가 높아짐을 알 수 있었다. 농도가 \( 50 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 5.9 \%, 100 \mu \mathrm{g} \) 인 때 \( 29.4 \% \), \( 200 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 52.9 \% \) 저해되었으며, VCAM-1도 동백꽃 추출물 성분증가에 따라 감소하여 저헤 화과가 높아졌으며, 특히 농도가 \( 50 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 12.5 \%, 100 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 43.8 \%, 200 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 62.5 \% \) 저해되었다. 또한, E-selectin 억시 감소하여 cell adhesion의 저헤 효과가 높아짐을 알 수 있었고, 농도가 \( 50 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 7.1 \%, 100 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 24.4 \%, 200 \mu \mathrm{g} \) 일 때 \( 35.7 \% \) 저해 되었다. 따라서 동백꽃에는 cell adhesion을 저해시키는 물질이 함유되어 있는 것으로 조사되어 항암 작용, 암전이 억제등에 CJF가 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.</p><h2>Western bloting</h2><p>Fig. 5에서 보듯이 Camellia japonica flower(CJF) 추출물의 농도가 증가함에 따라 신호전단 분자인 VEGFR2, PI3-K 및 \( \beta \)-catenin의 밴드가 약허지는 것을 관찰한 수 있다. 이것은 각각의 신호전달 분자의 발현이 CJF에 의해서 저해되어 발현이 방해되어 신호의 전달이 차단되는 것을 의미하머, 신호가 차단됨에 따라 신호가 IkB에 미치지 못하여 이를 분해하지 못함으로써 핵내의 전사인자인 NF-kB를 활성화시키지 못하여 신생혈관의 형성이 저해되는 것으로 판단된다.</p>	생명
난소를 절제한 흰쥐에서 오디가 혈 중 지질 함량 변화에 미치는 영향	<p>뽕나무는 뽕나무과(Moraceae)의 뽕나무속(Morus)에 속하는 교목성 낙엽수로 온대에서 아열대에 이르기까지 널리 분포하며, 분포밀도가 가장 높은 곳은 동아시아의 한국, 중국대륙 및 일본열도이다. 이 식물은 우리나라에서 예로부터 민간 상용 약초로 부인들의 붕증, 혈결 및 요통, 타박상, 지통, 습진, 유행성이하선염, 폐결핵, 급성관절 등을 치료하는데 사용되었으며, 특히 그 뿌리와 줄기를 다려먹으면 간암 치료에 특효하다고 전해 내려오고 있다. 오디에 대한 기록으로는 구종석이라는 옛 의서에 '뽕나무의 정령은 오디에만 있는데 신농본초경에는 이것만 빼놓고 뽕나무의 용도가 매우 많이 적혀 있다'고 나와 있으며, 우리나라의 동의보감 등의 고서에도 그 효능에 대해 언급하고 있는데, 그 내용을 보면 '달고, 차며 독이 없다', '오장과 관절을 이롭게 하고 혈기를 통하게 한다', '백발을 검게 하며, 오장을 이롭게 하며 오래 먹으면 배고픔을 모르게 한다'고 기록되어 있다. 누에를 치기 위해 심겨졌던 뽕나무는 누에의 먹이로서 뽕잎을 이용하고 한방재료로서 뽕나무 뿌리를 이용해왔을 뿐 뽕잎의 수확시기와 맞물려 있는 오디에 있어서는 생식 또는 잼, 술, 시럽 등으로 일부만이 이용되었다. 이것은 과실의 크기가 작고, 수분함량이 높아 수확작업이 어렵고, 부패하기 쉬워 저장이 어려운 점도 오디 이용률이 현저히 낮은 원인 중의 하나이다. 현재까지 오디에 관한 연구로는 잎에 flavone, steroids, triterpenes, amino acids, vitamin 및 다량의 미네랄 성분이 존재하고 있으며, 또한 전통 생약으로 당뇨병을 예방, 치료하며 갈증을 해소시키는 것으로 알려져 있다. Asano는 뽕나무 잎으로부터 N-containing sugars를 분리, 동정하였으며, Basnet는 뽕잎으로부터 ethylacetate, butanol 분획에서 혈당 강하 활성을 가진 물질이 2-aryl-benzofuran 유도체임을 보고하였다. 또한 정 등은 뽕잎의 water-soluble 분획에서 혈당 강하 활성물질 acarobose와 마찬가지로 탄수화물의 소화에 관여하는 효소인 \( \alpha \)-glucohydrolase 억제작용에 기인한다고 보고하였으며, 최근 Kim등은 뽕잎 추출물이 흰쥐와 건강한 성인의 헐청지질에 미치는 영향을 조사하였다. 그 외 뽕나무 수용성 추출물의 항산화 활성 및 쥐를 이용한 여러 가지 생리활성을 조사 및 오디의 형태와 과실에 대한 특성 연구, 오디 색소에 관한 연구 등이 대부분이며 줄기 및 잎에 관련한 항당뇨 효과에 대한 연구가 이루어졌으며, 최근에서야 혈관을 막는 원인이 되는 중성지방을 제거하고, 간에 해로운 성분을 없애주는 효능이 있다는 것이 밝혀졌다. 하지만 국산 오디의 경우 수급이 원활하지 않아 가격이 비싸기 때문에 산업체에서 국산 오디를 사용하기가 무척 어려운 실정이다. 이에 본 연구는 폐경 후 여성이나 난소를 제거한 동물의 경우 음식물 섭취가 촉진되고, lipid나 lipoprotein 대사의 이상으로 인한 고지혈증(hyperlipidemia)과 심혈 관질환(cardiovascular disease)이 빈번히 나타나므로 흰쥐에 갱년기 장애를 유도하였을 때 나타나는 estrogen 분비 감소로 인한 심혈관계 질환 발병 위험률에 있어서 국산오디추출물이 어떠한 영향을 미치는지에 대한 효과 뿐 아니라 국산 오디보다 비교적 가격이 싼 중국산 및 타지키스탄 오디를 국산오디와 비교하여 그 효과를 살펴보았다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>체중증가량</h2><p>폐경 후 여성의 비만은 독특한 생리적 현상으로 실제로 폐경 후의 여성이나 난소를 제거한 동물의 경우 음식물 섭취가 촉진되고, 몸무게와 지방조직이 증가된다. 실험기간 동안 실험동물의 체중 증가량 및 식이 효율을 Table 2에 나타내었다. 난소를 절제한 OVX-control이 난소를 절제하지 않은 Sham군보다 몸무게가 뚜렷이 증가 \( (\mathrm{P}<0.05) \)하는 경향을 보였다. 난소를 절제한 group군 간에 유의성 있는 변화는 보이지 않았으나, 다른 군에 비해 타지키스탄 오디추출물 투여군의 경우 몸무게가 뚜렷이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 일반적으로 에스트로겐은 지방조직의 지단백리파아제(lipoprotein-lipase)의 활성을 저하시키고 호르몬 민감성리파아제(hormone sensitive lipase) 활성을 증가시켜 체지방 축적을 억제한다고 알려져 있다. 따라서 난소를 인위적으로 제거할 경우 여성호르몬의 결핍으로 인하여 지방조직이 증가하게 된다. 인위적으로 난소를 제거한 후 오디를 투여할 경우 Sham군과 비교해 유의적으로 체중 증가 현상이 나타났는데 이것 역시 여성호르몬의 부재에 의한 것으로 오디 추출물이 체중감소에는 뚜렷한 영향을 미치지는 못하였다. 하지만 식이 섭취율을 살펴보면 OVX-conrl군에 비해 유사하거나 높았음에도 불구하고, 최종 몸무게는 OVX-control에 비해 낮은 것으로 보아 오디가 갱년기 장애의 대표적인 증상인 체중 증가를 감소시킬 수 있는 기능성의 식품으로의 연구도 가능할 것으로 보인다.</p><h2>혈청 중 효소활성</h2><p>혈청 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)는 간과 심장에 고농도로 존재하는 효소로서 세포장애 정도와 비교적 상관성이 좋을 뿐 아니라 다른 혈 중 효소에 비해 예민하게 변동하여 간염, 간경변 등의 지표로 널리 이용된다. 정상인의 범위는 \(5 \sim 40 \mathrm{unit}/\mathrm{L}\)이고, 횐쥐의 정상 효소 활성은 \(39 \sim 111 \mathrm{unit}/\mathrm{L}\)로 알려져 있다. 여러 조직에 광범위하게 존재하는 GOT와 GPT (glutamic pyruvic transaminase)는 간이나 심장근육에 많이 존재한다고 알려져 있고 혈청중에는 보통은 미량이 있으며, 간에서는 주로 세포 중에 존재하나 간 세포의 상해 시 간세포의 막 투과성이 항진된 결과 혈중으로 유출되어 급성간염, 중독성감염의 경우 뚜렷이 상승하고, 만성간염, 간경변증, 비alcohol성 지방간 및 과체중(비만)등에서 상승한다. Fig. 1 및 2는 오디 추출물이 혈청 효소 활성에 미치는 영향을 살펴본 것이다. GOT 및 GPT 활성은 Sham군에 비해 OVX-control이 유의성 있게 증가하는 경향을 나타내었다. 오디 추출물 투여 시 GPT 값은 정상군인 Sham군보다는 높은 값 \( (\mathrm{P}<0.05) \)을 나타내었지만, OVX-control군 보다 그 값이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한 오디 추출물 투여 시 GOT 활성은 정상군인 Sham군과 유사할 정도로 그 값이 감소하였으며, 특히 타지키스탄 오디 추출물은 Sham군 보다 그 값이 감소하는 것을 볼 수 있어 오디가 간 기능 해복 효과가 있다는 연구결과와 일치하였다.</p> <h2>혈청 중 지질 농도 분석</h2><p>각종 순환기계 질환과 밀접한 관련이 있는 식이성 인자로서는 콜레스테롤, 포화지방산 그리고 당질의 과잉 섭취와 식이섬유소, 비타민과 미량 무기질 등의 결핍과 불균형 등을 들 수 있는데 이러한 요인들은 혈청 콜레스테롤 농도를 상승시키며 지단백질 조성의 변화를 초래한다고 알려져 있다. 콜레스테롤은 세포막의 구성요소이며 담즙산, steroid hormone과 vitamin D의 전구물질로서 생체내의 필수 성분이긴 하나, 장기간 과량 섭취 시 혈중 농도가 높아지고 체내에 축적되면 고지혈증, 동맥경화증, 심장 질환 및 담석증 등 각종 순환 기계 질환을 유발하게 되는 것으로 알려져 있다. 대부분의 콜레스테롤과 심장순환기관련 질환에 대한 역학조사는 Framingham 연구 결과를 토대로 이루어지고 있으며, 이러한 심순환기 질환의 발병과 혈중 콜레스테롤의 상관관계는 청 · 장년기에 높게 나타나지만, 65세 이후의 남성에 있어서 사실상 무관하게 나타나고 있다. 콜레스테롤의 분포를 보면, 건강한 젊은 여성의 경우 같은 나이의 남성에 비해, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 그리고 중성지방은 낮고, HDL-콜레스테롤은 남성에 비해 상대적으로 높으나 폐경에 이르러 중성지방과 HDL-콜레스테롤은 대체로 변화가 없으나 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤은 증가되어 폐경기 이후 혈관관련질환의 발병률이 높아지는 원인으로 작용하고 있다. 에스트로겐은 혈장 콜레스테롤을 저하시키는 효과를 가지며 그 주요 기전은 간 조직의 LDL-cholesterol 제거에 의한 것으로 알려져 있다. 또한 지방질 운반에 관여하는 또 다른 지단백질인 HDL-cholesterol은 조직으로부터 나온 콜레스테롤을 받아들여 간으로 이동시켜 LDL-cholesterol의 산화를 방어하는 역할을 수행하며 혈액 내 HDL-cholesterol 농도가 감소하면 콜레스테롤을 간으로 이동시키지 못하므로 HDL-cholesterol 농도가 감소하면 콜레스테롤을 간으로 이동시키지 못하므로 HDL-cholesterol 농도가 낮은 것은 심혈관계 질환의 위험요소가 되는 것으로 알려져 있다. 난소절제 후 \( 0.9 \% \) 생리식염수를 투여한 군의 경우 난소절제 하지 않은 군에 비해 total-cholesterol 및 triglyceride 함량이 높았다. 이에 반해 난소절제 후 각 오디추출물을 투여한 경우 total-cholesterol 및 triglyceride 함량 모두 난소절제 대조군에 비해 감소하였으며 total-cholesterol의 경우 타지키스탄 오디 투여 시 정상군과 유사할 정도로 감소하였다 \( (\mathrm{P}<0.05) \). 혈청 지질농도 역시 난소절제 대조군의 경우 비난소절제한 정상군보다 약간 높게 나타났으나 난소절제 후 각 오디추출물을 투여 할 경우 세 가지 오디 투여군 모두 정상군보다 낮아지는 것을 볼 수 있었다. 또한 Fig. 5에서 보듯이 혈 중 HDL-cholesterol 농도의 경우 난소절제 대조군은 정상군보다 수치가 약간 감소하였으며, 난소절제 후 각 오디 추출물 투여 시 정상군과 유사하거나 정상군에 비해 약간 증가하였지만, 특히 국산 오디 추출물을 투여할 경우 정상군보다 뚜렷이 증가 \( (\mathrm{P}<0.05) \) 하는 것을 볼 수 있었다. 이것은 폐경기 여성을 대상으로 한 다수의 연구에서 에스트로겐을 투여하면 HDL-cholesterol 농도가 증가하고, LDL-cholesterol 농도 및 혈 중 중성지질의 수준을 낮추어 줌으로 오디 추출물이 폐경 이후 증가하는 혈류관련질환을 개선시켜 줄 것으로 생각된다.</p>	생명
대장균을 이용한 Akt/PKB Protein Kinase의 발현 및 활성화	<h1>결과 및 고찰</h1> <p>세포는 세포 밖의 신호(signal)를 세포내로 전달해주는 다양한 신호전달기구에 의존하여 생명현상을 유지한다. 그 중 세포내의 작은 2차 신호전달 물질(second-messenger molecules)은 중요한 역할을 하는뎨, 특히 inosites는 kinase와 반응하는 것으로 알려져 있다. Growth-factor regulated</p> <p>serine/threonine kinase인 protein kinase \( \mathrm{B}(\mathrm{Akt} / \mathrm{PKB}) \) 는 phosphoinositide 3-OH kinase( \( \mathrm{PI}-3 \mathrm{~K}) \) product와 결합하여 plasma membrane으로 translocation되며 phosphoinoside-dependent kinase 1(PDK1) 등에 의하여 473 번째 위치의 serine과 308 번째 위치의 threonine이 인산화 됨으로써 활성화(activation)된다[3]. 이렇게 활성화 된 Akt는 다양한 스트레스에 의해서 야기되는 apoptosis로부터 세포를 보호하는 survival signal을 전달해주며 insulin과 관련된 대사과정에 참여하여 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이와 같은 Akt kinase 활성을 조절 할 수 있는 조절물질은 Akt kinase가 관여하는 다양한 조절 기능으로부터 유추할 때 암, 당뇨, 치매 등을 치료할 수 있는 신약 개발에 많은 기여를 할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 세포내 신호전달 기구 중 Akt등을 포함하는 인산화를 통한 신호전달기구를 분석할 수 있는 assay kit개발을 목적으로 human Akt kinase를 활성이 상실되지 않은 형태로 대장균에서 대량으로 발현시키는 연구를 실시 하였다.</p> <h2>Human \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 의 대장균에서의 발현</h2> <p>대장균 발현 vector인 \( \mathrm{pET} 28 \mathrm{a}(+) \) 에 human \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 의 cDNA 유전자를 삽입한 pET28-Akt1 재조합 벡터를 제조한 후, 이를 E. coli \( \mathrm{BL} 21 \) 에 형질전환하였다. 형질전환체 접종시 IPTG를 최종농도 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 배양한 후 cell lysate를 SDS-PAGE로 확인해 본 결과 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 로 추정되는 단백질이 발현됨을 알 수 있었다(Fig. 1). 예상되는 발현 단백질은 \( 60 \mathrm{kDa} \) 정도이지만 발현된 단백질의 분자량은 이 보다 약간 큰 것으로 분석되었다. 하지만 상기 조건에서 발현된 단백질은 soluble fraction이 아닌ㅜinsoluble fraction으로 발현되어 보다 구체적인 발현 조건 개선이 요구되었다(data not shown).</p> <h2>Akt/PKB 발현조건 최적화</h2> <p>\( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 를 soluble form으로 대량 발현시키기 위해서 IPTG 농도를 바꾸어주거나 배양온도를 낮추어 주는 등 다양한 조건에서 형질전환 된 E. coli를 배양하는 실험을 실시하였다. 전반적으로는 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 배양 하였을 때 가용성 발현 단백질 양이 많았다. 따라서 다양한 IPTG 농도 하에서 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 발현시킨 Akt kinase의 발현 양상을 Fig. 2에 나타냈다. 결과적으로, IPTG가 0.01-0.09 mM까지 Akt 단백질이 soluble form으로 발현되었으나, insoluble form도 상당량 존재하였다. 최종적으로 0.03-0.07 \( \mathrm{mM} \) 의 IPTG 농도에서 soluble form으로의 발현율이 가장 높은 것으로 판단되었으며, 이후의 모든 발현 실험은 \( 0.05 \) \( \mathrm{mM} \) IPTG 농도로 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 발현을 유도하여 진행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>DNA 추출 및 조작</h2> <p>야생형 Akt/PKB kinase 유전자는 pUSEamp-Akt1 cDNA (catalog \# 21-153, Upstate Biotechnology사, USA)를 구입하여 사용하였다. 대장균에서의 형질전환 및 plasmid DNA 재조합 조작은 Maniatis 등의 방법에 따라 추출하였다. 각종 제한효소 및 T4 DNA ligase(Takara, Korea) 등은 구입하여 사용하였으며, 반응조건은 제조 회사의 권장 방법에 따라 실시하였다.</p> <h2>발현벡터의 제작</h2> <p>구입한 pUSEamp-Akt1 cDNA 재조합 벡터를 EcoRI \( \mathrm{BamHI} \) 으로 자르고 얻은 \( 1.75-\mathrm{kb} \) 의 단편을 같은 제한효소를 이용하여 자른 pET28a \( (+) \) (Novagene, USA) 벡터에 삽입하여 길이 7.1-kb의 pET28-Akt1 재조합 벡터를 제작하였다.</p> <h2>대장균에서 유전자의 대량 발현</h2> <p>각각의 배양 조건에서 성장한 균체의 단백질의 양을 측정하기 위해서 Bradford 분석법을 이용하였다. 배양한 균체에 각각 \( 300 \mu \mathrm{L} \) 의 완충액을 넣어 현탁시키고, 초음파분쇄기로 분쇄한 후 \( 10,000 \times g \) 에서 30 분간 원심분리하여 얻어진 침전물과 supernatant를 이용하여 각각의 protein의 양을 측정하였는뎨, 이때 BSA(bovine serum albumin)를 표준품으로 이용하여 표준검량곡선을 작성한 후 측정하였다.</p> <h2>Akt/PKB kinase의 정제</h2> <p>Akt kinase를 정제하기 위하여, IPTG \( 0.5 \mathrm{mM} \) 로 발현을 유도시킨 대장균을 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양 후 원심분리하고, 세포만을 disruption buffer [ \( 25 \mathrm{mM} \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} / \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}(\mathrm{pH} \) 7.5) + \( 300 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 20 \mathrm{mM} \) imidazole, \( 0.2 \mathrm{mM} \mathrm{CoCl}_{2} \), AEBSF]에 현탁하여 초음파로 분쇄하였다. 원심분리로 세포 침전물을 제거한 cell lysate를 nickel-nitrotriacetic acid \( \left(\mathrm{Ni}^{2+}\right. \)-NTA) resin(Qiagen, Germany)과 섞어 1 시간 방치하였다. \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-NTA agarose 컬럼을 동일한 완충액으로 3 회 세척하고, \( 250 \mathrm{mM} \) imidazole 함유 elution buffer로 His \( _{6^{-}} \) tagged protein을 용출하였다. 용출한 단백질은 dialysis buffer [ \( \left.25 \mathrm{mM} \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} / \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, \mathrm{pH} 7.5,0.2 \mathrm{mM} \mathrm{CoCl}_{2}\right] \)로 충분히 투석하여 사용하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>분리한 단백질이 목적하는 Akt kinase 임을 명확히 밝히기 위해서 SDS-PAGE 후 젤에 전개된 단백질을 Pharmacia사의 multiphore electrophoresis kit를 이용하여 electrotransfer 방법에 의해 nitrocellulose membrane에 옮겼다. Ponceau Staining으로 transfer된 protein band를 확인한 후 \( 1 \mathrm{x} \) TBS (Tris-buffered saline: \( 20 \mathrm{mM} \) Tris, \( 500 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl,} \mathrm{pH} \) 7.5)으로 washing한 후 blocking buffer(5\% dried milk in PBS, 0.05\% Tween-20) \( 100 \mathrm{~mL} \) 를 넣어 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후, anti-Akt antibody와 1 차 반응을 시키고, Supersignal West Femto Chemiluminescence western blotting detection system(Pierce Biotech, USA)을 이용하여 band의 형성을 확인한 후 건조시켜 보관하였다.</p> <h2>Akt/PKB kinase 활성화</h2> <p>정제한 Akt 단백질은 293 cell lysate를 이용하여 활성화시켰다. 간단하게, Akt protein kinase(10 unit \( / \mu \mathrm{L}) 20 \mu \mathrm{L} \), \( 10 \times \) kinase buffer(200 mM HEPES [pH 7.4], \( 143 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}, 10 \mathrm{mM} \) EDTA) \( 3 \mu \mathrm{L}, 20 \mathrm{mM} \) DTT \( 3 \mu \mathrm{L} \), cell lysate \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) 1 \mu \mathrm{L}, 2 \mathrm{mM} \) ATP \( 3 \mu \mathrm{L} \) 를 섞어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응 시켰다. 활성화된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) kinase는 필요 시 \( \mathrm{Ni}^{2+} \) -NTA column으로 정제하여 사용하였다.</p> <h2>비방사성 protein kinase assay</h2> <p>Protein kinase assay는 형광 물질인 FITC 가 부착된 기질 (FITC-TRRSRTESIT)을 이용하여 실험하였다. 반응액은 FITC-peptide \( 5 \mu \mathrm{g}, 2 \times \) reaction buffer(40 mM HEPES \( \left[\begin{array}{ll}\mathrm{pH} & 7.2\end{array}\right], 20 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, 20 \mathrm{mM} \mathrm{MnCl}_{2}, 2 \mathrm{mM} \) DTT, \( 40 \mathrm{mM} \) ATP, \( 2 \mu \mathrm{g} \) phosphatidyl serine) \( 10 \mu \mathrm{L} \) 에 증류수를 혼합하여 총 부피를 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 로 조정하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 반응한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 열처리로 반응을 정지시킨 sample을 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전개하여 활성을 확인하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>포유동물세포는 외부환경, 세포의 변화, 외부 신호를 인식하고 이에 대응하여 반응하기 위해 진화학적으로 보존된 여러 신호전달기전들을 가지고 있다. Hemmings 그룹에 의해 세포생존을 위한 신호전달과정에 Akt/PKB protein kinase가 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀진 이후, 이의 활성화 조절 기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 단순히 하나의 발암유전자로 발견된 Akt/PKB kinase는 해당 유전자의 염기서열과 단백질 서열의 분석으로, 새로운 phosphatidylinositol 3 kinase \( (\mathrm{PI} 3 \mathrm{~K}) \) 의 major effector protein이라는 사실이 밝혀젔다. 이 효소에는 N-terminal에 pleckstrin homolgy(PH) domain이 존재하며, \( \mathrm{PH} \) 도메인의 존재로 이 효소가 PI \( 3 \mathrm{~K} \) lipid products에 의해 세포막에 운반되는 단백질 중의 하나로 밝혀지게 된 것이다.</p> <p>세포내의 신호전달 체계는 생체를 유지하는데 가장 핵심적인 세포의 생사 및 항상성 등에 필요한 조절을 담당하고 있으며, 이를 조절할 수 있는 조절물질의 개발은 학문적으로나 산업적으로 중요하다. 이의 중요성을 인식하여 신호전달 조절물질을 선별하기 위한 연구가 진행된 바 있으나 큰 성과를 얻지 못하였다. 그 주요 원인은 신호전달의 주요 messenger인 인산화 분석 방법이 너무 어렵고, 고 비용을 필요로 하며, 시간이 많이 걸리는 어려움을 지적할 수 있다. Akt/PKB kinase의 겅우 cell signaling의 상부에 위치하고 있는 kinase로서 XXRXRXXS/TXX(X: hydrophobic amino acid) 서열에 대한 특이적인 인산화를 통하여 세포의 생존과 관련된 signal을 관장하고 있다. 이러한 인산화의 표적 단백질 중에는 세포의 암화에 필수적인 telomerase를 포함하여, 당대사에 관련된 조절 유전자, 세포사를 유도하는 조절유전자들이 포함되어 있다. 따라서 Akt/PKB kinase의 활성을 억제하는 저해제를 개발할 경우 세포 내 신호전달체게에 대한 연구용으로 매우 유용하게 작용할 것이며, 항암제 등 다양한 의약품 개발이 가능할 것이다. 이외에도, Akt/PKB kinase가 당뇨병, 노인성 치매 등과도 연관이 있다는 보고들을 염두에 둔다면, Akt/PKB-kinase inhibitor의 의약품으로서의 개발 가능성이 많음을 시사해 주고 있다. 지금까지 Akt kinase assay에 사용하는 Akt kinase 단백질은 모두 동물세포에서 생산하였으머, 결과적으로 상당한 비용을 요구하고 있다. 최근에는 이러한 Akt/PKB kinase를 대체할 수 있는 방선균 유래의 kinase를 이용하여 인산화를 실시하고, 이러한 시스템을 이용하여 Akt/PKB kinase 저해제를 성공적으로 발굴한 예도 있다. 이러한 Akt/PKB kinase의 중요성을 감안하여, 본 연구에서는 Akt kinase assay에 직접 사용할 수 있는 Akt/PKB kinase를 확보하기 위해, \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) kinase를 동물세포가 아닌 대장균에서 직접 발현시키고 활성화시키는 연구를 실시하였다.</p> <h2>발현된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 의 정제</h2> <p>발현된 Akt kinase는 \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-NTA agarose column을 사용하여 정제하였다(Fig. 3). 예상대로 insoluble form의 Akt 단백질은 제시된 컬럼 조작 조건에서 분리되지 않았으나, soluble Akt만이 성공적으로 분리되었다. 분리된 단백질은 예상 하는 분자량 보다 약간 큰 것으로 생각되었지만, anti-Akt antibody를 이용한 Western blot 결과 human Akt/PKB임을 확인할 수 있었다.</p> <h2>Akt/PKB의 in vitro 활성화 및 nonradioactive kinase assay</h2> <p>E. coli에서 발현 되어 정제된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 는 473 번째 위치의 serine과 308 번째 위치의 threonine이 인산화 되지 않았으며, 따라서 kinase 활성을 나타내지 않는다. 활성형 Akt/ \( \mathrm{PKB} \) 를 얻기 위하여 정제된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 를 293 cell lysates와 반응시켜 인산화 시킨 후 다시 정제하여 활성형 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 활성형 Akt kinase가 이전에 보고된 형광 peptide를 이용한 nonradioactive kinase assay system에 이용될 수 있는 지 확인하였다(Fig. 4). 그 결과, 활성화되지 않은 Akt 단백질에서는 peptide의 인산화가 관찰되지 않았지만, 활성화 된 Akt 단백질에서는 peptide를 인산화 시킬 수 있음이 관찰되었다. 이러한 사실은 대장균에서 발현시켜 얻은 Akt kinase로도 nonradioactive kinase assay의 kinase source로 사용할 수 있음을 명백하게 보여 주었다.</p> <p>일반적으로 kinase의 활성 측정을 위해 단백질 기질이나 펩타이드에 방사성 인산이 전달되는 정도를 측정하거나 인산화 잔기에 특이적인 항체를 이용하지만, 이러한 방법들은 위험성이 높고, 시간이 오래 걸리며, 고가여서 대량 assay에 적용하기는 불가능하다. 그러나, 상기에서 설명한 nonradioactive Akt protein kinase의 활성 측정법은 방사성 동위원소를 사용하지 않고도 감도가 뛰어나고 신속하게 2 시간 이내에 Akt protein kinase의 활성을 측정할 수 있다. Akt protein kinase가 기질로 이용하는 형광 펩타이드를 인산화시키면 펩타이드의 전하가 \( -2 \) 가 만큼 환원되며, 이러한 전하량의 변화에 따라 인산화된 펩타이드와 인산화되지 않은 펩타이드가 중성 \( \mathrm{pH} \) 상태의 agarose gel 전기 이동 양상이 달라지게 된다. 즉, 인산화된 펩타이드는 양극으로 빠른 속도로 이동하지만 인산화되지 않은 펩타이드는 중성을 띄어 이동하지 않거나 천천히 이동하게 된다. 이러한 방법을 이용하여 Akt protein kinase에 특이적인 저해제를 식물로부터 분리하여 구조 및 효능을 보고한 논문이 있으나, 모든 assay에는 반드시 kinase source가 필요하며, 현재 시판되는 Akt kinase를 사용하기에는 너무 고가이다. 본 연구 결과에서 제시하고 있는 것처럼 Akt kinase를 대장균에서 발현시키고 이를 assay에 사용한다면, 학문적으로는 물론 다양한 Akt kinase inhibitor 탐색에 많은 도움이 될 것으로 사료된다.</p>	생명
Hippocampus abdominalis 유래 단백질 가수분해물의 간 보호 효과	<h2>RT-PCR</h2> <p>ALC의 TGF- \( \beta \) 에 의한 간 손상 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. Chang 세포에 ALC를 \( 0.2,0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도로 2시간 전처리 한 후 \(10 \mathrm{ng/mL}\) \(\mathrm{TGF-\beta}\)를 처리하였다. 24시간 배양 후 RNA 추출을 위해 TRIzol 용액 \( 500 \mu \mathrm { L } \) 를 가해 4에서 교반기에 30분간 용해 후 Chloroform을 첨가하여 10분 간 상온에서 방치하였다. \( 14,000 \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 15분간 원심분리 하여 얻은 상층액에 isopropyl alcohol을 첨가하여 상온에서 10분간 방치한 후 다시 원심 분리하였다. 원심분리하여 얻은 RNA에 \( 70 \% \) ethanol을 가하고 원심분리하는 세척과정을 두 번 반복한 후, 상층액을 버리고 RNA를 공기 중에서 건조하였다. 건조된 RNA에 DEPC 용액을 더한 뒤 정량 하였다. 정량 결과 를 통해 \( 0.9 \mu \mathrm { g } \) 의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 된 cDNA는 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 냉동보관하며 사용하였으며 중합효소연쇄반응에 이용하였다. 각 유전자의 발현양은 GAPDH 발현양을 기준으로 정량 분석하였다.</p> <h2>실험동물 및 사육환경</h2> <p>본 실험을 위하여 오리엔트바이오(Korea)로부터 5주령 ICR mice 수컷 55마리를 구입하여 사용하였다. 실험기간 동안 사육 실의 온도는 \( 24 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도는 \( 50 \% \) 를 유지하였으며 조명은 12시간을 주기로 하였다.</p> <h2>급성 알코올 독성 유도</h2> <p>실험을 수행하기 위하여 무작위로 정상군 5마리, 알코올 투여 군 10마리, ALC 투여군 10마리로 그룹을 나누어 실험을 수행하였다. 먼저 정상군과 알콜투여군에 생리식염수를 투여하고, ALC 투여 군에는 ALC \( (50 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) body weight)을 경구투여 후 30분 뒤에, 정상군에는 생리식염수를, 나머지 두 그룹에는 에탄올 \( (2 \mathrm { ~g } / \mathrm { kg } \) body weight \( ) \) 을 일주일 간 같은 시간에 매일 1회 투여하였다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 해마를 효소를 이용하여 해마 단백질 을 가수분해하고 그렇게 얻은 해마 단백질 유래 효소 가수분해 물의 에탄올에 의해 유도된 간 손상 보호 효과를 확인하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>해마 단백질 유래 효소가수분해물(ALC) 제조</h2> <p>해마 원료에 단백질 가수분해 효소인 alcalase (Novozymes, Denmark)를 이용하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) \( \mathrm { pH } \) \(8.0 \) 조건 하에 24 시간 동안 가수분해를 진행하였다. 가수분해 후 \( 3,000 \times \mathrm { g } \) 에서 20 분간 원심분리 한 후 잔사를 제거한 상층액을 취하여 이를 해마 단백 질 유래 효소가수분해물 \( ( \mathrm { ALC } ) \) 로 사용하였다.</p> <h2>세포주 배양</h2> <p>본 실험에서 사용한 normal liver cell line인 Chang 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin \( ( \mathrm { P } / \mathrm { S } ) \) 이 첨가된 Roswell Park Memorial Institute medium을 이 용하여 배양하였고, 간암세포주 Huh7은 \( 10 \% \mathrm { FBS } \) 와 \( 1 \% \mathrm { P } / \mathrm { S } \) 이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium을 사용하였으 며 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 배양하였다.</p> <h2>세포 독성 측정</h2> <p>\( \mathrm { ALC } \) 의 세포 독성은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. Chang 세포를 \( 2.5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cell } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 씩 96 well plate에 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. 분주 16 시간 후에 \( \mathrm { ALC } \) 를 농도별로 처리하여 24시간 후 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 배양액 제거 후 MTT 용액 을 4 시간 동안 처리한 다음 \( 150 \mu \mathrm { L } \mathrm { DMS } \) 에 30 분간 녹여 분 광광도계를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 에탄올 독성 억제효과는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 세포를 96 well plate에 \( 2.5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cell } / \mathrm { mL } \) 로 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 씩 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 16시간 배양하였다. ALC를 농도별로 1시간 전처리한 후 \( 800 \mathrm { mM } \) 의 에탄올을 첨가하고 24 시간 배양하였 다. 배양액 제거 후 MTT 용액을 4시간 동안 처리한 다음 150 \( \mu \mathrm { L } \mathrm { DMSO } \) 에 30 분간 녹여 분광광도계를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>급성 알코올 독성 억제 실험. 혈청 GPT 및 GOT 활성 측정</h2> <p>GPT와 GOT는 간세포 내에 존재하는 효소로 간 조직에 손상이 일어나면 혈청 내로 유리되게 된다. 따라서 혈청 내의 \( \mathrm { GPT } \), \( \mathrm { GOT } \) 활성 증가는 간 손상의 지표로 사용된다(Coudray 등, 1993). 실험 동물의 혈청 \( \mathrm { GPT } \) 와 \( \mathrm { GOT } \) 의 활성 측정 결과(Fig. 3B, C), GPT와 GOT 모두 정상군에 비해 대조군에서 유의적으 로 증가하여 간조직에 손상이 발생함을 확인할 수 있었다. GPT 함량은 알코올 투여군과 비교하여 ALC 투여군에서 유의적 감소를 확인하였다. 간 중량과 \( \mathrm { GOT } \) 함량은 알코올 투여군에 비해 유의적 차이는 보이지 않았다. 그러나, 알코올 투여군에 비해 증가된 간 중량과 감소된 GPT 함량으로 볼 때 ALC 투여 가 알코올 섭취로 인한 간 독성 예방에 효과가 있음을 추측할 수 있었다.</p> <h2>만성 알코올 독성 억제 실험. 체중 및 식이 섭취량 변화</h2> <p>알코올 중독이 되면 환자들의 식이섭취량이 유의적으로 감소되고 다른 영양소의 흡수가 저하되어 영양 결핍으로 인해 체중이 감소된다는 보고가 있으며(Mezey 1980; Scheig 1970), 알코올을 과량으로 섭취 시 열 발생으로 인한 에너지 소모가 증가되기 때문에 체중이 감소되는 현상이 발생한다는 연구 결과가 있다(Pikaar 등, 1987). 따라서 4주간 ALC (25 mg/kg body weight)와 에탄올 \( (0.9 \mathrm { ~g } / \) body weight \( ) \)을 투여하여 만성 알코올 독성을 유도하고 실험기간 동안 7일마다 실험동물의 체중과 사료 섭취량을 측정하였다(Fig. \( 4 \mathrm { ~A } , \mathrm { ~B } ) \). 4주간의 체중 변화는 정상군이 마리 당 평균 \( 2.5 \mathrm { ~g } \) 이 증가한 반면 대조군은 평균 \( 1 \mathrm { ~g } \) 증가하여 정상군에 비해 현저히 감소된 체중 증가량을 보여주었다. 반면 ALC 투여군은 마리 당 평균 \( 2.0 \mathrm { ~g } \) 이 증가함으로써 정상군과 유사한 수준의 증가량을 보여주었다. 식이섭취량 또한 체중과 유사한 경향을 보여주었다. 정상군( \( 1.1 \mathrm { ~g } / \mathrm { day } ) \) 과 ALC (1.2 \( \mathrm { g } / \) day)군이 대조군 \( (0.6 \mathrm { ~g } / \mathrm { day } ) \)에 비해 두 배 가까이 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 위 결과는 알코올 투여 시 체중 및 식이섭취량 이 감소되었다는 연구 결과와 일치하였으며(Scheig 1970), 위 결과를 통해 ALC 투여에 의해 알코올 독성에 따른 체중 감소가 억제된 것을 확인하였다.</p> <h1>Abstract</h1> <p>Recently, liver damage contributes to big percentage of the morbidity and mortality rates worldwide. Excessive intake of alcohol is one of the major causes of liver injury. When liver injury is repeated and becomes chronic, it leads to development of fibrosis and cirrhosis. In the liver, TGF- \( \beta \) is a profibrogenic cytokine, which participates in various critical events cause liver fibrosis. Seahorse (Hippocampus abdominalis) is a common traditional Chinese medicine and has been widely used for centuries. Seahorse has been known to have a variety of bioactivities, such as anti-oxidant, anti-fatigue, and anti-tumor. Peptide is one of the main compounds of seahorse. In this study, we isolated enzymatic hydrolysate from seahorse H. abdominalis by alcalase hydrolysis and investigated the effect of the hydrolysate on liver injury. In the present in vitro studies, the hydrolysate increases cell viability of Chang cells and protects Huh7 cells from ethanol toxicity. In addition, the hydrolysate inhibits TGF- \( \beta \)-induced responses. In vivo studies show that the pretreatment of hydrolysate reduces alcohol-induced increases of serum Glutamic oxaloacetic acid transaminase and Glutamic pyruvate transaminase activities and increases liver weight and body weight. These results suggest that seahorse may have a hepatoprotective effect.</p> <p>Keywords Alcoholic liver disease . Hepatoprotective effect Hippocampus abdominalis</p> <h1>서 론</h1> <h1>서 론</h1> <p>전세계적으로 간 질환의 발생률은 점차 증가하고 있으며 간 질 환에 의한 사망자수는 전체 사망자수에서 큰 비율을 차지하고 있다(Lozano 등, 2012; Murray 등, 2012). 이러한 간 질환의 주요 원인 중 하나로 알코올 섭취를 들 수 있다. 지속적인 알 코올 섭취는 뇌, 신장, 그리고 심장 등과 같은 여러 기관에 다 양한 건강상의 문제를 유발하며, 특히 해독작용을 하는 간에 심 각한 손상을 가져온다(Jung과 Choi 2014). 알코올로 이한 간질 환은 비교적 단순하고 가벼운 지방간부터 간염, 간섬유화, 그리 고 간 질환의 마지막 단계이며 회복이 불가능한 간경변증까지 들 수 있다(O'Shea 등, 2010). 간은 인체의 대사 기능의 중심이 되기 때문에 이러한 간 손상은 인체 기능에 치명적이다.</p> <h2>만성 알코올 독성 유도</h2> <p>실험수행을 위해 동물을 무작위로 정상군, 알코올 투여군, ALC 투여 군에 각 10마리씩으로 나누어 실험을 수행하였다. 투여 방법은 급성 알코올 독성 유도 실험과 동일하게 수행하고 투여량을 달리하였다. ALC를 \( 25 \mathrm { mg } / \) body weight의 농도로, 에탄올은 \( 0.9 \mathrm { ~g } \) /body weight의 농도로 4주간 매일 같은 시간에 1회 투여 하였다. 7일마다 실험동물의 체중과 사료 섭취량을 측정하였다.</p> <h2>간 중량 측정</h2> <p>실험 동물의 간 중량 측정을 위하여 급성 알코올 독성 유도 실험의 경우 투여 처리기간인 1주 후, 만성 알코올 독성 유도 실험의 경우 4주 후 마취하고 심장 채혈한 후 간을 적출하였다. 적출한 간은 생리식염수로 세척한 다음 수분을 제거하고 중량을 측정하였다.</p> <h2>혈중 Glutamic oxaloacetic acid transaminase (GOT), Glutamic pyruvate transaminase (GPT) 활성 측정</h2> <p>혈액 채취 후 실온에서 30분간 방치하여 응고시킨 다음 3000 \( \mathrm { rpm } \) 에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하여 사용하였다. GOT \( \mathrm { GPT } \) 측정 Kit (Asan, Korea)를 사용하여 \( \mathrm { GOT } \) 와 \( \mathrm { GPT } \) 활성을 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>세포 독성 확인</h2> <p>Chang 세포에서 \( \mathrm { ALC } \) 의 처리가 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 수행하여 세포생존율을 측정하였다 ( \(Fig. \) \(1A \)). 실험 결과 \( \mathrm { ALC } \) 는 수행된 모든 농도 \( (0.05,0.1,0.2,0.5 \), \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) )에서 세포 독성을 나타내지 않았으며 세포생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>알코올 독성 억제 효능 확인</h2> <p>Huh7 세포에 \( \mathrm { ALC } \) 를 1시간 전처리 한 후 에탄올을 \( 800 \mathrm { mM } \) 처리하고 24시간 뒤 세포생존율을 확인하였다 \(Fig. \) \(1B) \). 실험 결과, 에탄올 처리에 의해 감소된 세포생존율이 \( \mathrm { ALC } \) 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. \( 0.1 \mathrm { mg } / \) \( \mathrm { mL } \) 의 농도에서부터 유의적으로 증가하였으며 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서는 대조군과 유사한 수준까지 세포생존율이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 \( \mathrm { ALC } \) 가 Huh7 세포를 에탄올 독성으로부터 보호하는 것을 확인하였다.</p> <p>간이 알코올로 인해 손상을 받으면 상처 치유 과정이 일어난 다. 이 과정에서 간 손상 부위에 세포외기질(extracellular matrix, \( \mathrm { ECM } ) \) 의 축적이 일어나고 이 과정이 반복되고 만성적으로 일어 나게 되면서 상처 치유 과정과 관련된signaling이 지속적으로 활 성화됨에 따라 상처 치유 반응이 계속해서 일어나게 된다. 이 에 따라 과도한 세포외기질의 축적이 일어나게 되고 간섬유화, 간경변증으로 발전하게 된다(Parola과 Pinzani 2009). 간성상세 포(hepatic stellate cell, \( \mathrm { HSC } \) )는 세포외기질 생성을 주도하는 주요 세포이다. 휴지상태의 \( \mathrm { HSC } \) 가 알코올에 의해 활성화가 되면 콜라겐(collagen), \( \alpha \)-smoonth muscle actin ( \( \alpha \)-SMA), TGF- \( \beta \) 와 matrix metalloproteinase 등과 같은 세포외기질을 형성한다. \( \mathrm { TGF } - \beta \) 는 주요 profibrogenic cytokine으로 \( \mathrm { HSC } \) 의 활성화나 간 세포의 세포사멸(hepatic apoptosis) 혹은 세포외기질 형성에 관 여한다(Wynn 2008). 또한 TGF- \( \beta \) 는 상피간엽이행(epithelial- mesenchymal transition, EMT)을 촉진시키는데, 이는 결국 간손 상을 유발하고 간섬유화로의 발전을 유도한다(Dooley과 ten Dijke 2011). 그러나 현재까지 이러한 알코올로 인해 유도된 간 손상을 치료할 수 있는 효과적인 방법은 미비한 실정이다.</p> <p>해마는 큰가시고기목(Syngnathifromes), 실고기과(Syngnathidae) 에 속하는 어종으로 온대와 열대해역이 주 서식지이다. 아시아 등지에서 전통 약재로 널리 이용되고 있는 해마는 특히 중국에 서 매우 귀한 약재로 여겨진다(Chen 등, 2015). 여러 연구에 의 하면 해마는 항종양( \( \mathrm { Li } \) 등, 2008), 항산화(Chen 등, 2011), 항피 로(Jianying 등, 2000) 등 다양한 생리활성을 가지고 있다. 해마 의 주요 구성 성분은 스테로이드, 미네랄, 아미노산, 펩타이드, 지방산을 들 수 있다(Chen 등, 2015). 본 연구에서는 그 구성 성분 중 아미노산과 펩타이드에 주목하였다. 아미노산은 호르몬 과 저분자의 질소 함유물 합성에 중요한 역할을 하며 세포 신 호전달 인자로서 유전자 발현과 단백질 인산화를 조절할 수 있 다( \( ( \mathrm { Wu } \) 2009). 또한 펩타이드 중 생리활성 기능을 가진 bioactive peptide는 인체의 기능에 긍정적인 영향을 끼쳐 궁극 적으로 인체 건강에 도움을 줄 수 있다. 현재까지 22 개의 아미 노산이 해마에서 분리가 되었지만 그와 관련된 자세한 메커니 즘에 관한 연구는 부족한 실정이다(Chen 등, 2015).</p> <h2>만성 알코올 독성 억제 실험. 간 중량 측정</h2> <p>간 무게를 측정한 결과(Fig. \( 4 \mathrm { C } ) \), 대조군의 간 무게 \( (0.8 \pm 0.14 \mathrm { ~g } ) \)가 정상군 \( (1.04 \pm 0.19 \mathrm { ~g } ) \)에 비해 유의적으로 감소된 것을 통해 만성 알코올 간 독성이 유도된 것을 확인하였다. 또한 \( \mathrm { ALC } \) 투여군 \( (0.94 \pm 0.096 \mathrm { ~g } ) \) 은 대조군에 비해 유의적으로 증가된 것을 통해 알코올 투여로 유도된 간 독성이 ALC 투여에 의해 억제된 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>만성 알코올 독성 억제 실험/혈청 GPT 및 GOT 활성 측정</h2> <p>혈청 \( \mathrm { GPT } \) 및 \( \mathrm { GOT } \) 활성을 측정결과(Fig. \( 4 \mathrm { D } , \mathrm { E } ) \), 대조군에서 정상군보다 감소된 \( \mathrm { GPT } \)와 \( \mathrm { GOT } \)를 확인할 수 있었다. 대조군과 \( \mathrm { ALC } \) 군을 비교했을 때, \( \mathrm { GPT } \) 에 비해 \( \mathrm { GOT } \) 의 활성이 더 감소 한것을 관찰할 수 있었는데 이는 Soh 등(2003)과 Bae 등 (2009)의 연구에서와 유사한 경향을 보여주었다. 알코올의 만성적 투여는 왜소체 에탄올 산화체계(microsomal ethanol oxidizing system, MEOS)를 통해 알코올 산화가 증가되면서 활성산소인 \( \mathrm { O } _ { 2 } ^ { - } , \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 및 \( \mathrm { OH } \cdot \) 생성되어 간세포의 손상이 발생하게 된다 (Lieber 1991). 비록 GOT에서 유의성을 관찰할 수 없었고 GPT 의 경우 ALC 투여에 의한 감소를 확인할 수 없었지만, 그 외의 실험동물의 체중, 사료 섭취량, 그리고 간 중량 결과를 종합 해봤을 때, ALC 투여가 간을 알코올 독성으로부터 보호해주는 것을 확인할 수 있었다.</p> <p>In vitro에서 \( \mathrm { ALC } \) 가 에탄올에 의해 유도된 독성과 \( \mathrm { TGF } - \beta \) 에 의한 간 손상을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, in vivo를 통해서도 ALC 처리에 의해 급성 알코올 독성과 만성 알코올 독성으로 인한 간 손상이 약화되는 것을 확인하였다. 따라서 \( \mathrm { ALC } \) 의 간 보호 효과를 유추해볼 수 있었다. 그러나 동물실험에서 간 무게 변화나 \( \mathrm { GOT } \) 와 \( \mathrm { GPT } \) 활성변화에서 통계적으로 유의성이 나타나지 않았기에 향 후 추가적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.</p> <h2>TGF- \( \beta \) 에 의한 간 손상 억제 효과 확인</h2> <p>TGF- \( \beta \) 는 간성상세포를 활성화시켜 세포외기질 형성을 유도하고 EMT를 촉진시킬 수 있다. 이로 인해 간손상이 유발되고, 더 진행되면 간섬유화로 발전이 된다. 이에 \( \mathrm { ALC } \) 의 간 보호 효능 을 확인하기 위해 Chang 세포에 \( \mathrm { ALC } \) 를 2시간동안 전처리 하 고 TGF- \( \beta \) \((10 \mathrm { ng } / \mathrm { mL } ) \) 를 24시간 처리하여 RT-PCR을 통해 유전자 발현 정도를 확인하였다 \((Fig. \) \(2) \). 간성상세포가 활성화되어 있는 동안 발현된다고 알려진 \( \alpha- \mathrm { SMA } \) 와 vimentin의 mRNA 발현을 확인하였다(Friedman 2008). 또한 EMT marker인 slug를 확인하였다. EMT는 상피세포(epithelial cell)가 전이능력과 침윤 능력을 보유하는 세포인 간엽세포(mesenchymal cell)로 분화하는 과정이다. 간에 염증이나 손상이 발생하였을 경우 EMT가 유도되게 된다. 손상된 간세포가 \( \mathrm { EMT } \) 를 통해 재생이 되며 손상이 회복되는데 그 손상이 과도하게 일어나는 경우 기질의 재형성이 유발되면서 간섬유화가 발생이 된다. Slug는 이러한 \( \mathrm { EMT } \) 의 핵심 조절 인자 중 하나이다(Kim 등, 2010). \( \alpha \)-SMA, vimentin, slug의 유전자 발현 정도를 확인한 결과, TGF- \( \beta \) 에 의해 증가된 vimentin, \( \alpha \)-SMA, slug가 ALC 투여에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 \( \mathrm { ALC } \) 가 TGF- \( \beta \) 로 인한 간 손상이 억제할 수 있는 효능을 가진 것이라 사료된다.</p> <h2>급성 알코올 독성 억제 실험. 간 중량 측정</h2> <p>일주일 간 ALC \( (50 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) body weight)와 에탄올( \( 2 \mathrm { ~g } / \mathrm { body } \) weight)을 투여하여 간 독성을 유도한 후 간을 적출하고 그 무게를 확인하였다(Fig. 3A). 그 결과 정상군의 평균 간 무게(1.06 \( \pm 0.05 \mathrm { ~g } ) \)에 비해 알코올만 투여한 대조군의 평균 간 무게 \( (0.6 \pm \) \( 0.19 \mathrm { ~g } ) \)가 유의성 있게 감소하였고 \( \mathrm { ALC } \) 군 \( (0.82 \pm 0.15 \mathrm { ~g } ) \) 은 대조군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었다.</p>	생명
한국산 민자주방망이 버섯의 유전적 변이	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>채집 및 배양</h2> <p>가랑잎애기버섯, 밀버섯, 솔버섯, 황토볏짚버섯, 및 민자주방망이버섯은 경상북도 경산시 하양읍의 야산등 7곳과 제주도에서 채집한 민자주방망이버섯과 광릉에서 채집한 자주방망이버섯아재비를 각각 1종을 채집하였다. 민자주방망이버섯과 자주방망이버섯아재비 외에 가랑잎애기버섯, 밀버섯, 솔버섯, 졸각버섯, 만가닥버섯 등을 비교 분석 재료로 하였다. 채집한 버섯의 주름살 일부분 떼어 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하였다. 배양된 균사는 감자연결, 모양, 색깔 등을 보고 기존의 문헌에서 서술된 내용과 일치되는 균사를 분리하여 계대배양 하였고, 그중 같은 시기에 계대한 균주를 분리하여 실험에 사용하였다.</p> <p>일반적으로 버섯균사의 배양실험에 많이 사용하는 PDA 배지를 선정하였다. PDA배지는 PDA \( 39.0 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{pH} 5.4 \)로 조제하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C}\), 1.5 기압에서 30분간 멸균하고, clean bench 하에서 멸균된 직경 \( 87 \mathrm{~mm} \)의 petri dish에 \( 50 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 완전히 식힌 후, 직경 \( 5 \mathrm{~mm} \)의 Cork borer로 자른 후 접종하였다. 접종 후 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)의 incubator에서 25일간 배양하였다.</p> <h2>Genomic DNA의 분리</h2> <p>Genomic DNA 분리에 사용한 균사는 PDA배지에서 25일 간 배양한 균사를 사용하였다. DNA분리 방법은 Yoon 등의 방법을 약간 변형시켜, 배양한 균사체의 약 \( 0.5 \mathrm{~g} \)을 액체질소로 동결시켜 유발로 갈아서, 마쇄한 분말을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) eppendorf tube에 옮기고, lysis buffer [ \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \((\mathrm{pH} 7.2)\), \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA \( (\mathrm{pH} 8.0)\), \(3\%\) sodium dodecyl sulfate (SDS), \(1 \% \) 2-mercatoethanol] \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 넣어서 잘 섞고, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 중에는 10분마다 두 세번씩 뒤집어서 섞어주었다. 다음에는 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하고 상층액을 micropipet으로 채취하여 다른 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 옮겼다. 채취한 양과 동량의 phenol-chloroform-isoamylalcohol (25: 24: 1)을 넣어 잘 섞은 뒤, \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 채취하여 새 tube에 옮긴 후 채취액의 2배의 냉장보관한 \( 70 \% \) ethanol을 넣고 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 3분간 원심 분리하여 DNA를 침전시켰다. pellet을 확인한 후, 상층액을 제거하고 실온에 20분 정도 건조시킨 다음, TE buffer \( [10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \((\mathrm{pH} 8.0)\), \( 1 \mathrm{mM}\) EDTA \((\mathrm{pH} 8.0)]\) \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣어서 DNA를 용해시킨 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하여 PCR 반응용액의 주형 DNA로 사용하였다.</p> <h2>PCR 반응액의 조성과 PCR 조건</h2> <p>PCR에 사용한 primer들의 code name과 sequence는 Table 1에 나타내었다. 대체로 \( \mathrm{G}-\mathrm{C} \)의 함량이 \( 60 \sim 70 \% \)이었다. PCR을 위한 반응 혼합액의 조성은 Taq polymerase \( 1 \mathrm{U} \), Tris-HCl \((\mathrm{pH} 9.0)\) \( 10 \mathrm{mM} \), dNTPs mixture \( 250 \mu \mathrm{M}\), \(\mathrm{KCl} ~40 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{MgCl}_{2} ~1.5 \mathrm{mM} \)였고 여기에 genomic DNA \( 1.0 \mu \mathrm{l} \) primer \( 2.0 \mu \mathrm{l} \) (Genotech)를 넣고 3차 증류수를 \( 20 \mu \mathrm{l} \)까지 채웠다. PCR에 사용한 thermal cycler는 영국 Techne사의 Progene였으며, PCR 조건은 박등의 방법을 약간 변형하여 따라 주형 DNA를 변성(denaturation)시키기 위해 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 처리 후, 증폭을 위해 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 변성(denaturation), \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 부착(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 중합 반응을 확실하게 완성하였다. PCR한 product들은 ethdium bromide를 첨가한 \( 1.0 \% \) agarose gel에서 \( 1 \times \mathrm{TAE} \) buffer (Tris base, glacial acetic acid, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{EDTA} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \))를 사용하여 \(70 \mathrm{volt}\)로 전기영동한 후 UV상에서 나타나는 band들을 관찰하였다.</p> <h2>계통수 분석</h2> <p>RAPD결과는 각 밴드를 하나의 형질로 취급하여 유무에 따라 '1'과 '0'으로 표시하고 전체 OTU 에 대한 자료형렬을 작성하였으며, PAUP (4.02b version, Swfford, 2001)을 사용하여 parsimony analysis를 하였으며, 분석방법으로는 Heu-restic search를 이용하였다. 또한 Nei의 유전적 거리지수를 다소 변한 Nei-Li의 거리지수를 이용하여 상사도 행렬을 도출하였다. 도출된 자료행렬에 따라 유전적 유사도를 기초로 한 neighbor-joining (NJ) tree를 산출하였다. 또한 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 jacknifing, bootstrap을 이용하였다. 이러한 분석방법은 1000회 반복하였으며 이를 통한 계통수를 찾아내었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>DNA의 PCR-RAPD pattern</h2> <p>본 연구에서는 Tricholomataceae과에 속하는 12균주의 유전적변이를 RAPD법을 이용해 분석하였다. RAPD분석을 위해 사용된 random primer는 총 28개였으며, 종간구별에 특이적인 primer는 15개였다. 본 실험에서 반응이 일어난 15개의 primer 대부분 G+C content가 매우 높았으며\( (60 \sim 70 \%) \) 그 중 3번 반복 실험을 통해 분류군 전체에 반응이 일어난 것은 15개였다. 이러한 결과는 일반적으로 primer의 염기구성이 DNA의 증폭길이에 커다란 영향을 미치며, random primer에 있어서 G+C content가 높을수록 DNA 증폭은 매우 잘 일어난다는 견해와 일치하였다. PCR 과정을 통하여 증폭된 RAPD 절편들은 \( 1600 \mathrm{bp} \)에서 \( 100 \mathrm{bp} \) 사이의 구간에서 관찰되었고, RAPD marker의 수는 primer마다 \( 3 \sim 8 \)개로 다양하게 나타났으며, 종간에 서로 차이를 나타내거나 종내의 지역 개체군간에 동일하거나 서로 다른 밴드양상이 관찰되었다. 예를 들어 primer MGL-1을 이용한 PCR 결과 Lepista nuda A는 5개의 band가 나타나고 Lepista nuda C는 8개의 band가 나타났고 이는 band 굵기도 다양하게 나타났다. 이와 같은 양상은 모든 primer에서 관찰되었다.</p> <h2>유전적 유사도</h2> <p>15개의 primer로부터 자료분석에 유용한 45개의 scorable RAPD marker가 최종분석에 이용되었고, 이를 근거로 Nei-Li의 유전적 거리지수를 이용하여 비유사도(상수도) 지수 행렬을 도출하였다.</p> <p>유전적 상사도지수행렬에 의하면 민자주방망이버섯 사이의 변이는 \(0 \sim 21.3 \% \)이고 자주방망이버섯아재비는 \(21.2 \sim 28.0 \% \)이며 가랑잎애기버섯은 \( 15.4 \sim 27.4 \% \)를 나타내었다. 전체 분류군을 PAUP프로그램을 이용하여 분석한 결과, 전체 79단계의 길이를 갖는 전체 66개의 가장 짧은 계통수를 얻었으며, Consistency index (autapomorphy 제외)는 0.5769, Reten-tion index (RI)는 0.5217, Homoplasy index (HI)는 0.5156을 나타내었다. 조사된 전체 버섯분류군의 RAPD에 기초한 tree는 5개의 분계조를 형성하고 있다. 첫 번째 분계조는 만가닥버섯으로 가장 기부에 위치하고 있고 6개의 autapomorphic chang를 가지고 있다. 두 번째 분계조는 졸각버섯으로 7개의 synapomorphic chang와 자주방망이버섯아재비와 자매군을 형성하고 있다(8 autapomorphic chang). 세 번째 분계조는 가랑잎애기버섯으로 11개의 autapomorphic chang를 가지고 있다. 네 번째 분계조는 밀버섯으로 6개의 synapomorphic chang를 가지고 있다. 마지막 분계조는 I지역 민자주방망이버섯이 서로 상이한 7개의 분류군이 분계조를 형성하고 있으며, 이중 A지역 민자주방망이버섯과 C지역 민자주방망이버섯이 서로 1개의 autapomorphic chang를 가지고 H지역 민자주방망이버섯과 자매군을 형성하고 있으며(1개의 synapomorphic chang), 이들은 또 다시 G지역 민자주방망이버섯과 F지역 민자주방망이버섯이 하나의 커다란 분계조를 형성하고 있다(1개의 synapomorphic chang와, \( 48 \% \) bootstrap 지지도 그리고, \( 51 \% \) jacknifing 지지도). 염기변이에 기초하여 얻어진 neighbor-joining(NJ) tree 분석결과에 있어서도 최대절약계통수 분석과 같은 분계조를 형성하였다.</p> <p>한편 Parsimony tree에서는 민자주방망이버섯 G지역과 F지역 사이의 관계설정이 확립되지 않았으나 NJ tree 에서는 두 분류균이 자매군을 형성하고 있음을 보여주었다. RAPD의 연구결과는 민자주방망이버섯의 종내의 개체변이, 송이과 다른종과의 유연관계와 진화경향성을 파악하는데 도움이 되었다. A지역 민자주방망망버섯과 C지역 만자주방망이버섯이 유전적 거리지수가 \( 12.3 \% \) 로 가장 가까움을 나타내었고, 같은 자주방망이속인 자주방망이버섯아재비는 밀버섯보다 더 유전적 거리지수가 멀다는 것을 알 수 있었다. 갓은 지름 \( 4 \sim 12 \mathrm{~cm} \)로 초기에는 평반구형이나 차차 편평형이 되며, 갓 표면은 평활하고, 갓 끝은 굽은형을 가지고 있으며, 포자문은 담홍색의 특징인 민자주방망이버섯은 본 연구결과 하나의 분계조를 형성하여 유전적으로는 안정된 형태를 이루고 있다. 그러나 갓은 지름 \( 3 \sim 8 \mathrm{~cm} \), 갓 표면은 초기에는 담자갈색이나 차차 황회갈색이 되며 갓 끝은 초기에는 굽은형이나 차차 위로 뒤집히는 등의 특징을 가지고 있는 자주방망이버섯아재비는 같은 속인 민자주방망이버섯과 같은 분계조를 형성하지 않고 오히려 졸갑버섯과 분계조를 형성하고 있어 단계통군을 지지하고 있지 않다. 밀버섯과 가랑잎애기버섯은 같은 속이지만 하나의 분계조를 형성하고 있지 않아 차후의 단계통여부는 추가된 분류군의 실험이 요구된다. 한국, 중국 등지에 분포하는 만가닥버섯은 자주방망이버아재비와 졸각버섯과 아주 가까운 유연관계를 형성하고 있음을 보여 주었다.</p> <p>지금까지 민자주방망이버섯, 밀버섯, 가랑잎애기버섯, 자주방망이버섯아재비, 졸각버섯, 민가닥버섯등의 유연관계가 외부형태학적 연구나 분자계통학적 연구가 수행한 바 없으나, 본 연구결과 이들의 유연관계 설정에 상당한 정보를 제공하였다. 하지만 각 종들의 객관적인 자료를 얻기 위해서는 각 속에 속하는 분류군의 첨가가 요구된다. 본 6조의 진화경향성은 각 마디의 붕괴로 아쉽게도 유추할 수는 없었다. 이러한 결과는 민자주방망이버섯의 분류체계를 확립하기 위한 자료로 아직 불충분하며, 이 문제를 해결하기 위하여 부가적인 분류군 및 RAPD와 같은 다른 유용한 marker를 이용하여 민자주방망이버섯을 논한다면 분류체계, 유연관계 및 진화경향성을 규명하는데 유용할 것으로 사료된다.</p> <p>민자주방망이버섯[Lepista nuda (Bull. ex Fr.) Cooke]은 분류학적으로 담자균문(Basidiomycota), 진정담자균강(Eubasi-diomycetes), 주름버섯목(Agaricales), 송이과(Tricholomata-ceae), 자주방망이버섯속(Lepista)에 속하며, 우리나라의 경우 자주방망이버섯속에는 민자주방망이버섯(L. nuda), 광릉자주 방망이버섯[L. irina (Fr.) Bigelow], 자주방망이버섯아재비 [L . sordida (Schum. ex Fr.) Sing] 세 종이 있다. 민자주방망이버섯은 우리나라의 대부분에서 서식하며, 일본, 중국, 유럽의 북반구 일대와 오스트레일리아에 서식하고 있으며 늦가을부터 초겨울에 걸쳐 정원, 잡목림, 혼합림 내 땅위에 단생 또는 군생하는 낙엽 분해성과 외생 균근성 버섯으로 균륜을 형성한다.</p> <p>민자주방망이버섯은 맛과 향이 뛰어나 구미나 중국 둥지에서는 식용으로 널리 이용하고 있다. 또한 유리아미노산 28종, vitamin \( \mathrm{B}_{1} \), pectin, lignin등의 성분을 함유하고 있고, ibrin 분해 활성도가 매우 높으며, 항종양작용이 높은 것으로 보고되었다.</p> <p>민자주방망이버섯은 식용으로 기호성이 뛰어나기 때문에 이의 재배 방법을 개발하고 품종을 개량을 위한 기초 연구들이 이루어져 왔다. 민자주방망이버섯은 세계적으로 널리 분포하고 있어 서식지의 생태학적 조건에 따라 특성의 차이를 나타낸다. 또한 프랑스 및 호주산 민자주방망이 버섯의 자실체 형성 최적조건을 비교해보면 호주산이 프랑스산보다 높은 온도를 필요로 하였다고 보고되었다. 프랑스산 민자주방망이버섯의 여러 품종을 교배하여 폼종 개량한 바있다. 또한 Hha와 Hinfl 등의 제한효소와 cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker를 이용하여 프랑스와 호주의 민자주방망이버섯 및 자주방망이버섯 아재비를 분석한 결과 각각 같은 종으로 판명되었으나 종간 혹은 같은 종이라도 서식지가 다르면 교배가 이루어지지 않았다.</p> <p>이러한 연구 결과들은 민자주방망이버섯이 많은 유전적 변이가 있으며 이를 바탕으로 육종할 수 있음을 보여준다. 그러나 우리나라 민자주방망이버섯에 대한 연구는 자실체, 포자등의 형태학적 특징에 기반을 둔 연구나 random amplified polymorphic DNA (RAPD)방법 등에 의한 단편적인 종적 특성에 대한 보고와 배양학적 특성과 토양생태학을 토대로 한 특성뿐이고, 민자주방망이버섯 내의 유전적 변이나 같은 속 혹은 과 내의 다른 종들과의 유연관계에 분자유전학적 방법에 대한 연구는 이루어진 바 없었다. 그리하여 본 연구에서는 random primer를 이용한 RAPD를 실시하고 PAUP (4.0b version, Swofford, 2001)을 이용하여 민자주방망이버섯 종내의 개체간 변이 및 송이과 버섯간의 Collybia. confluens, C. peronata, L. sordida, Laccare. laccata, 및 L. cinerascens의 계통분류학적 유연관계를 규명하고자 하였다.</p>	생명
Induction of Apoptosis and Antitumor Activity by Stichoposide D through the Generation of Ceramide in Human Leukemia Cells	<h2>고 찰</h2> <p>해양 천연물질은 암 치료제의 중요한 원료로 인지되어 왔으며 암의 예방과 치료에 있어 그 역할이 최근에 더욱 명백해지고 있다. 이전의 연구에서 Stichoposide chloronotus와 Thelenota ananas로부터 분리한 트리테르펜 글리코시드는 백혈병세포인 P388 세포의 성장을 억제한다는 것을 보여 주었다. 또한 이전의 연구에서 Thelenota anax로부터 분리한 STC가 Fas 및 caspase-8 활성에 의한 산성 SMase의 활성화와 glutathione 고갈에 의한 중성 SMase의 활성화를 통해 세라마이드를 형성하여 백혈병 세포의 세포사멸을 유도하며 HL-60 세포의 이종 이식 종양 모델에서도 항암작용을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 STC와 구조가 유사한 STD를 사용하여 백혈병 세포의 세포사멸 유도 및 이의 분자적 기전을 규명하여 STC와의 작용 및 기전과 비교하여 보다 효과적인 해양 트리테르펜 글리코시드의 구조적 특징을 살펴보고자 하였다. STC와 STD를 K562 세포에 처리하여 세포 사멸을 확인한 결과 시간과 농도 의존적으로 세포 사멸이 일어남을 확인할 수 있었다. 그리고 다른 백혈병 세포주인 HL-60 세포에서도 STC와 STD에 의해 세포사멸이 유도된다는 것을 알 수 있었다. 또한 STC에 의한 세포사멸 유도에 Fas 활성화를 통한 외인성 경로와 미토콘드리아 손상을 통한 내인성 경로가 관련한다는 것을 알 수 있었고, STD 역시 외인성 경로와 미토콘드리아 손상을 통한 내인성 경로가 관련한다는 것을 확인하였다.</p> <p>세라마이드는 여러 종류의 세포들에서 세포 사멸을 유도하는 중요한 이차전령으로 작용한다고 알려져 있고 또한 STC에 의한 세포 사멸에도 세라마이드의 생성이 중요하다는 것을 이전 연구에서 관찰 하였다. STC에 의한 세라마이드의 생성은 TNF-a에 의한 세포사멸과 유사하게 산성과 중성 SMase의 활성화에 의해 일어남을 알 수 있었다. 그러나 백혈병 세포주에서 STD에 의한 세포사멸 유도에 있어 세라마이드가 중요한지는 밝혀져 있지 않아 본 연구에서 살펴본 결과 STD에 의한 세포 사멸 유도에는 세라마이드의 생성이 중요하지만 생성 기전은 STC와는 다르다는 것을 알 수 있었다. 즉, 세라마이드 합성효소 저해제인 FB1을 전처리하여 STD에 의한 세라마이드의 생성과 세포 사멸이 부분적으로 억제된다는 것을 관찰함으로써 STD에 의한 세라마이드 생성은 세라마이드 합성효소의 활성에 의해 일어나며 STD에 의한 세포 사멸에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 그러나 STD에 의해 세라마이드 합성효소가 활성화되는 기전은 아직 알 수 없었고 향후 이에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.</p> <p>또한 STD에 의한 항암 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 면역결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양을 만든 후 STC 또는 STD를 주사하여 종양 크기를 측정하였다. STC와 STD를 주사하지 않은 대조군에 비해 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 STC 또는 STD를 주사한 실험군의 종양을 때어 조직을 확인한 결과 세포사멸 및 염증세포의 침윤을 관찰할 수 있었고 세라마이드 역시 증가해 있음을 알 수 있었다. 이러한 in vivo 효과는 in vitro에서의 결과와 유사함을 알 수 있었고, 본 연구에 사용된 STC와 STD는 간독성을 비롯한 약물의 독성이 없는 안전한 약물임을 알 수 있었다(data not shown). 이러한 결과들로부터 해삼 독소로부터 추출한 STC와 STD는 세포사멸을 유도하는 정도와 분자적 기전은 다소 차이가 나지만 모두 백혈병의 치료물질로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한 STC와 STD의 분자 내에 있는 aglycone의 구조는 동일하나 여기에 결합하고 있는 당 사슬의 당이 다르므로 인해 이들 작용의 강도와 분자적 기전이 차이가 있다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과 산성 SMase나 중성 SMase가 결핍된 백혈병 세포에는 STC 보다는 STD가 더 효율적인 항암제로 사용될 수 있을 것이며 세라마이드 합성효소가 결핍된 백혈병 세포에는 STC가 더 효과적인 항암제로 사용될 수 있을 가능성을 제시하였다. 향후 이들 작용의 차이에 대한 더 자세한 분자적 기전을 규명한다면 암세포에 존재하는 효소의 특성에 따라 보다 효과적인 항암제 개발에 필요한 정보를 제공할 수 있을 것이라 생각된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>백혈병 세포주인 HL-60와 K562 세포는 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였고, \(10\%\) 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, GIBCO, Grand Island, NY)과 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{mL} \)의 페니실린과 스트렙토마이신(GIBCO, Grand Island, NY)이 첨가된 RPMI640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)를 사용하여 \( 37 \mathrm{C}\), \( 5 \% \) \(\mathrm{CO}_{2} \), 완전 습윤 상태의 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>STC와 STD는 정제된 가루의 형태로 러시아의 Stonik 교수 (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry)로부터 받아서 사용하였다. 3, 3'-dihexyloxacarbocyanine iodide \( \left(\mathrm{DiOC}_{6}\right) \) 는 Molecular Probes (Eugene, OR)사로부터 구입하였으며, anti-cytochrome c 그리고 anti-\(\beta\)-actin antibodies는 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-poly (ADP-ri-bose) polymerase (PARP) 및 anti-AIF, anti-Smac/DIABLO antibodies는 Cell Signaling사의 제품을 사용하였으며, anti-procaspase 3, anti-COX Ⅳ (cytochrome oxidase IV)는 Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-procaspase 8, anti-procaspase-9 anti-bodies는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였으며, anti-ceramide antibody는 Alexis Biochemicals (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였다. Caspase-8 저해제인 Z-Ile-Glu-Thr-Asp-fluoromethyl ketone (Z-IETD-FMK), caspase-9 저해제인 Z-Leu-Glu-His-Asp-fluoromethyl ketone (Z-LEHD-FMK), pan-caspase 저해제인 Z-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone (Z-VAD-FMK)와 caspase-3 저해제인 Z-Asp (OCH3)-Glu (OCH3)-Val-Asp (OCH3)-fluo-romethyl ketone (Z-DEVD-FMK)는 Sigma (St Louis, MO, USA)사로부터 구입하였으며, Annexin V-FITC apoptosis detection kit는 BD pharmingen (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)사의 제품을 사용하였다. 그 외의 모든 시약은 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.</p> <h2>Apoptosis assay (Annexin V/PI staining)</h2> <p>각 세포를 6 well plates에 세포 수가 \( 3 \times 10^{5} / \mathrm{ml} \)이 되도록 분주하여 \( 0.1 \% \) DMSO (대조군) 및 다양한 농도의 STC와 STD를 첨가하여 2, 4, 및 6시간 배양하였고 또한 여러 가지 저해제의 영향을 살펴보기 위하여 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC와 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 처리하기 1시간 전에 저해제들을 처리하여 배양하였다. 배양 후, 배양된 세포들을 수확하여 \( 200 \mu \mathrm{l} \)의 annexin V binding buffer를 넣은 후, annexin V-FITC와 PI를 \( 5 \mu \mathrm{l} \) 첨가하고, 빛을 차단하여 \( 37 ^{ \circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응한 후, 유세포 분석기(FACScan, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포 10,000개 당 apoptotic cell의 수를 측정하였다. 각 실험은 3회 반복하여 시행하였다.</p> <h2>면역형광염색(Immunofluorescence staining)</h2> <p>\( 0.1 \% \) MSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, 슬라이드 유리 위에 도말하고 PBS에 녹인 \( 2 \% \) paraformaldehyde를 사용하여 고정하고, PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, PBS에 녹인 \( 0.1 \% \) Triton X-100을 사용하여 permeabilization한다. 다시 PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, 일차 항체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 반응시키고, PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, FITC 또는 PE-conjugated anti-rabbit IgG나 anti-mouse IgG로 1시간 동안 상온에서 반응시키고, PBS 완충용액으로 3회 세척하여 mount 용액을 떨어뜨린 후, 커버 유리로 덮어 Zeiss LSM 510 confocal microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 이미지를 얻었다.</p> <h2>면역결핍 생쥐에서 HL-60 세포의 종양 이종이식 (xenograft)</h2> <p>In vivo 상에서 STC 및 STD의 항암 효과를 알아보기 위해 \( 2 \times 10^{7} \)개의 HL-60 세포를 \(100 \mu \mathrm{l} \)의 PBS에 부유시켜 6~7주령의 면역결핍 생쥐의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양의 크기가 \( 60 \sim 100 \mathrm{~mm}^{3} \) 정도 되었을 때, 대조군에는 PBS 완충용액을, 실험군에는 \( 7.19 \mu \mathrm{g} / \mathrm{kg} \)의 STC와 \( 21.795 \mu \mathrm{g} / \mathrm{kg} \)의 STD를 생쥐의 꼬리에 3일에 1번씩 주사하였으며, 종양의 크기는 측경 양각기(Caliper)를 사용하여 측정하였다. 일정 시간이 지난 후에 마우스의 종양을 떼어 무게를 측정하고, 구획을 나눠 냉동시키거나 파라핀으로 고정시켜 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry)을 시행하였다.</p> <h2>면역조직화학염색</h2> <p>파라핀으로 고정시킨 종양 조직을 얇게 썰어 슬라이드 유리 위에 고정시키고 탈 파라핀 과정을 거친 후, 종양 조직을 헤마톡실린과 에오신을 사용하여 염색하고 일차 항체인 anti-ceramide antibody (1:10)를 상온에서 1시간 반응시킨 다음 이차 항체를 반응시키고 PBS 완충용액으로 세척한 다음 mount 용액을 떨어뜨려 커버 유리로 덮어 ScanScope (Aperio Technologies Inc., Park Center Dr. Vista, CA, USA)를 사용하여 이미지를 얻었다.</p> <h2>통계적 분석</h2> <p>데이터는 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다. 대조군 세포와 여러 가지 농도의 STC 및 STD를 처리한 세포 사이의 생존율에 차이가 있는지를 알아보기 위하여 일원 배치 분산분석 (ANOVA test)과 Student's t-test를 사용하여 분석하였다. \( P<0.05 \)일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>만성 골수성 백혈병(Chronic myelogenous leukemia)은 조혈 모세포에 영향을 미치는 돌연변이의 결과로 발생하는 척수 증식성의 장애(myeloproliferative disorder)이며, 이러한 돌연변이에 의해 9번 염색체와 22번 염색체 사이에 균형적인 전위(balanced translocation)가 발생하는데 이 염색체를 필라델피아(Ph) 염색체라고 한다. 만성 골수성 백혈병은 모든 백혈병의 약 \( 15 \sim 20 \% \)를 차지하고 100,000명에 \( 1 \sim 1.5 \)명의 빈도로 발생한다고 보고되었다. 만성 골수성 백혈병은 무기력, 체중 감소, 출혈, 식은 땀, 빈혈, 및 비장 비대증(splenomegaly)을 포함하는 증상이 있음에도 불구하고, 환자의 약 \( 50 \% \)는 증상이 없어 혈액 검사로 진단되는 경우가 많다. 만성 골수성 백혈병은 bcr/abl 전위에 의한 티로신 키나제(tyrosine kinase)의 활성 때문에 발생하므로 만성 골수성 백혈병에 대한 표적 치료제인 이마티닙(imatinib) 치료는 이전의 치료법과 비교하면 우수한 반응률과 생존율을 가지지만 약물을 복용하는 환자의 \( 20 \% \)는 완전한 세포 유전적 반응이 나타나지 않고, 일부 환자들은 시간이 흐르면서 견딜 수 없는 부작용이나 약물 내성을 나타내게 된다. 따라서 부작용이 적고 항암작용이 뛰어난 물질의 발굴이 절실히 필요한 실정이다.</p> <p>해양 트리테르펜 글리코시드(marine triterpene glycosides)는 해삼 (Holothurians)이나 일부 해면류(sponges)에서 분리한 천연물질로서 항 진균 작용, 세포독성, 용혈작용과 세포증식을 억제하는 효과 등 여러 가지 생물학적 활성들을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 이전의 연구 결과 Thelenota anax에서 추출한 stichoposide C (STC) (quinovose를 함유하는 hexaoside, Fig. 1A)는 HL-60 및 K562 세포와 같은 백혈병 세포에서 산성 스핑고마이엘리나제(acid sphingomyelinase; acid SMase)와 중성 스핑고마이엘리나아제(neutral sphingomyelinase; neutral SMase)를 활성화시켜 세라마이드(ceramide)를 생성하고 이러한 세라마이드가 STC에 의한 세포사멸 유도와 항암 작용에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 또한 STC에 의한 산성 SMase 활성화는 세포사멸 수용체인 Fas 활성에 의해 caspase-8이 활성화되어 나타났으며 중성 SMase 활성화는 glutathione 고갈에 의해 활성화된다는 것을 알 수 있었다.</p> <p>세라마이드는 세포 주기 억제, 세포 사멸 및 세포 노화와 스트레스 등을 포함하는 세포 내 다양한 과정을 조절하는 등 종양억제 지질(tumor suppressor lipid)로 알려져 있다. 또한 세라마이드는 serine palmitoyl transferase와 세라마이드 합성 효소(ceramide synthase)가 작용하여 de novo로 합성되거나 스핑고마이엘린(sphingomyelin) 가수분해에 의해 생성 된다. 세포막의 구성 성분인 스핑고마이엘린을 가수분해하여 세라마이드를 생성하는 SMase는 여러 종류가 있으며 효소의 최대 활성을 나타내는 \( \mathrm{pH} \)에 따라 산성, 중성 및 염기성 SMase로 분류한다. 세포 사멸을 유도하는 여러 가지 자극에 반응하여 세라마이드가 생성될 때 산성 SMase와 중성 SMase가 관여한다고 보고되었으며 항암 물질들은 여러 종류의 암세포들에서 세라마이드를 증가시킨다고 알려져 있다. 이러한 면에서 스핑고지질의 대사를 조절하여 암세포의 세라마이드를 증가시킬 수 있는 약물은 항암치료의 새로운 후보가 될 수 있다. 더욱이 항암제에 의한 고전적인 세포사멸경로의 활성이 실패한 경우에 세라마이드가 증가하면 caspase 비의존적 세포사멸경로(caspase-independent cell death pathway)를 활성화시키는 물질로 작용할 수 있다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 세라마이드 생성을 증가시켜 세포 사멸을 유도하는 STC와 구조가 유사한 STD (glucose를 함유하는 hexaoside, Fig. 1A)를 사용하여 백혈병 세포에서 STC와 같은 세포사멸 유도 및 항암작용이 있는지와 이의 분자적 기전을 규명하여 구조적 차이에 의한 작용이나 기전에 차이가 있는지를 조사하고자 한다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>STD에 의한 백혈병 세포주의 세포 사멸 유도</h2> <p>만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포에 대한 STD의 세포 성장에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 농도별 및 시간별로 STD를 첨가하여 배양시킨 후, annexin V/PI 염색법을 사용하여 세포 사멸 정도를 관찰하였다. STD는 K562 세포의 세포 사멸을 농도 및 시간 의존적으로 유도하였다. 이러한 STD의 세포 사멸 유도 효과가 K562 세포에만 국한되는지를 살펴보기 위하여 다른 백혈병 세포주인 HL-60 세포에 미치는 영향을 관찰한 결과 정도의 차이는 있으나 HL-60 세포에서도 역시 STD에 의한 세포사멸이 관찰되었다. 이러한 STD의 세포사멸 유도 효과를 비교하기 위하여 양성 대조군으로 STC를 사용하였다. Fig. 1B와 1C에서 보는 바와 같이 K562 세포와 HL-60 세포에서 STD의 세포사멸 유도 효과가 STC의 작용보다는 약하게 나타났고 STC와 비슷한 정도의 세포사멸은 약 2-5배 정도 높은 농도에서 관찰되었다(K562 세포인 경우 STC의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \), STD의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 1 \mu \mathrm{M} \); HL-60 세포인 경우 STC의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 0.3 \mu \mathrm{M}\), STD의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 1.5 \mu \mathrm{M} \)이었다).</p> <h2>STD에 의한 외인성 경로(extrinsic pathway)와 내인성 경로(intrinsic pathway)의 활성화</h2> <p>세포 사멸에 중요한 caspase를 활성화시키는 경로에는 세포 사멸 수용체(death receptor)의 활성화를 통한 외인성 경로와 미토콘드리아 손상을 통한 내인성 경로가 존재한다. STD가 세포사멸을 유도하는 데 어떠한 경로를 경유하는지를 살펴보기 위하여 K562 세포에 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC와 \( 1.0 \mu \mathrm{M}\) STD를 각각 2, 4, 6시간 처리하고, Western blot을 이용하여 여러 가지 caspase들의 활성을 관찰하였다. 그 결과 STC와 STD 모두 시간 의존적으로 caspase-8, caspase-9, 및 caspase-3가 활성화되며, caspase-3의 기질인 PARP가 분해됨을 관찰하였다. 또한 caspase의 활성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위하여 pan-caspase 저해제인 Z-VAD-FMK와 caspase-3 저해제인 Z-DEVD-FMK, caspase-8 저해제인 Z-IETD-FMK, 및 caspase-9 저해제인 Z-LEHD-FMK를 각각 50, 50, 25, 및 \( 25 \mu \mathrm{M} \) 농도로 1시간 처리한 후, \( 0.5\mu \mathrm{M}\) STC와 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 처리하여 6시간 동안 배양하고 세포 사멸 정도를 확인한 결과 Z-VAD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-IETD-FMK 및 Z-LEHD-FMK를 전 처리한 경우 STC와 STD에 의한 세포 사멸이 부분적으로 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 STC와 STD에 의한 세포 사멸이 부분적으로는 caspase 의존적으로 일어남을 알 수 있었다. 또한 STC와 STD에 의해 미토콘드리아 경로가 활성화되는지를 확인하기 위하여 MMP \( (\Delta \psi \mathrm{m}) \)를 측정하고 세포질과 미토콘드리아 분획을 분리하여 단백질 발현을 Western blot을 이용하여 확인하였다. 그 결과 STC와 STD에 의해 MMP가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 더욱이 STC와 비교하여 STD에 의한 MMP의 감소율이 더 높은 것을 관찰할 수 있었다. 또한, MMP의 감소로 인해 미토콘드리아에서 세포질로 cytochrome c와 Smac/DIABLO 및 AIF가 방출됨을 관찰하였다. 이러한 결과로부터 STC와 STD에 의한 K562 세포의 세포 사멸은 미토콘드리아를 경유하는 내인성 경로와 세포 사멸 수용체의 활성화를 통한 외인성 경로를 통하여 일어남을 알 수 있었다.</p> <h2>Mitochondrial Membrane Potential (MMP; \( \Delta \psi m \) ) 측정</h2> <p>\( 0.1 \% \) DMSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, \(50 \mathrm{nM} \) \( \mathrm{DiOC}_{6} \)를 처리한 RPMI1640 배지를 \( 1 \mathrm{ml} \) 가하여 빛을 차단하고 30분 동안 \( 37^{ \circ} \mathrm{C} \)에 반응 후 세포를 수확하여 유세포 분석기(FACScan, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 분석하였다. \( \Delta \Psi \mathrm{m} \)은 3회에 걸쳐 측정하였다.</p> <h2>세포질과 미토콘드리아 단백질의 분리</h2> <p>\( 0.1 \% \) DMSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, \( 1\mathrm{M} \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 100 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \), \( 100 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{M} \) sucrose, \( 6.15 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) digitonin 그리고 25x cocktail이 포함된 완충용액을 첨가한 다음 잘 섞어주고, 상온에서 30분간 배양하였다. \( 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 원심 분리하여 상층액(세포질 단백질)을 추출하고, 나머지 세포 pellet에 세포용해 완충용액을 넣어 미토콘드리아 단백질을 추출하였다</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>\( 0.1 \% \) DMSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD 혹은 다른 시약을 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, \( 20 \mathrm{mM} \) Tris \( (\mathrm{pH} 8.0) \), \( 137 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl} \), \( 10 \% \) glycerol, \( 1 \% \) NP-40, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{~NaF}\), \(1 \mathrm{mM} \) PMSF 그리고 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) leupeptin이 포함된 세포용해 완충용액을 첨가한 다음 \( 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리하여 단백질을 추출하고, Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad Lab., Richmond, CA)를 사용하여 단백질 양을 측정한 다음 \( 8 \% \) 또는 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 단백질을 분리하고, PVDF membrane (Amersham Life Science, Inc., Piscataway, NJ)에 분리된 단백질을 전사한 후, \( 5 \% \) skim milk가 첨가된 PBS-T로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 측정하고자 하는 단백질에 대한 일차 항체로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음 membrane을 PBS-T로 세 번 세척한 후, 이차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG나 anti-mouse IgG로 2시간 동안 상온에서 반응시키고, 역시 PBS-T로 세 번 세척한 다음 ECL detection kit (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 현상하였다. 그리고 anti-B-actin antibody (Sigma, St Louis, MO, USA)를 internal control로 사용하였다.</p> <h2>STD의 세라마이드 합성효소의 활성에 의한 세라마이드 생성</h2> <p>이전의 연구 결과 STC에 의해 세라마이드가 형성되었고 이러한 세라마이드가 STC에 의한 세포사멸 유도에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 STC와 구조유사체인 STD도 세라마이드를 생성하는지를 면역형광염색법으로 살펴보았다. Fig. 3A에서 보는 바와 같이 STD에 의해서도 STC에서처럼 세라마이드가 생성됨을 알 수 있었다. 이러한 STD에 의한 세라마이드 생성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한지와 STC에서처럼 산성 SMase의 활성과 중성 SMase의 활성에 의한 것인지를 확인하기 위하여 산성 SMase의 저해제인 desipramine과 중성 SMase의 저해제인 GW4869를 각각 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포 사멸이 desipramine과 GW4869에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰하였으나, STD에 의한 세포 사멸은 desipramine과 GW4869에 의해서 억제되지 않음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성이 산성 및 중성 SMase의 활성화에 의한 것인지를 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법으로 확인해 보았다. 그 결과, STC에 의한 산성과 중성 SMase의 활성화를 육안으로 관찰할 수 있었고 또한 세라마이드의 생성도 확인할 수 있었다. 반면에 STD에 의해서는 산성과 중성 SMase 활성은 관찰되지 않았으나 STC와 마찬가지로 세라마이드의 생성은 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드 형성은 산성 및 중성 SMase의 활성에 의해 일어나는 것이고, STD는 그렇지 않다는 것을 알 수 있었다.</p> <p>또한, STD에 의한 세라마이드 형성이 STD에 의한 세포사멸에 중요한지와 세라마이드 합성효소의 활성에 의한 것인지를 관찰하기 위하여 세라마이드 합성효소 저해제인 fumonisin B1 (FB1)을 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 저해되지 않았고 STD에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고, STC에 의한 caspase-9, caspase-3와 caspase-8의 활성은 FB1에 의해 억제되지 않았으며, STD에 의한 caspase-9과 caspase-3의 활성은 FB1에 의해 억제되었고, caspase-8의 활성은 부분적으로 억제되었다. 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성을 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법으로 확인해 보았다. 그 결과, 앞서 확인한 바와 같이 STC에 의한 산성과 중성 SMase의 활성화를 관찰할 수 있었으나 예상한 바와 같이 FB1에 의해서는 이들 활성화에 변함이 없었다. 또한 세라마이드의 생성도 변화가 없었다. 반면에 STD에 의한 산성과 중성 SMase의 활성은 관찰할 수 없었고, FB1에 의한 영향도 없었다. 그리고 세라마이드의 생성은 FB1에 의해 부분적으로 억제됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드의 생성은 산성과 중성 SMase의 활성화에 기인한 것이고 STD에 의한 세라마이드의 생성은 세라마이드 합성 효소의 활성화에 기인한 것임을 확인할 수 있었다. 또한 STC와 STD에 의해 세라마이드가 생성되는 분자적 기전은 다르지만 이들에 의한 세포사멸 유도에는 세라마이드의 생성이 중요하다는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>In ViVo에서 STD에 의한 세라마이드 생성과 항암 효과</h2> <p>In vivo에서 STD에 의한 항암 효과를 확인하기 위하여 면역 결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양 모델을 만들었다. HL-60 세포를 면역결핍 생쥐의 옆구리 피하에 주사하여 종양을 만든 후 종양이 어느 정도 자랐을 때 STC와 STD를 면역결핍 생쥐의 꼬리에 3일 마다 주사하여 종양의 크기를 관찰하였다. STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 종양의 크기가 빨리 증가하였으나 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. STD의 경우 STC 용량의 3 배를 주입하였을 때 종양의 성장이 현저하게 억제 되었고, STC와 동량의 STD를 주입했을 때는 종양의 성장 억제 효과가 나타나지 않았다(data not shown). 이러한 결과는 정도의 차이는 있지만 in vitro에서의 작용과 유사하였다. 따라서 in vivo에서도 STC의 항암작용이 STD보다 강하다는 것을 알 수 있었다. 또한 종양을 떼어 낸 후 얇게 썰어 조직을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 관찰한 결과 종양세포가 있음을 확인할 수 있었으며 STC 또는 STD를 주사한 실험군의 종양인 경우 세포 사멸이 일어난 부분을 관찰하였다. 그리고 이 종양조직에서 면역조직화학염색법을 이용하여 세라마이드를 관찰한 결과 STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 세라마이드가 약하게 염색된 반면 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 세라마이드가 증가됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 in vitro에서의 결과와 유사하였으며 STC와 STD에 의한 세라마이드 생성이 세포 사멸과 종양 억제에 있어 중요하다는 것을 알 수 있었다.</p>	생명
사료 첨가제에 의한 대하의 혈액학적 특성	<p>국내 새우양식산업은 대하(Penaeus chinensis)를 주 양식품종으로 하여 1980년대 후반부터 서해안 지역을 중심으로 활발히 성행하다가 1993년에 충남 태안 및 전북 고창지역에서 처음 발병한 후 매년 대량 폐사가 일어나고 있고 피해지역도 점차 확산되고 있다. 감염된 새우는 두흉갑 및 체표에 흰반점을 형성하는 증상이 주를 이루어 white spot syndrome disease (WSSD)로 보고되고 있으나, 최근에는 외형적 특징 없이 폐사하는 경우도 발생하고 있다. 이에 대해 다수의 국내 연구진에 의해 새우의 대량폐사를 유발하는 바이러스에 대한 보고와 함께 현장에서의 방역대책과 다양한 신속진단법이 개발되기도 하였지만, 아직까지 크게 살효를 거두지는 못하고 있다. 따라서 이에 대한 해결책으로 그동안 부각되지 않았던 질병의 예방과 직접적으로 연결되는 체내 면역력에 대한 다양한 연구가 요구되고 있다.</p><p>대표적인 무척추동물인 대하는 일반 어류와는 달리 병원체에 대한 방어기작으로서 과립세포 등의 세포성 인자와 prophenoloxidase(pro-PO) 등의 체액성 인자를 기초로 하는 비특이 면역계를 가진다. 주된 방어기작을 담당하는 세포성 인자에는 과립이 없고 식작용을 하는 무과립세포(hyaline cell)와 적은 수의 과립이 존재하며 이물질에 대한 인식작용을 하는 반과립세포(semi-granular cell), 그리고 체액성 인자인 prophenoloxidase activating system (pro-PO system)과 연결하여 직접적인 방어작용을 하는 과립세포(granular cell)가 있다. 이외에도 보조작용을 하는 체액성 인자에는 물질응집의 효과를 가지는 lectin 등이 있다.</p><p>한편, \( \beta\)-1,3-glucan, \( \beta\)-1,3-1,6-glucan, peptidoglycan, 그리고 다수의 면역기능 다당류 등이 면역강화제의 형태로 사료에 혼합되어 사용되고 있으나 그 효과에 대한 보고는 전무한 실정이다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해서는 효율성과 경제성을 고려한 다양한 사료첨가제의 개발이 요구되고 있으며, 다양한 사료첨가제의 개발에 있어 그 효과를 검증할 수 있는 시스템이 동물사육실험을 제외하고는 전무한 것도 문제점으로 지적될 수 있다.</p><p>이에 본 연구에서는 그동안 대하의 면역에 대한 기초 연구가 미비한 점에 감안하여 사료첨가제 성분을 급이한 후, 진행되는 대하의 체내 면역력에 대한 기본적인 이해와 함께 사료첨가제의 효과를 검증할 수 있는 시스템 개발을 위한 기초 연구를 실시하였다.</p><p>우선 본 연구를 위해 전남 신안 지역의 양식장에서 사육 중인 평균 체중 \( 5 \sim 6 \mathrm{~g} \) 정도의 대하 치하를 구입하여 4개 수조에 각 10미씩 분산 수용하고 1주일간 일반사료를 급이하면서 순치시켰으며, 사료 첨가제로 사용된 5-aminolevulinic acid(ALS), 수용성 키토산, 그리고 감초와 녹용이 각각 \( 5 \% \) 정도 포함된 한약재의 열수 추출물 등은 \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 농도로 조절하여 각각 시판되는 새우 일반사료(치하용 사료, (주)천하제일사료)에 분무하여 흡착시킨 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 저온 건조시켜 준비하였다. 이 때 사용된 치하용 사료에는 조단백 \( 45 \% \), 조지방 \( 5 \% \), 조회분 \( 17 \% \), 조섬유 \( 5 \% \), 칼슘 \( 1.2 \% \) 그리고 인 \( 2.7 \% \)가 포함되어 있다. 그런 다음 일반사료, ALA 첨가사료, 키토산 첨가사료, 한약재 열수 추출물 첨가사료를 2주간 지속적으로 체중의 \( 10 \% \) 분량으로 1일 2회 급이 하였다. 실험 종료 후, 각 시험구별로 시료 개체당 \( 0.5 \sim 1 \mathrm{ml} \) 정도의 hemolymph를 심장으로부터 직접 채혈하여 준비하였는데 시료 채집 시, 체강도와 자극에 대한 반응성을 기준으로 각 시험구별 외형적 건강도를 조사한 결과, Table 1에서 보는 것 처럼 대조구인 일반사료 급이구와 비교하여 ALA, 키토산, 한약재 추출물 사료첨가제 급이구에서 전반적으로 더 좋은 건강상태를 보였다.</p> <p>채혈된 hemolymph로부터 hemocyte의 수와 조성을 확인하기 위해 Kondo 등의 방법에 따라 \( 5,000 \ rpm \)으로 5분간 원심분리하고 동량의 medium 199과 혼합한 다음, Giemsa 용액으로 염색하여 광학현미경 상에서 관찰하였다. 먼저 hemocyte의 수에 있어서는 전체적으로 평균 \( 3 \sim 3.5 \times 10^{5} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 정도의 유사한 수준을 보였지만, hemocyte 조성에 있어 무과립(hyaline), 반과립(semi-granular), 과립(granular) 세포의 상대적인 비율에서는 시험구별로 다소 큰 편차를 보이고 있다. 일반사료 투여구에서는 전체적으로 무과립(hyaline) 형태의 세포가 많이 관찰된 데 비해 ALA와 키토산, 그리고 한약재 열수 추출물 첨가사료 투여구의 경우, 반과립(semi-granular) 혹은 과립(granular) 형태의 세포가 상대적으로 많이 관찰되었다. 이는 바이러스 감염 시 전체 hemocyte의 수는 감염 전과 비교하여 큰 차이가 없지만 hemocyte의 조성에 있어 과립 세포와 반과립 세포는 \( 62 \% \)에서 \( 46 \% \)로 감소하기 무과립 세포는 \( 38 \% \)에서 \( 54 \% \)로 증가한다는 결과와 함께 면역증강 물질을 투여할 경우, 일반 사료를 투여한 시험구와 비교하여 hemocyte의 수는 거의 유사하지만, 조성에 있어 과립 세포와 반과립 세포는 \( 10 \% \)이상 증가하지만 무과립 세포는 오히려 \( 10 \% \) 이상 감소한다는 서로 상반된 결과를 나타낸 이전의 보고에 대한 결과를 재확인함과 동시에 본 실험에서 사용된 ALA와 키토산, 그리고 한약재추출물 등의 사료첨가제에 대한 면역증강 관련물질로서의 사용 가능성을 나타내는 것이기도 하다.</p><p>또한 각 시험구의 차이를 확인하기 위한 방법으로 hemolymph 내 단백질의 변화를 확인하기 위해 SDS-poly-acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 실시하였다. 우선 시료는 PBS로 수세한 다음, SDS sample buffer로 처리하였고, \( 1 \% \) polyacrylamide gel로 전기영동 후, \( 0.5 \% \) Coomassie brilliant blue R-250 solution으로 염색하여 molecular weight standard marker(Roche, Germany)와 비교하면서 확인한 결과, 각 시험구별로 툭정 위치에서 단백질량의 변화를 나타내었다. ALA-사료첨가제 투여구의 경우 에는 60 kDa 위치에서, 그리고 한약재 열수추출물 사료첨가제 투여구의 경우에는 75 kDa 위치에서 각각 일반사료롤 투여한 대조구에 비해 높은 수준의 단백질 함량을 보이고 있는 데 이 중 75 kDa 크기의 단백질은 이전의 연구에서 보고되었던 것처럼 hemocyanin으로, 60 kDa 크기의 단백질의 경우 미확인된 hemolymph protein 중 한 종류일 것으로 각각 추정된다. 특이적으로 증가한 이들 단백질들에 대해 ALA의 경우에는 각종 유기체의 tetrapyrrole 생합성 (porphyrin, chlorophyll, heme 및 vitamin \( B_{12} \) 등) 과정에서 발견되는 중간물질의 하나로서, C-5의 지방족 화합물이며 heme 구조를 가진 각종 효소나 porphyrin 중간물질, 비타민 등의 제조에서 전구물질로 사용되고 있다는 점과, 한약재 열수 추출물의 경우에도 주로 보혈작용을 하는 것으로 알려진 녹용과 감초 등이 포함되어 있다는 점이 본 연구에서 나타난 결과에 대한 근거가 될 수 있을 것으로 예상된다.</p><p>한편, 상기의 이러한 시험구별 차이에 대해 간접적인 외부병원체에 대한 지표로서 Vibrio 균의 존재 여부를 확인하기 위해 혈액채취 후 각 시험구별로 3미씩 남은 시료의 간췌장과 아가미 등 내부 장기를 시료로 하여 TCBS agar plate (DIFCO, USA)에 접종한 다음, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양하였다. 각 시험구별로 Vibrio 균의 배양 결과를 확인해 본 결과, 일반사료 급이구에서는 평균 \( 3 \times 10^{3} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 인데 비해 나머지 3개 사료첨가제 시험구에서는 모두 \( 1 \times 10^{2} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 미만의 낮은 수치를 나타내었다. 이는 상기의 hemocyte의 조성이나 hemolymph 단백질의 패턴과 더불어 일반 사료와 비교하여 사료첨가제를 투여함에 따라 새우 체내에서 면역 혹은 방어능력이 향상되고 있음을 간접적으로 시사해 주는 것으로도 볼 수 있다.</p><p>그러므로 본 연구에서는 현재 새우양식산업에 있어 질병에 따른 폐사와 관련하여 가장 시급한 것은 면역과 관련하여 기존에 보고되어 있는 다양한 천연물 중 대하의 체내 면역력을 강화시킬 수 있는 물질을 탐색할 수 있는 시스템을 확립하는 것이라 예상하여 이를 위해 새우의 체내 요스 중 면역과 직접적인 관련이 있는 hcmocyte를 중심으로 연구를 진행하였으며, 면역관련물질의 투여를 통해 hemocyte의 조성과 hemolymph 단백질, 그리고 병원성 지표로서 Vibrio 균의 배양결과에 대한 특이성을 확인하였으므로 이를 새우의 체내 면역력을 검증할 수 있는 시스템 개발에 대한 기초 차료로 이용하고자 한다. 또한 ALA와 한약재 열수 추출물을 투여했을 경우, 새우의 hemolymph 내에서 hemocyanin으로 추정 되는 75 kDa 크기의 단백질과, 미확인된 hemolymph protein의 일종인 60 kDa 크기의 단백질이 각각 특이적으로 발현된 데 대해 추가적인 연구를 통해 hemocyte를 중심으로 한 해양 무척추동물의 면역기작을 규명해 나갈 예정이다.</p>	생명
Bacillus subtilis JK-56이 생산하는 chitinase isozyme의 정제와 특성 규명	<h2>Ammonium sulfate 침전</h2> <p>조효소액을 ammonium sulfate \( 30 \sim 70 \% \) 농도로 포화시킨 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 원심분리하여 침전된 단백질을 최소량의 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer에 녹인 다음 동일한 완충액으로 3회 투석하고 polyethylene glycol (PEG) 6,000으로 농축하였다.</p> <h2>Model 491 Prep Cell을 이용한 Native-PAGE 정제</h2> <p>Native-PAGE의 조건은 Table 1 과 같이 \( 10 \% \) resolving (separating) gel \( 5 \mathrm{~cm} \) 에 \( 4 \% \) stacking gel \( 1 \mathrm{~cm} \) 의 원통형 gel을 만들었다. 조효소액 \( 240 \mu l \) 에 5배 농축된 sample buffer \( 600 \mu \) 를 첨가한 다음 원통형 gel에 loading 하였다. \( 15 \mathrm{~W} \) 의 일정한 전력으로 전기영동을 실시한 다음 선단지시약(bromophenol blue; BPB)이 바닥까지 모두 내려간 다음 이후에 용출되는 용출액을 fraction collector를 통해서 회수하였다. 각 fraction을 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였고, chitinase 활성을 측정하였다.</p> <h2>Native-PAGE와 활성 band 측정</h2> <p>정제된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 \( 7 \% \) 의 poly-acrylamide gel을 사용하여 Laemmli의 방법에 따라 native-PAGE를 실시하였다. Native-PAGE로부터 확인된 band가 chitinase 활성 band인지 확인하기 위해서 petri dish에 효소의 기질인 colloidal chitin을 \( 1 \% \) 함유한 고체 agar plate를 만들어서 전기영동을 실시한 acrylamide gel을 plate 위에 얹고 효소 반응 온도인 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 반응시 킨 후 투명환을 확인하였다. 활성 band와 비교하기 위해 동일한 조건으로 전기영동한 것을 Coomassie blue R-250으로 염색하여 서로의 band를 비교하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>정제된 효소의 분자량을 측정하기 위하여 Laemmli의 방법에 따라 SDS-PAGE로 측정하였으며, \( 10 \% \) poly-acrylamide gel과 Tris-glycine 완충액(25 mM Tris, \( 192 \mathrm{mM} \) glycine, \( 0.1 \% \) SDS, \( \mathrm{pH} \) 8.3)을 사용하였다.</p> <h2>\|soelectric point pI 측정</h2> <p>정제효소의 pI (isoelectric point)는 isoelectric focusing (IEF)에 따라 ampholyte (pH 3.5 10)의 \( \mathrm{pH} \) 구배로 실험하였다.</p> <h2>정제효소의 온도와 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 안정성 최적 활성 측정</h2> <p>각각의 온도와 각각의 \( \mathrm{pH} \) 완충액에 정제 효소를 30분 동안 방치한 후에 잔존활성을 측정하여 상대활성으로 안정성을 검토하였고 각각의 효소 반응 온도, \( \mathrm{pH} \) 별로 효소활성을 측정하여 최적온도와 \( \mathrm{pH} \) 를 검토하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>Chitin은 \( N \)-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)이 5,000개 이상 \( \beta-1,4 \) 결합으로 중합된 분자량 100만 이상의 천연 고분자 다당물질로서 게, 새우 등의 갑각류 및 연체류의 껍질과 근육 그리고 곤충류, 버섯류 및 사상균류의 세포벽 등에 함유되어 있다. 연간 생산량은 1,000억톤 이상으로 지구상에서 cellulose 다음으로 많이 생산되고 있는 biomass 자원이며, 최근 chitin 및 chitin 유도체(chitin 올리고당 등)는 식품산업, 제약산업, 농업 및 환경분야 등의 많은 분야에 이용되고 있다. Chitin의 화학구조는 식물의 섬유소인 cellulose와 비슷하지만 분자 내에 아세틸 아미노기 를 가지고 있고 이들 상호간에 강한 수소결합을 하고 있기 때문에 화학약품에 대한 내성이 강하며 또한 물과 일반적인 유기용매에 녹지 않는다.</p> <p>Chitinase (chitodextrinase; EC 3.2.1.14)는 chitin의 \( \beta-1 \), 4결합을 가수분해하며 작용기작에 따라 chitin 및 chi-todextrin의 \( \beta-1,4 \) 결합을 무작위로 분해하는 endo형 chitinase, chitobiose를 N -acetyl-D-glucosamine으로 분해하는 N-acetyl-D-glucosaminidase, 그리고 chitin 사슬의 비환원 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose 또는 그 이상의 단위체로 절단하는 exo형 chitinase 등 세 종류가 알려져 있다.</p> <p>Chitinase는 다양한 곰팡이의 세포벽을 용해시켜 곰팡이를 protoplast화 시키는데 이용되고 있다. 또한 식물에 병원성을 일으키는 곰팡이들을 저해하는 효과적인 생물조절인자로 이용되고 있다. 그리고 chitinase는 갑각류의 폐기물(껍질 등)을 처리하는 생물전환과정에 효과적으로 이용되어 부가가치가 높은 물질을 생산한다. 상업적으로 여러 가지 다양한 시료로부터 chitinase 효소 자체를 정제해서 이용을 하기도 한다. 효소 10 units에 약 100 달러 이상의 고가에 거래가 이루어지고 있다.</p> <p>한편, 항생물질의 전구물질로 사용되는 glucosamine의 생산, 생변환에 의한 단세포 단백질의 생산, 그 외 식품 분야 및 의약품 분야에서 널리 이용되고 있는 chitin의 대량 생산을 위해서도 값싼 chitinase의 생산이 필수적으로 요구 된다. Chitinase의 생산 미생물로는 곰팡이 등이 활성이 크지만, 대량생산을 위해서는 통기 및 교반이 용이한 세균이 적당하며, 또한 chitinase 유전자의 분리 및 조작 등에도 곰팡이보다는 세균이 유리하다. 따라서 본 연구에서는 지구상에서 풍부한 생물자원의 하나인 chitin의 이용을 위하여 chitinase를 생산하는 세균을 토양으로부터 분리 - 동정하고, chitinase의 최적생산조건을 검토하였다. 또한 chitinase를 prep-cell system을 이용하여 정제하였으며, 정제된 효소의 물리학적 및 효소학적 특성을 검토하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Chitinase 생산 균주의 분리</h2> <p>부산 경남 일원에서 채집한 토양 시료를 증류수에 현탁하여 적당히 희석한 다음 colloidal chitin이 함유된 분리용 배지에 도말하여 투명환을 생성한 균주를 1차로 100여 균주를 분리하였다. 그 중에서 chitinase 활성을 측정한 결과, 활성이 가장 높은 56번 균주를 2차로 선별하여 편의상 \( \mathrm{JK}-56 \) 이라 명명하였다. Fig. \( 1(\mathrm{~A}) \) 과 같이 JK-56 균주는 세포 외로 chitinase를 분비한다는 것을 알 수 있다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>JK-56 균주의 형태학적. 특성을 검토한 결과를 Table 2에 나타내었다. Fig. 1(B)의 전자현미경(transmission elec-tron microscope; TEM)상의 사진으로 볼 때 그람양성균의 전형적인 막대 모양으로 포자는 한쪽으로 치우쳐 있었다. 세포의 크기는 JK-56 균주가 Bacillus subtilis에 비해서 조금 작은 것으로 나타났다. Table 2에서 보는 바와 같이 citrate 이용능과 gelatin 가수분해 외에 나머지 특성은 Bacillus subtilis와 거의 홉사한 결과를 보였다.</p> <p>분리 균주 JK-56로부터 genomic DNA를 분리하여27f-1492r primer를 사용하여 16S rDNA 부위를 PCR로 증폭 시킨 후 auto-sequence를 이용해 염기서열을 결정하고 균주의 결정된 425개의 염기서열을 Gene bank database와 비교한 결과 Bacillus subtilis strain 09와 \( 100 \% \) 의 상동성을 보였다.</p> <p>JK-56 균주의 형태학적, 배양학적, 생화학적 특징 및 par-tial 16S rDNA sequencing 결과 등의 제반 분류학적 특징들을 비교해 볼 때 Bacillus subtilis strain 09와 가장 유사한 것으로 판명되었다. 따라서 본 균주를 Bacillus subtilis로 동정하고 편의상 Bacillus subtilis JK-56으로 명명하고 이후의 실험에 사용하였다.</p> <h2>Chitinase의 최적 생산조건 검토</h2> <p>Bacillus subtilis JK-56이 생산하는 chitinase의 생성 최적 조건을 결정하기 위하여 탄소원, 질소원, 무기염, 금속이온의 영향 및 각각의 농도 그리고 초발 \( \mathrm{pH} \), 온도의 영향을 검토하여 배양시간 경과에 따른 균의 증식 및 효소 생산성 을 검토하였다. 그 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 효소 생산 최적 조건을 결정하였다.</p> <h2>배양시간에 따른 효소 활성 및 생육도</h2> <p>최적 생산 배지조건하에서 Bacillus subtilis JK-56의 진탕 배양 시간에 따른 균의 생육도와 효소생산량, 단백질량, \( \mathrm{pH} \) 변화 등을 관찰하였다. 그 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 배양 시간은 약 10시간에서 30시간까지 대수증식기를 보였으며 30시간 이후에 정지기를 거쳐 약 40 시간 정도에 사멸기에 이르러 비교적 생장이 빠르다는 것을 알 수 있었다. Chitinase 효소생산 측면에서는 약 15시간까지 거의 효 소생산이 없다가 15 시간 이후에 효소생산이 급격하게 이루어지면서 40시간 때에 최고의 효소생산을 나타내었다. 따라서 배양 40시간을 효소생산 최적 시간으로 결정하였다 (Table 3). 배양액 내의 단백질량을 보면 균체가 성장하기 전까지 감소를 보이다가 균체가 성장하면서 전반적으로 증가하였다. 정지기에는 배양액 내의 단백질을 이용해 세포 증식의 준비를 하는 단계로 약 12시간까지 단백질이 줄어 들다가 대수증식기가 시작되면서 활발한 대사가 이루어져 효소를 많이 생산한 것으로 추정된다. 사멸기에 접어들면서 단백질량이 증가하는 것은 cell autolysis로 인해 단백질량이 계속 증가하는 것으로 생각된다. 배양 시간의 경과에 따라 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 변화는 완만하게 상승해서 \( \mathrm{pH} 8.5\)정도 까지 상승하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>Chitinase 생산균주의 분리</h2> <p>부산, 경남 일원의 논밭의 흙, 퇴비 및 바닷가 근처의 흙 등을 채집하여 시료로 사용하였다. 멸균수에 적당히 희석한 시료를 colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해해서 투명환을 생성하는 colony를 순수 분리하였다. Colloidal chitin을 만들기 위해서 Jeuniaux의 방법을 따랐다. 1차로 순수 분리된 colony를 \( 1 \% \) colloidal chitin, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) peptone, \( 0.2 \% \) beef extract, \( 0.1 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \), \( 0.1 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.05 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 함유한 효소생산용 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 의 조건하에서 2~3일간 진탕 배양한 후 chitinase 활성을 측정하여 활성이 높은 균주를 2차로 분리하였다.</p> <h2>Chitinase 활성 측정 및 단백질 정량</h2> <p>Chitinase 활성 측정을 위해서 효소 생산 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 48 시간동안 진탕배양한 호에 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 효소 반응은 \( \mathrm{pH} 7.0,100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer에 현탁한 \( 1 \% \) colloidal chitin \( 1 \mathrm{ml} \) 에 조효소액 \( 1 \mathrm{m \ell} \) 을 가하여 총부피 \( 2 \mathrm{ml} \), 최종농도 \( 0.5^{\circ} \) 가 되도록 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 진탕하면서 효소 반응을 시킨 후 끓는 물에 5분간 처리하여 반응을 정지시켰다. 반응 후 남아 있는 colloidal chitin을 제거하기 위허서 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 DNS (dinitrosalicylic acid) 법으로 유리된 환원당을 정량하였다. 효소 1 unit는 1시간 동안 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 N-acetyl-D-glucosamine을 생산하는 효소의 양으로 정하였다. 단백질량은 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 Lowry 법으로 정량하였다.</p> <h2>분리균주의 분류 및 동정</h2> <p>분리 균주의 분류학적인 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양학적, 생화학적인 제반 특성을 조사하였으며, 16S rDNA의 염기서열을 통해 National Center for Bio-technology Information (NCBI)의 gene bank database와 비교 분석하여 동정하였다.</p> <h2>효소생산 최적조건</h2> <p>분리 균주의 chitinase 생산을 위한 최적조건을 검토하기 위하여 탄소원, 유기질소원, 무기질소원, 무기염, 금속이온의 영향 및 각각의 농도와 초발 \( \mathrm{pH} \), 배양온도의 영향을 검토하고 최적조건에서 배양시간에 따른 균의 증식 및 효소 생산성을 검토하였다.</p> <h2>조효소액의 조제</h2> <p>효소생산 최적 조건에서 48시간 동안 배양한 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다.</p> <h1>요 약</h1> <p>토양으로부터 chitinase를 생성하는 균주를 분리하여 동정한 결과 Bacillus subtilis로 판명되었으며, 분리한 균주를 Bacillus subtilis JK-56 이라 명명하였다. B. subtilis JK-56의 chitinase 생산 최적 조건을 검토한 결과 \( 1 \% \) chitin, \( 0.5 \% \) polypeptone, \( 0.1 \% \mathrm { KCl } , 0.05 \% \mathrm { MnSO } _ { 4 } \cdot 4 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 이며 초발 \( \mathrm { pH } 7.0 \), 배양온도 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 가장 많은 효소를 생산하였다. 본 균주가 생산하는 chitinase를 정제하기 위해서 native- PAGE를 이용해 효소활성 band를 확인한 결과, 1개의 강한 활성 band와 2개의 약한 활성 band를 가지는 isozyme으로 확인되었다. 확인된 isozyme을 정제한 결과, isozyme 중 1개의 강한 활성 band를 정제하였고 정제된 효소를 Chi-56A라고 명명하였다. Chi-56A의 효소 특성에 관해서 실험한 결과 분자량은 약 \( 53 \mathrm { kDa } , \mathrm { pI } \)는 4.3으로 확인되었다. 본 효소는 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 상당히 안정하였으며 효소의 최대활성 온도도 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 확인되는 등 열에 대해 상당히 안정한 효소로 확인되었다. Collidal chitin에 대한 정제효소 Chi-56A의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 값은 \( 17.33 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 였다. 그리고 \( \mathrm { pH } 6.0 \)에서 최대의 활성을 나타내었고, 산성범위보다 알칼리범위에서 안정한 것으로 나타났다. 또한 \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \) 존재하에서 높은 활성을 나타내었고 \( \mathrm { Co } ^ { 2 + } \) 와 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 존재하에서도 활성이 약간 증가한 반면에 \( \mathrm { Hg } ^ { 2 + } \) 존재 하에서는 상당한 저해를 받았다. Chito 올리고당에 대한 분해 산물을 HPLC로 확인해 본 결과 짝수개의 올리고당의 분해산물은 \( \left (( \mathrm { GlcNAc } )_ { 2 } \right ) \) 만을 생산하였고 홀수개의 올리고당에 대해서는 GlcNAc와 \( \left (( \mathrm { GlcNAc } )_ { 2 } \right ) \)를 생산하는 것으로 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose \( \left (( \mathrm { GlcNAc } )_ { 2 } \right ) \) 를 생산하는 exo형 chitinase로 추정된다.</p> <h2>Native PAGE를 이용한 활성 band 확인</h2> <p>효소정제를 위하여 40시간 동안 배양한 후 배양액을 원buffer, \( \mathrm{pH} 8 \sim 10 \)은 borate buffer, \( \mathrm{pH} 10 \sim 11 \)은 \( \mathrm{NaHCO}_{3} \). \( \mathrm{NaOH} \) buffer를 그리고 \( \mathrm{pH} 11 \sim 12 \) 는 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot \mathrm{NaOH} \) buffer에 각각 효소를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 방치한 다음 효소 의 잔류활성을 측정해 보았다. 그 결과 Fig. 6 (D)에서 보는 것과 같이 \( \mathrm{pH} 6 \) 에서 가장 안정하였다. 특이한 것은 \( \mathrm{pH} 11 \sim 12 \)에서 상당히 안정함을 보였는데 이것은 아마도 phosphate의 영향이 아닌가 생각된다. 그리고 대체적으로 산성 쪽에서보다는 염기성 쪽에서 더 안정한 것으로 확인되었다. 효소 활성 최적 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 결과는 Fig. 6 (C)에서 보는 바와 같이 \( \mathrm{pH}6 \)의 phosphate buffer에서 가장 높은 활성 을 보였다. 효소활성에서도 \( \mathrm{pH} \) 안정성과 마찬가지로 염기성 쪽에서 더욱 높은 활성을 보였다.</p> <h2>정제효소의 금속이온에 따른 효소활성의 영향</h2> <p>효소활성에 미치는 금속이온의 영향을 검토하기 위하여 효소액을 \( 20 \mathrm{mM} \) EDTA가 포함된 phosphate 완충액 \( (\mathrm{pH} \) 7.0)에 24시간 투석 후 다시 EDTA가 없는 동일 완충액에 24시간 투석 처리하였다. 처리된 효소에 각각의 금속이온을 \( 10 \mathrm{mM} \) 되게 첨가한 후 효소활성을 측정하여 상대적인 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>효소의 기질특이성 실험</h2> <p>효소의 반응 특이성을 알아보기 위하여 여러 종류의 chito 올리고당들을 기질로 하여 효소반응을 한 뒤 반응 산물을 HPLC를 통해 분석하였다. Column은 carbohydrate analysis P/N84038 (Waters社)을 사용하였고 용매는 acetonitlile : water \( (70: 30, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 사용하였으며 유속은 \( 0.5 \) \( \mathrm{m} \ell / \mathrm{min} \) 으로 하여 RI (refractive index) 검출기를 이용해서 검출하였다.</p> <h2>정제효소의 금속이온에 따른 효소활성의 영향</h2> <p>효소활성에 대한 금속이온의 영향을 검토하기 위하여 조효소액에 각각의 금속이온을 \( 1 \mathrm{mM} \) 되게 첨가하여 전술한 활성 측정법으로 비교하였다. 효소액은 \( 20 \mathrm{mM} \) EDTA가 포함된 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 7)에 효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 투석한 후, EDTA가 없는 동일한 완충액에 24시간 투석하였다. 그 결과 Table 5 에 나타난 것처럼 \( \mathrm{Co}^{2+}, \mathrm{Mg}^{2+} \) 에서 비교적 높은 활성을 보였으며 \( \mathrm{Mn}^{2+} \) 에서 가장 높은 활성을 보였고 \( \mathrm{Hg}^{2+} \) 에서는 활성에 상당한 저해를 받는 것으로 확인되었다.</p> <h2>정제효소의 기질 농도에 따른 영향</h2> <p>정제된 효소에 대한 colloidal chitin의 농도에 대한 영향을 Lineweaver Burk plot으로부터 측정하여 \( K_{\mathrm{m}} \) 값을 구하였다. 그 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이 본 효소에 col-loidal chitin에 대한 \( K_{\mathrm{m}} \) 값은 \( 17.33 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 로 확인되었다.</p> <h2>정제효소의 chito 올리고당의 분해 양상</h2> <p>Chi-56A가 chito 올리고당을 기질로. 했을 때 어떤 분해 양상을 가지는지를 실험해 본 결과 Fig. 8 에서 보는 바와 같이 \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \)는 거의 분해하지 않았다. 그리고 \( (\mathrm{GlcNAc})_{4} \)와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{6} \) 의 경우에도 Fig. 8 (D)와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{32} \)(F)의 결과로 보아 분해산물로 \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \) 만이 생성되는 것을 확인하였다. 또한 Fig. 8 (C)와 (E)의 결과에서 와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{5} \) 의 분해산물은 GlcNAc와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \) 를 함께 생성하였다. 위의 두 가지 결과에 의해 Chi- 56A는 chitin 사슬의 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \)를 생산하는 exo형 chitinase로 추정된다.</p>	생명
미토콘드리아 displacement loop 영역의 염기서열을 이용한 녹용의 원산지 동정	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>녹용 시료</h2> <p>본 연구에 사용된 녹용은 서울의 경동시장에 위치한 녹용 수입회사로부터 수입면장을 확인한 러시아산 원용(Cervus ela-phus sibericus, 마록), 중국산 깔깔이(Cervus elaphus bac-trianus, 마록), 뉴질랜드산 뉴자(Cervus elaphus, 적록)등 각 13 개씩을 구입하여 공시재료로 사용하였다. 또한, 북미산 녹용(Cervus elaphus canadensis)은 실제 국내 유통이 금지되었으나 북미에서 수입되어 중국산으로 판매되는 제품을 녹용 수입 회사를 통해서 13점을 구매하여 사용하였다. 이중에서 각 10개의 시료는 D-loop 영역의 염기서열을 위한 시료로 나머지 3개의 시료들은 원산지 동정을 위한 검정용으로 사용하였다.</p> <h2>Total genomic DNA의 분리, 추출</h2> <p>녹용 시료로부터 genomic DNA의 분리 및 정제는 Matsunaga 등의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 실시하였다. 녹용 \( 1 \mathrm{~g} \)에 3 배 분량의 lysis buffer \( \left(155 \mathrm{mM} \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}\right. \), \( 10 \mathrm{mM} {KHCO} 3,1 \mathrm{mM} {EDTA}) \)를 첨가한 다음, homogenizer를사용하여 균질화시킨 후 \( 3,000 \times g \)로 15 분간 원심분리 하였다. 침전된 pellet에 lysis buffer II \( (100 \mathrm{mM} \) Tris- \({HCl}, \mathrm{pH} \) 8.0, \( 10 \mathrm{mM} {EDTA}\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(0.5 \% \) SDS를 \( 3 \mathrm{ml} \)넣고 protei-nase \( \mathrm{K}(50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \)를 첨가한 후에 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온기에서 1시간동안 방치하였다. 이후 RNase \( (50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \)을 첨가한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 처리하였다. 이들 혼합액에 \( 6 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} 1.5 \)\( \mathrm{ml} \)과 chloroform \( 3 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 잘 혼합한 후에 \( 12,000 \times \) \( g \)에서 15분간 원심분리 하였다. 이후 상층액을 버리고 DNA 침전물을 TE buffer \( (10 \mathrm{mM} \) TrisHCl \( \mathrm{pH} \) 8.0, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA)에 용해하여 분광광도계를 사용하여 \( 260\mathrm{~nm} \) 에서 UV 흡광도를 측정하여 분리한 녹용 DNA의 농도를 결정한 후 TE buffer (10 mM TrisHCl pH 8.0, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA)를 사용하여 최종 농도가 \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{ul} \)이 되도록 희석한 후 냉동 보관하였다. 또한 일부 genomic DNA 추출이 잘 되지 않는 녹용은 Genomic DNA isolation kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 분리, 추출하였다.</p> <h1>결 과</h1> <p>녹용은 매년 수요가 증가하는 고가의 한약재로 간주되고 있다. 하지만 국내 수요량의 많은 부분을 수입 녹용에 의존하는 실정이다. 이러한 상황에서 저가의 녹용이 고가로 둔갑 판매되거나 10여년 전부터 수입이 금지된 북미 산 녹용이 유통되는 문제는 과학적인 녹용의 감별 기술 개발을 요구하고 있다.</p> <p>본 연구는 변이 축적 율이 가장 높아 종간의 분류 지표로 주로 사용되고 있는 미토콘드리아 D-loop 영역의 염기서열 분석을 통해서 원산지 특이적인 녹용의 염기서열을 탐색하고자 수행하였다. NCBI의 GenBank에서 북미산 사슴 (AY970666.1, Cervus elaphus Canadensis)과 러시아산 사슴 (AF058371.1, Cervus elaphus sibericus)의 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역을 선정하고 이들의 염기서열 비교를 통해서 이들 영역을 증폭하기 위한 PCR용 primer를 합성하여 약 1,100 1200 bp로 예상되는 크기의 PCR 산물을 얻었다. 아가로스 겔 전기영동을 통해서 증폭이 확인된 PCR 산물은 direct 염기서열 결정법을 통해서 염기서열을 확보한 후 BLAST 상동성 분석을 수행하였다. BLAST 상동성 분석 결과를 보면 각 10개의 러시아산, 북미산, 뉴질랜드산 녹용의 미토콘드리아 D-loop의 염기서열은 C. elaphus cana-densis와 가장 높은 염기서열 상동성을 보여주었다. 전체적으로 녹용 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역에 대한 BLAST 상동성은 \(97\%\) \(99\%\)정도로 본 연구에서 해석한 염기서열이 D-loop 영역임을 알 수 있었다. 하지만 BLAST 상동성 결과에서 보면 러시아산, 북미산 및 뉴질랜드산 녹용이 C. elaphus canadensis에서 유래하는 미토콘드리아 D-loop 유전자와 가장 유사하게 나타났다. 일반적으로 C. elaphus cana-densis는 북미를 서식처로 하는 녹용 사슴으로 분류되는데 반해서 BLAST 분석에서는 다른 녹용 사슴과 높은 상동성을 보이는 일부의 결과로 볼 때 미토콘드리아 DNA를 이용한 BLAST 상동성 분석은 녹용의 원산지 판별에 유용하지 않음 을 알 수 있었다. 또한, 중국산 녹용의 경우는 러시아산, 북미산, 뉴질랜드산의 경우보다 낮은 \(94\%\) \(95\%\)의 상동성 결과를 나타냈으며 구체적으로 보면 중국산 10개 시료 중에서 3개의 시료(C02, C03, C07)는 Cervus elaphus macneilli와, 나머지 7개의 시료(C01, C04, C05, C06, C08, C09, C10)는 Cervus ela-phus red deer의 D-loop 유전자와 가장 높은 상동성을 보여주었다. 따라서 중국산의 경우도 BLAST 분석을 통해서는 정확한 원산지 확인이 어려운 것으로 분석되었다. 결국, 이러한 BLAST 상동성 분석 방법은 미토콘드리아의 D-loop 영역의 염기서열 유사성을 통해서 해당하는 유전자가 녹용사슴으로부터 유래한 것을 확인하는 데에는 유용할 수는 있지만 녹용사슴의 원산지를 확인 또는 동정하는 데에는 유용한 방법이 아님을 알 수 있었다.</p> <p>한편, Fig. 1에서 보는 것과 같이 중국산 녹용의 PCR 산물이 러시아산, 북미산, 뉴질랜드산의 것보다 크기가 작게 검출되어 중국산 녹용의 D-loop 영역 내에 결실 부분의 존재를 예상 할 수 있었다. 이러한 D-loop 영역의 결실 부위는 DNA 염기서열 결정 후 ClustalW2 프로그램을 이용한 multiple alignment를 통해서 확인할 수 있었다. Fig. 2는 원산지 별로 각 10개의 녹용 시료, 즉 40개의 미토콘드리아 D-loop 영역의 multiple alignment 결과 중에서 D-loop의 결실 부위를 포함하는 일부분을 나타낸 것으로 중국산 녹용의 D-loop 영역에 약 \( 60 \sim 70 {bp} \)의 결실이 있음을 확인할 수 있었다.</p> <p>녹용의 유연관계에 분석을 통해서 중국산 녹용의 D-loop영역의 결실부위가 중국산 녹용을 하나의 그룹으로 묶여주는 특성이 되는지를 확인해 보고자 neighbor joining 방법을 통한 phylogenetic tree 분석을 수행하였다. 그 결과 10개의 중국산 녹용은 하나로 그룹화 됨을 볼 수 있는 반면에 러시아산, 북미산 및 뉴질랜드산 녹용들은 수입 국가별 분류와는 다르게 혼재되어 분지되어 그룹화되어 있었다. 이러한 결과로부터 녹용의 D-loop 영역 내 결실 부분은 중국산 녹용을 동정하기 위한 유용한 분자마커가 될 수 있을 것으로 생각된다. 하지만 미토콘드리아 D-loop 영역의 multiple alignment 분석에서는 러시아산, 뉴질랜드산, 북미산 녹용을 특정하는 원산지 특이적인 염기서열 또는 Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs)을 보이는 단일 염기변이성 마커 등을 확인할 수 없었다. 한편, D-loop 영역의 결실 특성을 이용하여 중국산 녹용의 분자 동정이 가능한 지를 검증해 보고자 D-loop 영역의 결실을 확인할 수 있는 DL-F1과 DL-R1 primer를 선정하여 각 3개의 러시아산, 중국산, 뉴질랜드산 녹용 시료를 대상으로 PCR 검증을 실시하였다. 결과적으로 Fig. 3에서처럼 중국산 녹용의 PCR 산물이 러시아산, 북미산 및 뉴질랜드산에서 보다 약 \( 60 \sim 70 {bp} \)작은 크기로 나타나 PCR법을 통한 중국산 녹용의 원산지 추정이 가능함을 확인할 수 있었고 최종적으로 중국산 녹용에 존재하는 결실 부위의 해석은 이들 9개의 PCR 산물을 pGem T vector에 클로닝 한 후 염기 서열 분석을 통해서 확인할 수 있었다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>녹용(Cornu Cervi Pantotrichum, deer antler)은 우리나라에서 가장 많이 소비되는 동물성 생약으로써 신농본초경에서는 강장보신의 효능이 있어 여러 가지 허약증을 치료하는 대표적인 전신 강장약으로 알려져 왔다. 최근 녹용의 생물학적 활성 검색에 의하면 조혈모세포의 생성을 촉진시켜 조혈작용과 신체활성을 증가시키고 당 대사를 개선시켜 생장 및 발육을 촉진시키는 효과가 있으며 소화기관 계통의 기능 촉진, 그리고 심혈기관을 항진시킴으로써 강심효과 및 면역 증강 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 Lee등의 녹용의 원산지에 따른 약효의 비교연구는 녹용이 직접적인 조혈촉진 및 회복 효과의 차이가 없다고 하는 반면에, Kim등의 조혈과 관련한 유전자인 IL3, GM-CSF 및 TPO 등의 유전자 발현에서 녹용이 원산지별, 부위별로 약간의 차이가 있으나 CD34의 발현과 형태적 변화 관찰에서는 원산지 별로 통계학적으로 유의한 효과를 얻지 못했다는 보고로 볼 때 녹용의 원산지에 따른 효능의 규명이 원산지의 감별보다 더 시급한 과제가 아닐까 생각된다.</p> <p>우리나라에서 사슴 생산물의 이용은 주로 한약제인 녹용에 편중되고 있다. 최근 경제성장과 함께 녹용의 소비량은 매년 꾸준한 증가세를 보이고 있으며 수입량 또한 지속적으로 증가하고 있다. 하지만 유통과정에서 저가의 녹용을 값비싼 러시아산 녹용으로 둔갑시키거나 수입이 금지 된 북미산 녹용을 중국을 통해 반입하는 부정 유통 등이 사회적으로 문제시되고 있다.</p> <p>지금까지의 녹용의 원산지 판별은 단지 형태적 특징이나 관능검사 수준에서 머물러 있어 정확한 녹용의 원산지 구분이 어렵고 판정에 대한 신뢰성이 현저히 떨어져 녹용의 감별 기술이 시급히 필요한 시점이다. 현재 사용되는 한약재 중에서 산삼, 웅담, 녹용 등의 고가 한약재에 대한 진위 검사법은 주로 외관 관찰에 의한 형태적 방법과 향미, 색상 등의 관능검사에 의해서 주로 의존하고 있으며 그 밖에 화학적 조성을 조사하는 이화학적 방법 등이 고려되고 있지만 판별기준에 대한 절대적인 객관성이 부족하다. 따라서 최근 분자생물학적 기술을 이용한 생물의 종 판별 보고 사례를 통해서 녹용의 원산지 판별에도 이들 기술의 활발한 적용 사례가 보고되고 있다.</p> <p>국내에서 소비되는 국산 녹용은 매화록과 마록으로 크게 구별되어 각각 사슴과(Cervidae)에 속하는 일본사슴(Cervus nippon terminck), 붉은사슴(Cervis elephus L.) 그리고 북미산 wapiti라고 알려진 북미사슴(Cervus canadensis)의 어린 뿔을 잘라 건조시킨 것을 사용하고 있다. 이외에도 녹용은 생산되는 원산지에 따라서 러시아로부터 주로 수입되는 원용, 중국 동북부 지방에서 생산되는 동마록, 신장 지방의 서마록, 그리고 일반적으로 적록 또는 뉴자로 일컫는 뉴질랜드산과 비교적 체구와 뿔이 큰 것으로 알려진 북미산 사슴인 대록 등의 품목이 유통되고 있다.</p> <p>한편, 한약재의 유통구조 개선 및 가공 산업 육성방안연구와 보건복지부 주도의 한약재 품질표준화가 추진되면서 한약재의 사용 및 한약의 객관성 확립을 위한 연구가 활발해지고 있다. 최근 서양에서도 동양의학에 대한 관심이 고조되면서 동양의학의 원리, 치료법 및 한약의 약리효과에 관한 많은 논문들이 보고되고 있으며 그 중에서도 최근 Chan은 한약의 과학화를 이루기 위한 방안으로 한약재의 품질표준화, 한약재의 독성평가와 함께 한약재의 진품판별(authentication)을 중요한 과제로 제시하고 있다. 이러한 측면에서 한약재 중에서 대부분을 수입에 의존하는 녹용의 원산지 판별은 다른 어떤 한약재보다 시급하지만 이에 대한 대책은 전무한 상태이다. 대부분의 진핵 세포는 핵 안에 존재하는 핵 DNA (nuclear DNA)와 세포질안에 존재하는 미토콘드리아 및 엽록체 DNA로 구성되어 있는데 이들 유전물질은 개체간에서는 차이가 있으나 동일 개체 내에서는 부위에 상관없이 일정하다. 개체간 DNA의 변이를 확인하기 위해서 염기서열의 변이를 기초로 한 RAPD-PCR(random amplified polymorphic DNA), PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphisms)과 같은 PCR을 이용한 분자생물학적 방법이 주로 사용되고 있다. 실제로 한우와 젓소의 MC1R(melanocortin 1 receptor) 유전자의 염기서열 중에서 한 개의 염기에서의 결실 돌연변이에 기초한 한우고기 유전자 판별법은 실제로 유통현장에서 적용되고 있다.</p> <p>본 연구에서는 세포질 유전물질인 미토콘드리아 DNA를 대상으로 녹용의 원산지 동정을 수행하였다. 미토콘드리아 DNA를 대상으로 한 것은 미토콘드리아 DNA의 염기치환율 이 핵 DNA보다 약 \( 5 \sim 10 \)배 이상 빨라 종간 및 종내 염기치환에 의한 많은 돌연변이를 보유하고 있어 이들의 염기서열 정보는 동물의 기원, 진화과정, 집단의 유전적 구조 및 종간의 유전적 유연관계 및 계통분화 연구 등에 유용한 정보를 제공해 주기 때문이다. 특히 미토콘드리아 DNA에 존재하는 13개의 단백질 암호화 유전자, 22개의 tRNA 유전자, 2개의 rRNA 유전자 및 DNA 복제개시 부위인 D-loop (displacement loop) 중에서 D-loop 영역은 미토콘드리아 DNA에서 유래하는 여러 유전자들보다 약 5배의 높은 염기치환율을 갖는 것으로 추정되고 있어 이 영역을 이용한 생물종의 감별과 유연관계 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서도 녹용 사슴의 미토콘드리아 DNA의 D-loop영역을 대상으로 한 원산지 감별의 가능성을 타진해 보았으며, 결과적으로 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역의 염기서열 분석으로 중국산 녹용의 분자적 동정에 유용한 분자마커를 확인하였다. 이러한 중국산 녹용의 미토콘드리아 D-loop영역내 결실은 본 연구에 사용된 10종의 중국산 녹용 모두에서 확인되었으며 추가로 확보한 3종의 중국산 녹용 시료에서도 결실 부분을 특이적으로 증폭할 수 있는 PCR 검출과 이 PCR산물의 클로닝을 통한 염기서열 분석을 통해서 최종적으로 확인할 수 있었다.</p> <p>본 연구를 통해서 중국산 녹용에서만 발견되는 결실 부위를 확인하기 위한 PCR법은 수입 녹용 중에서 약 \( 22 \% \)를 차지하는 중국산 녹용의 감별과 중국산 녹용이 러시아산 녹용으로 둔갑 판매되는 것을 방지하는 데 대단히 유용하게 사용할 수 있을 것으로 사료된다(2006년 한국의약품수출입협회). 하지만, 미토콘드리아 DNA에서 가장 염기치환 율이 높다고 알려진 D-loop 영역의 염기서열 분석으로는 러시아산, 뉴질랜드산 그리고 북미 산 녹용을 특정하는 원산지 특이적인 염기서열과 RFLP 부위 등을 확인 할 수 없었다. 이러한 결과는 지리적으로 떨어져 있는 녹용 사슴 간에 상당히 높은 근연 관계가 있음을 보여주는 결과가 아닌가 생각된다. 따라서 앞으로 러시아산, 북미산 및 뉴질랜드산 녹용의 원산지 감별은 D-loop 영역 이외에 ATPase 6, ATPase 8, NADH 4, NADH 6 및 Cyt b등과 같은 미토콘드리아 유래의 다양한 유전자를 대상으로 한 보다 심도 깊은 연구 및 다양한 원산지로부터 다수의 녹용 시료를 대상으로 한 연구가 함께 진행된다면 보다 정확한 녹용의 원산지 감별이 가능하지 않을까 생각된다.</p> <h2>미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역 PCR</h2> <p>녹용으로부터 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역의 PCR은 NCBI의 GenBank로부터 염기서열이 공개된 AY970666.1 (Cervus elaphus canadensis)과 AF058371.1 (Cervus elaphus sibericus)의 D-loop 염기서열을 alignment를 통해서 5'-TAA TATACTGGTCTTGTAAACC와 5'-GGGTCGGAAGGCTTG GGACCAAACC의 서열을 설계하여 각각 forward (DL-F)와 reverse primer (DL-R) 명명한 후 합성하였다(Bioneer, Korea). PCR을 위한 반응시약의 조성은 다음과 같이 준비하였다. 즉 최종 PCR 반응액을 20\(\mathrm{ul}\)로 기준으로 할 때 PCR 전용 tube에 template DNA를 약 \( 100 \mathrm{ng} \), primer 각 \( 0.5 \mathrm{uM}, {dNTP} \) 각 200uM, 10x PCR buffer 그리고 ampliTaq DNA polymerase (Applied Biosystens, USA) 2 unit를 첨가하였다. Thermal cy-cler Dice (Takara, Japan)를 이용한 PCR 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 최초 변성 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 54^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초 그리고\( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 70초를 1회로 하여 총 35회 반복한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 last extension을 수행하였다. 또한, 미토콘드리아 D-loop 영역 중에서 결실이 일어나는 부분을 확인하기위한 primer로서 DL-F1 (5'- AACCTTATGCGCTCGTAGTA)과 DL-R1 (5'-AGTGAAAAGTACATGCTTATA)을 설계하여 사용하였다(Bioneer, Korea). 중국산 녹용의 D-loop 영역 안의 결실 부위를 확인하기 위한 PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 최초 변성 한 다음, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 1회로 하여 총 35회 반복한 후, 최종적으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 last extension을 수행하였다. 이때 사용한 PCR 반응시약은 Top Taq DNA polymerase premix kit (Bioneer, Korea)를 사용하였다.</p> <h2>D-loop 영역의 클로닝</h2> <p>D-loop 영역의 결실부위를 확인하기 위해서 DL-F1과 DL-R1 primer를 통해서 확보된 PCR 산물은 PCR purificationkit (CoreBio System, Korea)로 정제한 후, pGEM T vector sys-tem (Promega, USA)를 사용하여 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 liga-tion을 수행하였다. \( {Hit}^{{TM}}-{DH} 5 {a} \) competent cell (RBC, Taiwan)을 제조사가 권장하는 방법에 따라서 형질전환 한 다음 LBagar (X-gal, \( 40 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \); IPTG, \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \); ampicillin, \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) )에 \( 100 \mathrm{ul} \) 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 16시간 동안 배양하여 흰색의 집락을 선별하였다. 이후 이 집락을 LB broth (ampicillin, \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) )에 접종시켜 16시간 동안 진탕 배양 한 후 Plasmid DNA miniprep kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 분리, 정제하여 염기서열 해석을 위한 주형 DNA로 사용하였다.</p>	생명
Fucoidan의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도 억제 효과	<h2>Fucoidan의 B16F10 melanoma cell 내의 멜라닌 생성 억제 효과</h2> <p>Fucoidan이 B16F10 melanoma 세포의 신호전달경로를 통하여 간접적으로 tyrosinase 활성에 관여하는지를 확인하기 위하여 먼저 멜라닌 합성에 대하여 fucoidan이 억제작용을 하는지를 알아보았다. Fucoidan을 1, 10, 20 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리하고 48시간이 지난 후 멜라닌 생성량을 측정하였다. Fucoidan \( 1 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서는 대조군에 비하여 \( 9.9 \%, 10 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 에서는 \( 26.6 \%, 20 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 에서는 \( 43.4 \% \) 를 감소시켰으며, 최종 농도인 \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 에서는 \( 46.5 \% \) 로 멜라닌 생성을 감소시킴으로써 통계적으로 유의하게 멜라닌 생성이 억제되고 있었다 \( ( \mathrm { p }<0.05 \), Fig. 4). 양성대조군인 kojic acid와 비교하였을 때 모든 농도에서 fucoidan에 의한 멜라닌 생성량 감소가 더욱 현저하였다.</p> <h2>Fucoidan의 B16F10 melanoma cell 내의 tyrosinase 활성도 억제 효과</h2> <p>Tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하며, melanosome에서 tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만들고 다시 DOPA를 산화시켜 DOPA chrome을 만드는 DOPA oxidase로 작용하여 멜라닌 polymer를 합성하는데 있어서 key enzyme으로 작용한다. 그러므로 tyrosinase 활성 억제제는 피부 내에서 멜라닌 polymer 합성을 효과적으로 저해할 수 있기 때문에 중간 생성단계에서 tyrosinase에 의해 생성되는 반응 산물인 DOPA chrome의 저해 정도를 확인하는 L-DOPA oxidase 방법을 채택하였다. Fucoidan이 B16F10 melanoma 세포의 tyrosinase 활성도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 fucoidan을 1,10,20 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리하고 48시간이 지난 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Fucoidan \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서는 대조군에 비하여 tyrosinase 활성도가 \( 8.8 \%, 20 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)에서는 \( 12.8 \% \), 최종 농도인 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)에서는 \( 43.3 \% \)가 감고되었으며 통계적으로도 유의하였다(p<0.05, Fig. 5). 양성대조군인 kojic acid와 비교하였을 때 모든 농도에서 fucoidan에 의한 tyrosinase 활성도 감소가 더욱 현저하였다.</p> <h2>세포 생존능(cell viability)의 측정</h2> <p>Yang 등의 방법에 준하여 다음과 같이 cell viability를 측정하였다. B16F10 melanoma 세포를 96-well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells \(/ \)well 농도로 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 하루 동안 안정화를 시킨 후 fucoidan을 1, 10, 20 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 처리를 한 후 48 시간 동안 배양하였다. 그 후 각 well의 배지들을 제거하고 MTT solution ( \(5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \) in PBS) 을 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 씩 첨가하고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 동안 반응시킨</p> <p>후 MTT solution을 제거하고, 각 well에 \( 100 \mu \) 의 dimethylsulfoxide (DMSO)를 첨가하여 \(15 \sim 20 \)분간 plate shaker로 흔들어 준 다음 microplate reader를 사용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>B16F10 melanoma cell 내의 멜라닌 생성량 측정</h2> <p>6-well plate에 well당 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells \(/ \)well로 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 배양을 하였다. 배지를 제거하고 fucoidan이 1, 10, 20, 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석된 배지로 교체한 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS (phosphate buffered saline)로 2번 세척하고, \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) Triton X-100을 함유한 \( 100 \mathrm { mM } \) sodium phosphate \( \left ( \mathrm { pH } \right . \) 6.8) \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 넣고 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 용해시킨 후, 12000 \( \mathrm { rpm } \) 에서 30분 동안 원심 분리하여 얻은 pellet을 멜라닌 정량에 사용하였다. 물에 불용성을 나타내는 멜라닌의 액화를 일으키기 위하여 \( 10 \% \) DMSO가 함유된 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { ~NaOH } \)를 적정량 넣고 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 동안 반응을 시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>B16F10 melanoma cell내의 tyrosinase 활성도 측정</h2> <p>6-well plate에 well 당 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells \(/ \)well 농도로 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 배양을 하였다. 배지를 제거하고 fucoidan이 1, 10, 20, 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석 된 배지로 교체한 후 48시간을 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS로 2번 세척하고, \( 1 \% ~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) Triton X-100을 함유한 \( 100 \mathrm { mM } \) sodium phosphate ( \( \mathrm { pH } \) 6.8) 을 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) 넣고 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 용해시킨 후, 12,000 \( \mathrm { rpm } \)에서 30분 동안 원심 분리하여 얻은 상등액을 tyrosinase 활성도 측정에 사용하였다. 상등액 \( 40 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)와 \( 100 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.8)에 녹인 \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) L-DOPA \( 160 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 1시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 배양하였다. 반응이 끝난 후 tyrosinase에 의해 DOPA로부터 형성되는 DOPA chrome의 양을 \( 490 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하여 상대적 tyrosinase 활성으로 나타내었다.</p> <h2>\( \alpha- \)MSH 에 의한 과생성 멜라닌 생성량 및 tyrosinase 활성도 측정</h2> <p>외부 자극에 대한 B16F10 melanoma 세포 내 과생성 멜라닌과 tyrosinase의 활성도에 대하여 fucoidan이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 외부 자극제로 \( \alpha- \)MSH를 사용하였으며 실험방법은 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성량 측정 및 tyrosinase 활성도 측정과 동일하게 시행하였다.</p> <h2>Polyacrylamide gel에서 tyrosinase 활성 측정</h2> <p>B16F10 melanoma 세포를 6-well에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells \(/ \)well로 분주한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. 24시간 후에 \( \alpha- \)MSH가 포함된 배지에 fucoidan을 1, 10, 20 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석하여 교체한 다음 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, \( 1 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) Triton X-100을 함유한 \( 100 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate \( ( \mathrm { pH } \) 6.8)을 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 넣고 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분 동안 반응시킨 후 12,000 \( \mathrm { rpm } \)에서 30분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액은 tyrosinase 효소원으로 사용하였다. BSA를 표준 단백질로 이용하여 단백질을 정량하고 SDS \(-10 \% \) polyacrylamide gel에서 일정량의 단백질과 sample loading buffer 혼합액을 전기영동 하였다. 얻어진 gel을 \( 200 \mathrm { ~ml } \) 의 \( 100 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate buffer에 넣고 상온에서 30분 동안 가볍게 흔들어준 후 새로운 용액으로 교환하고 한 번 더 세척하였다. 그리고 \( 10 \mathrm { mML } -DOPA 용액을 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2시간 이상 반응시켜 나타나는 갈색의 밴드를 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Mushroom tyrosinase inhibition assay</h2> <p>Tyrosinase에 대한 fucoidan의 직접적인 영향을 알아보기 위하여 fucoidan을 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000 및 4,000 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 다양한 농도로 조제한 후 L-tyrosine을 이용하여 tyrosinase 활성 억제율을 알아보았다. 양성대조군으로 사용된 kojic acid의 경 우 농도가 높아짐에 따라 tyrosinase의 활성을 억제시키는 경향을 보였다 \( ( \mathrm { p }<0.05) \). 그러나 fucoidan의 경우 \( 1000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서만 대조군에 비하여 tyrosinase의 활성을 \( 16.7 \pm 4.1 \% \) 억제하여 \( ( \mathrm { p }<0.05) \) 양성 대조군으로 사용된 kojic acid에 미치지 못하는 활성을 나타내었다. 이는 Park 등이 다시마 열수추출물외 alginate와 fucoidan이 tyrosinase에 직접적인 작용을 하지 않는 것으로 보고한 연구와도 일치하였다. 이러한 결과로 미루어 fucoidan이 직 접적으로 tyrosinase 효소의 활성을 억제하지는 않은 것으로 판단된다.</p> <h2>세포 생존능(cell viability)</h2> <p>Fucoidan이 B16F10 melanoma 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 방법을 이용하여 생존율을 측정하였다. Fucoidan을 1, 10, 20 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리한 후 48시간동안 배양한 결과 대조군과 비교하여 fucoidan \( 1 \mu \mathrm { g } \) \( / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \( 113.2 \pm 3.3 \% \)로서 대조군보다 유의하게 높은 세포 생존능을 보였으며 \( ( \mathrm { p }<0.05), 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 에서는 \( 110.3 \pm \) \( 3.3 \%, 20 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \( 103.6 \pm 5.4 \% \) 대조군과 유의한 차이는 없었다. Fucoidan \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 투여군에서는 세포생존능이 \( 93.4 \pm 5.2 \% \)로서 대조군보다 유의하게 더 낮았다 \( ( \mathrm { p }<0.05 \), Fig. 3). 즉, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 이상의 고농도에서는 세포 독성이 나타날 수 있음을 의미하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 실험 기기</h2> <p>실험에 사용된 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-trazolium bromide (MTT) 과 fucoidan, tyrosine, Triton X-100, mushroom tyrosinase, \( a \)-MSH, DOPA는 Sigma사(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 그 외 시약은 일급 또는 특급 시약을 사용하였으며 세포 배양을 위한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지와 fetal bovine serum (FBS), 항생제 penicillin-streptomycin은 GIBCO사(Grand Island, NY, USA)의 제품을 사용하였다.</p> <p>실험에 사용된 기기는 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator (Forma Scientific 3111, Marietta, OH, USA), clean bench (Hanback Co, Ltd. HB-402SM, Seoul, Korea), microscope (Nikon TS 100, Japan), multi-detection microplate (Bio-TEK Synergy HT, Winooski, VT, USA) 등이었다.</p> <h2>실험 방법</h2> <p>Mushroom tyrosinase inhibition assay</p> <p>자외선 또는 주변 환경에 의해 tyrosinase가 활성을 갖게 되면 tyrosine (또는 DOPA)이 중간생성 단계인 DOPA chrome의 생성경로를 거쳐 자동 산화반응에 의해 멜라닌 고분자로 변화한다. 본 실험은 L-tyrosine을 기질로 하여 중간 단계인 DOPA chrome의 생성여부를 측정하였다. 즉, 다양한 농도별로 희석한 fucoidan \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 와 \( 50 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 6.5)에 녹인 \(1 \mathrm { mM } \) L-tyrosine \( 170 \mu \mathrm { l } \)를 96-well plate에 넣고 mushroom tyrosinase \( (1,000 \mathrm { ~unit } / \mathrm { ml } ) \) \( 20 \mu \mathrm { l } \\)를 혼합한 후 상온에서 30분 배양한 후 \( 490 \mathrm { ~nm } \)에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 구하였다.</p> <p>\( \begin {array} { l } \text { 상대적 tyrosinase } \\ \text { 활성도( \%) } \end {array} = \frac {\text { 시료 첨가군의 O.D at } 490 \mathrm { ~nm } } {\text { 시료 무첨가군의 O.D at } 490 \mathrm { ~nm } } \times 100 \)</p> <h2>세포주 및 세포 배양</h2> <p>한국 세포주은행에서 분양받은 B16F10 멜라닌 세포주는 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM을 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다.</p>	생명
v21n10	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>실험에 사용한 8주령의 수컷 Spague-Dewley (SD) rat은 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 1주 이상 본 실험 사육장환경에 적응시킨 후 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고 사육장 실내의 온도는 \( 22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \( 50 \pm 10 \% \), 조경은 12 시간 명/암 주기가 되도록 조절하였다.</p> <h2>시료 및 추출</h2> <p>본 실험에 사용한 하고초는 (주)옴니허브에서 구입하여 한국한의학연구원 한약자원연구센터에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다. 각 약재 \( 200 \mathrm{~g} \) 에 5 배량의 물을 가한 다음 2시간씩 2회 환류 냉각 추출하여 여과한 후 농축하고 동결건조하여 그 분말을 얻어 진행한 모든 실험에 사용하였다. 시료의 농도는 동결 건조 분말의 중량을 기준으로 표시하였다. 각각 실험에 사용된 시료는 혈전용해는 \( 20 \% \) dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, Louis, MO, USA), PT와 APTT는 \( 10 \% \) DMSO, 혈소판응집은 phosphate-bufffered saline (PBS, \(\mathrm{pH} 7.4\))에 녹여 실험에 사용하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>혈전용해 실험에 사용한 시약은 fibrinogen from human plasma, thrombin from human plasma, plasmin from human plasma를 Sigma (Louis, MO, USA)에서 구입하였고, PBS는Gibco (USA)에서 구입하였다. 응고타임에 사용된 calibration plasma, normal control, low abnormal control, PT-fibrinogen HS, SynthASil, calcium chloride \( 0.020 \mathrm{M} \), reference emulsion 시약은 Instrumentation Laboratory (Italy)로부터 구입하여 사용하였다. 혈소판응집 유발물질인 adenosine diphosphate (ADP)와 collagen은 Chrono-Log (Havertown, USA)의 제품을 사용하였다.</p> <h2>혈액 준비</h2> <p>응고타임 실험에 사용된 혈액은 수컷 SD-rat을 동물사육실에서 1주일간 순화시킨 다음 ethyl ether로 마취하고, 항응고제 \( 0.15 \mathrm{M} \) sodium citrate (Vacutainer, Becton dicknson, UK)를 혈액과 \( 1: 9(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 비율이 되도록 주사기로 복대동맥으로부터 채혈하였다. Low speed centrifuge (Gyrozen, Incheon, Korea) \( 1,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 상등액의 platelet rich plasma (PRP)은 버리고, 계속하여 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 platelet poor plasma (PPP)를 얻어 실험에 사용하였다. 혈소판 응집실험에 사용된 혈액은 수컷 SD-rat을 동물사육실에서 1주일간 순화시킨 다음 경동맥만 분리하여 Polyethylene Tube (Becton dicknson, UK) 를 삽입해서 Heparin coated tube (Green vac tube, Standardplus & medical Co., Ltd, St. Ingberg, Germany)로 옮겨 혈액을 담아 전혈을 사용하였다.</p> <h2>혈액 응고 시간 APTT, PT 측정</h2> <p>시료의 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 확인하고자 시료가 APTT와 PT에 미치는 영향을 조사하였다. 혈액응고억제 활성 중 내인성 경로(intrinsic pathway)에 기인하는 활성 트롬빈 플라스틴 시간 APTT와 외인성 경로(extrinsic pathway)에 기인하는 프로트롬빈 시간 PT를 자동혈액응고 분석기 ACL-7000 (Instrumentation Laboratory, Milano, Italy)를 사용하여 측정하였다. SD rat을 원심분리하여 얻은 platelet poor plasma (PPP)와 시료를 정해진 농도로 3:1의 비율로 섞어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 미리 배양한 후 자동 혈액 응고 분석기와 ACL assay reagent kit를 이용하여 시약과 반응시켜 응고될때까지의 혈액 응고 시간을 측정하였다.</p> <h2>혈전 용해능 측정</h2> <p>PBS로 fibrinogen의 최종 농도가 \( 0.6 \% \) 가 되도록 완전히 용해시킨 용액 \( 50 \mathrm{ml} \) 를 직경 \( 14 \mathrm{~cm} \) 의 petri dish에 옮기고 PBS에 녹인 thrombin 용액 50 NIH units를 30분 이상 상온에 방치하여 고화시켰다. 약재시료를 직경 \( 6 \mathrm{~mm} \) filter paper disc \( 20 \% \) DMSO에 각 농도로 약재시료 녹인 것을 fibrin plate 상에 점적하여 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15시간 동안 반응시킨 후 fibrin plate가 용해되어 형성된 투명환의 넓이를 측정하였다.</p> <h2>혈소판 응집능 측정</h2> <p>혈소판 응집능은 전혈의 혈소판 응집을 측정하는 im-pedance방법으로, 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극사이에 형성된 전기적 저항(ohm)의 변화로 나타내었다. 시험물질을 PBS에 녹여서 Chrono-Log aggregometer model 700-2(Chrono-Log, Havertown, USA)을 사용하여 혈액을 stir bars(Chrono-Log, Havertown, USA)를 넣은 plastic cuvettes (Chrono-Log, Havertown, USA)에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응시키고, 시험물질을 가하여 5분간 반응시켰다. 2분 정도 baseline을 확인 후, 혈소판응집 촉진물질을 일정량 넣고 \( 1,200 \mathrm{rpm} \)으로 교반하면서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최대 10 분간 측정하였다. 혈소판 응집촉진물질은 ADP와 collagen을 첨가하여 응집을 유도 하였고, 대조군에 대한 응집억제 정도를 비교하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 측정 결과는 3반복 이상의 독립적인 실험에서 도출된 대표값의 평균(mean)과 표준편차(standard deviation; SD)로 나타내었다. 각 실험군 간의 차이는 t-test를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였으며, \( p< 0.05 \)값인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>혈전은 한의학에서의 어혈 의미와 유사하며, 어혈과 밀접한 병기를 갖는 기울, 혈열, 한습, 양허와도 관련성이 높다. 동의보감에서는 어혈을 혈체라는 순환기능의 장애라는 개념으로 이해하고 있다. 그에 따른 치료는 활혈거어의 효능을 가진 본초가 주로 사용되며, 병리에 따른 기전에 따라 이기해울\(\cdot\)보양온리\(\cdot\)청열양혈 등의 효능을 가진 본초들과 함께 사용된다. 현재 식이조절, 약물요법, 운동요법 등으로 혈관계 질환을 유발하는 혈전의 예방과 치료방법이 있으며, 약물요법에는 현재 aspirin, dipyridamole, ticlopidine 등의 혈소판응집 억제제와 streptokinase (SK), urokinase (UK), aminocaproic acid 등의 혈전용해제, heparin, warfarin, dicumarol 등의 항응고제가 보편적으로 사용되고 있다. 하지만 생체 내에 혈전용해제를 투여했을 때 과량으로 생성된 plasmin에 대한 면역반응으로 혈전 용해 작용이 감소가 발생된다. 그리하여 이러한 약품들은 urokinase를 제외하고는 경구투여가 불가능하다는 단점이 있다. 또한, 일반적으로는 fibrin만을 용해시키는 선택적인 용해작용이라기보다 다른 단백질도 분해하는 넓은 범위의 protease의 성질을 가지는 것이 대부분이다. 이러한 성질을 가지는 protease를 혈전증 치료의 목적으로 장기간 또는 다량으로 사용할 경우에는 혈관벽이나 혈액성분등 다른 단백질을 함께 용해하기 때문에 매우 심각한 부작용이 있을 수 있다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 위 약물요법의 단점을 보완하도록 한약재로 항혈전 효능 검증을 하고자, 혈전 용해 활성을 검색하는 가장 기본적인 실험 방법인 fibrin plate법을 이용하여 fibrin의 용해 활성을 조사하였다. 혈전용해도 측정에 대해 하고초를 농도별 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(1.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 처리하여 15시간 후 fibrin plate가 용해되어 형성된 투명환의 넓이를 측정하는 실험을 진행한 결과 Fig. 1A에서 나타난 것처럼 \( 10, 5, 2.5,1.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 이 각각 \( 6.85 \mathrm{~mm}^{2}\), \(2.89 \mathrm{~mm}^{2} \), \( 0.00 \mathrm{~mm}^{2}\), \(0.00 \mathrm{~mm}^{2} \) 로 혈전용해도가 농도의존적으로 효능을 나타냄을 알 수 있다. 다음으로 혈액 응고 cascade에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 확인하고자 하고초의 APTT와 PT에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig. 2에서 나타난 것처럼 PT 의 경우 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 경우에는 각각 \( 550.00 \%\), \(116.49 \% \) 로 대조군보다 탁월한 지연효과를 보였으며 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(1.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 은 \( 89.01 \%\), \(85.28 \% \) 로 혈액 응고시간 단축효과를 보였다. APTT의 경우 Fig. 3에서 나타난 것처럼 \(10,5,2.5,1.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 는 각각 \( 550.00 \% \), \( 550.00 \%\), \(227.30 \%\), \(166.57 \% \) 로 대조군보다 매우 우수한 지연효과를 보였다. 혈소판 응집에 대한 작용을 살펴보기 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극 사이에 형성된 전기적 저항의 변화로 나타나는 실험을 시행한 결과 하고초의 농도별 \(10,5 ,2.5,1.25\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 가 Fig. 4 에 나타났듯이 ADP는 각각 \( 100 \% \), \( 98.11 \%, 100 \%\), \(37.33 \% \) 이고 collagen에서는 \( 100 \%\), \(100 \%\), \(100 \% \), \( 86.36 \% \) 로 매우 뛰어난 응집억제 활성을 보였다. 그 결과 하고초가 혈전용해, 응고시간(PT, APTT), 혈소판 응집능 실험에서 공통적으로 대조군과 비교하여 항혈전 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 특히 APTT평가에서 실험한 각 농도에서 모두 탁월한 혈액응고지연 효과가 나타남을 알 수 있었다.</p> <p>약리학적으로 하고초는 saponin 성분인 oleanolic acid를 함유해 간세포에 보호효과, 항결핵작용이 있는 것으로 나타났다. 또한 ursolic acid는 oleanolic acid와 함께 간세포보호효과를 가지며, nitric oxide의 생성을 억제하는 항염증, 항바이러스 작용 및 암세포에도 항암 효과 등이 있는 것으로 보고됐다. 그리고 flavonoid계 색소인 anthocyanin을 함유해 노화를 예방할 수 있는 항산화 효능이 있다. 또한 flavonoid 배당체와 수용성 potassium chloride를 함유하고 있어 혈압강하 작용과 이뇨 작용이 있는 것으로 보고되었으며, tannin 성분은 숙주세포 안으로 침입하는 것을 저해하여 항HIV 기능을 나타내는 것으로 규명되었다. 특히, 2a-hydroxy-oleanolic acid는 우수한 thrombin 저해활성을 나타내어, 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용한다는 결과를 통해 하고초의 혈전 형성 억제효능이 약재에 포함된 saponin 성분인 oleanolic acid 와의 관련성을 명확하게 하기 위해 연구가 필요할 것으로 보인다. 따라서 하고초를 향후에 혈전 질환의 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 동물모델에서의 깊이 있는 효능 연구와 관련 작용기전에 대한 체계적인 연구, 구성성분의 분석 및 함량 분석을 토대로 한 유효성분 도출 연구 등이 필요하며, 추출물의 적정 용량 산정 및 최적의 투여방법 개발, 안전성 평가 등의 연구도 지속적으로 이루어져야 할 것으로 판단된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>경제소득의 증가로 소비의 질이 향상되면서 고혈압, 동맥경화증, 고지혈증, 심근경색, 혈전증 등 선진국에서 전체 사망률의 \( 36 \sim39 \% \)를 차지하는 심혈관 관련질환이 증가하여 사회적으로 문제가 되어왔다. 최근 우리나라에서도 식생활의 선진화, 서구화가 됨에 따라 심혈관계질환으로 사망하는 인구수가 점차 증가추세에 있다.</p> <p>혈액은 혈장 및 혈구세포로 구성되어 신체 각 조직으로 산소와 영양분을 공급하고 세포 내 대사로 인해 생성된 노폐물들을 제거하여 각 조직의 항상성 유지에 중요한 역할을 담당하고 있다. 생체 내에서 혈액은 응고와 용해작용이 항상 평형을 이루고 있어 정상적인 상태에서는 출혈이나 혈전 등에 의해 흐름이 방해 받지 않는다. 그러나 혈관벽이 손상을 받게 되면 평형상태가 깨지고 혈액 중의 혈소판이 점착, 활성화, 응집되고 응고계 활성화가 일어나 급속한 혈전을 형성하게 된다. 혈전증은 혈관에 혈전이 쌓여 혈액의 흐름을 방해하여 세포 성장 장애 및 기능 장애를 유발시켜 뇌경색, 심근경색 등 여러 형태의 성인병을 일으키는 주요원인이다. 혈전이 정맥에서 생성되면 혈액순환장애가 야기되어 부종이나 염증이 발생하고, 동맥에서 발생하면 허혈이나 경색을 유발하여 동맥경화, 심근경색증, 뇌졸중 및 폐동맥 색전증 등의 심혈관계질환을 초래하게 된다. 혈전 초기 상처부위의 혈관 내피세포손상에 의해 혈소판이 점착, 활성화, 응집되면서 시작되며 혈액응고계를 활성화시키면서 촉진이 된다. 그 후 혈소판은 활성화되고 혈소판 내 ADP와 thromboxane \( \mathrm{A}_{2} \) ( \( \left.\mathrm{TXA}_{2}\right) \) 등이 분비되어 혈소판은 더욱 활성화되어 혈소판의 막에 존재하는 GP II b/IIla 수용체와 fibrinogen이 결합하여 혈소판 응고가 촉진된다. 혈소판이 활성화가 일어나면 serotonin, \( \mathrm{Ca}^{2+} \), \( \mathrm{TXA}_{2} \) 등을 유리하여 다른 혈소판의 응집을 증폭시키고, 혈장에 존재하는 coagulation factors와 반응하여 clot을 형성하게 된다. 이 단계를 거쳐 내인성 및 외인성 응고계 cascade활성으로 생성된 thrombin은 fibrinogen을 fibrin으로 전환시킨다. 혈소판 응집 반응과 혈액응고 반응은 동일 영역에서 신속하게 진행되는데, PT (prothrombin time)는 외인성 응고계에서 fibrin clot을 형성시킬 때까지의 시간을, APTT (activated partial thromboplastin time)는 내인성 응고계에서 fibrin clot을 형성시킬 때까지의 시간을 의미한다. 정상적인 상태에서는 활성화된 plasminogen, 즉 plasmin이 fibrin과 fibrinogen을 분해하여 혈전이 용해되고 정상 혈관으로 회복되지만, 비정상적인 상태에서는 혈전증을 유발하게 된다.</p> <p>하고초(Prunella vulgaris Linné)는 신농본초경에 수재되어 있는 한약재로 예부터 화농성피부질환이나 다리부종 등의 치료약으로 사용되어 왔으며, 민간요법으로는 폐결핵, 황달, 고혈압의 치료로 사용되어왔다. 성분으로는 전초로부터 oleanolic acid, ursolic acid, rutin, hyperoside, cis-caffeic acid 및 trans-caffeic acid, vitamin, carotenoid, tannin, organic acid 등이 보고되었고, 꽃으로부터 ursolic acid뿐 아니라 delphinidin과 cyanidin의 glycoside, d-camphor, d-fenchone 및 fenchyl alcohol 등이 보고되었으며, 지상부로부터 sterol (aspinasterol, stigmast-7-en-3]-ol)과 각종 ursane 및 oleane계 triterpenoid들이 보고되어 있다. 최근까지의 생리활성연구로는 항 HIV (human immunodeficiency virus), 항염증, 항알러지, 항산화, 항HSV (herpes simplex virus), 항돌연변이 등이 보고되고 있다. 그러나 현재 항혈전 활성에 대해서는 알려진 바가 없어 본 연구에서는 하고초의 항혈전 효능을 탐색하기 위하여 혈전 반응에 대한 하고초의 물 추출물의 활성 연구를 진행하였다. 이를 위해 혈전 용해 활성, 혈액 응고시간 지연효과, 혈소판 응집억제활성 등을 통해 항혈전 효능을 평가하였다.</p>	생명
형질 전환된 Saccharomyces cerevisiae의 leucocin A 향균 활성도에 대한 탄소원의 영향	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주, 배양 배지 및 성장곡선</h2> <p>균주는 발현 플라스미드 pAUR Leuco A를 lithium acetate법에 의해 효모 세포(Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763)에 형질 전환 하여 사용 하였다. 효모의 배양을 위한 배지 조건은 \(2\%\) polypeptone, \(1\%\) yeast extract로 고정한 후, 다양한 탄소원(fructose, glycerol, glucose, sucrose)을 \( 2 \% \) 로 사용하여 배양하였다 \( \left(30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \). Leucocin A를 생산하는 형질 전환된 효모는 전 배양을 aureobacidine A (Takara, Japan)의 최종 농도가 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 가 되도록 첨가된 \( 5 \mathrm{ml} \) 배지에서 실시하였다. 전배양이 대수 증식기(OD600 7.5에서 8)에 도달했을 때 탄소원이 각각 다른 \( 50 \mathrm{ml} \) 에 본 배양 시켰다. 균주가 대수 증식기에 있을 때 subculture 하였다. 시간에 따른 형질 전환된 효모 균주의 성장 양상을 UV spectrophotometer \( OD600 \mathrm{~nm}) \) 을 이용하여 측정 하였고 Bacillus subtilis (ATCC 6633)을 LB 배지 \( (0.5 \% \) yeast ex-tract, \(1 \% \mathrm{NaCl}\), \(1 \%\) bacto tryptone)에 배양 시켜 \( ( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) ) 항균 활성을 알아보았다.</p> <h2>총 분비 단백질량과 단백질 분해효소 활성 측정</h2> <p>배양 시료률 원심분리 \( (6000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}) \) 하여 얻은 상층액을 이용하여 총 분비단백질(Bradford assay, Bio-rad, USA) 단백질 분해효소 및 항균활성을 구하였다. Protease 활성 추정을 위해 상층액 \(200 \mu \mathrm{l}\)와 \( 1 \% \) casein \( (0.2 \mathrm{~M} \) Tris-HCl buffer, \( \mathrm{pH} \) 5.8) 용액 \(200 \mu \mathrm{l}\)를 섞은 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 반응시켰다. 이후 \( 0.4 \mathrm{M} \) trichloroacetic acid (TCA) \( 600 \mu \mathrm{l} \)을 섞어 5 분간 반응시키고 원심분리 \( (6000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}) \) 하여 상층액의 광학밀도를 측정하였다 \( (OD280 \mathrm{~nm}) \).</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 원심분리\( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 6000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}\right) \) 한 후 cell pellet을 제외한 상층액을 이용하여 항균활성을 촉정하였다. 먼저 탄소원을 달리한 시료의 상등액을 이용, 액체 배지에서 항균 활성을 측정 하였다. 상등액 \(250 \mu \mathrm{l}\)와 멸균수 \( 450 \mu \mathrm{l},4 \times \) 배지 \(250 \mu \mathrm{l}\)에 B. subtilis \(50 \mu \mathrm{l}\)를 접종 한 뒤, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\) 에서 접종 직후와 접종 후 12 시간 배양한 뒤 \( OD600 \mathrm{~nm} \) 를 측정하여 배양 전후의 광학밀도 차를 계산하였다.</p> <h1>결과 및 토의</h1> <h2>형질 전환체의 시간에 따른 성장속도</h2> <p>Fig. 1은 탄소원에 따른 재조합 효모의 성장 속도를 비교한 결과이다. 광학밀도는 4 가지 탄소원을 유지하는 배지의 모두에서 15 시간까지 증가하였는데 이는 15 시간까지 대수적으로 증식한 후, 서서히 정체기와 사멸기로 접어든 것으로 샤료 된다. Fig. 1은 탄소원에 따른 세포증식을 확인한 것으로 sucrose>glycerol>glucose>fructose 순으로 세포 증식이 높을 것으로 확인되었다. 특히 sucrose가 포함된 배지에서 배양 15 시간 경과 시 세포밀도는 glucose를 유지하는 배지에서 배양한 경우에 비해 \( 18 \% \) 높게 측정되었다. Lipase 유전자가 포함된 pWI3proROL 벡터로 형질전환된 S. cer-evisiae의 경우 24 시간 이후에 정지기에 접어 든 결과와 비교하면, 본 연구에서는 일찍 정지기에 접어드는 것을 알 수 있었고 최대 광학밀도 \( (OD600 \mathrm{~nm}) \) 도 본 연구가 더 높았다. 본 연구에서는 Matsumoto 등과는 다른 다양한 탄소농도를 이용, polypeptone이 함유된 배지를 사용한 점과 군주의 차이에 의해 증식속도에 차이가 난 것으로 사료되었다.</p> <h2>탄소원에 따른 형질 전환쳬의 총 분비 단백질 및 단백질분해효소 분비율 측정</h2> <p>Fig. 2A는 leucocin A 형질 전환체를 탄소원에 따른 총 분비 단백질량을 나타낸 것으로, glycerol을 제외한 탄소원에서 배양하는 경우 배양 15 시간에 총 분비 단백질량(total secreted protein)이 최대로 측정되었다. 총 분비 단백질량은 sucrose에서 배양하는 경우가 가장 높았고 fructose에 배양하는 경우 가장 낮게 확인되었다. Sucrose에서 배양한 경우 glucose에 배양한 경우에 비하여 총 분비 단백 질량이 약 \( 7.9 \% \) 증가하였다.</p> <p>Fig. 2B는 leucocin A 형질 전환체의 탄소원에 따른 단백질분해효소 분비율을 나타낸 것으로 sucrose를 사용한 경우 배양 초기부터 완만하게 감소하여 15 시간에 가장 낮은 단백질 분해효소 분비율을 보였고 15 시간 이후 전체적으로 완만하게 상승 하였다. Fructose와 glycerol, 그리고 glucose를 사용한 경우는 0 시간부터 12 시간 까지 비슷하게 진행되었고 15 시간을 기점으로 이들 모두가 급격히 감소했지만 특히 glycerol을 사용한 경우는 단백질 분해 효소 분비율이 급감하였으며, 18 시간 이후부터 glycerol과 fructose를 사용한 경우에 비슷하게 진행 되었다. 그러나 glucose를 사용한 경우 15 시간 까지 계속적으로 감소되다 15 시간 이후 급격히 상승 하는 것을 볼 수 있었다. 탄소원으로써 glucose를 사용한 경우 단백질 분해 효소 분비율의 급격한 상승은 Lee 등의 논문과 같은 결과를 가졌다. 따라서 이 결과는 leucocin A 형질 전환체의 다양한. 탄소원 사용 시 총 분비 단백질이 증가하고 동시에 단벅질분해효소 분비의 감소를 의미했다. Lee 등의 결과에서도 총 분비 단백질의 증가와 동시에 단백질 분해 효소 분비율의 감소와 같이 유사한 형태가 나타났다. 이는 균체의 성장이 최고조에 이른 15 시간까지는 배지의 영양분을 이용하였고, 이후 영양분 고갈에 따른 세포파괴와 살이있는 세포에서의 단벡질 분해효소 분비의 양이 증가하는 것으로 사료된다.</p> <h2>항균 활성 측정</h2> <p>Leucocin A 형질전환체를 다양한 탄소원에서(fructose, glycerol, glucose, sucrose) 배양한 후 배양시간 별로 수집된 배양액의 항균 활성(antibacterial activity)을 측정하기 위하여 B. subtilis를 대상으로 성장정도를 광학밀도로 측정하였다 \( \left(30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~rpm}, 12 \mathrm{~h}\right) \). Fig. 3은 leucocin A 형질전환체와 대조긴의 배양 시간 별로 수집된 배양액의 상등액이 포함된 배지에서의 B. sub-tilis 성장 저해를 나타낸 것이다. Leucocin A 형질 전환체가 대조군에 비하여 성장이 현저히 억제 되었다는 것을 알수 있었고, 탄소원 모두 15 시간에 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 또한 sucrose과 glucose에서 각각 2 시간 배양 하였을 때 \( 29.6 \% \) 와 \( 29 \% \) 의 성장저해로 항균 활성이 관찰 되었고 15 시간 경과 시에는 각각 \( 72.6 \% \) 와 \( 65.5 \% \) 의 성장저해로 항균 활성이 관찰 되어 sucrose를 탄소원으로 시용하였을 경우 항균 활성이 가장 높은 것을 알 수 있었다.</p> <p>인간은 오랜 시간 동안 식품의 저장성을 높이기 위해 음식물의 변질을 막는 다양한 방법들을 시도 해오고 있다. 가열, 동결 및 건조 등과 같은 물리직인 방빕 외 미생물의 발효에 의한 방법, 식품의 산성화나 소금이나 실탕에 의한 절임 방법 및 다양한 화학 합성 방부제 첨가 등의 방법들을 사용하고 있다. 화학 합성 방부제의 사용은 자체 독성 때문에 사용량이 제한되고 있고 이용범위가 좁을 뿐만 아니라, 소비자들이 기피하고 있는 실정이다. 따라서 이를 해결하고자 하는 딶은 연구들이 있었다.</p> <p>Bacteriocin은 미생물이 생산하는 천연의 항균 물질로서, 무독성 방부제로 사용이 가능하다. Bacteriocin은 단벽질 또 는 단백질과 탄수화물의 복합체로 구성되어 있가 때문에 인쳬로 섭취될 시 단백질 가수 분해 효소에 의해서 분해되어 인체에 무해하고 잔류성이 없다는 점에서 친연방부제로서의 효용성이 증대되고 있다. 고온 살균 처리가 불가능한 어육 연제품에의 적용과 발암원에 대한 저항성등이 보고되고 있으며, 기타 여러 가지 작용도 최근 밝혀지고 있다.</p> <p>기존 항생제가 2차 대사산물인데 반하여 bacteriocin은 자신의 유전자로부터 직접 생합성(ribosomal translation)되기 때문에 직접적인 유전자 조작에 의해 생물 공학적 응용이 가능하다. Bacteriocin의 분자량은 일반직으로 \( 4-6 \mathrm{kDa} \) 로, 소수성(hydrophobicity)이며, 20개 정도의 아미노산으로 구성되어 있다. 살균 혹은 정균기작은 추로 상대 균주의 세포막에 이러한 소수성 분사가 작용하여 생리적 기능을 파괴함으로써 이루어지는 것이 특징이다. 세포막에 bacter-iocin이 작용한다는 속성은 bacteriocin의 산업적 용용에 있어서 장점으로 작용될 수 있다. 또한 bacteriocin은 그 자체가 고온에서의 활성을 유지하고 광범위한 \( \mathrm{pH} \) 에서의 안정성과 무독, 무색, 무취의 성질을 가지고 있다.</p> <p>대표적인 bacteriocin인 nisin은 미국의 FDA에 의해 식품 첨가분로서의 안정성을 인정반았기 현재 구미를 비롯한 47개국에서 식품 첨가제로 이용 되고 있다. 그러나 nisin은 매우 고가이기 때문에 식품에 응용하기에는 다소 무리가 있는 것이 사실이다. 또한 bacteriocin을 생산하는 대부분의 박테리오신 균주는 유산균을 사용하여 생산되고 있어서 부산물에 의한 식품의 풍미를 변화 시킬 수 있다는 치명적인 약점을 안고 있으며 대장균 동의 원핵생물을 이용하여 생산하 는 과정에서 bacteriocin에 의한 숙주의 성장저해가 나타날 수 있다. 이 점에 착안하여 bacteriocin의 일종인 leucocin A 유전자를 효모에서 발현 시켰다. 효모에서 생산되는 bac-teriocin은 효모의 성장을 저해 하지 않으면서 세포막에서 분비되게 하였으므로 정제 또한 용이한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 미생물 배양 시 carbon source가 단백질 생산에 중요한 요소임에 착안하여 leucocin A를 분비하는 효모의 생산 수율을 향상시키기 위한. 다양한 조건 중 carbon source에 의한 생산 번화를 살펴보았다.</p>	생명
레스베라트롤에 의한 인간 암세포주, A549와 SKOV3의 p53의존적 Apoptosis 유발	<h2>부착성 상실 세포사멸 실험(anoikis assay)</h2> <p>Anoikis assay는 CytoSelect 96 -well anoikis assay kit (Biolab Diagnostics, South Africa)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. Resveratrol을 농도별로 포함하는 medium에 A549, SKOV3 세포를 부유시킨 뒤, 각 well 당 \( 0.5 \times 10 ^ { 5 } \) 으로 hydrogel이 코팅된 96-well plate에 분주했다. Resveratrol 처리 48 시간 후, 각 well에 MTT reagent를 첨가하고 3 시간 반응시킨 뒤, detergent solution를 첨가하였다. 3 시간 배양 후, infinite reader를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>siRNA를 이용한 p53 유전자 일시적 침묵</h2> <p>A549 세포에서 siRNA transfection은 p53에 특이적인 siRNA (p53 siRNA)와 양성대조군인 scrambled control siRNA (control siRNA)를 이용하여, 각각의 siRNA를 lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA)과 섞어 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. Transfection시킨 뒤, resveratrol을 농도 별로 48 시간 처리하였고, 단백질 발현 분석을 통해 siRNA의 효율성을 검증하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>각 실험조건에 따라 resveratrol을 농도 별로 처리한 A549, SKOV3 세포를 lysis buffer에 용해한 뒤, \( 15,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리 하여 상층액에 있는 전체 단백질을 얻었다. \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 가열하여 sample을 얻었고 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel에 의해 분리시켰다. 분리된 단백질을 Nitrocellulose membranes 에 전달시킨 뒤, TBST에 용해시킨 5 \% non-fat skim milk를 이용하여 blocking하였다. 그 후, 1 차 항체를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 후, enhanced chemiluminescence reagent (GEHealthcare, UK)를 membrane에 도포하고 X-ray film에 노출시켜 시각화하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Resveratrol이 A549, SKOV3 세포의 생존과 성장에 미치는 영향</h2> <p>Resveratrol이 A549, SKVO3 세포의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 시행하였다. Resveratrol 을 농도 별 \( (0,20,40,60,80,100 \mu \mathrm { M } ) \) 로 각각 24,48 시간 처리한 후 세포 생존율을 측정한 결과, resveratrol은 A549 세포의 생존을 농도, 시간의존적으로 억제하였다. 반면에 SKOV3 세포의 생존에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 1A, B). Resveratrol이 세포의 성장에도 영향을 미치는지 알아보기 위해, BrdU incorporation assay를 시행하였다. 그 결과 A549 세포의 증식 비율은 resveratrol 처리 농도에 따라 점차적으로 감소하였다. 반면에 SKOV3 세포의 증식에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 1C). 이러한 결과를 통해 resveratrol이 농도 의존적을 A549 세포의 생존과 증식을 억제하고, SKOV3 세포에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.</p> <h2>P53 knock-down(유전자 기능의 불완전 소실)에 의한 resveratrol의 A549세포 증식억제 및 caspase발현조절효과</h2> <p>위 실험들을 통해 resveratrol이 A549 세포의 apoptosis를 유도한다는 것과 반면에 SKOV3 세포에는 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 알아냈다. P53은 apoptosis를 유발하는 것으로 잘 알려져 있으므로, 이러한 결과가 p53 유전자 발현에 의존한 것인지 알아보기 위해 정상적인 p53 유전자를 가지는 A549 세포에 siRNA를 이용하여 일시적으로 p53 유전자의 발현을 억제시켰다. P53 유전자가 확실하게 억제되었음을 확인한 후(Fig. 4A), p53 유전자가 억제된 세포에 resveratrol을 농도별 \( (0,40,100 \mu \mathrm { M } ) \)로 48시간 처리하여 pro-caspase3의 발현량을 확인하였다. 그 결과 resveratrol 처리에 의한 pro-caspase3의 발현량에 변화가 없었다(Fig. 4B). 또한 p53 유전자가 억제된 A549 세포의 생존율과 성장률 모두 변화가 없었다(Fig. 4C,D). 반면 control siRNA를 처리한 세포는 상기의 결과들과 동일하게 세포생존과 증식 모두 resveratrol 처리농도에 따라 감소하였다. 이러한 결과는 resveratrol에 의한 A549 세포의 생존 및 증식억제 효과는 p53 유전자에 의존한다는 것을 보여준다. 결론적으로 본 연구에서는 resveratrol에 의해 유도된 A549 세포의 증식억제 및 apoptosis 유도 효과는 p53 유전자에 의존적임을 SKOV3 세포와의 비교를 통해 알아냈고, 또한 세포가 부유상태일 때는 억제 효과가 나타나지 않는다는 것을 보여준다. 본 연구 결과는 A549 폐암세포에서 resveratrol의 항암효과에 대한 기전을 밝히는데 기여할 수 있다고 사료된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>Resveratrol은 포도, 오디, 땅콩과 같은 많은 과일과 채소에 존재하는 폴리페놀 화합물로써 다양한 생물학적 효과를 가진다고 보고되어 있다. 그러나, resveratrol이 A549 폐암세포에서 유도하는 apoptosis에 관여하는 분자적 기전 및 anoikis에 관해서는 명백하게 밝혀지지 않았다. 본 연구에서, 우리는 정상적인 p53 유전자를 갖는 A549 세포에서 resveratrol의 효과를 조사하고, p53 유전자가 결실된 SKOV3 난소암세포와 그 효과를 비교했다. Resveratrol은 확실하게 SKOV3 세포에 비해 농도, 시간의존적으로 A549 세포의 생존과 증식을 억제했다. 또한 resveratrol은 A549 세포의 apoptosis를 유도했지만 세포의 anoikis 저항성에는 영향을 미치지 않았다. 더불어, p53 유전자 기능이 불완전 소실된(knock-down) A549 세포의 생존과 증식은 resveratrol에 의해 변하지 않았다. 그러므로, 본 연구의 결과는 resveratrol의 항암 효과가 기능을 하는 p53 유전자의 존재에 의존한다는 것을 보여준다. 결론적으로, 우리는 resveratrol이 p53 유전자에 의존적으로 A549 세포에 대해 항암효과를 가진다는 것을 입증했다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>A549 세포는 wild-type의 p53 유전자를 가지고 있는 폐암 세포주이며 SKOV3는 p53 유전자가 결실된 자궁암 세포주이다. A549, SKOV3 세포는 한국 세포주 은행(KCLB)으로부터 분양받았고, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) penicillin 그리고 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin을 포함하는 RPIM- 1640 배지에 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 가 공급되는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 배양하였다. 배양 중인 세포의 배지는 2-3일에 한번 새로운 배지로 교체해주었다.</p> <h2>세포 생존율 측정(MTT assay)</h2> <p>A549, SKVO3 세포를 96-well plates에 각 well 당 \( 4 \times 10 ^ { 3 } \) 으로 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 의 medium과 함께 분주하고 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 가 공급되는 incubator에서 24 시간 동안 배양한 후, 각 well 마다 resveratrol을 \( 20,40,60,80,100( \mu \mathrm { M } ) \) 농도로 처리하고 24,48 시간 배양하였다. Control group에는 resveratrol을 넣지 않고 동일한 양의 DMSO를 넣었다. 배양 후 medium을 제거하고 \( \mathrm { MTT } (0.4 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 를 \( 20 \mu \mathrm { l } / \) well 넣고 incubator에서 3 시간 배양한 뒤 iso-propyl alcohol을 \( 100 \mu \mathrm { l } / \mathrm { well } \) 넣어 생성된 formazan을 용해시킨 뒤, infinite reader를 이용하여 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정했다. 측정값은 3 번은 반복하여 평균값으로 얻었다.</p> <h2>세포사멸 검출</h2> <p>A549, SKOV3 세포를 chamber slide (Lab-Tak II chamber slider system, USA)에 각 well 당 \( 4 \times 10 ^ { 4 } \) 로 분주한 뒤 24 시간 동안 부착시키고, resveratrol을 각 농도 별로 처리 후 48 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 \( 4 \% \) para-formaldehyde로 상온에서 10 분간 세포를 고정시킨 후, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUNEL) assays는 Red in situ apoptosis Detection kit (Millipore Corporation, MA, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. DAPI로 DNA를 대조 염색한 후, 형광현미경을 이용하여 각 농도에 따른 핵의 형태를 관찰 하였고, 무작위적으로 5 개의 필드를 선택하여 평균치를 구하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>암은 전세계적으로 인류의 건강과 생명을 위협하는 사망률이 높은 질병 중 하나이며, 암 관련 사망자의 수는 향후 50년간 2배 증가할 것으로 예상된다. 따라서 암 치료를 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있고, 최근 프로그램된 세포 죽음을 표현하는 용어인 세포자멸사(apoptosis)에 대한 분자 기전연구가 활발히 진행되고 있다. Apoptosis는 세포 스스로 조절이 가능한 능동적 과정이지만, 암세포의 경우 apoptosis에 대한 저항성을 갖기 위해 세포 내 다양한 분자기전 교란을 일으킴으로써 항암제에 대한 저항성을 가질 수 있다. Anoikis는 apoptosis의 아류형이며 부적절한 세포 부착 혹은 부착의 손실에 의해 일어난다. 일반세포는 부착되지 않은 상태에서 생존하지 못하고 Anoikis라는 세포 사멸과정을 거치게 되는데 이에 반해, 암세포의 경우 부착되지 않은 상태에서도 spheroid 형태를 형성하여 성장할 수 있으며, 생체 내에서 혈류를 통해 다른 기관으로 이동할 수 있으므로, 암세포의 Anoikis 저항성은 세포의 전이능력과 연관성이 있다.</p> <p>Resveratrol은 자연계에 널리 존재하는 폴리페놀류의 한 종류이며 와인, 땅콩, 오디 등의 식품에 함유되어 있다. 또한 백혈병과 전립선암, 유방암과 같은 다양한 상피암종의 세포증식 억제 효과를 가진다고 보고되었다. 이러한 효과는 세포주기의 억제와 apoptosis 유도를 통해 나타나며, 이 과정에서 p53 유전자가 관여한다고 보고된 바 있다. 종양억제유전자로 널리 알려진 p53의 돌연변이는 인간암세포에서 흔히 관찰되고 정상적인 p53은 FAS, Bax,Bcl-2 등 다양한 apoptosis 관련 유전자들의 발현을 조절함으로써 apoptosis를 유발한다. 최근 항암효과를 가지는 다양한 천연소재에서 apoptosis를 조절하는 중요한 메커니즘을 규명하는 연구가 꾸준히 이루어지고 있으며, 이전의 연구는 resveratrol이 A549 세포의 성장을 억제하고 apoptosis를 유도하는 등의 항암효과를 가진다는 것을 보고한 바 있다. 그러나, resveratrol이 정상적인 p53 유전자를 가지는 A549 세포의 anoikis 저항성에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구와 p53 유전자가 결실된 SKOV3 세포와의 차이점에 대해서는 보고된 바 없다.</p> <p>그러므로 본 연구에서는 resveratrol이 A549 폐암세포와 SKOV3 자궁암세포의 생존 및 사멸에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고 또한 이러한 과정에서 p53이 관여하는 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 resveratrol은 Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, MO, USA)에서 구입하였고 dimethyl sulfoxide (DMSO, \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) ) 에 용해한 뒤 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하였다. p53 small interfering RNA (siRNA), 대조군 siRNA, beta-actin antibody는 Santa cruz biotechnology사(CA, USA)에서 구입하였다. Pro-caspase3, p53 antibodies는 Cell signaling technology사(MA, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>Resveratrol이 A549 세포의 apoptosis에 미치는 영향</h2> <p>다음으로, resveratrol이 A549, SKOV3 세포의 apoptosis를 유도하는지 조사하였다. Resveratrol을 농도 별 \( (0,40 \), \( 100 \mu \mathrm { M } ) \) 로 48 시간 처리 후, 세포의 핵에 염색되어 형태적 변화를 관찰할 수 있는 DAPI 염색과 DNA의 분절여부를 파악할 수 있는 TUNEL 염색을 시행하였다. 그 결과, A549 세포에서는 DAPI에 의해 염색된 세포의 수가 확실하게 감소하였다는 것을 관찰할 수 있었고, TUNEL에 의해 염색된 세포는 resveratrol 처리 농도에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 반면에, SKOV3 세포에서는 TUNEL에 의해 염색된 세포가 거의 없는 것으로 나타났고 염색된 세포의 형광강도와 면적 또한 현저히 적었다(Fig. 2A-B). Resveratrol에 의해 유도된 세포 apoptosis 비율을 확인하기 위해, TUNEL에 염색된 세포/DAPI에 염색된 세포의 비율을 분석한 결과resveratrol을 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 의 농도로 처리하였을 때, 확실하게 apoptosis가 일어난 A549 세포의 비율이 증가했다는 것을 확인하였다(Fig. 2C). 이러한 결과들을 통해 A549 세포에서 resveratrol의 생존억제 효과는 apoptosis 유도와 연관성이 있다고 보여지며, SKOV3 세포에서는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보여진다. 세포와 세포 외 기질과의 결합이 끊어질 때, 정상 세포는anoikis에 빠지게 되어 대부분의 세포가 죽는 반면 암세포는 고착 비의존성 성장(anchorage-independent growth)을 함으로써 부착할 수 있는 기층(substratum) 없이 생존이 가능하다. 그러므로 우리는 resveratrol이 A549, SKOV3 세포의 anoikis 저항성에 영향을 미치는지 조사하기 위해 resveratrol을 농도별로 48시간 처리한 후 anoikis assay를 시행하였다. 그 결과 두 가지 세포 모두에서 resveratrol에 의한 anoikis 유도 효과가 없었다(Fig. 2D). 이러한 결과는 resveratrol이 A549 세포가 부착상태일 때는 apoptosis를 유도 하지만 부유상태일 때는 세포생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 또한 이러한 결과는 resveratrol이 일차 종양세포의 증식은 억제하지만, 전이과정에서 다른 기관으로 이동하는 세포의 증식을 억제하는 효과는 없다는 것을 의미한다.</p> <h2>Resveratrol이 apoptosis 관련 단백질의 발현에 미치는 영향</h2> <p>Caspases는 세포내에서 불활성화된 proenzyme의 형태로 존재하여 세포사멸 신호에 의해 분절되어 활성화 된다. 그 중 caspase3는 apoptosis 유발인자들에 의해 caspase cascade가 일어나면 다른 caspase에 의해 활성화되며, apoptosis 유도의 최종 단계에서 중 중요한 역할을 하는 effecter caspase이다. 그러므로, resveratrol을 A549 세포에 처리했을 때 농도의존적으로 apoptosis가 유도되는 현상의 분자적 기전 분석을 위하여 pro-caspase3 단백질의 발현 변화를 western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, A549 세포에서 resveratrol에 농도가 증가함에 따라 pro-caspase3의 발현이 억제되었고, SKOV3 세포에서는 변화가 없었다(Fig. 3A-B). pro-caspase3의 발현량의 감소로 A549 세포의 apoptosis 유도 효과에 caspase3가 관여한다는 것을 확인하였다.</p>	생명
9-hydroxypheophorbide-a와 660 nm 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료의 항암효과와 치료기전에 대한 연구	<h2>이종이식된 종양의 광역학치료</h2><h3>세포주의 이종이식</h3><p>Nude mouse의 등에 피하로 \( 30 \mathrm{G} \) 인슐린 주사기를 이용하여 \( 10^{7} \mathrm{cells} / 100 \mu \mathrm{l} \)의 두경부 평편상피암세포주를 주입하고 종양의 형성유무를 관찰하고 1주 간격으로 종양의 부피를 측정한 결과 1주 후 \( 34.3 \pm 24.2 \mathrm{mm}^{3} \)로 28마리 nude mouse 모두 종양이 형성됨을 확인하였다. 종양의 크기는 2주 후 \( 82.9 \pm 40.1 \mathrm{mm}^{3}\), 3주 후 \( 171.1 \pm 67.9 \mathrm{mm}^{3} \) 그리고 4주 후 \( 352.9 \)\( \pm 126.8 \mathrm{mm}^{3} \)로 시간이 지남에 따라 종양부피의 증가를 확인하였다.</p><h3>종양의 광역학치료</h3><p>제1군: 정상대조군: 광역학치료전 종양의 크기가 \( 335.0 \pm 141.4 \mathrm{mm}^{3} \)에서 광역학치료 1주 후 \( 402.3 \pm 190.4 \mathrm{mm}^{3} \), 2주 후 \( 439.7 \pm 99.8 \mathrm{mm}^{3} \), 3주 후 \( 733.7 \pm 199.9 \mathrm{mm}^{3} \), 4주 후 \( 792.0 \pm 244.2 \mathrm{mm}^{3} \)로 종양의 크기가 4마리 모두 지속적으로 증가하였다. 또한 2주 후부터 종양의 중심부위에 조직의 괴사가 일어나기 시작하였고 종양의 바깥부위는 지속적인 종양의 성장을 관찰할 수 있었다.</p><p>제2군: 9-HpbD-a만 중양에 투여군: 9-HpbD-a만 종양에 투여한 2군에서는 9-HpbD-a 투여 시 종양의 크기가 \( 364.8 \pm 75.8 \mathrm{mm}^{3} \)에서 광역학치료 1주 후 \( 393.7 \pm 154.7 \mathrm{mm}^{3}\), 2주 후 \( 519.8 \pm 298.1 \mathrm{mm}^{3}\), 3주 후 \( 651.3 \pm 211.9 \mathrm{mm}^{3}\), 4주 후 \( 830.5 \pm 201.0 \mathrm{mm}^{3} \)로 종양의 크기가 4마리 모두 제1군인 정상대조군과 같이 지속적으로 증가하였다. 정상대조군과 같은 양상으로 2주 후부터 종양의 중심부위에 조직의 괴사가 일어나기 시작하였고 종양의 바깥부위는 지속적인 종양의 성장을 관찰 할 수 있었다.</p><p>제3군: 레이저만 종양에 조사한군: \( 660 \mathrm{nm} \) diode laser만을 종양에 조사한 실험군에서는 총 4마리의 nude mouse 중 3마리의 nude mouse는 치료가 되지 않았고 1마리의 nude mouse는 재발되었다. 치료가 되지 않은 종양의 크기는 치료 전 종양의 크기가 \( 428.0 \pm 48.5 \mathrm{mm}^{3} \)에서 치료 1주 후 \( 888.9 \pm 372.5 \mathrm{mm}^{3}\), 2주 후 \( 1051.7 \pm 213.9 \mathrm{mm}^{3} \), 3주 후 \( 1260.2 \pm 479.5 \mathrm{mm}^{3}\), 4주 후 \( 1142.7 \pm 389.0 \mathrm{mm}^{3} \)로 종양의 크기가 4주까지 지속적으로 증가하였고 4주 이후 종양의 크기가 감소하였다. 재발된 종양조직은 치료 전 종양의 크기가 \( 428.0 \mathrm{mm}^{3} \)에서 치료 1주 후 \( 140 \mathrm{mm}^{3}\), 2주 후 \( 27 \mathrm{mm}^{3} \), 3주 후 \( 0 \mathrm{mm}^{3} \)로 종양이 완치되는 것 같았으나 4주 후 \( 12 \mathrm{mm}^{3} \)로 새로운 종양의 형성을 확인할 수 있었다.</p><p>제4군: 광역학치료군: 9-HpbD-a와 \( 660 \mathrm{nm} \) diode laser를 이용하여 광역학치료를 시행한 실험군에서 2마리의 nude mouse에서 치료가 되지 않았고 종양의 크기는 광역학치료전 \( 429.0 \pm 85.5 \mathrm{mm}^{3} \)에서 광역학치료 1주 후 \( 721.2 \pm 454.6 \mathrm{mm}^{3}\), 2주 후 \( 812.1 \pm 411.4 \mathrm{mm}^{3}\), 3주 후 \( 907.1 \pm 353.6 \mathrm{mm}^{3}\), 4주 후 \( 629.5 \pm 262.1 \mathrm{mm}^{3} \)로 종양의 크기가 4주까지 지속적으로 증가하였고, 4주 이후 종양의 크기가 감소하였다. 그리고 4마리의 nude mouse 종양에서 재발을 확인하였는데 종양의 크기가 광역학치료 전 \(428.4 \pm 37.4 \mathrm{mm}^{3} \)에서 광역학치료 1주 후 \( 157.3 \pm 104.4 \mathrm{mm}^{3}\), 2주 후 \( 114.7 \pm 86.5 \mathrm{mm}^{3}\), 3주 후 \( 0 \mathrm{mm}^{3} \)로 종양이 완치되었으나 4주 후 \( 84.4 \pm 70.2 \mathrm{mm}^{3} \)로 새로운 종양의 형성을 확인할 수 있었다. 광역학치료 후 10마리의 nude mouse가 완치되었으며 종양의 크기는 광역학치료 전 \( 475.7 \pm 38.2 \mathrm{mm}^{3} \)에서 광역학치료 1주 후 \( 442.4 \pm 180.2 \mathrm{mm}^{3}\), 2주 후 \( 185.6 \pm 116.3 \mathrm{mm}^{3} \), 3주 후 \( 76.8 \pm 107.6 \mathrm{mm}^{3}\), 4주 후 \( 0 \mathrm{mm}^{3} \)로 종양의 크기가 점차 줄어들었다. 종양의 치료 중 특별한 독성반응은 보이지 않았고 치료 중에 온도센서를 이용하여 측정한 종양내의 온도는 평균 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)이었다. <h2>세포사멸 분석</h2><h3>괴사세포와 고사세포 염색</h3><p>광역학치료에 의한 세포사멸기전을 확인하기 위하기 Hoechst 33342 (Sigma, USA)와 Propidium iodide (PI: Sigma,USA) 염색법을 이용하였다. 6 well plate에 24시간 동안 배양한 세포에 광감작제(\(0.15 \mu \mathrm{g/ml}\)) 또는 \(0.29 \mu \mathrm{g/ml}\)) \(100 \mu \mathrm{l}\) 를 세포배양 배지로 희석하여 첨가하고 6시간 후 \(660 \mathrm{nm}\) diode laser (\(400 \mathrm{mW}\), \(30\mathrm{min}\))를 조사하였다. 레이저조사를 마치고 바로, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 24시간 후 각각의 well에 Hoechst 33342용액(\(0.5\mathrm{mg/ml}\), Sigma)과 PI용액(\(0.5\mathrm{mg/ml}\), Sigma)으로 염색 후 형광현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 \(330 \sim 385 \mathrm{nm}\)의 UV 영역에서 세포를 관찰하였다. 세포계수는 200배의 배율에서 5곳의 영역을 관찰한 평균값을 결과로 사용하였다.</p><h3>투과전자현미경</h3><p>광감작제 \( (0.15 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 또는 \( 0.29 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)와 \( 660 \mathrm{nm} \) diode laser \( (400 \mathrm{mW}, 30 \mathrm{min}) \)를 이용하여 광역학처치 6시간 후 cell scraper (Sarstedt, USA)를 이용하여 세포를 배양 flask에서 분리하여 \(2.5\%\) glutaraldehyde solution (Yakuri, Japan) \( 1\mathrm{ml} \) 를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 전고정 하였다. 후 고정을 \( 1 \% ~\mathrm{OsO}_{4} \) 실시하였다. 그리고 \( 2 \% \) agarose gel을 첨가하여 agarose block을 만들고 탈수과정과 침투, 포매, block trimming, semi-thin section, thin section, 전자염색을 통해 관찰하였다.</p><h2>이종이식된 종양의 광역학치료</h2><h3>세포주의 이종이식</h3><p>배양된 SNU-1041 세포주를 hemocytometer를 이용하여 세포의 수를 \( 10^{8} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 만들었다. 그리고 30 gauge\( (\mathrm{G}) \)인 슐린 주사기로 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 누드마우스의 등에 피하로 주입 후 종양의 형성유무를 관찰하고 1주 간격으로 종양의 부피를 측정하였다.</p><h3>종양의 광역학치료</h3><p>누드마우스에 이종이식된 종양의 크기가 약 \( 400 \sim 600 \mathrm{mm}^{3} \)에 도달하였을 때, 제 1군 \( (\mathrm{n}=4) \)은 정상 대조군으로 종양에 아무런 처치도 하지 않았고 제 2군 \( (\mathrm{n}=4) \)은 9-HpbD-a으로만 치료한 군으로서 \( 30 \mathrm{G} \) 인슐린 주사기를 먼저 종양 중심부에 넣고 주위조직으로 여러번 반복시켜 광감작제가 고루 퍼질 수 있는 경로를 확보한 후 DPBS용액으로 희석한 9-HpbD-a (\(9.38 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 일정한 압력으로 서서히 종양내에 주입하였다(fanning technique). 제 3군 \( (\mathrm{n}=4) \)은 레이저 치료만을 시행한 군으로서 다이오드 레이저의 diffuser tip을 종양 중심부와 기저부에 삽입 후 각각 10분씩 평균 \( 0.96 \mathrm{J} / \mathrm{mm}^{3}(400 \mathrm{mW}) \)의 에너지를 조사하였다. 제 4군 \( (\mathrm{n}=16) \)은 상기한 방법으로 9-HpbD-a 를 종양 내 투여하고 6시간 후 레이저 조사를 시행한 광역학치료군이었다. 레이저 조사 시에는 온도센서를 이용하여 종양내의 온도변화를 기록하였다.</p><h3>종양부피의 측정</h3><p>각 군에서 치료 후 1주, 2주, 3주, 4주의 시점에서 종양의부피 (평균\(±\)표준편차)를 측정하여 항암효과를 판정하였다. 부피의 계산은 다음의 공식을 이용하였다.</p><p>\( \mathrm{V}=(4 / 3 \times \mathrm{A} \times \mathrm{B} \times \mathrm{C}) \times 1 / 2~(\mathrm{~V}= \) 부피, \( \mathrm{A}= \) 장축, \( \mathrm{B}= \) 단축, \( \mathrm{C}= \) 높이 \( ) \)</p><h3>항암효과의 판정</h3><p>항암효과는 각 군에서 이식된 암종의 부피의 변화를 4주까지 측정하여 완전 치료율과 종양부피의 변화를 비교하여 판정하였다.</p><h3>통계처리</h3><p>SAS 통계프로그램을 이용하여 9-HpbD-a의 농도변화 및 조사시기에 따른 항암효과의 차이를 two-way ANOVA test로 분석하였고 이종이식한 종양에서 항암효과의 차이는 repeated measure ANOVA test와 student t-test로 \(95\%\) 유의수준에서 검증하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>세포 독성능 측정</h2><h3>Pheophytin-a, 9-HpbD-a와 9-HpbD-a red의 세포 독성능</h3><p>광감작제로 pheophytin-a, 9-HpbD-a, 9-HpbD-a red를 이용하여 세포 독성능을 비교하였다. 레이저 조사는 \( 400 \mathrm{mW} \)의 세기로 30분 \( \left(3.2 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)으로 하였고 광감작제를 투여하고 바로 레이저 조사를 시행하였다. 3종류의 광감작제에서 공통적으로 \( 0.59 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서부터 세포 독성능을 나타내기 시작하였다. Pheophytin-a의 \( \mathrm{IC}_{50} \) (\(50\%\) inhibition concentration)은 \( 16.41 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 광감작제가 희석된 에탄올을 사용한 대조군의 \( \mathrm{IC}_{50} ~26.12 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)과 같이 낮은 세포 독성능을 보였고 9-HpbD-a, 9-HpbD-a red에서는 광감작제의 농도가 증가할수록 세포생존율은 감소되었는데 9-HpbD-a의 \( \mathrm{IC}_{50} \)은 \( 1.46 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 9-HpbD-a red의 \( \mathrm{IC}_{50}\) \(3.51 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)보다 세포 독성능이 가장 우수한 광감작제임을 확인하였다.</p><h3>레이저 조사량에 따른 세포 독성능</h3><p>세포 독성능이 가장 우수한 9-HpbD-a를 이용하여 레이저 조사량에 따른 세포독성을 확인하였다. 레이저 조사는 \( 400 \mathrm{mW} \)의 세기로 0분, 1분 \( \left(0.1 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right)\), 5분 \( \left(0.5 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right)\), 30분 \( \left(3.2 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)으로 하였고 광감작제를 투여하고 바로 레이저 조사를 시행하였다. 레이저를 조사하지 않고 9-HpbD-a만을 투여한 실험군의 \( \mathrm{IC}_{50} \)은 \( 24.43 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 가장 높았으며 1분 \( \left(0.1 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 은 \( 11.72 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), 5분 \( \left(0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \)은 \( 4.87 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 그리고 30분 \( \left(3.2 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \)은 \( 1.46 \mu \mathrm{g} \) \( / \mathrm{ml} \)으로, 조사된 에너지의 양이 증가할수록 세포생존율은 감소되었다. 9-HpbD-a의 농도가 \( 4.69 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 세포생존율은 0분에서 \( 89 \%\), 1분 \( \left(0.1 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)에서 \( 81 \%\), 5분 \( (0.5 \)\( \left.\mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right)\), 30분 \( \left(3.2 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right)\)에서 각각 \( 52 \%, 5 \% \)로 나타닜으며 9-HpbD-a의 농도가 \( 37.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 0분의 세포생존율은 \( 10 \% \)로 감소하였고, 1분 \( \left(0.1 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right)\), 5분 \( \left(0.5 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right)\), 30분 \( \left(3.2 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)에서도 모두 세포생존율이 \( 1 \% \)로 감소함을 보아 9-HpbD-a의 농도가 높아질수록 세포생존율도 감소됨을 확인할 수 있었다.</p><h3>9-HpbD-a 와 배양시간에 따른 세포 독성능</h3><p>광감작제인 9-HpbD-a를 농도별로 96 well plate에 투여하고 레이저조사 까지의 시간 간격을 0, 3, 6, 9, 12시간으로 하여 세포생존율 확인한 결과 0시간에서의 \( \mathrm{IC}_{50} \)은 \( 1.43 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 가장 높았으며 3시간에서는 \( 0.27 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), 그리고 6시간, 9시간, 12시간에서는 각각 \( 0.14 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, 0.12 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, 0.11 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 6시간까지 세포생존율이 통계적으로 의미 있게 감소하였다\( (\mathrm{p}<0.05)\). 0시간을 제외한 나머지에서 \( 0.59 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상의 9-HpbD-a 농도에서 생존율이 모두 \( 10 \% \) 미만으로 감소되었다.</p><h3>9-HpbD-a의 세포 독성능</h3><p>세포 독성능이 가장 우수한 9-HpbD-a와 \( 660 \mathrm{nm} \) diode laser 를 이용하여 레이저조사량은 \( 400 \mathrm{mW} \)의 세기로 30분\((3.2 \left.\mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)으로 하였고, 9-HpbD-a를 농도별로 96 well plate에 투여하고 레이저조사까지의 시간 간격을 6시간으로 하여 세포 생존율을 확인하였다. 대조군으로는 \( 400 \mathrm{mW} \)의 세기로 30분\( \left(3.2 \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 간 레이저 조사만을 시행한 실험군, 다양한 농도의 9-HpbD-a만을 투여한 실험군 그리고 세포에 아무런 처치도 하지 않은 실험군으로 하여 세포생존율을 확인한 결과 9-HpbD-a의 농도가 \( 0.29 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 9-HpbD-a를 투여하고 레이저조사를 시행한 실험군의 세포생존율은 \( 13 \% \), 레이저조사만 시행한 실험군, 9-HpbD-a만을 투여한 실험군 모두 \( 87 \% \)로 광역학치료를 시행한 실험군에서 우수한 세포독성을 확인하였고 9-HpbD-a의 농도가 높아질수록 광역학치료를 시행한 실험군에서는 급속한 세포 생존율의 감소를 확인할 수 있었다. 반면에 대조군인 레이저조사만 시행한 실험군, 9-HpbD-a만 투여한 실험군에서는 세포생존율의 감소가 적었음을 확인하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>광감작제 및 레이저</h2><p>광감작제는 금호 생명과학연구소에서 녹조류의 클로로필을 산화반응과 산처리를 통해 10-hydroxypheophytin a 유도체로 만든 다음 이를 유기용매를 이용하여 추출한 10-hydroxypheophytin와 10-hydroxypheophytin a 유도체의 유도체를 유기합성 후 안정된 구조 및 대량 수율이 가능한 9-hydroxypheophorbide-a (9-HpbD-a)와 9-hydroxypheophorbide-a red (9-HpbD-a red)를 사용하였다.</p><p>레이저는 새로운 광감작제가 최대 흡수 스펙트럼을 보이는 \(660\mathrm{nm}\) 다이오드 레이저(Golden Light, Korea)를 사용하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>인체 하인두암 환자들의 수술 중에 채취한 조직에서 수립된 SNU-1041 편평상피세포암종의 세포주를 RPMI-1640(GibcoBRL, USA) 배양액 \(500\mathrm{ml}\)에 우태혈청(GibcoBRL,USA) \(50\mathrm{ml}\)와 antibiotic-antimycotic solution (Gibco, BRL) \(5.5\mathrm{ml}\)를 섞은 세포배양액으로 세포배양 플라스크(Nunc,Denmark)를 이용하여 \(5\%\)의 탄산가스와 \(95\%\)공기가 공급되고 적절한 습도와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도가 유지되는 배양기(ThermoForma, USA)에서 배양하였으며 세포의 모양을 도립현미경(Olympus CK40, Japan)을 통하여 관찰하였다. 세포들은 플라스크 바닥에 부착하여 자랐으며 트립신(GibcoBRL, USA)처리 후 계대배양하였다.</p><h2>실힘동물 및 사육조건</h2><p>6주령의 BALB/C/nu/nu 숫컷 누드마우스(Charles River,Japan)를 온도는 \(22 \sim 23 ^{\circ} \mathrm{C} \), \(40 \sim 60\%\)로 유지되는 항온항습기(Jeung Do Industry Co, korea)에서 멸균 소독된 물과 방사능으로 조사한 멸균된 사료로서 급수 급식하면서 사육하였다.Clean rack에 4 mice/cage씩 나누어 무균적으로 3-4일에 한번씩 멸균된 깔집으로 교환하였으며 3-4일에 한 번씩 Hibitan용액으로 복도와 무균실내를 청소하였고 손은 \(70 \%\) 에탄올로 소독하고 소독된 일회용 장갑을 착용하여 세균에 감염되지 않도록 사육하였다.</p><h2>세포 독성능 측정</h2><h3>형태학적 변이 관찰</h3><p>96 well plate에 24시간 동안 배양한 세포에 \(0.2 \mathrm{μm}\) 주사기필터(Gelman, USA)로 광감작제 \((75 μ\mathrm{g/ml}\)) \(100 μ \mathrm{l}\)를 세포배양배지로 희석하여 2배수 희석을 통하여 광감작제의 농도를 줄여나갔다. 광감작제를 투여 후 레이저 조사까지의 시간과 레이저 조사시간을 다르게 하여 레이저조사를 시행하였다. 72시간 동안 도립현미경으로 세포의 형태학적 변이를 관찰하면서 광감작제와 레이저조사에 의한 독성능을 평가하였다. 대조군으로 광감작제만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군, 광감작제를 투여하지 않고 plate에 레이저조사만을 시행하고 배양한 실험군, 그리고 광감작제가 녹여져 있는 에탄올(Merck, Germany)만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군으로 하였다.</p><h3>MTT assay</h3><p>광감작제와 레이저조사가 세포에 미치는 독성능을 알아보기 위해 MTT assay 방법을 이용하였다. 96 well plate에 24시간 동안 배양한 세포에 광감작제\((75 μ\mathrm{g/ml}\)) \(100 μ \mathrm{l}\)를 2배수 희석을 통하여 광감작제의 농도를 줄여나갔으며 대조군으로 광감작제만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군, 광감작제를 투여하지 않고 plate에 레이저조사만을 시행하고 배양한 실험군 그리고 광감작제가 녹여져 있는 에탄올(Merck,Germany)만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군으로 하였다. 72시간을 배양한 후 각각의 well에 \(50 \mu \mathrm{l}\)의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]용액(\(2 \mu \mathrm{g/ml}\), Sigma)을 첨가하고 4시간 배양 후 각 well의 배지를 모두 제거하고 \(150 \mu \mathrm{l}\)의 dimethylsulfoxide (DMSO:KANTO, Japan)를 첨가한 후 microplate reader (BIO-RAD550, USA)로 \(540 \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 다음의 식을 이용하여 측정하였으며 광감작제의 농도마다 4개의 well의 평균 흡광도값을 계산하여 결과로 사용하였다.</p><p>Cell viability \( (\%)=\frac{\text { Mean optical density in test well }}{\text { Mean optical density in control well }} \times 100 \)</p> <p>최근의 연구에서 광역학치료시 레이저조사 세기와 세포의 종류에 따라 세포의 반응이 세포고사와 세포괴사로 세포파괴 기전의 비율이 다른데 돌연변이형 p53 유전자를 가진 human bladder carcinoma의 경우 \( \mathrm{LD}_{50} \)(\(50\%\) lethal dose)의 광량에서는 세포고사가, \( \mathrm{LD}_{90} \)의 광량에서는 세포괴사를 통한 세포파괴가 더 활성을 갖는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서도 이와 같은 현상을 관찰할 수 있었는데 낮은 광감작제 농도에서는 세포고사가 주된 사멸기전으로 확인되었고, 높은 감작제 농도에서는 세포괴사가 주된 세포사멸 기전임을 확인하였는데 광역학치료 후 일어나는 괴사의 진행과정은 직접적인 세포막 손상에 의하여 세포 내 ATP 저장이 고갈되면서 세포 복제나 복구과정이 장애를 입거나 세포 내로 아미노산 이동이 저하되고 세포 내 \( \mathrm{pH} \)의 감소가 잍어난다. 또한 리소솜막이 손상되면서 여러 단백질 분해효소들이 해리되고 이로 인한 종양세포의 퐈괴와 괴사반응이 진행하는 것으로 알려져 있다. 이밖에 세포막의 손상은 아라키돈산 대사 과정의 장애와 혈관손상이 가능하고 동반된 보체계(complement system)의 자극, 히스타민과 다른 염증매개물질의 배출은 괴사과정을 가속화한다. 직접적인 세포손상은 세포막의 이온 전달을 매개하는 여러 단백질에도 손상을 입혀 전해질 균형에도 장애를 유발하는데 세포 내 칼슘이 증가하면 endonuclease의 활성화로 DNA가 분해되는 칼슘의존형 세포고사를 유발한다. 이러한 세포고사는 광역학치료 후 모든 경우에서 발견되는 것은 아니고 사용한 광감작제의 종류와 대상 세포주에 따라서 차이를 보인다. 또한 세포가 세포고사와 세포괴사로 가는 중요한 열쇠는 adenosine triphosphate의 역할이라 하였고 해당과정과 산화적 인산화의 저해제로 인한 에너지생산의 저해가 광역학치료 후 세포괴사를 유도한다고 하였다.</p><p>누드마우스에 이종이식된 종양의 광역학치료는 치료효과를 높이고 종양 내 광감작제 치료농도를 유지하기 위하여 광감각제를 직접 종양 내에 주입하였고, 종양중심부의 응고 및 탄화를 막아 레이저의 종양 내 투과성을 향상시키기 위하여 diffuser tip을 종양내에 직접 삽입하여 치료하는 간질성 레이저치료(interstitial laser therapy)를 시행하였다. 치료된 종양이 완치되는 경우 치료 2주 후부터 종양의 크기가 줄어들기 시작하고 종양 변연부(marginal area)의 종양성장도 관찰할 수 없었다. 그러나 종양의 재발 또는 치유가 되지 않은 종양에서는 공통적으로 종양 변연부에서 성장하는 것으로 보아 광역학치료시 종양 변연부 치료도 중요시 고려해야할 사항이라고 사료된다.</p><p>앞으로 9-HpbD-a가 광역학치료에서 효과적인 광감작제로 사용되기 위해서는 9-HpbD-a가 정상세포뿐만 아니라 종양세포와의 작용기전에 대한 이해가 필요하고 광감작제가 정상조직에는 빠른 대사를 통하여 빠져나가고 종양조직에만 많은 양의 광감작제가 선택적으로 축적되어 광역학치료의 효과를 높여야 할 것이고 새로운 광감작제와 함께 인체 조직의 침투력이 좋은 우수한 레이저의 개발도 함께 이루어져야 한다. 이러한 연구를 토대로 더 나은 광역학치료의 치료기전에 대한 이해와 효과적인 임상적 이용이 가능할 것으로 기대된다.</p> <h1>고 찰</h1><p>광역학치료를 수행하기 위해서는 특정파장의 빛에 활성을 나타내는 광감작제와 광감작제를 충분히 활성화시킬 수 있는 빛이 필요한데 이러한 광원으로 레이저가 주로 광역학치료에 이용된다. 광역학치료용 레이저는 다른 광원에 비해 광감작제를 활성화시킬 수 있는 충분한 에너지를 가지고 있으며 단일파장의 빛을 방출할 수 있어 광감작제의 활성을 최대로 유도할 수 있는 장점을 가지고 있다. 현재 광역학치료용 레이저는 continuous wavelength(CW) 형식의 diode laser가 보편적으로 사용되고 있다. 본 연구에 사용된 diode laser는 광감작제의 최대흡수 스펙트럼인 \(660 \mathrm{nm}\)의 레이저로서 새로 개발된 광감작제에 적합한 레이저라 할 수 있다. 광역학치료에 사용한 레이저의 방사방식에 따라서도 세포독성효과의 차이가 있을 수 있는데 필요한 광선의 양을 짧은 기간 동안 최대 동력으로 방사하여 인접한 정상세포에 특별한 손상 없이 종양세포에 집중적으로 조사하는 펄스 방식이 더 효과적이라고 하였다. 펄스 방식의 레이저는 일반적으로 CW방식의 레이저 보다 조직 내 침투효과가 더 깊고 레이저 발생시 나타나는 열도 낮은 것으로 알려져 있어 광역학치료의 효과를 높이는데 적합한 레이저라고 생각되나 \(660 \mathrm{nm}\)의 펄스형 레이저는 아직까지는 개발이 안되어 CW방식의 레이저를 사용하였다.</p><p>본 연구에서 사용된 광감작제는 녹조류인 Spirulina platensis의 chlorophyll a로부터 금속이온을 제거한 피오파이틴 a와 이의 피톨기를 가수분해 시킨 피오바이드 a로부터 개발 한 9-hydroxypheophorbide-a(9-HpbD-a)는 기존의 hematophorphyrin derivative HpD 광감작제가 갖는 단점을 보완할 수 있는 광감작제로 체내에서 배설되는데 시간이 오래 걸리는 단점을 줄여 체내의 누적을 방지할 수 있는 장점이 있다. 또한 광감작제의 최대 흡수파장이 높아지면 이러한 광감작제에 맞는 레이저를 선택하여야 하는데 가시광선 영역에서 높은 파장의 레이저일수록 조직에 침투되는 깊이가 깊어져 광역학치료의 효과를 높일 수 있다. 기존의 HpD 광감작제가 \( 630 \mathrm{nm} \) 영역의 최대 활성을 보이는 반면 9-HpbD-a의 최대 홉수 파장은 \( 660 \mathrm{nm} \)로 기존의 광감작제보다 높은 파장의 레이저를 사용할 수 있는 장점을 갖고 있다.</p><p>본 연구에서 세포 독성능이 가장 우수한 9-HpbD-a를 이용한 세포 독성능은 전처리된 광감작제의 농도가 높을수록 세포 생존율의 지수적 감소현상을 확인하였는데 광역학치료의 효과는 단순히 광감작제의 총 세포 내 농도보다는 얼마나 효과적으로 세포내 작용부위에 위치하는가 하는 세포내 분포가 더 중요하다고 하였다. 광감작제의 세포내 분포는 감작제의 물리화학적 성질에 따라 차이를 나타내는데 흔히 사용되는 HpD 류의 Photofrin, Photogem과 같은 친지질성 감작제나 5-ALA-induced protoporphyrin IX 등은 주로 사립체, 소포체막, 핵막 그리고 세포핵 주변에 축적된다. 반면에 A1PcS\(_{4}\), TPPS 등의 친수성 감작제는 세포막을 투과하는 성향이 적기 때문에 주로 간질내나 종양의 혈관기질에 축적된다. 광감작제의 약동학적 연구에 의하면 친지질성 감작제는 혈중 HDL, LDL 등의 지단백과 친수성 감작제는 주로 알부민과 결합하며 종양세포로 이동된 감작제는 선택적으로 홉수되어 정상조직과는 분포의 차이를 나타낸다. 산성 \( \mathrm{pH} \)의 종양조직은 친지질성 감작제에 친화력이 강한 기질로 구성되어 있고 종양세포는 LDL 수용체가 많이 분포되어 있는 특징적인 구조로 되어 있어서 감작제의 흡수정도가 정상조직과는 차이가 있다. 친지질성 감작제가 지질막을 통과하여 세포내 소기관과 결합하기 쉬워 광감작효과가 좋다고 하였다. 본 연구에 사용된 광감작제는 친수성 광감작제로 체내에서 대사되는 시간이 친지질성 광감작제보다 빠르다는 장점을 가지고 있고 기존의 광감작제와 동등한 세포 독성능을 확인하여 세포 내 독성효과를 나타내는 다른 기전이 존재함을 시사한다.</p><p>세포독성효과는 조사한 에너지량에 비례하여 증가되었는데 이는 세포내로 흡수된 감작제를 반응시킬 수 있는 광물리현상이 증가하기 때문인 것으로 생각된다. 9-HpbD-a 투여 후 레이저를 조사하기까지 9-HpbD-a와 배양시간에 따른 세포생존율은 6시간 이후부터 12시간까지 비슷한 세포 독성능을 확인하였고, 시간간격을 두지 않은 실험군과는 확연한 차이를 보였다. 이는 세포 내 광감작제의 침투시간이 6시간 이후부터 충분한 반응이 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 이는 광역학치료 시 중요한 요소 중의 하나로 광감작제와 세포의 충분한 반응시간을 갖게 하는 더 높은 치료효과를 가져올 것이라고 사료된다.</p>	생명
호중구의 자연 세포사멸 및 세포사멸 지연에 대한 Brefeldin A의 영향	<h1>고 찰</h1><p>본 연구는 단백질 분비의 억제제인 BFA가 자극을 받지 않은 상태에서나 세포사멸을 억제시키는 상태에서 호중구의 세포사멸을 유도한다는 것을 보였다. BFA는 골지체에서 저분자 GTP결합 단백질인 ARF-1의 guanine핵산의 치환능을 억제하는 물질인데 호중구에서 ARF-1은 세포질 분획에 존재하는 것이 증명되었다. 본 연구의 결과는 낭포의 이동이 BFA에 의하여 억제되는 경우와 단백질의 분비 과정이 손상을 받는 경우, 이들에 의하여 호중구의 세포사멸이 영향을 받을 수 있을 가능성을 제시하였다.</p><p>호중구의 세포사멸은 염증성 매개물질을 포함한 여러 인자들에 의하여 조절 받는다. 그러나 아직 어떠한 기작에 의하여 이들 물질이 호중구의 생존 기간에 영향을 주는가는 밝혀져 있지 않다. LPS, GM-CSF, IL-8, dexamethasnone 및 db-cAMP 등은 호중구의 세포사멸을 지연시켰다. BFA는 LPS나 GM-CSF에 의한 호중구 세포사멸의 지연을 억제하였으나 이들 물질들 중에서 db-cAMP에 의한 세포사멸은 BFA에 영향을 적게 받았다. 이들 결과는 단백질 이동을 억제함으로써 세포사멸이 증가한다는 것을 보여주고 있으며 다른 자극제에 의한 세포사멸은 다른 경로에 의하여 조절을 받고 있다는 것을 암시하고 있다. 어떤 일정한 조건에서 호중구는 세포사멸을 억제한다고 알려진 GM-CSF나 IL-8 등을 생성하고 분비한다. 따라서, BFA가 이들 사이토카인의 분비를 억제하여 세포사멸에 영향을 줄 가능성이 있다고 추측할 수 있다. 그러나 본 연구에서 이들 사이토카인들을 첨가하였을 때 BFA에 의한 세포사멸 유도는 억제되지 못하였다.</p><p>BFA에 의한 세포사멸의 기작에 대한 연구에서 Jurkat T-세포를 BFA로 처리하였을 때 caspase-3의 활성증가가 관련이 있을 것이라고 제안되었다. 본 연구에서도 BFA를 처리한 호중구는 세포사멸의 증가과정에서 PI 염색이나 DNA 전기영동에서 DNA 조각이 증가함을 보임으로써 BFA에 의하여 endonuclease가 활성화된다는 것을 알 수 있다. 그러나, caspase-3의 억제제는 BFA에 의한 호중구의 형태 변화, annexin V의 결합양상, DNA 조각의 증가 등에 대하여 영향을 미치지 못하였다. 활성화된 호중구에서는 caspase와는 다른 endonuclease 활성이 있음이 보고된 것과 위의 결과는 비교될 수 있다. 또한, 단백질 분해효소의 억제제인 3,4-dichloroisocoumarine이나 N-1-tosylamide-demethyl-chloromethyl ketone이 HL-60 세포에서 BFA에 의한 DNA의 절단을 억제한다고 하였는데 이는 BFA에 의한 DNA의 절단은 단백질 분해 효소에 의하여도 영향을 받을 수 있음을 보여주고 있다. Pongracs 등은 caspase- 3에 의한 PKC- \( \delta \)의 활성화가 호중구의 세포사멸에 중요하다고 하였다. 그러나 본 연구에서는 BFA에 의한 세포 사멸은 PKC- \( \delta \)에 대한 특이적인 억제제인 rottlerin에 의하여 영향을 받지 않았다. 이러한 결과로써 우리는 BFA에 의한 세포사멸은 caspase-3를 통하지 않는 단백질 분해효소에 의하여 일어난다는 것을 추측할 수 있으나 아직 어떠한 인자에 의한 것인지는 밝히지 못하였다. 최근, 소포체에 대한 BFA의 장기간 처리에 의하여 세포사멸이 일어나는 것은 caspase-7을 통한 caspase-12의 활성 때문이라고 보고된 바 있다. 세포사멸 동안 일어나는 미토콘드리아의 transmembrane potential (\( \Delta \Psi \mathrm{m} \)), 세포질에서 미토콘드리아로의 Bax의 전이, cytochrome c의 분비 및 미토콘드리아에서 apoptosis inducing factor (AIF)의 분비와 같은 미토콘드리아에서의 변화는 caspase의 억제제에 의하여 영향을 받지 않기 때문에 미토콘드리아가 caspase-의존형과 caspase-비의존형의 세포사멸의 교차물질로서 역할을 할 것이라고 가정할 수 있다. BFA가 미토콘드리아에 직접적으로 변화를 일으켜서 세포사멸을 유도하는가를 알기 위하여 앞으로 더 많은 연구가 필요하다.</p> <h1>서 론</h1><p>호중구는 생체 내 염증이 일어나는 경우 가장 먼저 동원되는 탐식세포로서 다량의 활성 산소종을 생성하여 세균 등을 사멸시키지만 이러한 생성물에 의하여 조직의 손상을 동반하기도 한다. 따라서, 활성화된 기능을 억제하는 것과 함께 호중구의 세포사멸의 조절은 염증의 종결을 위하여 필수적이며 더욱 중요하다고 알려져 있다. 사멸된 호중구는 세포 내 독작용을 나타내는 물질의 분비가 없이 대식세포에 의하여 탐식되어 소멸된다. 사멸된 호중구가 제거됨으로써 염증 반응이 종결되어야 하나 세포사멸에 들어가지 않은 노화된 세포들은 일부분의 기능이 유지되므로 노화된 호중구의 제거가 일어나지 않으면 염증성 매개 활성물질에 의한 조직 손상은 더욱 증가된다.</p><p>호중구는 생체 내에서 6-10시간, 배양 상태에서 24시간에 \( 50 \% \)가 자연 세포사멸이 된다. 그러나 세균의 감염으로 인한 lipopolysaccharide (LPS)의 증가, granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF)와 같은 성장 인자들 및 만성 염증성 질환에서 분비되는 여러 사이토카인들에 의하여 생존기간이 증가한다. 현재까지 호중구의 세포사멸이 일어나는 현상의 연구에 비하여 세포사멸의 기작에 관한 연구는 부족하다. 세포사멸은 모든 세포에서 일어나는 일반적인 현상이지만 세포의 종류나 자극제에 따라서 각각 다른 생화학적, 기능적인 차이를 보이기 때문으로 생각할 수 있다.</p><p>Brefeldin A (BFA)는 Penicillium brefeldianum으로 부터 분리한 macrocyclic lactone으로서 ADP-ribosylation factor (ARF)의 GDP-GTP교환을 억제하여 골지체로의 막 이동이나 소포의 이동을 억제하는 물질이다. BFA는 HL-60 세포에서 세포사멸을 증가시킨다고 알려져 있으며 여러 암세포에서 세포사멸을 증가시키는 것은 p53과는 관계가 없는 것으로 밝혀졌다. 최근의 연구에서 Jurkat T-세포를 BFA로 처리하였을 때 caspase- 3의 활성 증가가 세포사멸을 유도한다고 하였으며 세포사멸을 억제하는 단백질인 Bcl-2의 발현의 증가가 있으면 BFA에 의한 세포사멸은 방지된다고 하였다. 그러나 호중구에서는 Bcl-2의 발현은 측정되지 않고 그와 같은 종류에 속하는 myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1)은 발현되어 있다는 것이 밝혀짐으로써 호중구의 세포사멸 조절은 암세포주들과는 다르다는 것을 제시하고 있다.</p><p>호중구는 Mcl-1이나 caspase-3와 같은 세포사멸 조절 단백질들을 발현하고 이들 단백질 합성 정도에 따라 세포사멸이 증가되거나 억제된다. 단백질이나 mRNA 합성을 억제하는 약물들에 의한 호중구의 세포사멸 변화는 많은 연구가 되어 있으나 단백질 분비에 관여하는 약물들의 세포사멸에 대한 영향은 조사된 것이 거의 없다. 따라서, 본 연구에서는 단백질의 분비를 억제하는 BFA가 호중구의 자연 세포사멸과 여러 약물에 의한 세포사멸의 지연에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하고 세포사멸에서 BFA의 작용기작을 알아보고자 하였다.</p> <h2>Flow-cytometry 측정</h2><p>\( 5 \times 10^{5} \)의 호중구를 인산염 완충액으로 세척하고 \( 70 \% \) 에탄올에 부유하였다. \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤을 방치하고 다시 인산염 완충액으로 1회 세척한 다음 \( 0.5 \mathrm{~mM} \) EDTA가 들어있는 인산염 완충액에 시료를 부유하였다. RNase (\( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)와 propidium iodide (PI)(\( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \))를 첨가하여 실온에서 15분간 배양하였다. 측정할 때까지 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관한 다음 \( 10^{4} \)개의 세포를 이용하였다. Phosphatidylserine (PS)의 세포 외막으로의 노출되는 정도는 annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)의 결합을 이용하였다(TACS apoptosis detection kit, Trevigen, Netherland). 세포를 \( 1 \times 10^{6} \)으로 분리하여 인산염 완충액으로 2회 세척한 다음 annexin V-FITC와 PI를 첨가하고 15분 동안 반응시켰다. \( 1 \times 10^{4} \)의 세포를 flow-cytometry (Beckton Dickinson, USA)으로 측정하였다. Annexin V-FITC와 Pl의 결합 차이로써 다음과 같은 세포들을 구분하였다; 세포사멸된 세포: annexin V-FITC 양성, 세포사멸 말기 세포나 괴사된 세포: annexin V-FITC와 PI 양성, 생존하는 세포: 모두 음성 염색.</p><h2>Western blot</h2><p>배양한 세포(\( 2 \times 10^{7} \))를 인산염 완충액으로 세척한 다음 단백질 분해효소 억제제(\( 0.5 \mu \mathrm{M} \) leupeptin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) aprotinin 및 \( 10 \mathrm{~mM} \) phenylmethylsulfonylfluoride)와 \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaF} \) 및 \( 2.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~Na}_{3} \mathrm{VO}_{4} \)가 첨가된 세포용해 완충액(\( 1\% \) Triton X-100, \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \) 및 \( 20 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.4 \))을 이용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 하에서 1시간 동안 방치하였다. 파괴된 세포를 함유하는 용액을 Eppendorf microcentrifuge를 이용하여 \( 16,000 \times \mathrm{g} \)로 10분간 원심 분리하여 핵 분획 및 파괴되지 않은 세포 등을 침전시키고 상층액을 얻어서 단백질양을 측정한 다음 전기영동에 이용하였다.</p><p>SDS-PAGE 후 western blot법을 사용하여 Mcl-1에 대한 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 Mcl-1의 발현 정도를 측정하였다. 약물을 처리한 호중구는 \( 2.5 \% \) mercaptoethanol과 \( 1.2 \% \) sodium dodecyl sulfate를 넣고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 가열하여 처리한 다음 \( 15 \% \) polyacrylamide 겔에 loading하여 전기영동을 시행하였다. 전기영동 후 겔의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. Nitrocellulose membrane을 \( 10 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl, \( 0.15 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.1 \% \) sodium azide로 구성된 완충액에 \( 5\% \) skim milk을 포함하는 용액으로 2시간 처리하며 1차 항체는 \( 1:1000 \)으로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시키고 nitrocellulose membrane을 세척하였다. 다시 Triton X-100이 들어있지 않는 Tris 용액으로 세척하고 ECL chemiluminescence (Amersham)나 nitroblue tetrazolium과 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 발색 방법으로 전개시켰다.</p><h2>통계 처리</h2><p>세포사멸의 결과는 평균\( \pm \)표준편차(mean\( \pm \)SD)로 나타내었다. 통계학적 유의성은 자료들의 분포를 확인하고 Student's t-test를 이용하여 검정하였고 \( p \) 값이 0.05이하이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>BFA에 의한 호중구 세포사멸의 유도</h2><p>호중구는 배양 상태에서 자연 세포사멸이 빠르게 일어 난다. 세포사멸의 특징인 핵의 농축이나 세포질 내 낭포가 쉽게 관찰되었다. 이들 변화는 DNA조각의 증가와 일치하여 증가하였으며 PS의 세포 외막으로의 노출 정도와도 일치하였다. 20 시간 배양 후 약 \( 50 \% \)가 세포사멸이 유도되었다. \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 BFA를 첨가 하였을 때 호중구의 세포사멸은 \( 75 \pm 8 \% \)로 증가하였다. BFA를 처리하지 않은 세포들에서는 DNA의 조각이나 PS의 측정이 약하게 나왔으나 BFA를 처리한 호중구들은 DNA 조각이나 annexin-V염색이 강하게 나타남으로써 BFA에 의하여 세포사멸이 증가함을 보였다. BFA에 의한 세포사멸을 \( 0.01 \mu \mathrm{M} \) 로부터 \( 10 \mu \mathrm{M} \)까지 농도별로 측정하였을 때 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \)의 낮은 농도에서부터 세포사멸이 일어났으며 \( 10 \mu \mathrm{M} \)에서 최대의 반응을 보였다. 따라서 본 연구에서는 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 농도의 BFA를 실험에 사용하였다.</p><h2>호중구의 세포사멸 지연에 대한 BFA의 영향</h2><p>호중구의 세포사멸을 지연시킨다고 알려진 LPS나 GM-CSF로 호중구를 20시간 처리하였을 때 세포사멸되는 세포의 수가 현저히 감소하였다. 이들 약물을 처리하기 1시간 전에 BFA를 투여하고 20시간 배양 후 세포사멸을 측정하였다. BFA를 처리한 세포에서는 LPS나 GM-CSF가 들어 있더라도 세포사멸되는 정도가 증가함으로써 BFA는 세포사멸의 지연을 억제한다는 것을 알 수 있다. LPS를 처리한 세포에서 DNA 조각이 감소하는 현상도 BFA의 전처리 시에는 억제되었다. 한편, dibutyryl-cyclic AMP (db-cAMP), dexamethasone 및 interleukine-8 (IL-8)으로 처리하여 세포사멸이 지연된 경우, BFA의 효과는 부분적으로 나타났다. 이들 결과들은 BFA가 세포사멸을 억제하는 서로 다른 약물들에 대하여 각각 다른 작용을 가진다는 것을 보여주고 있으며 그들에 의한 호중구의 세포사멸 억제기작이 다를 것이라는 것을 암시하고 있다.</p><h2>BFA에 의한 세포사멸 유도에서 caspase-3 억제제와 protein kinase C-\( \delta \)(PKC-\( \delta \))억제제의 영향</h2><p>최근 다른 연구자들의 보고에 의하면, 세포사멸이 일어나는 동안 PKC-\( \delta \)는 caspase-3에 의하여 분해되면서 활성형으로 전환된다고 하였다. 따라서, 본 연구에서는 PKC-\( \delta \)에 대한 특이적인 억제제인 rottlerin과 caspase-3의 억제제인 zDEVD-fmk가 BFA에 의한 세포사멸에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하였다. Rottlerin을 단독으로 첨가였을 때 호중구의 세포사멸은 현저히 감소하였다. 그러나 BFA를 농도별로 증가시켜 유도된 세포사멸은 \( 10\mu \mathrm{M} \)의 rottlerin에 의하여 영향을 받지 않았다. 또한, zDEVD-fmk를 \( 200 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 BFA와 처리하여 PI 염색으로 세포사멸 정도를 관찰하였을 때도 BFA에 의한 세포사멸은 억제되지 않았다. 이들 두 결과는 BFA에 의한 세포사멸은 caspase-3를 통한 PKC-\( \delta \)의 활성에 의한 세포사멸과는 관계가 없다는 것을 제시하고 있다.</p><h2>Mcl-1의 발현에 대한 BFA의 영향</h2><p>호중구에서 발현되는 세포사멸 억제단백질인 Mcl-1의 발현이 BFA에 의하여 영향을 받는가를 보기 위하여 \( 10\mu \mathrm{M} \)의 BFA가 들어 있는 배양액에서 세포를 20시간 처리한 다음 Mcl-1에 대한 항체를 이용하여 western blot을 시행하였다. Mcl-1의 단백질 양은 배양 20시간에서 현저히 감소하였으나 LPS나 db-cAMP를 처리하였을 때 감소되는 양이 줄었다. Mcl-1의 단백질 양은 BFA의 단독 처리에 의하여 감소되었을 뿐만 아니라 LPS나 db-cAMP에 의하여 증가되는 것도 억제되었다. 이들 결과는 세포 사멸을 억제시키는 Mcl-1의 발현되는 단백질 양의 변화에 의하여 BFA의 효과가 나타난다는 것을 제시하고 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사람 호중구의 분리 및 배양</h2><p>호중구의 분리는 dextran 침전과 ficoll-hypaque 법으로 분리하고 RPMI 배지에서 \( 5 \% \) 소 혈청을 첨가하여 20시간 동안 배양하여 호중구의 세포사멸을 유도하였다. 혈액 \( (100 \mathrm{ml}) \)은 \( 0.1 \mathrm{~M}\) EDTA, \( \mathrm{pH} 7.4 /0.9 \% \mathrm{~NaCl} \)이 들어 있는 수혈용 팩에 채혈하였다. \( 30 \mathrm{~ml} \)의 Hespan을 넣고 1시간 동안 실온 상태에서 방치하여 적혈구를 제거하였다. 호중구를 포함하는 혈장 성분층을 분리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 상태에서 \( 850 \times \mathrm{g} \)로 15분 동안 원심분리하였다. 침전된 세포를 20 \( \mathrm{ml} \)의 인산염 완충액(\( 8.0 \mathrm{~mM} \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 1.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 136 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \), \(2.6 \mathrm{~mM} \mathrm{~KCl} \), \(0.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\), \(0.6 \mathrm{~mM} \mathrm{~CaCl}_{2} \), \( \mathrm{pH} 7.4 \))에 부유시킨 다음 \( 60 \mathrm{~ml} \)의 증류수를 넣고 잘 섞은 뒤 50초간 방치한 후 \( 20 \mathrm{~ml} \) 의 \( 4 \% (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{~NaCl} \)을 넣었다. 세포는 \( 850 \times \mathrm{g} \)에서 10분간 원심 분리하고 인산염 완충액에 다시 부유시켰다. 임파구 분리용액인 ficoll-hypaque 용액을 세포층 밑에 넣고 \( 850 \times \mathrm{g} \)에서 30분간 원심분리하여 분리된 과립구층은 다시 RPMI 배양액에 부유하여 사용하였다.</p><h2>호중구 세포사멸의 형태 관찰</h2><p>\( 2 \times 10^{5} \)세포를 약물을 처리하고 20시간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 두었다. Cytospin에서 \( 500\mathrm{rpm} \)으로 1분간 원심 분리한 다음 메탄올으로 고정시키고 May- Grunwald Giemsa 염색액으로 염색하였다. 호중구의 세포사멸은 \( 400 \times 10 \) 배 현미경 시야에서 최소한 300개의 세포 중에서 특이적인 변화가 나타난 세포를 확인하여 \( \% \)로 표시하였다.</p><h2>DNA 전기영동</h2><p>사멸된 세포에서 특징적으로 나타나는 조각의 DNA를 전기영동으로 확인하였다. \( 5 \times 10^{5} \)의 호중구를 약물 처리한 다음 \( 13,000 \times \mathrm{g} \)에서 2분간 원심하여 분리한다. 인산염 완충액으로 세척하고 세포용해 완충액( \( 10\mathrm{~mM}\) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.5 \), \(1 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 0.2 \% \) Triton X-100)에 proteinase K (\( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \))를 첨가하여 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 처리하였다. \( 28,000\mathrm{rpm} \)에서 2시간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 DNA를 phenol/chloroform으로 추출하고 isopropanol로 침전시겼다. RNase A (\( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \))를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 다음 \( 1 \% \) 아가로스 겔에서 전기영동(\( 50\mathrm{V} \))을 3시간 시행하였다.</p>	생명
	<h1>서 론</h1> <p>비소는 자연계 또는 인위적인 사용에 의해 발생되는 금속원소로서 환경에 광범위하게 분포되어 있다. 비소의 화학적 성질은 매우 복잡하여 다양한 비소 화합물이 생성되는데 산소, 염소, 황 등과 결합하고 있는 무기비소와 탄소 또는 수소와 결합하고 있는 유기비소로 분류되며, 인체독성은 무기비소가 유기비소에 비해 상대적으로 큰 것으로 알려져 있다.</p> <p>비소는 수많은 철광석 및 비철광석에서 발견되며 공기와 음식, 제련업, 살충제와 지열발전소 등의 산업장에서도 발견된다. 일반적으로 인체가 비소에 노출되는 가장 주요한 경로는 음용수와 식품의 오염을 통한 것이다. 식품을 통한 노출은 수산물 중의 arsenobetaine, arsenocholine, 그리고 arsen-osugars의 노출이 주를 이루는데, 이들 유기비소는 무기비소에 비해 독성이 낮고, 소변으로의 배설이 빠르기 때문에 인체에 미치는 영향이 적다고 알려져 있다. 반면, 음용수를 통한 만성적인 비소 노출은 최근 전세계적인 문제로 대두되어 큰 주목을 받고 있다.</p> <p>음용수 중의 비소는 대부분 무기비소 형태로 인체에 노출된다. 위장관을 통해 쉅게 체내로 흡수된 무기비소는 혈류를 따라 여러 장기에 분포되며, 주로 간에서 대사되어 소변으로 배설된다. 아직까지 비소의 독성 기전은 명확히 밝혀지지 않고 있으나, 최근에 비소에 의한 독성기전, 특히 발암과정이 체내에서의 산화적스트레스(oxidative stress) 발생과 관련이 있다는 연구결과들이 보고되어 주목 받고 있다. 활성산소는 DNA에 직접 결합하여 single 또는 double strand DNA 손상, 결손 등의 돌연변이를 유발한다. 8-hydroxydeox-yguanosine (8-OHdG)은 활성산소에 의해 guanine이 산화된 형태로 매우 낮은 농도의 산화적 손상을 반영할 정도로 매우 민감해서 가장 많이 이용되는 산화적스트레스 지표 중 하나이다.</p> <p>본 연구는 비소를 포함한 중금속에 비교적 오랜 기간 동안 노출되었을 것으로 생각되는 일부 폐금속광산 주변 지역의 주민들 중 여자들을 대상으로 이들의 요중 비소농도를 평가하고 비소의 노출정도와 산화적 유전자손상과의 관련성을 평가해 보고자 시행되었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>연구 대상</h2> <p>본 연구는 충청북도에 소재하고 있는 두 군데의 폐금속광산 지역 주민 중 여성 주민 165명을 대상으로 실시하였다. 연구대상자 중 본 연구에 참여하겠다는 동의서를 작성한 사람을 대상으로 직접 면접조사를 실시하여 인구학적 특성과 비소노출과 관련된 인자들을 조사하였으며 대상자들의 일시뇨를 제공받아 \(-20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하면서 실험에 이용하였다.</p> <h2>요중 비소 정량</h2> <p>요중 비소는 Hydride Generation System (FIAS 400)이 장착된 원자흡광기분광광도계(Atomic absorption spectrometer, Perkin-Elmer Model 5100, USA)를 이용하여 hydride gen-eration 방법으로 분석하였다. 채춰한 소변은 \( \mathrm { HCl } \), ascorbic acid 및 \( \mathrm { KI } \)를 2:2:1:1의 비율로 혼합하여 1 시간 반응시킨 후 \(10 \% \mathrm { HCl } \)로 희석하여 분석에 이용하였다. 환원제로는 \(0.2 \% \) \( \mathrm { NaBH } _ { 4 } \) 와 \(0.5 \% \mathrm { NaOH } \)를, 이동상은 \(3 \% \mathrm { HCl } \), 운반가스는 argon을 각각 사용하였다. 표준 시료(Lyphocheck \( { } ^ { Ⓡ } \) Urine Metals Control, Bio-Rad, USA)를 이용하여 요중 비소 분석에 있어서의 정확성을 도모하였다. 희석액에 함유된 비소의 농도는 시료와 동일한 방법으로 희석한 소변에 비소표준용액을 첨가하여 얻은 표준검량곡선으로부터 산출하였다.</p> <h2>요중 비소와 8-OHdG와의 관련성 평가</h2> <p>요중 비소와 산화적 유전자 손상지표인 8-OHdG와의 관련성을 평가한 결과, 전체 165명에 대한 분석에서 상관계수 \(0.399( \mathrm { p }<0.001) \) 의 유의한 관런성을 보여주어 비소의 노출은 체내에서 산화적스트레스 발생과 관련이 있는 것으로 나타났다. 대상자들의 산술 평균연령인 64세를 기준으로 저연령군과 고연령군으로 나누어 요중 비소 및 8-OHdG 의 농도를 비교하였다. 요중 비소의 농도는 고연령군이 7.14로 저연령군 7.08에 비해 다소 높았으나 통계적인 유의성은 없었다. 요중 8-OHdG 의 농도도 고연령층이 4.01로 저연령층 3.41에 비해 높았으나 역시 통계적인 유의성은 없었다(data not shown). 연령에 따라 나눈 두 군에서 두 변수 사이의 관련성을 평가한 결과, 양군 모두에서 유의한 관련성을 보여주었으나 저연령군은 상관계수 0.458의 매우 높은 관련성을 보인 반면, 고연령군은 0.359의 상대적으로 낮은 상관계수를 보여주었다. 대상자들의 요중 비소 산술평균인 \(7.09 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)creatinine을 기준으로 나누어 요중 8-OHdG의 농도를 비교한 결과, 고농도군의 요중 OHdG 농도는 4.78로 저농도군의 2.58에 비해 통계적으로 유의하게 높은 것으로 나타났다 \(( \mathrm { p }<0.001)(data not shown). 비소 농도에 따라 나눈 두 군에서 두 변수 사이의관련성을 평가한 결과, 양군 모두에서 유의한 관련성을 보여주었으나 저농도 노출군에 비해 상대적으로 높은 관련성을 보여주었다 (0.348 vs. 0.272).</p> <h1>고 찰</h1> <p>본 연구는 일부 폐금속 광산 지역에서 장기간 거주한 주민들의 만성적인 비소노출 정도를 평가하고 이것이 산화적 유전자 손상에 미치는 영향을 평가해보고자 시행되었다. 충북지역의 모 폐광산 지역에 거주하는 주민 중 본 연구에 포함된 165명의 여성들의 평균 요중 비소 산술 평균농도는 \(7.09 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)creatinine으로 최고 높은 농도를 보인 사람의 농도가 \(29.48 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)creatinine으로 나타났다. 이는 산출한 단위의 차이로 인해서 직접 비교는 어렵지만 세계보건기구에서 정한 비직업적 노출기준인 \(30 \mu \mathrm { g } /1 \)를 초과하는 경우가 한 명도 없는 것으로 폐광산으로 인한 비소의 과다 노출은 없는 것으로 판단할 수 있다. 그러나 Huang 등이 우리나라에 거주하는 일반인 290명을 대상으로 보고한 평균 요중 비소농도 \(3.95 \mathrm {\mu g } / \mathrm { g } \)crea-tinine에 비해서는 다소 높은 수치를 보여주었다. 이러한 결과는 이들 광산이 폐쇄된 지 모두 40년 이상의 기간이 지났기 때문에 현재 시점에는 그다지 지역주민들에 대한 노출이 높지 않지만 일반 비노출 지역에 비해서는 다소 높은 것으로 판단된다.</p> <h2>요중 8-OHdG 농도 측정</h2> <p>대상자의 요중 8-OHdG 농도는 시판되는 ELISA kit (8-OHdG Check, Japan Institute for the Control of Aging, Japan)를 사용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 분석하였다. 최종 농도는 소변의 크레아티넌 농도로 보정한 값을 사용하였다.</p> <h2>요중 크레아티닌 정량</h2> <p>요중 크레아티닌량은 Jaffe 반응을 이용한 방법에 의해 정량하였다. 즉, 채취한 요를 증류수로 100배 희석한 희석뇨 \(150 \mu \mathrm { l } \)에 picric acid \((0.036 \mathrm { ~mol } / \mathrm { l } ) \) \(50 \mu \mathrm { l } \)와 \( \mathrm { NaOH } 25 \mu \mathrm { l } \)를 연속하여 넣고 잘 섞은 후, 정확히 15분간 반응시켰다. Microplate Reader (Spectra max 340, Tecan, Switzerland)로 \(510 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여, 크레아티닌 표준용액(아산제약, 한국)으로 작성한 크레아티닌 표준검량곡선으로부터 요중 크레아티닌량을 산출하였다. 이때 크레아티닌 \(0,5,10,15,20,25 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)를 표준 용액으로 사용하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>시행한 연구 결과는 SPSS 12.0 통계 프로그램을 이용하여 분석하였다. 두 지표간의 관련성은 Pearson correlation CO-efficient로 제시하였고, \( \mathrm { p }<0.05 \)를 유의한 것으로 판정하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>인구학적 특성</h2> <p>전체 대상자의 평균 연령은 \(64.3 \pm 11.2 \) 세였다. 대상자 165명 중에서 직장이나 학교에 다니는 사람은 3명이었으나, 이들 모두 직업적인 비소노출은 없는 것으로 확인되었다. 나머지 대상자는 모두 농사에 종사하거나 특정한 직업이 없는 전업주부였다. 대상자들의 평균 거주기간은 45년이었으며 10년 이상 거주자가 전체 대상자의 \( 92.1 \% \) (152명)를 차지하였다.</p> <h2>요중 비소 및 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) 농도</h2> <p>조사 대상자들의 평균 요중 비소 농도는 기하평균(기하표준편차)이 \(5.65(2.02) \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)creatinine으로 나타났으며 가장 노출이 적었던 사람은 \(0.67 \mathrm {\mu g } / \mathrm { g } \)creatinine, 가장 농도가 높았던 사람은 \(29.48 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)creatinine을 보여 주었다. 대상자들의 산화적 유전자 손상 정도를 평가하기 위하여 소변 중의 8-OHdG농도를 측정하였다. 그 결과, 대상자들의 평균 요중 8- OHdG농도는 기하평균(기하표준편차)이 \(2.78(2.81) \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)creatinine으로 나타났으며 \(0.45 \mathrm { gg } / \mathrm { g } \)creatinine에서 \(31.31 \mathrm {\mu g } / \mathrm { g } \)crea-tinine의 범위를 보여 주었다.</p> <p>비소의 만성적인 노출은 여러 가지 독성기전을 통해서 암을비롯한 유해작용을 유발하는데 그 중 하나가 산화적 스트레스에 의한 독성기전이다. 지금까지 알려진 바에 의하면, 비소는 체내에서 환원과정 또는 메칠화 과정으로 독성이 감소되면서 체외로 배설되는데, 이 과정에서 글루타치온(glutathion) 환원효소와 nitric oxide synthase 등의 항산화와 관련된 효소 등의 활성이 저하되는 반면, 지질의 과산화 및 활성산소의 생성은증가된다고 보고되었다. 폐금속광산 주변의 주민들은 폐광으로부터 유출되는 각종 금속에 만성적으로 노출될 가능성이 매우 높기 때문에 비소에 지속적으로 노출될 가능성도 높다고 할 수 있다. 본 연구에서도 고농도의 비소 노출은 없는것으로 나타났지만 저농도에 의한 만성적 노출을 배제할 수는없다. 이러한 의미에서 폐광산 주민들을 대상으로 비소농도에 따른 요중 8-OHdG 의 관련성을 파악하는 것은 매우 중요하다. 본 연구의 결과에서 요중 비소 농도는 8-OHdG와 유의한 상관관계를 보여, 폐광지역주민들이 비소에 만성적으로 노출되면서 체내에서 산화적스트레스를 유발할 가능성을 제시해 주었다. Chung 등이 일반인 572명을 대상으로 한 연구에서 총비소 농도와 요중 8-OHdG 농도가 상관계수 0.19의 유의한 상관관계를 보임을 보고하였다. 본 연구에서는 요중 총비소 농도와 요중 8-OHdG 농도 사이에는 상관계수 \(0.399( \mathrm { p }<0.001) \)의매우 높은 관련성을 보였다. 이는 본 연구의 대상이 되었던 폐광산 지역 주민들이 허용치 이상의 고농도의 비소 노출은 없지만 일정 농도의 비소에 만성적으로 노출되었고 이로 인해 산화적 유전자 손상이 발생했음을 시사하는 것이다. 또한 본연구의 결과는 만성적인 비소노출에 대한 효과지표(effect marker)로서 요중 8-OHdG의 농도가 매우 유용하게 이용될수 있음을 의미한다.</p> <p>본 연구에서 전체 대상자의 연령을 평균치 이하군과 이상군으로 나누어 요중 비소와 8-OHdG의 농도를 비교한 결과, 요중 비소농도와 8-OHdG의 농도가 모두 고연령층에서 상대적으로 높았으나 통계적인 유의성은 없었다. 요중 비소의 농도가 고연령군에서 높은 이유는 저연령군에 비해 폐광산 지역에서의 거주기간이 상대적으로 길고 \((48.25 \pm14.39 \)년 VS. \(29.63 \pm \) \(14.40 \)년) 이에 따른 노출시간이 길었기 때문으로 해석된다. 따라서 두 변수 사이의 관련성이 저연령군에서 더 높았던 것도 저연령군에서의 비소노출이 상대적으로 낮은 것과 관련이있을 것으로 사료된다.</p> <p>한편, 비소노출 농도에 따라 두 군으로 나누어 비교한 자료에서 8-OHdG의 농도는 고농도 노출군이 유의하게 높은 것으로 나타났으나 두 변수 사이의 관련성은 오히려 낮은 농도의 노출자들에서 더 높게 나타났다. 전체 대상자들의 노출정도가 모두 기준치 이하의 노출이었기 때문에 평균 농도를 기준으로 나눈 구분 자체가 큰 의미를 갖는다고 보기는 어렵지만 비소농도가 상대적으로 낮았던 저연령층에서의 관련성이 더 높았던 점을 종합해서 고려해 본다면, 비소노출에 의한 유전자 손상의 평가는 고농도의 비소노출보다는 저농도의 비소노출군에서 보다 정확하게 평가됨을 시사한다. 본 연구에서 이에 대한 정확한 이유를 파악하기는 어렵지만 비소의 노출정도에 따라 체내에서의 독성기전이 달라질 가능성을 배제할 수 없을것으로 판단된다.</p>	생명
Eucalyptus와 geranium이 마우스 splenocytes에서 IL-2 및 IL-4 생성에 대한 효과	<p>아로마는 그리스어 "향신료(spice)"에서 파생된 말로 오늘 날에는 일반적으로 "향"을 의미한다. 아로마 에센셜 오일은 식물에서 추출한 화학물질과 호르몬 성분으로 인체에 사용 가능한 오일은 약 300여 종 이상이 있으며 그중 약 60여 종의 오일이 이용되고 있다. 이들 오일 중 eucalyptus는 Eucalyptus globulus라는 식물의 잎에서 추출한 오일로서 thuione, carvone, menthrone, atlantone, vetivone, pino cam phone, piperitone, cryptone vervenone, jasmone, fenchone, pulegone 등의 복합성분으로 이루어져 있으며 항박테리아, 항바이러스, 해열작용, 항염증작용 등을 나타내는 것으로 알려져 있는, 케톤 군에 속하는 오일이다. Geranium은 Pelargonium graveolens라는 식물의 잎에서 추출한 오일로서 geraniol, a-terpineol, terpineol-4, sabinol, linalol, thuyanol 등의 복합성분으로 이루어져 있으며 항박테리아, 항바이러스 작용, 상처치유, 염증완화를 나타내는 것으로 알려져 있는, 알코올 군에 속하는 오일이다.</p><p>Interleukin-2 (IL-2)는 항원이나 마이토젠으로 활성화된 T림프구에서 주로 생성되는 \(15 - 19 \mathrm{KD}\)의 당단백으로 133개의 아미노산으로 이루어져 있다. IL-2는 원래 림프구 혼합배양이나 T세포 마이토젠으로 자극시킨 말초혈액 림프구 배양 상층 액에 존재하는 T세포성장인자(T-cell growth factor, TCGF)로서 기술되었으며 기능시험 결과 T세포성장을 증진시키는 것으로 밝혀졌고 이 TCGF는 thymocyte stimulation factor (TSF), thymocyte mitogenesis factor (TMF), T cell replacing factor (TRF), killer helper factor (KHF)와 동일의 사이토카인이였다. IL-2는 T세포 중에서도 주로 T helper 1 (Th1)세포에 의해서 생성되고 있으며 T helper 2 (Th2)세포가 생성하는 IL-4나 IL-10에 의해서 영향을 크게 받는다.</p><p>IL-4 는 129개의 아미노산으로 이루어진 분자량 \(15 - 19 \mathrm{KD}\)의 당단백이다. IL-4는 phorbol myristic acetate (PMA)로 자극시킨 EL-4 thymoma세포주 배양 상층 액에서 발견된 사이토카인으로서 B세포를 분화 증식시키기 때문에 B Cell Growth Factor (BCGF)로 불렸으며 또한 T세포의 분화증식에도 관여하고 있다. IL-4는 B세포 반응을 조절하는 T세포나 mast cell, 그리고 활성화된 basophil에서 생성되고 있다. 혈액질환에 대한 임상응용과 함께 항종양효과, 항이식편거절반응, 항graft-versus-host disease (GVHD)효과가 주목되고 있다.</p><p>본 연구에서는 eucalyptus와 geranium이 마우스면역에 미치는 효과를 보기 위하여 마우스림프구배양에서의 IL-2와 IL-4생성의 변화를 관찰하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물</h2><p>암컷 Balb/C 마우스로서 생후 8주 내외, 체중 \( 25\mathrm{~g} \) 내외의 것을 한국 효창 사이언스(대구, 경북)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.</p><h2>시약</h2><p>실험에 사용한 에센셜 오일, eucalytus와 geranium 에센셜 오일은 Razzmatazz Ltd.(England)의 제품으로서 Eucalyptus (Code No. AD01)과 Geranium (Code No. AD08)을 사용하였다.</p><h2>비장세포배양 상층액 준비</h2><p>비장세포배양 상층액 준비는 미리 준비된 비장세포 부유액을 \( 10 \% \)가 되게 소 태아혈청을 가한 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지 (complete \( 10\% \) FCS RPMI 1640)로 \( \mathrm{ml} \) 당 \( 2 \times 10^{6} \) 세포가 되도록 조절하여, 24 wells tis-sue culture plate (Costar, Cambridge, MA, USA)에 \( 1 \mathrm{~ml} \)씩 분주한 후 eucalyptue \( 10 ~\mu \mathrm{g}\), \(100 ~\mu \mathrm{g}\), \(1 \mathrm{~mg} \)을 각각 작용시키거나 geranium \( 0.1,1,10 ~\mu \mathrm{g} \)을 각각 작용시켜 \( 37 \mathrm{C}\), \(5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 배양하였다. 배양시간은 상기의 조건에서 2, 4, 24, 48, 72시간으로 하였다. 각각 일정시간 배양이 끝난 후 전량 배양액을 수거한 다음 \( 300 \times \mathrm{g} \)에서 10분간, \(10,000\times \mathrm{g} \)에서 30분간 원침 시킨 후 그 상층액을 수거하여 배양상층액에서 IL-2, IL-4 생성을 정량 하였다. IL-2 정량은 24, 48, 72시간 째, IL-4 정량은 2, 4, 24시간 째의 배양 상층액을 사용하였다.</p><h2>IL-2 측정</h2><p>IL-2 측정은 Quantikine \( { }^{\mathrm{TM}} \) Mouse IL-2 ELISA kit (R \( \& \) D Systems Inc., Minneapolis, USA)을 이용하였다. 간략하면 미리 IL-2에 대한 모노클론항체가 부착된 96 wells micro-plate의 각 well에 시료 희석 액 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 분주하고 시료 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩 을 적하하여 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 horseradish peroxidase가 함유된 항체액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하하여 다시 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5 번 세척한 후 hy-drogen peroxide와 tetramethylbenzidine이 포함된 기질 액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하하여 실온에서 30분 동안 방치한 후 stop 액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 가하였다. Optical density는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p><h2>IL-4 측정</h2><p>IL-4 측정은 Quantikine \( { }^{\mathrm{TM}} \) Mouse IL-4 ELISA kit (R \( \& \) D Systems Inc., Minneapolis, USA)을 이용하였다. 간략하면 미리 IL-4에 대한 모노클론항체가 부착된 96 wells micro-plate의 각 well에 시료 희석액 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 분주하고 시료 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하 하여 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 horseradish peroxidase가 함유된 항체 액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하 하여 다시 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5 번 세척한 후 hydrogen peroxide와 tetramethylbenzidine이 포함된 기질액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩 을 적하하여 실온에서 30분 동안 방치한 후 stop액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 가하였다. Optical density는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p><h2>통계학적 분석</h2><p>실험성적은 평균 또는 평균\( \pm \)표준편차로 나타냈으며 각 군 간의 통계학적 검정에는 Student's t-test를 사용하고 P값이 0.05 미만일 때 의의 있는 차로 간주하였다.</p> <h1>고 찰</h1><p>아로마테라피란 건강과 삶의 만족을 증진시키기 위하여 에센셜 오일을 적합하게 사용하는 것을 말한다. 에션셜 오일의 가장 빈번한 이용은 마사지나 목욕시 피부를 통한 흡수방법이 있지만 그 외에도 후각, 호흡, 입을 통한 섭취방법 등이 적용되고 있다. 아로마 에센셜 오일이란 식물에서 추출한 화학물질과 호르몬 성분의 천연 식물향으로 부작용이 거의 없고 정신적 안정, 피부미용, 공기정화 등에 탁월한 효능이 있으며 향기요법은 향의 독특한 성분을 이용한 자연치료의 개념으로 이용되고 있다. 에센셜 오일은 각종 식물의 꽃, 잎, 열매, 줄기, 뿌리 등에 따라 추출방법이 다양하며 추출 부위에 따라 인체에서의 치료 효능도 다르기 때문에 효능별 오일의 종류 또한 여러 가지이다. 일부 에센셜 오일이 면역계의 유지, 억제, 자극을 위한 조절자로서 작용하고 있으며 류마티스 관절염, 혈관질환, 종양, 스트레스, 염증, 통증, 정신장애, 감염질환과 같은 여러 질환들의 상태를 호전시키는 데에 어떻게 작용하는 것인가에 대한 연구들이 보고 되고 있다. Shibata 등은 고압에 의한 스트레스를 나타낸 마우스에 향료를 노출시켰을 때 면양적혈구에 대한 항면양적혈구 프라크형성세포수의 정상회복과 흉선퇴화현상이 정상화되는 것을 관찰함으로서 스트레스에 의해서 유도된 면역억제가 향료에 의해서 회복됨을 보고하였다. Fujiwara 등은 고압 스트레스로 유발시킨 마우스의 면역억제현상이 여러 가지 향료에 노출시켰을 때 회복됨을 관찰하였으며 향료의 종류와 작용시간에 따라 그 효과가 달라질 수 있음을 보고하였다. Komori 등은 감귤류 향료를 우울성환자에 적용하면 항우울성 약제의 필요량이 감소되었고 이 향료의 치료효과는 신경내분비 호르몬과 면역능의 정상화차원에서 항우울제보다 더 효과적임을 관찰하였다. Al-Zuhair 등은 carra- geenan에 의해서 부종을 보인 쥐에 cardamomum종자유를 투여하였을 때 현저한 항염증작용이 나타남을 관찰하였다. 김 등은 정향나무나 다수의 식물추출물에 존재하는 기름 성분인 eugenol을 이용한 실험에서 아나필락시스 유발물질이 투여된 쥐에 eugenol을 작용시키면 강력한 항아나필락시스 효과가 나타남을 관찰함과 동시에 아나필락시스 유발물질이 투여된 쥐의 혈청내 히스타민의 상승 또한 eugenol의 주사에 의해서 현저히 감소함을 관찰하여 eugenol이 비만세포의 탈과립을 차단함으로서 항아나필락시스 특성이 나타남을 보고한 바 있다. Visioli 등은 lipopolysaccharide(LPS)를 미리 노출시킨 마우스 대식세포에 아로마 오일인 oleuropein을 작용시키면 nitrite생성이 증가하고 nitric oxide 생성효소의 활성이 상승하는 것을 관찰하여 내독소가 관여된 생체반응에서 대식세포 매개성 반응이 증강되어 결과적으로 생체방어에 유익할 수 있음을 보고하였다. Siani 등은 남아메리카나 아마존지역에서 궤양이나 염증에 민간약제로 널리 사용하고 있는 Protium이라는 식물들로부터 에센셜 오일을 추출하여 항염증활성을 측정하였다. 결과에서는 Protium속내의 종에 따라 상당한 차이를 보였다. 즉 NO 생성 등이 이들 식물의 종에 따라 증가 혹은 감소를 보인 것이다. 따라서 이들은 이러한 에센셜 오일이 병증에 따라 유효한 약제로서 사용될 가능성을 제의한 바 있다. Shinde 등은 Cedrus deodara에서 추출한 기름성분을 인위적으로 유발시킨 부종을 보이는 쥐에 작용시켰을 때 비만세포의 탈과립을 억제하고 lipoxygenase의 활성을 억제시킴을 관찰하였다. 이들은 결론적으로 C. deodara의 오일이 비만세포의 안정화, leukotriene생성의 억제를 통해서 항염증작용이 나타날 수 있음을 보고하였다. 또한 Shinde 등은 C. deo-dara의 오일을 투여한 쥐의 호중구부착능저해, 3형 혹은 4형 과민반응의 저해 등을 관찰하여 이들 오일이 체액성이나 세포성 면역반응에 저해효과를 보일 수 있음을 보고하였다. Mazor 등은 멕시코나 인도의 약용식물에서 추출한 ses-quiterpene 락톤이 사람 호흡기 상피세포의 인터루킨-8 유전자발현을 억제함을 관찰하여 항염증작용의 효과를 증명하였다. 본 연구에서는 아로마 에센셜 오일이 면역반응에서 중요한 기능을 맡고 있는 사이토카인 들 중에서 IL-2와 IL-4의 생성에 미치는 효과를 알아보고자 하였다. 시험관 내에서 비장세포에 eucalyptus를 작용시켰을 때 IL-2의 생성이 대조군에 비하여 eucalyptus 저농도\( (10 ~\mu \mathrm{g}) \)에서는 증가하였고 약간 높은 농도\( (100 ~\mu \mathrm{g}) \)에서는 초기 배양에서는 높게 생성되다가 시간이 경과되면서 감소를 보였다. 고농도\( (1 \mathrm{~mg}) \)에서는 초기 배양에서부터 감소함으로서 고농도에서는 오히려 IL-2생성의 저해인자로 작용할 수 있음을 보여준 결과이며 적정농도와 시간에 따라 IL-2생성의 증감을 보임을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과는 생체에 적용시 euca-lyptus의 적정농도에 따라서는 IL-2관련 면역반응의 상승효과를 기대해 볼 수 있을 것이다. 비장세포에 geranium을 작용시켰을 때에도 IL-2 생성이 저농도\( (0.1 ~\mu \mathrm{g}) \)에서 증가현상을 보였고 약간 높은 농도\( (1 ~\mu \mathrm{g}) \)에서는 초기 배양까지는 상승을 보이다가 시간이 경과되면서 감소하였으며, 고농도\( (10 ~\mu \mathrm{g}) \)에서 감소현상을 나타냄으로서 eucalyptus노출 때와 유사한 경향을 보였지만 저농도에서의 IL-2의 생성량은 gera-nium의 노출 때가 약간 높았다.</p><p>비장세포에 eucalyptus를 작용시켰을 때 IL-4의 생성은 IL-2의 생성 때와는 다른 양상을 보였다. 즉 eucalyptus 고농도\( (1 \mathrm{~mg}) \)의 초기 배양(2, 4시간)에서는 대조군에 비하여 증가를 보였지만 후기 배양(24시간)에서는 감소를 보였다. 약간 높은 농도\( (100 ~\mu \mathrm{g}) \)에서는 초기 배양에서 생성에 변화를 보이지 않다가 후기 배양에서 상승하였다. 그러나 저농도\( (10 ~\mu \mathrm{g}) \)에서는 IL-4생성에 큰 변화를 보이지 않았다. 즉, 생체에 적용시켰을 때 eucalyptus 저농도에서는 IL-4관련 면역반응에 큰 영향을 미치지 않으나 고농도에서는 미칠 수 있음을 의미한다 하겠다. 비장세포에 geranium을 작용시켰을 때 IL-4 생성은 노출농도 전반에 걸쳐 대조군에 비하여 상승을 보임으로서 eucalyptus 노출 때와는 다른 양상을 보였으며 IL-4관련 면역반응은 geranium의 농도가 낮을 때에도 상승을 보일 것으로 생각된다.</p>	생명
	<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>인간 제대혈 유래의 혈관내피세포인 Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)은 5\(\%\) FBS가 포함된 \( \mathrm{EGM}^{\mathrm{TM}} \) -2MV BulletKit \( { }^{\mathrm{TI}} \) (Lonza)에 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) penicillin streptomycin (Welgene)을 첨가하여 사용하였다. 세포는 \( 1 \% \) gelatin (sigma)로 코팅한 culture dish에 깔아 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\),\( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였으며, 세포가 \(80\sim 90\)\(\% \) confluence가 되면 Trypsin-EDTA (Welgene)을 처리하여 계대배양하였다.</p><h2>Hypoxia유도실험</h2><p>세포에 저산소 상태를 유발하기 위해서 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) (Sigma)나 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 의 DFO (Deferoxaminemesylate salt, Sigma)를 처리하여 저산소 상태와 유사한 환경을 조성하거나, \( 2 \% \mathrm{~O}_{2}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2}\), \(93 \% \mathrm{~N}_{2} \)로 이루어진 혼합가스를 주입한 hypoxia chamber를 사용하였다.</p><h2>RNA 추출 및 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)</h2><p>RNA는 Trizol \( ^{\circledR} \) (TAKARA)을 사용하여 분리하고 멸균한 3차 증류수에 녹여 사용하였다. cDNA합성은 PrimScript \( { }^{\mathrm{TM}} 1^{\text {st }} \) strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA)를 사용하여 RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)을 포함하는 반응액으로 60분 동안 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진행하였다. HUVEC에서의 SIRT1-7의 발현은 TaKaRa Ex Taq\( { }^{\mathrm{TM}} \) (TAKARA)를 이용하여 타겟 DNA를 합성하여 전기영동을 통해 확인하였다.</p><h2>면역조직화학염색 및 관찰</h2><p>HUVEC을 6-well plate에 HUVEC을 \( 2.5 \times 10^{4} \)개로 심고 안정화된 후, \( 100 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포를 phosphate buffered saline (PBS)로 3번 세척하고 \( 2 \% \) paraformaldehyde (Wako)에 5분간 반응시킨 후 PBS로 5분간 세척하고 \(0.1 \% \) Triton X-100 (Sigma)에 5분간 반응시켰다. anti-SIRT2 (1:100; abcam)를 \( 2 \% \) BSA가 첨가된 PBS 용액에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 처리하고 PBS로 세척 후, 형광이 부착된 2차항체(1:200; anti-rabbit Alexafluor 488 anti-rabbit \( \mathrm{IgG} \), invitrogen)를 상온에서 1시간 반응시켰다. 핵 염색을 위하여 상온에서 1 분간 \( 4^{\prime}, 6 \)-diamidino-2-(DAPI; Invitrogen)를 반응시켰다. 염색된 샘플은 형광현미경(Olympus)을 사용하여 관찰하였다.</p><h2>Matrigel을 이용한 저산소환경(hypoxia condition)에서의 혈관튜브형성능력 비교실험</h2><p>Matrigel Matrix (Becton Dickinson)를 96 well plate에 40\( \mu l \)씩 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(\mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 30분 배양시켜 겔로 굳혔다. Matrigel 위에 10,000개의 HUVEC과 \( 1 \% \)의 FBS를 포함한 EBM-2 배지 \(100 \mathrm{µl}\)를 넣어 3시간 30분 배양하였다. Hypoxia는 hypoxia chamber를 이용하였으며, SIRT2 inhibitor인 AK-1 (3-(azepan-1-ylsulfonyl)-N-(3-nitrophenyl) benzamide, Calbiochem)을 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 처리하였다. HUVEC의 혈관형성능력은 Image J프로그램을 사용하여, 세포의 길이를 측정하고 Excel로 통계처리 하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>저산소상태에서의 인간 제대혈 유래의 혈관내피세포 (HUVEC)의 세포형태</h2><p>Hypoxia에 의해 세포의 성장(growth), 부착(attachment), 증식(proliferation) 능력이 증진된다는 보고를 바탕으로, 먼저 HUVEC을 hypoxia 상태에서 배양하였을때, 세포의 형태를 확인하였다. 광학현미경으로 관찰한 결과, 정상산소상태 (normoxia)에서 보다 hypoxia chamber에서 18시간 배양한 세포의 부착능력과 세포상태가 더 양호하였다.</p><h2>저산소상태에서의 HUVEC세포의 SIRT family member의 발현</h2><p>Hypoxia에 의해 인간 제대혈 유래의 혈관내피세포에서의 SIRT family member의 발현을 확인하기 위해서, hypoxia 상태에서 4시간 배양한 세포에서의 SIRT family의 mRNA 발현을 측정한 결과, hypoxia상태의 HUVEC에서 SIRT1-5가 발현되며, SIRT1, 3, 4는 SIRT2, 5에 비해 현저하게 약하게 발현됨을 확인하였다. 그 중 SIRT2의 mRNA 발현이 가장 강한 것을 확인할 수 있었다. 이 사실을 바탕으로 하여, hypoxia와 SIRT2의 연관성을 알아보고자 다음의 실험을 진행하였다.</p><h2>저산소상태에서의 SIRT2의 핵 내 이동현상</h2><p>SIRT2 단백질은 주로 세포질 내에 존재하며, 세포주기에 의존하여 세포분열의 간기(interphase)와 유사분열(mitosis)동안에 핵 내로 이동한다고 보고되었다. 이러한 연구결과들을 바탕으로 hypoxia에 의해 SIRT2 단백질이 세포질에서 핵 내로 이동하는지 확인하기 위하여, \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 를 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 처리하여 hypoxia와 유사한 상태를 HUVEC에 주어 24시간 배양하였다. 그리고 면역조직화학염색법을 이용하여 SIRT2가 세포 내에 발현되는 위치를 확인한 결과, Normoxia에서는 SIRT2가 세포질에서 발현되었으나, Hypoxia에 의해 세포질에 위치해 있던 SIRT2가 핵 내로 이동된 것을 확인하였다.</p><h2>저산소상태에서의 SIRT2 발현과 혈관신생성장인자의 발현 증가</h2><p>기존의 연구들은 Hypoxia가 HIF-1\( \alpha \)를 안정화시키고, 안정화된 HIF-1\( \alpha \)에 의해 혈관신생성장인자의 발현을 유도하여 혈관신생을 일으킴을 보고하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 하여 Hypoxia에 의해 HUVEC에서 SIRT2와 혈관신생성장인자가 유도되는지를 mRNA 발현을 확인하였다. DFO를 \( 100 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 처리하여 세포에 hypoxia를 유도하여 24시간 배양한 결과, 기존 연구결과와 마찬가지로 hypoxia에 의해 HIF-1\( \alpha \)의 mRNA발현이 강하게 증가하였다.</p><h2>SIRT2 억제제에 의한 HUVEC의 혈관튜브형성능력 감소</h2><p>Fig. 4에서 Hypoxia에 의해 SIRT2와 VEGF의 발현이 증가한 사실을 바탕으로 하여, SIRT2의 발현에 의해서 혈관신생이 조절되는지 알아보기 위하여, Matrigel assay를 수행하였다. Matrigel에 HUVEC을 심고, SIRT2 억제제인 AK-1을 \( 10 \mu \mathrm{M} \)을 배지에 처리하여 normoxia와 hypoxia chamber를 이용한 hypoxia상태에서 3시간 30분을 배양하였다. 그 결과, normoxia 배양에서 보다 hypoxia배양에 의해 HUVEC의 혈관튜브형성 능력이 현저하게 증가한 것을 관찰하였으며, 산소농도가 다른 두 배양조건에 SIRT2 억제제인 AK-1을 처리하였을 때 모두 HUVEC의 혈관튜브형성능력이 감소됨을 관찰하였다. 이를 통해서 SIRT2의 발현억제를 통해서 HUVEC의 혈관형성 능력이 억제됨을 확인하였다.</p>	생명
계피 초임계 추출물 및 박 추출물의 항균·항산화 활성 비교	<h2>ABTS free radical 소거활성</h2> <p>ABTS radical을 이용한 항산화능 측정은 potassium persul-fate와 반응하여 암소에 방치하면 ABTS radical이 생성되는데 추출물의 항산화력에 의해 ABTS radical이 소거되어 radical특유의 색인 청록색이 탈색되는 원리를 이용한다. ABTS radi-cal 탈색 반응은 1 분 안에 종료 되므로 단시간에 측정할 수 있고, 극성과 비극성 물질 모두에 적용 가능하다.</p> <p>본 실험에서는 \( 80 \% \) methanol 추출물, SFE oil, SFM, cinna-maldehyde 및 trolox의 ABTS 라디칼의 소거활성을 측정하여 Table 4에 나타내었다. 계피 methanol 추출물은 \(\mathrm{100 \mu g / ml}\) 의농도에서 \( 93.12 \% \) 의 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였고, SFM중 \(\mathrm{200 bar 100 \mu g /ml}\) 의 농도에서 \( 93.21 \% \) 의 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다. 계피 methanol 추출물과 SFM 에서 높은활성을 나타낸 반면에 cinnamaldehyde, SFE oil 은 ABTS 라디칼 소거활성이 없었다. 이러한 항산화 결과는 cinnamaldehyde와 cinnamaldehyde 함량이 많은 SFC oil 보다 \( 80 \% \) methanol추출물과 SFM에 polyphenol과 같은 항산화 성분이 많이 포함되어 있기 때문이라 생각된다. 이전의 보고에 의하면 용매에 따라 \( 70 \% \) methanol, \(70 \%\) ethanol에서 항산화력과 polyphenol의 함량이 가장 많았고 hexane, chloroform 등의 비극성 용매 추출물에서는 항산화력과 polyphenol함량이 적었다.</p> <h2>계피 조건별 추출물 및 단일성분의 균 생육억제 효과</h2> <p>계피 추출물을 이용하여 Gram(+) 균과 Gram(-) 균에 대한 항균효과를 검섹한 결과는 Table 5에서 보는 것과 같이 SFE oil, cinnamaldehyde에서 모든 식중독 균에 대해 inhibition zone을 나타냈다. 그러나, \( 80 \% \) methanol 추출물과 SFM에서는 항균활성이 없었다. Gram(+)균에서는 B. cereus, L mano-cytogenes균에 대해 SFE oil 200 bar, 300 bar에서 높은 in-hibition zone을 보였고, 나머지 Gram(+)균에서는 SFE oil의 모든 압력조건에서 높은 inhibition zone을 보였다. 특히Gram(-)균 중 E. coli 에서는 cinnamaldehyde \( 2.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의농도에서 가장 높은 inhibition zone을 나타냈으며, SFE oil에서는 압력 조건에 관계없이 \( 200,300,400 \mathrm { bar } 2.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 이상 의 농도에서 높은 항균력을 보였다. 이에 반해 cinnamalde-hyde성분이 적게 함유된 \( 80 \% \) methanol 추출물, \( \mathrm { SFM } \) 에서는항균력 없었다. Cinnaaldehyde가 식중독균에 대해 항균력을 나타냈다고 보고되었으나, 본 논문에서는 다른 cam-phene, cineole, eugenol등의 성분들의 상호간의 상승 작용에 의해 SFE oil이 cinnamaldehyde보다 높은 항균력을 나타내는 것이라 생각된다.</p> <h1>감사의 글</h1> <p>이 논문은 2011학년도 계명대학교 대학원 학술연구 논문장학금과 교육과학기술부와 한국연구재단의 지역현신인력양으로 수행되었음에 감사드립니다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>계피 메탄올 추출물과 초임계 추출물의 수율</h2> <p>계피 메탄올 추출물과 초임계 오일과 박 메탄올 추출물(SFEoil: Supercritical Fluid Extraction oil, SFM: Methanol extractof SFE Marc)의 수율은 Table 1에 나타낸 것과 같이 계피의 메탄올 추출물은 \( 19.93 \% \) 의 수율을 보였다. 계피의 초임계 추출을 위한 최적의 조건을 검토하기 위하여 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 200,300 ,400 bar의 압력 조건에서 초임계 추출을 실시한 결과, 초임계오일과 박 메탄올 추출물의 수율은 용매 추출물에 비해 다소낮은 추출 수율을 보였으나, SFE oil과 SFM에서 압력이 높아질수록 수율이 증가하는 경향을 보였다. 생강 초임계 오일에서 온도에 관계없이 압력이 높아질수록 수율이 중가하였고, 개다래의 경우 초임계 추출물에서 온도, 압력, 시간에 비례적으로 수율이 증가하였다고 보고했다. 또한 초임계 유체 추출법에서는 보조용매의 사용에 따라 수율이 달라지는데, 우슬의 B-ecdysone 추출의 최적조건은 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } , 300 \mathrm { ~atm } , 20 \% \)methanol 조건에서 가장 높은 수율을 보였으며, 당근의 carotenoid 추출시에는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } , 300 \mathrm { ~atm } , 10 \% \) ethanol 조건에서 가장 많이 추출되었다. 따라서 초임계 유체 추출의 수율에 가장 많은 영항을 미치는 것은 압력이라 생각되고, 추출되는 천연물 성분의 화학적 성질에 따라서 온도, 보조용매 등에 의해 수율이 달라진다.</p> <h2>\( \mathrm { GC } / \mathrm { MS } \) 를 이용한 cinnamaldehyde 함량 분석</h2> <p>각 조건별 계피 추출물을 GC/MS를 이용하여 정유성분과 화학구조를 규명한 결과 (E)-cinnamaldehyde의 peak를 관찰하였고 화학구조를 규명한 결과는 Fig. 1과 같다. Cinnamaldehyde 함량을 구한 결과는 Table 2에 나타내었다. 그 결과 \( 80 \% \) 메탄올 추출물에 비해 SFE oil에서 cinnamaldehyde 함량이 약30~60배 이상 많이 함유되어 있었고, 특히 300 bar에서 cinna-maldehyde 함량이 가장 높음을 알 수 있었다. SFM에서는 \( 80 \% \) 메탄올 추출물 보다 cinnamaldehyde 함량이 적었고 압력이 높을수록 함량이 줄어드는 것을 확인하였다. 계피의 volatile oil과 oleoresin의 GC/MS 분석 결과 cinnamaldehyde가 검출된 성분의 \( 97 \% \) 를 차지하고, oleoresin의 경우는 cinnamaldehyde가 검출된 성분의 \( 50 \% \) 를 구성하고 있다고 보고되어있다. Cinnamaldehyde의 물리적 특성은 boiling point는 \( 246 ^ {\circ } \mathrm { C } \), water solubility는 \( 1,420 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \left (25 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 이다. 따라서 기존의 oil을 추출하는 soxhlet 추출법에 비해 초임계 추출법을 이용했을 때 더 많은 cinnamaldehyde를 얻을 수 있었다.<h2>DPPH free radical 소거활성</h2> <p>DPPH 는 분자 내 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이 때 분자의 움직임은 hydroxyl radical과 유사하여 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다 . ROS(reactive oxygen species)는 체내 방어기전에 의해 대부분 제거되지만 제거되지 못할 경우 생체분자들과 신속하게 반응하여 단백질의 변성이나 생체막의 지질 과산화, DNA 손상 등을 일으키며, 세포 내로 확산되거나 혈류를 통해 이동된 지질 과산화물은 새로운 radical 반응을 촉진시켜 각종 질환의 원인으로 작용 한다. 계피 methanol 추출물 및 초임계 추출믈, 초임계 추출물 박의 DPPH free radical 소거활성을 합성 항산화제인 BHA와 비교한 결과를 Table 3 에 나타내었다. 계피 SFE oil을 제외한 모든 조건에서 DPPH 소거활성이 높게 나타났으며, 특히 \( 80 \% \) methanol 추출물 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 에서 \( 93.98 \% \) 의 DPPH 소거활성이 나타났으며, SFM 중 200 bar 100 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 에서 \( 89.45 \% \) 로 \( \mathrm { SFM } \) 중 가장 높은 소거활성을 가지는 것으로 나타났다. Cinnamaldehyde와 SFE oil은 DPPH 활성이 나타나지 않았다. 계피의 경우 정유성분에 대한 연구가 대부분이며, 정유성분의 경우도 cinnamaldehyde의 기능성 항돌연변이, 항암 등에 대한 연구가 많다 \( [9,19] \). 반면 계피의 항산화력이나 항산화물질에 대한 연구는 미비하고, 정유 추출 후 남은 부산물에 대한 효능평가는 거의 이루어지지 않았기 때문에 본 연구에서 계피 박 추출물의 DPPH 라디칼 저해는 계피를 항산화 소재로 사용한 수 있는 새로운 연구이다.</p> <h2>추출 수율</h2> <p>추출 조건별 추출 수율은 추출 전 시료 건조물의 중량에대비 각 추출 방법에 의헤 생성된 추출 용액을 회전진공농축기로 감압 농축하여 나온 추출물 무게에 대한 백분율로 나타내었다.</p> <p>추출수율 \( ( \%, \mathrm { w } / \mathrm { w } ) = \) 추출물건조무게 \( / \) 시료건조무게 \( \times 100 \)</p> <h2>GC \MS 를 이용한 성분 분석</h2> <p>계피 초임계 추룰물을 EtOH에 희석한 후0.45 mu Mmem-brane filter로 여과하여 분석 시료로 사용하였다. 실험에 사용한 GC/MS system은 HP 190915-433 model (Paloalto,California, USA)이며 column은 HP-5MS \( (30 \mathrm { ~m } \times 0.25 \mathrm { ~mm } \), \( 0.25 \mu \mathrm { M } ) \) 를 사용하였고 Detector로는 MS를 이용하였다. ESImode에서 70 eV) 의 에너지로 이온화하였으며 TIC의 SCAN mode에서 검출이온 질량범위 \( 35 \sim 350 \) 흐로 선정하여 각 질량스폑트덤 중에서 가장 강도가 강한 main fragment ion을 중심으로 라이브리리를 검색하여 물질 확인 분석을 하였다.ㅡInjector temperature는 \( 260 ^ {\circ } \mathrm { C } \), detector temperature는 \( 280 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이며 carrier gas는 helium을 사용하여 flow rate를 \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \) 으로 사용하였다. Oven temperature는 최초 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분 동안 유지한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } / \mathrm { min } \) 속도로 \( 200 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 상승시킨 후, \( 200 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } / \mathrm { min } \) 속도로 \( 280 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 온도를 상숭시킨 후 20 분간 유지하였다. 라이브러리를 통헤 검색된 main peck인 계피의 주요 성분인 cinamaldehyde는 50, 500, 1,000 ppm의 농도로 제조한 후 정량 분석에 이용하였다.</p> <h2>a-a-diphenyl- \( \beta- \) picylhydrazyl (DPPH) radical 소거활성</h2> <p>시료의 free radical 소거 환성은 stable radical인 \( a-a \)-diphenyl- -3-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 환원력을 측정한것으로 \( 99 \% \) 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 회석한 회석액160 yll와 메탄올에 녹인 \( 0.15 \mathrm { mM } \) DPPH 용액 40 씨를 가하여 실은에 30 분 방치한 후 \( 517 \mathrm { ~nm } \) 에서 홉퐝도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 홉광도를 \( 1 / 2 \) 로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 \( \mathrm { RC } _ { 50 } \) 값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 BHA를사용하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>최근 생활수준이 향상됨에 따라 천연식품에 대한 소비자들의 선호 경향이 높아지고 식용 가능한 식물들에 대한 새로운 식품학적 가치가 인정되면서 천연물 유래의 활성물질 탐색에 연구가 집중되고 있으며, 이러한 천연 식물 자원을 대상으로 항균, 항산화, 항암을 비롯한 성인병 예방 및 면역증강 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 산소는 호흡을 하는 생물인 인체 내에서 꼭 필요한 원소이지만 외부적인 자극이나, 에너지 대사 과정 중에 발생하는superoxide,nitricoxide,hydroxyl, peroxyl, alkoxyl, hydroperoxyl radical과 같은 활성산소종(Reactive oxyzen species)은 미토콘드리아와 같은 세포 내 기관의 정상적인 대사 및 세포질 내 일부 효소들에 의하여 자연적으로 생성되며, 세포 내에 적당량이 존재할 경우 여러 가지 세포반응을 조절하는 인자가 된다. 하지만 과량의 활성산소종은 DNA 분전과 단백질의 불활성화 및 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 생체기능을 저하시킴으로써 노화를 유발 할 뿐만 아니라 류마티스성 관절염, 당뇨병, 심장병, 동맥경화, 암 등과 같은 여러 질환의 원인으로 잘 알려져 있다. 생체 내에는 활성산소로부터 세포를 보호하기 위한 방어 시스템이 있지만 현대인들은 환경오염, 스트레스, 식습관으로 활성산소에 노출되어 있다. BHT(butylated hydroxytoluene), BHA (butylated hydrox-yanisole), PG (proply gallate), TBHQ (tertiary butyihy-droquinone), ascorbic acid, tocopherol류, \( \beta \)-carotene 등은 활성산소를 차단하는 항산화제로서 사용되고 있지만, 지질변화 및 발암독성 때문에 사용이 제한되므로 천연식물 추출물이생체 내 항산화 방어시스템을 증가시키거나 ROS를 소거시키는 효과가 있다면 그 추출물은 다양한 질병을 예방하기 위한기능성 소재로 사용 될 수 있을 것이다.</p> <p>또한 전 세계적으로 합성 식품첨가물에 대한 안정성과 사용규정들이 다시 검토되면서 식품의 위생 관념이 철저해지고 있 는 추세이다. 그러나 지구 온난화 및 실내온도 상승 등 환경뿐만 아니라 외식의 확대와 학교급식의 의무화 등과 같은 단체 급식의 확대로 식중독 발생이 지속적으로 증가 하고 있는 추세이다. 국내 식중독 발생 현황은 2008년 354건, 7,453명으로 100만명 당 153.8명에 이른다. 식중독의 원인체는Escherichia coli, Salmanella sp, Staphylococcus aureus, Vibrio par-ahaemditicus 등이 주요 세균성 식중독의 원인체이며, 식중독 원인체가 불명확한 것을 제외한 전체 식중독의 \( 95 \% \) 가 식품위해미생물에 의한 식중독이 차지하고 있다. 이러한 식중독 원인 미생물이나 부패 미생물을 제어하여 식품을 안전하게 저장하기 위한 수단으로 nitrite, sorbic acid, sodium metabisulfite,염소제 등 다양한 합성 보존료가 장기간 사용되어왔다. 하지만 소비자들의 건강 지향적 욕구 증가와 안정성에 대한 의식 고조로 천연항균물질에 대한 선호 인식이 높아지고 있다.</p> <h2>ABTS radical 소거 활성</h2> <p>\( 7 \mathrm { mM } \) 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid) (ABTS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)와 \( 2.45 \mathrm { mM } \) potassium persulfate를 최종 농도로 흔합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS + 을 형성시킨 후 96 well에 \( 734 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도 값이 \( 0.70( \pm 0.02) \) 이 되게 phos-phate buffer saline (PBS, pH 4)로 희석하였다. 희석된 용액 \(180\mathrm{\mu l}\)에 sample \(20\mathrm{\mu l}\)를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물과 단일 물질의 유리 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 \( 1 / 2 \) 로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 \( \mathrm { RC } _ { 50 } \) 값으로 나타내었다.</p> <h2>사용 균주 및 배지</h2> <p>본 실험에서 사용한 Eschetichia coli \( \mathrm { O } 157: \mathrm { H } 7 \) 의 표준균주인ATCC 4388, Bacillus cereus의 표준균주인 ATCC 12573은 미국균주보존센터로부터, Staphylococcus aureus의 표준균주인 KCTC 1621, Listeria monaytogene의 표준균주인 KCTC 3710은 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터, Streptococcus mu-tans 의 표준균주인 KCCM 40105, Salmanella typhimurium의 표준균주인 KCCM 11862, Pseudamanas aeruginosz의 표준균주인 KCCM 1132, Vibrio parahaemolyticus의 표준균주인 KCCM11965 을 한국미생물보전센터로부터 분양 받아 각각의 균들을 tryptic soy broth (TSB, Difco, Detroit, USA)에 1백금이 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 shaking하여 3희 계대 배양 후 성장 최적조건에서 배양 시켰다. 또한, 생균수 측정을 위한 배지는 tryptic soy agar (TSA, Difco)를, 세균을 희석하기 위한 희석수로는 멸균 증류수를 사용하였다.</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>추출물의 항균력 검색은 disc diffusion method 법을 실시하였다. 균주를 \(100 \mathrm{ml}\) TSB에 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 shaking 하면서 24시간 배양하여 활성화시키고 3일 계대 배양 후 spectrophotometer (UNIKON922, Kontron, Milan, Italy)를 이용하여 \( 560 \mathrm { ~nm } \) 에서 O. D.값이 0.2가 되게 하여 균수를 \( 1 \times 10 ^ { 7 } \) \( \mathrm { cfu } / \mathrm { ml } \) 로 사용하였다. 고체배지에 멸균된 glass spreader로 균을 고르게 spread 한 후, \( 8 \mathrm { ~mm } \) paper disc (diamerter \( 8 \mathrm { ~mm } \), Adantec co., Tokyo, Japan)를 올려놓은 다음 추출물을 최종농도가 \( 0.5,2.5,5 \mathrm { mg } / \mathrm { disc } \) 가 되도록 DMSO에 용해시키고 \(50\mathrm{\mu l}\)를 주입하여 완전히 흡수시킨 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위의 inhibition zone \(\mathrm{mm}\)의 직경을 측정하였다.</p> <p>계피(Cinnamomum verum)는 중국 남부 및 북 베트남에서주로 많이 생산된다. 모양은 반관상, 반통상 또는 한쪽으로 말려 들어가 있는 관상의 껍질인데, 대부분 조각 형태로, 크기는 다양하다. 바깥 면은 짙은 적갈색이고 내면은 평탄하나 역시 적갈색이고 파절이 용이하다. 특이한 향이 있고 맛은 처음에 약간 달고 매우며 나중에는 점액성을 띄고 떫다. 성분은cinnamic aldehyde가 주성분이며, 그 외에도 cinnamyl ace-tate, phenylpropylacetate, cinnamic acid, salicylaldehyde 등이 있으며, diterpenoid류로는 cinnzeylanol이 존제한다. 그 외에도 정유(essential oil)로서 camphene, cineole, eugenol 등이 있다. 계피는 다양한 효능과 향이 있어 한방 및 민간요법에서 널리 사용되어 왔으며, 차, 음료 또는 한약의 제료로 오랫동안 사용되고 있다. 알려진 약리작용으로는 헐압강화, 말초혈관확장, 혈액순환이 있고, 한방에서는 감기, 진통에 사용되고 있다 .</p> <p>이처럼 질병의 치료와 예방을 위해 천연물로부터 유용성 성분을 분리하는 많은 연구방법이 제시되어 왔다. 그러나 대부분의 천연유효성분은 그 구조가 매우 복잡하고 정교할 뿐만아니라 불안정하여 이들을 효율적으로 추출하는데 어려움이있다. 현재 식물 내 유효성분을 추출하기 위한 방법으로는 특정 용매에 대한 구성물의 용해도 차이를 이용하는 용매 추출법이 널리 쓰이고 있지만, 이는 높은 온도릅 장시간 사용해야함으로써 발생하는 유용성분의 변성이나 파괴가 야기되고, 사용된 용매의 일부가 유용성분에 잔존한 가능성이 있어 이용에 제한적이다. 따라서 위의 단점을 보완하기 위한 추출법으로써 초임계 유체를 이용한 초임계 추출법이 주목 받고 있다. 초임계 추출공법은 저온에서 조작할 수 있어 천연물과 같이 열에 약한 물질의 추출에 유용하며, critical point 이상의 압력과 온도를 설정해 줌으로써 액상의 용해력과 기상의 확산계수가 높고 점도가 낮기 때문에 빠른 추출과 상 분리가 가능하다.</p> <p>최근의 초임계 유체 추출기술에는 이산화탄소가 가장 널리이용되고 있는데, 이는 이산화탄소의 닞은 임계 온도와 압력으로 온화한 조건에서 추출을 수행할 수 있으며, 독성, 가연성,추출대상물질과의 반응성 및 부식성이 없고 고순도의 이산화탄소를 쉽게 구할 수 있기 때문이다. 그리고 온도에 민감한 물질을 변성이나 분헤 없이 분리할 수 있어서 식품이나 의약등 인체에 직접 적용되는 제품의 생산에 매우 유용하나,아직 추출법에 따른 유용성분의 추출과 관련된 체계적인 연구는 없다. 또한 추출하고 남은 부산물(박)은 폐기하는 실정이므로 이에 대한 활용방안도 고려해 보아야 한다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 천연 식물소재인 계푀를 이용하여 용매추출, 초임계 추출 공정을 통한 초임계 오일과 박 추출물 의 항산화력 및 항균활성 특성을 검토하고, 각 조건별 추출물 의 cinnamaldehyde 함량을 분석하여 천연식품의 유용성분 분 리의 기초자료를 얻고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>계피 메탄올 추출물 제조</h2> <p>본 실험에서 사용한 계피는 대구시 약령시장에서 건조 상태의 것을 구입하여 분쇄한 후, 무게의 10 배량의 \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 의 \( 80 \% \)메탄올을 가하여 \( 24 \mathrm { hr } \) 정치하여 총 3 회 반복 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No. 3, Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (UT-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 농축한 후 동결 건조하여 메탄올 추출물로 사용하였다.</p> <h2>계피 초임계 추출물(SFE Oil)의 제조</h2> <p>초임계 추출에 사용할 초임계 추출 장치는 Waters AD-RC 08 (Waters CO., Milford, MA, USA)를 사용하였다. 시료를 추출 용기에 300g을 넣어 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) flow rate: co-solvent의 flow rate를 \( 47.5 \mathrm { ~g } / \mathrm { min } : 2.5 \mathrm { ~g } / \mathrm { min } \) 으로 하여 total flow rate \( \left ( \mathrm { CO } _ { 2 } \right . \) flow rate + co-solvent flow rate)를 \( 50 \mathrm { ~g } / \mathrm { min } \) 의 속도로 흘려주었고 co-solvent로는 HPLC급 ethyl alchol (JT Baker Co., Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였다. 추출 은도는 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 추출시간은 120 분으로 고정하였으며 압력을 200, 300, \( 400 \mathrm { bar } \) 로하여 압력이 다른 3 가지 조건에서 추출하였다. 회수된 추출물을 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 회전진공농축기(EYELA Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축한 후 실험에 사용하였다.</p> <h3>초임계 박 메탄올 추출물(SFM) 제조</h3> <p>초임계 추출을 하고 남은 부산물인 계피 박을 무게의 10 배 \( (w / v) \) 의 메탄올( \( 80 \%) \) 을 가하여 \( 24 \mathrm { hr } \) 정치하여 3회 반복하여 회수된 추츨물을 여과하여 rotary vacuum evaporator로 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 감압 농측한 후 동결 건조하여 사용하였다.</p>	생명
Chondromyces crocatus의 순수 분리	<h2>16S rDNA 염기서열의 분석</h2> <p>16S rDNA는 야생점액세균으로부터 분리된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 두 개의 oligonucleotide 5'-GAGTTGTCC-GGCGAG-3'(27f)과 5'-AGAAGGGGTATCAGC-3'(1525r)을 사용하여 증폭하였다. PCR을 통해 증폭된 DNA 단편은 다른 연구자에 의해 보고된 primer들을 사용하여 염기서열을 결정하였으며, 염기서열 분석에는 Clustal W 프로그램을 사용하였다. 얻어진 염기서열은 미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 GenBank에 등록하였는테, C. crocatus KYC2823의 16S rDNA 염기서열 accession number는 FJ176772이다.</p> <h2>형태학적 특성조사</h2> <p>단일 세포 관찰에는 Nikon ECLIPSE E600 위상차현미경을 사용하였으며, 집락과 자실체의 관찰 및 자실체의 채취에는 Nikon SMZ1000 입체현미경을 사용하였다.</p> <h2>PCR을 이용한 polyketide 합성 유전자 탐색</h2> <p>Type I polyketide 생합성 유전자중 ketosynthase 부위를 증폭할 수 있는 한 쌍의 oligonucleotide 5'-GCSATGGAY-CCSCARCARCGSVT-3'과 5'-SCCSGTSCCRTGSSCY-TCSAC-3'을 primer로 하고, KYC2823의 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 그리고 얻은 PCR 산물을 pGEM-T easy vector(Promega)에 클로닝하여 DNA 염기서열을 밝힌 후, NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 데이터베이스에 있는 서열과의 상동성을 분석하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Chondromyces spp.의 분리</h2> <p>다양한 환경에서 채취한 토양을 STEX 평판배지 위에 올려놓고 배양하면 토양 속에 들어있는 용균성 점액세균들이 E. coli를 영양분으로 이용하면서 자라게 된다. 그리고 E. coli가 모두 이용되어 영양분이 고갈되면 점액세균들이 수십만마리 단위로 뭉쳐서 다양한 형태의 다세포 자실체를 형성하게 된다. 이러한 조건에서 Myxococcus나 Corallococcus 속에 속하는 균주는 일반적으로 2주 이내에 20~40배의 입체 현미경으로 쉽게 관찰되는 자실체를 형성하지만, Chondro-myces 속에 속하는 점액세균들은 성장속도가 느려 동일 조건에서 한 달 이상 배양하는 경우에 자실체 형성이 관찰되었다. 국내 전역에서 채취한 총 1,784 개의 토양시료를 사용하여 자실체 형성을 유도하였을 때 Myxococcus나 Corallococcus 속에 속하는 균주들의 경우에는 일반적으로 토양시료 당 1~4 종류의 자실체를 형성함을 관찰할 수 있었다. 하지만 Choncromyces의 자실체는 전체 토양시료에서 약 15 개의 자실체만이 관찰되었으며, 이 중 C. crocatus의 자실체로 추정되는 것은 6 개였다. 이러한 결과는 국내에서 채취된 토양시료에 Chondromyces 균주들이 Myxococcus나 Corallococcus 균주들에 비해 훨씬 드물게 존재함을 보여준다. 유럽의 경우에도 C. crocatus 균주들이 극히 드물게 분리되었다고 보고되었다. 본 연구에서는 STEX 배지 상에 형성된 자실체를 멀균된 바늘로 새로운 배지로 옮기는 방식으로 C. crocatus로 추정되는 6개 균주 KYC2712, KYC2747, KYC2823, KYC2606, KYC2607, KYC2906을 일차적으로 분리하였다(Table 1). 이들은 각각 전남 순천, 경남 남해, 경북 청도, 충남 논산, 경북 예천, 전남 해남에서 채취한 토양시료에서 분리되어 주로 충청 이남에서 분리되었고 강원도와 경기도 지역에서 채취한 토양시료에서는 분리되지 않은 것으로 나타났다. 하지만, 분리된 균주수가 많지 않은 까닭에 이러한 결과가 어떠한 의미가 있는지는 확실하지 않다.</p> <h1>서 론</h1> <p>점액세균은 다세포 자실체를 형성하는 그람음성 토양세균으로 다양한 생리활성물질을 생산하는 것으로 잘 알려져 있다. 점액세균은 종에 따라서 다양한 형태의 다세포 자실체를 형성하는데, Chondromyces crocatus는 점액세균 중에서도 가장 복잡하고 아름다운 다세포 자실체를 형성하는 종이다. 전 세계적으로 Chondromyces 속에 속하는 점액세균들은 Myxococcus, Corallococcus, Sorangium 등의 점액세균에 비해 소수의 균주가 야생으로부터 순수 분리되었으며, 특히 C. crocatus의 경우에는 분리하는 과정에서 Sphingobacterium과 유사한 동반 세균이 항상 함께 분리되는 까닭에 분리된 균주들 중에서도 동반 세균 없이 완전히 순수하게 분리된 것으로 확인된 균주들은 극소수이다. 이중 C. crocatus의 새로운 표준균주로 제안된 균주 Cm c5는 1988년 독일 연구팀에 의해 브라질 이과수 부근의 열대우림에서 채취된 토양에서 분리된 균주로 성장에 동반 세균을 필요로 하지 않는다. 분리된 균주 수는 많지 않아도 C. crocatus에 속한 균주들로부터 ajudazol, chondramide, chondrochloren, crocacin, crocapeptin, thug-gacins 등 여섯 종류 이상의 생리활성물질이 분리되었다. 이 중, ajudazol과 crocacin는 진핵생 물의 전자전달계 저해제이며, thuggacin은 Mycobacterium tuberculosis에 항균활성을 갖는 항생 물질이고, chondramide는 진핵생물의 actin cytoskeleton의 기능에 영향을 미치는 물질이다. 이러한 물질의 중요성이 인식되면서 최근에 ajudazol, chondramide, chondrochloren의 생합성 유 전자들이 클로닝되었다.</p> <p>국내에서는 그 동안 C. crocatus 을 포함하여 Chondro-myces 속에 속하는 점액세균의 분리에 대한 보고가 전무하였다. 따라서 본 연구에서는 국내 여러 지역에서 채취한 토양으로부터 Chondromyces 속 균주로 보이는 균주를 분리하고자 하였으며, 그 결과로 동반 세균과 함께 존재하는 여섯 균주의 C. crocatus 추정 균주들을 분리할 수 있었다. 그리고 여러 분리 단계를 거쳐 이들 중 동반 세균이 완전히 제거된 C. crocatus KYC2823을 최종적으로 순수 분리할 수 있었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 배지 및 배양 조건</h2> <p>C. crocatus의 분리를 위해서 ST21 평판배지 표면에 Escherichia coil MC4100 생균을 도말한 배지(STE)를 사용하였으며, 자실체 형성 유도를 위해서는 WC 배지 표면에 E. coli 생균을 도말한 배지(WCE)를 사용하였다. 일반적인 배양에는 CY 평판배지를 사용하였고, 배양은 \( 32 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 이루어졌다.</p> <h2>Chondromyces 균주들의 분리</h2> <p>전국 각지에서 채취한 소량의 토양시료를 cycloheximide가 \( 300 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \)의 농도로 들어있는 STE 평판배지(STEX) 위에 올려놓고 \( 32 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 한 달간 배양한 후, 배지 상에 형성된 C. crocatus 특유의 자실체를 멸균된 바늘로 새 STE 배지로 옮기고, \( 32 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2주간 배양함으로써 균주들을 일차적으로 분리하였다. 이때, 일차 분리된 균주가 동반 세균 이 외의 다른 미생물들에 오염되어 있는 경우에는 이 과정을 1회 더 반복하였다. 이후, 일차 분리된 균주의 집락 모서리 세포를 새로운 STE 배지에 옮김으로써 동반 세균을 제거하고자 하였으며, 동반 세균이 제거된 균주를 CY 배지에서 단일 집락으로 분리함으로써 최종적으로 순수 분리된 균주를 얻을 수 있었다. 일차 분리된 균주들과 최종 분리된 균주는 점액세균은행 (www.myxobank.or.kr)에서 보관 관리되고 있다.</p> <p>C. crocatus는 다른 점액세균 균주들과는 달리 분리과정에서 Sphingobacterium과 유사한 동반 세균이 항상 함께 분리되는 것으로 알려져 있다. 현미경 관찰 결과 본 연구에서 일차적으로 분리된 균주들도 모두가 Fig. 1E에서 보인 바와 같이 동반 세균으로 추정되는 다른 세균이 존재함을 확인할 수 있었다. C. crocatus가 함께 존재하지 않으면 동반 세균은 계속 자랄 수 없기 때문에 동반 세균의 생존에는 C. crocatus가 반드시 필요하지만, 동반 세균이 없어도 정상적으로 성장하며 자실체를 형성하는 균주가 존재하는 것으로 보아 C. crocatus는 균주에 따라서는 동반 세균의 존재를 반드시 필요로 하지 않는 경우가 있는 것으로 보인다. 본 연구에서 관찰된 동반 세균도 점액세균에 비해 크기가 작은 간균으로 형태적으로는 다른 연구자에 의해 보고된 동반 세균과 유사하였다. 하지만 순수 분리할 경우 동반세포가 사멸하는 까닭에 현재로서는 이들이 다른 연구자들에 의해 보고된 동반세균과 동일한 종류인지는 확실하지 않다.</p> <p>일차 분리된 균주들의 집락을 현미경으로 관찰하였을 때, 모서리 부분에서는 동반 세균이 다른 부분에 비해 적거나 잘 관찰되지 않는 모습을 보였다. 아마도 이러한 현상은 집락의 모서리 부분에서 개별 점액세균들이 활주운동에 의해 밖으로 이동한 반면에 대부분의 동반 세균들은 집락 안에서 다른 점액세균과 머물러 있음으로써 발생한 것으로 보인다. 본 연구에서는 이러한 특성을 이용하여 집락의 모서리 부분에 위치한 점액세균을 멀균된 바늘로 채취하여 새로운 STE 배지에 옮기는 방식으로 일차적으로 분리된 6균주들을 대상으로 동반 세균이 제거된 C. crocatus 균주를 순수 분리하고자 하였다. 그 결과 다른 5 균주들의 경우에는 여러 번의 시도에도 불구하고 동반 세균을 제거할 수 없었지만, 경북 청도의 토양에서 분리한 균주 KYC2823의 경우에는 동반 세균을 완전히 제거한 상태의 균주를 얻을 수 있었다. 순수 분리한 균주 KYC2823은 다른 균주들과는 달리 다양한 배양 조건에서 동반 세균의 존재가 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 1D).</p> <h2>분리균주 KYC2823의 특성 및 동정</h2> <p>순수 분리한 균주 KYC2823은 STE 배지에서 E. coli를 영양분으로 이용하여 성장할 수 있었지만 셀룰로오스를 이용해서는 자랄 수 없는 용균성 점액세균으로, STE 배지 이외에도 WCE, CY 배지에서 성장할 수 있었다. 세포의 모양은 표준균주로 제안된 C. crocatus Cm c5와 같이 Chondromyces 특유의 간균형태였으며(Fig. 1D), 활주운동성을 가져 점액세균 고유의 집락 형상을 이루었다. 자실체 형태는 전통적으로 점액세균의 분류 및 동정에서 가장 중요한 기준이 되어왔는데, C. crocatus의 경우에는 다른 점액 세균과 확연히 구분되는 독특한 형태의 자실체를 형성한다. 이에 더해, C. crocatus의 집락은 다른 점액세균과는 구별되는 독특한 향을 발산한다. KYC2823은 WCE 배지에서 Cm c5 균주와 동일하게 C. crocatus 특유의 자실체를 형성하였으며(Fig. 1B), C. crocatus 집락 특유의 향을 발산하였다. 또한, 균주 KYC2823의 16S rDNA 염기서열 \( (1,546 \mathrm { bp } ) \)을 분석한 결과 KYC 2823은 표준균주 Cm c5의 16S rDNA 염기서열과 \( 99.8 \% \)의 동일함을 보였다(Fig. 2). 따라서 이러한 형태적, 생리적, 분자생물학적 특성들에 기초하여 본 연구에서는 균주 KYC2823을 C. crocatus로 최종 동정하였다.</p> <h2>C. crocatus KYC2823이 갖는 polyketide 생합성 유전자 탐색</h2> <p>C. crocatus Cm c5은 ajudazol, chondramide, chondro-chloren, crocacin, crocapeptin, thuggacins 등 6종류 이상의 생리활성물질을 생산하는 것으로 알려져 있으며, 현재까지 이 균주로부터 ajudazole과 chondramide 그리고 chondrochloren의 생합성 유전자들이 클론닝되었다. 국내에서 분리한 C. crocatus KYC 2823도 Cm c5 균주와 마찬가지로 이러한 유전자들을 가지고 polyketide 계열의 다양한 생리활성물질을 생산하는지, 또 아직까지 클로닝되지 않은 다른 polyketide 계열 생리활성물질 생합성 유전자들이 존재하는지를 알아보기 위하여 Komaki 등에 의해 보고된 PCR 방법으로 KYC 2823이 갖는 polyketide 생합성 유전자들을 분석하여 보았다. 이를 위해 먼저 KYC 2823 유전체 DNA를 주형으로 사용하고, type I polyketide synthase의 \( \beta \)-ketoacyl synthase 모듈 DNA 염기서열에 특이적인 두 개의 oligonucleotide를 primer로 사용하여 PCR을 수행한 후, 얻어진 PCR 조각을 pGEM-T vector에 클로닝하고, 이들의 DNA 염기서열을 분석하였다. 총 31개의 클론된 PCR 조각을 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 분석한 결과, 25 개의 PCR 조각은 Cm c5 균주의 ajudazol 생합성 유전자 ajuB[1]의 아미노산 서열과 모두 \( 90 \% \) 이상의 상동성을 보였으며(Fig. 3A), 다른 2 개의 PCR 조각은 chondramide 생합성 유전자 cmdA[13]의 아미노산 서열과 각각 \( 99 \% \) 이상의 상동성을 보였다(Fig. 3B). 이러한 결과는 KYC2823이 ajudazol과 chondramide 생합성 유전자를 가져 이들 물질을 생산할 가능성이 매우 높음을 보여준다. Ajudazol은 진핵생물에서 미토콘드리아의 전자전달을 전해하는 물질이며, chondramide는 진핵생물의 actin cytoskeleton의 기능에 영향을 미치는 물질이다. 또 다른 2개의 PCR 조각은 polyketide synthase 유전자 조각이기는 하지만 데이터베이스에 존재하는 서열과는 \( 77 \% \) 이하의 낮은 상동성을 보였다(결과 보이지 않음). C. crocatus으로부터 생합성 유전자가 클로닝되어 염기서열이 테이터베이스에 수록된 polyketide 계열 물질은 ajudazol, chondramide, chon-drochloren이므로 이들 두 PCR 조각의 유전자는 이미 클로닝된 세 물질의 유전자 외에 crocacin, crocapeptin, thuggacins과 같이 C. crocatus 분리된 다른 물질 또는 아직까지 밝혀지지 않은 전혀 새로운 물질의 생합성 유전자인 것으로 추정된다. 한편, 나머지 2개의 PCR 조각은 polyketide synthase 유전자가 아닌 것으로 분석되었다.</p> <p>C. crocatus는 점액세균 중에서 가장 복잡하고 아름다운 다세포 자실체를 형성하는 종이며, 적은 수의 균주가 분리되었음에도 불구하고 이들로부터 진핵생물의 전자전달계 저해제, actin cytoskeleton에 영향을 미치는 물질들과 같은 여러 흥미로운 생리활성물질들이 발견되었다. 본 연구에서는 국내에서 채취된 토양으로부터 이러한 C. crocatus 1균주를 순수 분리하였으며, 또한 형태적 및 생리적 특성으로 보아 C. crocatus 일 것으로 판단되는 5 균주를 동반 세균이 존재하는 상태로 분리하였다. 분리된 균주들은 지역적으로 전혀 다른 곳에서 채취된 토양시료로부터 분리되었으며, 또 균주의 특성도 조금씩 차이가 있는 것으로 나타나 서로 다른 균주들인 것으로 판단된다. 따라서 이들 균주들은 모두 향후 C. crocatus의 자실체 형성 연구 및 생리활성물질의 생산 연구에 귀중한 재료로 사용될 것으로 기대한다.</p> <h1>요 약</h1> <p>국내 토양으로부터 Chondromyces crocatus KYC2823을 순수 분리하고, 또 다른 5균주를 동반 세균이 함께 존재하는 상태로 분리하였다. 균주 KYC2823은 경북 청도군에서 채취한 토양시료에서 분리하였으며, 자실체 형태와 특이한 향의 발산을 포함한 여러 특성이 전형적인 C. crocatus임을 보였다. 이에 더해, 16S rDNA 염기서열이 C. crocatus의 새 표준균주로 제안된 Cm c5과 \( 99.8 \% \) 유사하였다. 한편, PCR을 이용한 polyketide 생합성 유전자 조각의 클로닝 및 분석은 균주 KYC2823이 전자전달계 저해물질인 ajudazol과 actin cytoskeleton의 기능에 영향을 미치는 물질인 chon-dramide의 생합성 유전자, 그리고 아직까지 클로닝되지 않은 polyketide 계열 물질의 생합성 유전자를 가지고 있음을 보여주었다.</p>	생명
섬쑥부쟁이(Aster glehni Fr. Schm.) 분획물의 항산화 및 항염증 활성	<p>세포 독성 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 훕광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide 저해활성 측정</h2> <p>Nitric oxide \( ( \mathrm { NO } ) \) 측정은 세포의 상층액에서의 nitric oxide \( ( \mathrm { NO } ) \) 의 양을 nitrite와 nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 \( 2 \times 10 ^ { 6 } \) 개의 celt을 confluence가 \( 80 \% \) 일 때, PBS로 2 번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12 시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide(LPS) \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 을 대조군을 뺀 모든 well 에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. \( \mathrm { NO } \) 생성량은 24 시간 후에 상층액를 모아 griess 시약으로 10 분간 반응시킨 후에 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 \( \mathrm { NO } \) 의 양을 \( 100 \% \) 로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.</p> <h2>Western blot을 통한 단백질의 발현 측정</h2> <p>Raw \( 264.7 \) 세포를 \( 60 \mathrm { ~mm } \) tissue culture dish에 \( 2 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 섬쑥부쟁이 헥산층, 에틸아세테이트층 분획물을 농도별로 처리한 배지로 교환하고 24시간 배양한 후 PBS로 세척하였다. Lysis buffer \( 100 \mu \mathrm { L } \) 을 첨가하여 세포를 용해시키고 원심분리하여 \( \left (4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12,000 \mathrm { rmp } , 20 \mathrm { ~min } \right ) \) 세포막 성분들을 제거하였다. 원심 분리하여 얻은 단백질은 bradford assay로 정량하였으며, \( 60 \mu \mathrm { L } \) 의 단백질을 \( 10 \% \) 의 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동한 후, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 30 40 V에서 2 시간 이상 transfer하였다. Transfer가 끝나면 ponceau에 담근 후 band를 확인하고 TBST로 2회 이상 씻은 후 꺼내서 \( 5 \% \) skim milk로 overnight 시켜 background는 제거시켰다. 3 회 washing 후 1 차 antibody(1:1000)를 1 시간 동안 붙인 후 다시 2차 antibody(1:1000)를 붙이고 ECLkit(Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 film에 옮겨 측정하였다. Band density는 Gel doc(Bid-rad, America)으로 확인하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxi-dant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. \( \cdot \mathrm { NO } , \mathrm { HNO } _ { 2 } \), \( \mathrm { ONOO } ^ { - } \)와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)은 염증 반응 시 대식세포 호중구 및 다른 면역 세포들의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 이때 ROS도 같이 생성된다. 염증 반응의 조절은 대단히 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로 알려져 있다. 그러나 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 ROS와 RNS가 과다 생성되고 그 결과로 영구적인 유전자의 변형이 야기된다. 이처럼 ROS와 RNS는 생체 내 여러 가지 세포의 작용을 조절하는 염증 반응과 깊이 관련되어 있다. 염증 과정 중에는 많은 양의 염증유도 cytokines (proinflammatory cytokines), nitric oxide( \( \mathrm { NO } \)) 그리고 pro-staglandin \( \mathrm { E } _ { 2 } \left ( \mathrm { PGE } _ { 2 } \right ) \) 가 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 와 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의해 생성되며, 포유 세포에서 \( \mathrm { NO } \) 는 neuronal \( \mathrm { NOS } ( \mathrm { nNOS } ) \), endothelial \( \mathrm { NOS } \) (eNOS) 그리고 \( \mathrm { iNOS } \) 세가지 형태의 \( \mathrm { NOS } \) 에 의해 합성된다. \( \mathrm { nNOS } \) 와 \( \mathrm { eNOS } \) 는 세포 내에 항상 존재하지만, \( \mathrm { iNOS } \) 는 interferon- \( \gamma \), lipopolysaccharide(LPS) 그리고 다양한 염증유도 사이토카인에 노출되는 경우에만 발현된다.<p>방향성 식용식물자원의 하나인 섬쑥부쟁이는 울릉도 산지에서 자생하는 국화과 개미취 속 다년초로서 모양은 취나물과 비슷하게 생겼고, 울릉도에서는 부지깽이라고 부르는데 이른 봄 새순을 잘라 식용하면 향이 진하다. 높이 \( 1 \sim 1.5 \mathrm { ~m } \)로 근경이 옆으로 자란다. 잎은 호생하고 장타원형이며 끝이 뾰족하고 뒷면에 선점이 있으며 가장자리에 불규칙한 톱니가 있다. 꽂은 8-9월에 피며 원줄기 끝의 산방화서에 달린다. Aster속 식물들은 한방에서 뱀에 물린데 상처를 치료하거나 타박상을 치료하는녜 사용되어 왔다. 현재까지 섬쑥부쟁이에 관하여 알려진 물질로는 \( \beta \)-amyrin acetate, phytol, alismol, \( \alpha \)-tocopheryl, quinone, \( \alpha \)-spinasterol, 10-O-methyl-alismoxide, alismoxide, 3-O-[6'-O-palmitoyl- \( \beta \)-D-glucosyl]-spinasta-7, 22-diene[20]와 \( \alpha \)-pinene, limonene, \( \delta \) -elemene, \( \beta \)-pienene, cis-3-hexenol, myrcene 외 25종과 살초활성 물질인 coumarin이 있다. 본 연구에서는 섬쑥부쟁이 메탄올 추출물로부터 용매 분획한 섬쑥부쟁이 분획물에 대해 항산화, 항염증에 대한 여러 종류의 in vitro 검색법을 실시하여, 식품과 제약 그리고 화장품 산업에 적용하기 위한 천연소재로서의 가치를 검토하였다.</p> <h2>Hyaluronidase 저해활성 확인</h2> <p>Hyaluronidase(HAase)는 mocopoly saccharide splitting enzyme의 하나로서 모세혈관 투과성에 관여하고, 간염, 치주염 등의 염증 부위에서 활성이 증가하고 급성 부종을 일으키며, chemical mediator의 유리에도 관여하는 등 염증발현과 관련이 있는 효소로 dermis(connective tissue)의 기본 물질인 HA와 같은 산성다당류(acidic mucopolysaccharides) 에서 N-acetyl-glucosamic 결합을 끊는 것을 촉진하며, 이들의 분해 물질은 생물학적 시스템을 조절하는데 매우 중요하다. 섬쑥부쟁이 분획물이 HA를 분해하는 HAase를 저해 할 수 있는지 알아보고자 다양한 농도에서 효소 저해 효과를 측정하여 Fig. 4 와 같이 나타내었다. 섬쑥부쟁이 헥산 분획물은 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 17.91 \% \), 에틸아세테이트 분획물은 10 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 24.37 \% \), 부탄올 분획물은 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 15.74 \% \), 물 분획물은 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 8.75 \% \) 의 저해 효과가 나타났고, 대조군인 ( + )-Catechin의 경우, \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 31.61 \% \) 의 저해능을 나타네어, 섬쑥부쟁이 분획물이 고분자 hyaluronic acid의 염증반응 조절에 다소 낮은 역할을 한 것으로 나타났다.</p> <h2>Lipoxygenase 저해활성 확인</h2> <p>Lipoxygenase(linoleate: oxygen oxidoreductase : EC1.13.11.12)는 일중항 산소(singlet oxygen) 존재 하에서 cis, cis-1,4 pentadiene \( \left (- \mathrm { CH } = \mathrm { CH } - \mathrm { CH } _ { 2 } - \mathrm { CH } = \mathrm { CH } - \right ) \) 구조를 가지고 있는 불포화지방산에만 작용-하는 기질 특이성을 갖는 산화 효소이다. Lipoxygenase의 작용으로 arachidonic acid는 6-hydroperoxyeicosatetra enoic acid를 거처 5-hydroperoxy-eicosatetraenoic acid와 여러 가지 형태의 leukotriene을 생성 한다. 특히, 5-hydroperoxyeicosa tetraenoic acid는 neutrophil chemotaxis를 작용하여 여러 가지 형태의 염증 반응이 일어나는 동안 조직에서 증가되고 있는 것으로 보아 이들 화합물은 leukocyte를 새로 생기게 하는 효소의 release를 증진시키거나 항원의 침입을 알리는 mediator를 증진시키는 작용을 하는 것으로 추측된다. 본 실험에서는 linolenic acid를 기질로 하여 soybean lipoxygenase에 의한 과산화 반응을 조사한 결과를 Fig. 5 에 나타내었다. 모든 용매추출물에서 농도 유의적으로 흡광도 수치가 감소함을 알 수 있었고, 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서 \( 29.5 \% \) 로 비교적 높은 저해활성을 보였다. 이는, 대조군인 ( + )-catechin의 \( 18.97 \% \) 보다 우수하였으며, 에틸아세테이트 분획물은 대체로 저농도에서 우수한 활성을 보였다.</p> <p>전자공여능 \( ( \%) = \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Superoxide anion radical 소거능 측정</h2> <p>Supcroxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium (NBT) 횐원방법에 의해 측정하였다. 각 시료용액 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \)와 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.5) 0.6 \mathrm { ~mL } \) 에 xanthine \( (0.4 \mathrm { mM } ) \) 과 \( \mathrm { NBT } (0.24 \mathrm { mM } ) \) 을 녹인 기질액 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 를 침가하고 xanthine oxidase \( (0.049 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) 1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 37 \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } 1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 반응 을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 supcroxide anion radical의 양을 \( 560 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>저해율 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 superoxide anion radical 생성량 } } {\text { 무첨가군의 superoxide anion radical 생성량 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Hyaluronidase 저해활성 측정</h2> <p>Hyaluronidase(HAase) 저해활성 측정은 sodium-hyalu-ronic acid(HA)로부터 형성 된 \( \mathrm { N } \)-acetylglucosamine을 glu-coxazoline 유도체로 변형시킨 후 p-dimethylaminobenzalde-hyde(DMAB)로 발색시켜 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다. 0.1 M acetate buffer(pH 3.5)에 녹인 HAase \( (7,900 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) 0.05 \mathrm { ~mL } \) 와 시료용액 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 배양한 다음 \( 12.5 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } { } _ { 2 } 0.1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하고 혼합 후 다시 20 분간 배양하였다. 기질로서 \( 0.1 \mathrm { M } \) acetate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.5) \) 에 녹인 \( \mathrm { HA } (12 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } ) \) 를 첨가하여 다시 40 분간 배양하여 \( 0.4 \mathrm { ~N } \) potassiumtetraborate \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 및 \( 0.4 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { NaOH } \) 용액을 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시컸다. 냉각 시킨 반응물 에 발색제로 DMAB 시약 \( 3 \mathrm { ~mL } \) 을 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 배양한 다음 \( 585 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 저해활성을 산출 하였다.</p> <h2>대식세포(Raw 264.7)의 독성 확인</h2> <p>섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물에 의한 macrophage 세포의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과 Fig. 6과 같이 나타내었다. 즉 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물이 lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 nitric oxide의 생성을 감소시킨 것인지, 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 세포 독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하는 것인지를 측정한 결과, 전 농도에서 \( 20 \% \) 이하의 세포 독성을 나타내었다. 따라서 본 실험에서는 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 농도를 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이하의 농도에서 nitric oxide량을 측정하였다.</p> <h2>Nitric oxide 저해활성 확인</h2> <p>내독소로 잘 알려진 lipopolysaccaride(LPS)는 그람 음성균의 세포외막에 존재하며, Raw \( 264.7 \) 세포와 같은 macro-phage 또는 monocyte에서 tumor necrosis factor-alpha(TNF-undefined</p> <p>flammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있다. Raw \( 264.7 \) cell의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 섬쑥부쟁이 분획물을 농도별로 세포에 처리하여 생성되는 \( \mathrm { NO } \)량을 측정한 결과 Fig. 7과 같이 나타내었다. LPS를 첨가하지 않은 군에서는 10 12 \%의 \( \mathrm { NO } \) 를 생성하였고, 에틸아세테이트 분획물은 농도 의존적으로 \( \mathrm { NO } \) 의 생성을 억제하였으며, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( \mathrm { NO } \) 의 생성을 \( 25.9 \% \) 를 억제하였다. 이는 Byun 등 의 현삼 메탄올 추출물과 Kim 등의 상황 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 추출물의 LPS로 유도된 Raw cell의 \( \mathrm { NO } \) 생성 억제능 에 미치는 결과와 비교하여 보면 섬쑥부쟁이 분획물 중 에틸아세테이트 분획물의 \( \mathrm { NO } \) 생성 억제능이 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>\( \mathrm { iNOS } \) 단백질의 발현 측정 결과</h2> <p>자극에 유도된 \( \mathrm { iNOS } _ {\text { 는 } } \) 오래 기간 동안 다량의 \( \mathrm { NO } \) 를 생성하게 되고, 생성된 \( \mathrm { NO } \) 는 guanylyl cyclase의 활성과 동시에 주위 조직에 세포독성을 나타낸다. 즉 LPS로 유도되어진 Raw \( 264.7 \) cell에서 iNOS의 protein level의 감소에 의해 항염증 효과를 기대할 수 있나. 섬쑥부쟁이 에털아세테이트 분획물이 \( \mathrm { iNOS } \) 를 저해하는 효과가 있는지 알아보기 위하여 Raw \( 264.7 \) cell에 \( \operatorname { LPS } (10 \mu \mathrm { g } / \mu \mathrm { L } ) \) 을 처리 하고 1 시간 뒤, 섬쑥부쟁이 에털아세테이트 분획물을 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 로 처리 한 후 24시간 배양한 후 iNOS, protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH에 데한 섬숙부쟁이 \( \mathrm { EtOAc } \) 분획물의 iNOS protein 발현율 \( \therefore 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 을 처리한 능도에서 \( 81.5 \% \) 을 감소시켜 우수한 활성이 관찰되었나(Fig. 8). 본 연구에서는 섬숙부쟁이 분획물을 이용하여 항산화 효과와 항염증 효과를 동시에 가지는 활성을 탐색하였으며, 그 중 가장 우수한 활성을 나타낸 섬쑥부쟁이 에털아세테이트 분획물을 이용하여 pro-inflammation 및 anti- inflammation 등 다양한 메커니즘 내의 in vitro 검색법을 수행하였다. 결론적으로, 섬숙부쟁이 에털아세테이트 분획물의 항염증 활성은 관련 분야의 활용 가치로서 이용 가능성이 크다고 판단된다. 추가적인 연구로, 분획물 내 어떠한 화합물이 우수한 항염증 활성을 나타내는지를 확인하여 아토피 유발 \( \mathrm { NC } \) Nga mice를 이용한 항아토피 연구와 같은 in vivo test를 제안한다. 또한, 향후 기능성 화장품, 연고제 등의 산업적 가치를 고려했을 때, 제재 첨가 시에 따른 안정성 및 안전성 등에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.</p> <h2>전자공여능 확인</h2> <p>섬쑥부쟁이 메탄올 추출물과 각 용-매별 분획물 그리고 양성대조군인 ascorbic acid의 전자공여능을 농도별로 측정하여 비교한 결과를 Fig. 2에 나타냈다. \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 헥산층 분획물이 \( 12.86 \% \) 를 나타내었고, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물은 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 각각 \( 58.0 \%, 46.4 \% \) 의 전자공여능을 나타내었으며, 물 분획물은 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 23.09 \% \) 의 전자공여능을 나타내었다. 대조군인 ascorbic acid의 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 과 비교 시 에틸아세테이트 분획물이 \( 28.5 \% \) 의 전자공여능을 나타내어 ascorbic acid 보다 다소 낮은 활성을 확인할 수 있었으나, \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 값에서는 에틸아세테이트 분획물이 \( 8.90 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 로 ascorbic acid의 \( 9.39 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 와 비교 시 유의적인 효과를 나타내었다. 에틸아세테이트 분획물은 부탄올 분획물 또는 \( 70 \% \) 메탄올 추출물과 비교했을 때, 각 분획물 중 전자공여능이 가장 우수한 것으로 나타나 phenolic hydroxyl \( ( \mathrm { OH } ) \) 기가 free radical의 환원 능력에 영향을 미친 것으로 추정하였다.</p> <h2>Superoxide anion radical 소거능 확인</h2> <p>생체내 활성 산소종은 산소에서 유래된 것들로서 안정한 분자 상태인 triplet oxygen \( \left ( { } ^ { 3 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \) 이 자외선, 방사선, 화학반응, 대사과정을 통하여 생성되며 superoxide anion radical \( \left ( \mathrm { O } ^ { 2- } \cdot \right ) \), hydroxyl radical \( ( \mathrm { OH } \cdot) \), peroxyl \( \operatorname { radical } \left ( \mathrm { HO } _ { 2 } \right ) \), nitri-coxide radical( \( \mathrm { NO } \cdot) \) 과 같은 자유 라디칼들과 라디칼의 형태가 아닌 singlet oxygen \( \left ( { } ^ { 1 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \), 오존 \( \left ( \mathrm { O } _ { 3 } \right ) \), hypochlorous acid \( ( \mathrm { HOCl } ) \) 그리고 과산화수소 \( \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \) 등이 있다[12]. 섬쑥부쟁이 메 탄올 추출물을 이용한 분획물의 superoxide anion radical 소거능은 Fig. 3과 같이 나타내었다. 헥산 분획물의 경우 \( 500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 28.03 \% \) 의 소거능을 보였고, 에틸아세테이트 분획물이 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 64.65 \% \), 부탄올 분획물이 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 35.66 \% \), 물 분획물이 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 23.84 \% \)를 나타내었으며, 대조군인 vitamin C에서는 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 33.84 \% \) 의 소거능을 나타내었다. 또한, \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 값은 에틸아세테이트 분획물이 \( 39.69 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 로 ascorbic acid의 \( 83.72 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 와 비교 시 우수한 효과를 나타내었다. Velioglu 등은 어 떤 식물에서는 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성이 크게 관련 있다고 보고한 바, 총 폴리페놀 함량이 우수한 에틸아세테이트 분획물이 ROS(Reactive oxygen species)중 하나인 superoxide anion radical \( \left ( \cdot \mathrm { O } _ { 2 } ^ { - } \right ) \)을 제거하는데 밀접한 관련이 있다고 사료된다.</p> <p>저해율 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Lipoxygenase 저해활성 측정</h2> <p>Lipoxygenase 활성 측정은 기존의 방법을 변형하여 실험하였다. 즉 반응구는 \( 0.1 \mathrm { M } \) tris buffer(pH 8.5) \( 2 \mathrm { ~mL } \) 와 시료용액 \( 0.02 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하고 lipoxygenase \( (500 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) \) \( 0.03 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 배양한 다음 \( 110 \mu \mathrm { M } \) linolenic acid \( 0.05 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 20분간 반응시켜 \( 254 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.<p>저해율( \%) \( = \left (1- \frac {\text { 시료첨 가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p></p> <h2>세포배양</h2> <p>본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 \( 10 \% \) fetal bovine \( \operatorname { serum } \) (FBS)과 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin( \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) \) 을 첨가한 Dulbeco's modified eagle's medium(DMEM) 배지를 사용하였으며, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. RAW \( 264.7 \) 세포에 시료용액의 여러 농도 \( (1,10 \), \( 100,1000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) ) 또는 양성 대조군을 1 시간 전처리한 후 \( \mathrm { LPS } (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 를 처리하고 24 시간 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 독성 측정</h2> <p>세포 독성 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 각 세포주 macrophage(Raw 264.7) cell을 96 well plate에 \( 0.6 \) \( 8 \times 10 ^ { 3 } \) cells/well이 되게 \( 0.18 \mathrm { ~mL } \) 분주하고, 시료를 농도 별 로 조제하여 \( 0.02 \mathrm { ~mL } \) 첨가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도로 제조한 MTT 용액 \( 0.02 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:EtOH(1:1) \( 0.15 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550 \( \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에 사용한 섬쑥부쟁이 (Aster glehni Fr. Schm.)는 2009년 7, 8원경 경북 울릉군 울릉읍에서 건조된 잎을 구입하여 실험재료로 사용하였다.</p> <h2>시료 추출 및 용매분획</h2> <p>시료의 추출은 섬쑥부쟁이 5kg 을 시료 중량의 10 배양인 \( 70 \% \) 메탄올을 가하여 상은에서 1주일간 3회 추출한 다음 filter paper(Whatman No. 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축하여 메탄올 추출물 \( (472.7 \mathrm { ~g } ) \) 을 얻었다. 섬쑥부쟁이 메탄올 추출물을 물에 현탁 후, 현탁액과 n-hexane을 1:1 비율로 분획 깔데기에 넣고 n-hexane층과 물층으로 분획하였고, n-hexane층을 다시 감압 농축하여 \( 154.22 \mathrm { ~g } \) 를 얻었다. 이상의 등일한 과정을 \( \mathrm { EtOAc } , \mathrm { n } - \mathrm { BuOH } \), 물로 순차적으로 가하여 각각 \( 74.66 \mathrm { ~g } , 87.84 \mathrm { ~g } , 155.98 \mathrm { ~g } \) 의 분획물을 얻은 후, 동결 건조하여 용매를 제거한 뒤 실험에 사용하였다(Fig. 1).</p> <h2>총 폴리페놀 함량 측정</h2> <p>폴리폐놀 정량은 \( \mathrm { AOAC } [1] \) 에 준하여 정량하였다. 즉, 100 배 희석한 시료용액 \( 3 \mathrm { ~mL } \) 에 Folin-Ciocalteu phenol reagent</p> <p>시약 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하고, \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } 0.2 \mathrm { ~mL } \) 을 넣은 후, 포화용액 \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 혼합한 후 1 시간 실온에서 방치하고, \( 640 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannic acid 로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.</p> <h2>전자공여능 측정</h2> <p>전자공여능(EDA: clectron donating ability)은 기존에 보고된 방법을 변형하여 96 well plate에 맞게 수정하여 측정 하였다. 각 시료용액 \( 2 \mathrm { ~mL } \) 에 \( 0.2 \mathrm { mM } \) 의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) \( 1 \mathrm { ~mL } \) 넣고 교반한 후 30 분간 방치한 다음 \( 517 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료 용액의 첨가군과 무침가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p>	생명
고지방식이를 제공한 마우스에서 여주와 아쉬아간다 발효추출물 조합의 항비만 효과	<h2>AST 및 ALT 측정</h2> <p>고지방식이와 여주 및 아위아간다 추출물 및 발효추출물의 투여가 마우스의 간세포에 영향을 주는 지를 알아보고자 간 독성 손상 지표 효소인 AST 및 ALT 활성을 비교 분석하였다(Fig. 2). 이들 효소는 간 조직의 괴사와 간 세포의 파괴와 같은 간 손상이 발생했을 때 혈중으로 유출되어 증가하게 되며 간 세포의 변성 및 괴사 등 간 손상의 지표로 이용되고 있다. 먼저 AST 측정 결과, NC 군과 비교하여 HFD군의 AST 활성이 다소 상승하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2A). 또한, NC 군 및 HFD군을 포함하여 다른 모든 군들과 비교하였을 때도 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 다음으로 ALT 측정 결과, HFD 군의 혈중 ALT 활성이 NC 군과 비교하여 약 \( 1.3 \) 배 정도 유의적으로 상승하는 변화를 보였다(Fig. 2B). 이는 고지방식이를 제공받음으로써 HFD군의 체중이 2 배 이상 증가했고 이에 따라 간 조직 내 지방의 침착으로 인한 간세포 장애 등의 영향을 받아 ALT 활성이 크게 증가한 것으로 보인다(Table 1, Fig. 3). 또한, AST 및 ALT 활성은 HFD군과 비교하여 MC 군, WS군, MCWS 군, FMC 군, FWS군 및 FMCWS군 사이에 유의적인 차이가 나타나지 않는것으로 보아 여주 및 아쉬아간다 추출물 및 발효추출물의 투여가 실험동물의 간 기능에 부가적인 부정적 변화를 일으키지 않았으며, 따라서 이들 추출물은 간 독성을 나타내지 않은 것으로 사료된다. 최근 연구에서 아쉬아간다의 간 독성 유발 가능 성에 대한 임상 테스트가 진행되었는데 그 결과 담즙정체나 황달 및 가려움증이 동반되는 증상을 보였지만 짧은 시간 내에는 다시 정상화되었으며 간 부전의 증상은 나타나지 않은 것으로 확인되었다.</p> <p>AST와 ALT 효소의 활성은 고지방식이, 고콜레스테롤식이, 알코올 등으로 인해 간 세포의 독성이 생기면 간 실질세포의 장애가 발생하여 간 세포가 파괴되고 혈액 중으로 이들 효소의 방출이 항진되어 활성이 증가한다고 알려져 있다. 그러나, AST는 간과 더불어 심장, 골격근, 신장, 뇌 및 적혈구에 걸쳐 광범위하게 발현되지만, ALT 는 골격근과 신장에서는 낮은 농도로 존재하고 간 손상에 보다 더 특이적이라고 보고되었다. 본 연구에서는 고지방식이를 공급받은 군들의 혈청ALT 활성은 유의적으로 증가하였으며 AST 활성은 HFD군에서 약간 증가하는 경향이 나타났으나 유의성은 보이지 않았다(Fig. 2). 따라서, 이러한 AST와 ALT의 증가는 고지방식이로 인한 간 세포 특이적 장애로 인해 발생한 것으로 판단된다. 그러나, 여주 및 아쉬아간다 혼합추출물(MCWS) 및 혼합발효추출물(FMCWS) 투여로 인해 고지방식이로 높아진 AST 및 ALT 활성이 유의적이지는 않으나 HFD군에 비해 다소 감소되는 경향이 나타남을 확인하였고, 이러한 경향은 이들 소재가 고지방식이 섭취로 의한 간 조직 내 지방의 축적을 억제하는 활성에 의한 것으로 사료된다(Figs. 2, 3).</p> <h2>부고환 지방조직 크기</h2> <p>부고환 주위 지방조직을 적출하여 고정시킨 후 H & E 염색과 광학현미경을 이용하여 지방세포의 크기를 현미경으로 관찰하였다(Fig. 5). HFD군의 부고환 지방세포의 크기는 NC군에 비하여 매우 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 추출물 투여군인 MC군, WS군, MCWS군 그리고 발효추출물 투여군인 FMC군, FWS군 그리고 FMCWS군에서는 모두 지방세포의 크기가 NC 군보다는 크지만 HFD군에 비해서는 현저히 작아지고 있음을 확인하였다(Fig. 5). PC군의 지방세포 크기도 HFD군에 비해 감소하고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 특히, Image Analyzer를 이용하여 지방세포 직경 크기를 측정헸을 때, Fig. 6 에서와 같이 HFD군 \( (110.4 \pm 3.48 \mu \mathrm { m } ) \) 의 지방세포 크기는 NC군 \( (62.21 \pm 1.71 \mu \mathrm { m } ) \) 과 비교하여 약 \( 1.8 \) 배 정도의 현저한 증가를 보였으며, 이와 같은 지방세포 크기의 증가는 추출물 및 발효추출물의 투여에 의해 감소하고 있음을 확인하였다(Fig. 6). 실험군별 지방세포 크기는 MC 군, WS군, MCWS군, FMC군, FWS군, FMCWS군 그리고 PC군에서 각각 \( 92.58 \pm 3.95,92.92 \pm 3.24 \), \( 89.58 \pm 3.00,83.57 \pm 2.48,86.31 \pm 3.75,80.68 \pm 3.04 \) 그리고 \( 86.10 \) \( \pm 3.50 \mu \mathrm { m } \) 로 측정되었으며 모든 군에서 HFD군과 비교하여 유의적인 지방세포 크기의 감소가 나타났고 특히 FMCWS군에서 의 크기 감소가 가장 높게 나타난 것으로 보아 혼합발효추출물이 지방세포의 크기를 줄이는 효과적인 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 여주와 아쉬아간다 단일 및 혼합추출물 그리고 단일발효 및 혼합발효추출물 투여군의 혈청 내 지질 성분의 함량 개선 및 복부지방량 감경 효과와도 일치하고 있음을 알 수 있다. 즉, 여주와 아쉬아간다 추출물 및 발효추출물이 고지방식이로 인한 이상지질대사를 개선하고 지방의 축척과 지방세포의 비대(hypertrophy)를 억제하는 활성에 의한 효과로 사료된다. 특히 발효추출물과 혼합발효추출물의 효능이 단일 추출물 및 혼합추출물에 비해 더욱 부가적으로 상승되고 있음을 확인하였다(Fig. 6).</p> <p>Fig. 5 와 Fig. 6 에 제시된 바와 간이 지방세포의 직경이 증대된 것은 고지방식이 섭취로 인해 지방세포 내 중성지방이 축적된 것으로 체중 증가량, 혈액 내 중성지방 함량, 복부지방 무게를 고려하여 볼 때 고지방식이 섭취로 인한 지방세포 크기가 증대된 비대형 비만으로 판단할 수 있다. 특히 백색 지방 조직에 속하는 부고환 지방조직이 비정상적으로 커지게 되면 심각한 정도의 대사증후군을 유발하는 것으로 알려져 있고 또한 고지방식이의 장기간 섭취는 지방세포의 증대를 유도하기 때문에 부고환 지방조직세포의 크기 측정은 항비만 효능을 입증하는 효과적인 방법으로 잘 알려져 있다. 일반적으로 이미 형성된 지방세포의 갯수는 감소되지 않으나 지방세포의 크기는 조절이 가능한 것으로 보고되어 있다. 지방세포의 크기 분석을 통해 발효추출물 투여군의 부고환 지방세포의 크기는 유의적인 차이는 없으나 비발효추출물 투여군에 비해 수치적으로 더욱 줄어드는 경향을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 이는 발효추출물의 지방세포 크기 감소 효능이 비발효추출물의 효능보다 더욱 부가적인 상승 효과가 있음을 의미하며 이를 통해 효율적인 체지방 감경 효과를 유도할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h2>Aspartate transaminase (AST) 및 alanine aminotransferase (ALT) 측적</h2> <p>혈중 AST 및 ALT 함량 측정은 실험동물을 마취시킨 후 흉부를 열어 심장에서 혈액을 채취하여 \( 13,000 \mathrm { rpm } \) 으로 10 분 동안 원심 분리 후 혈청을 분리하여 분석하였다. 혈장 AST와 ALT 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Lt.)를 사용하여 Reitman-Frankel 법으로 분석한 후 \( 505 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 각각의 함량을 산출하였다.</p> <h2>Histological staining</h2> <p>간과 부고환의 지방조직을 확인하기 위해 마우스를 마취시킨 후 간과 부고환 지방조직을 적출하여 \( 10 \% \) 중성포르말린 용액에 고정시킨 후, paraffin block을 제작하여 \( 0.4 \mu \mathrm { m } \) 굵기로 절삭한 후 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 통해 지방세포의 크기와 형태를 광학현미경을 이용하여 측정하였다. 또한 부고환 지방조직의 지방세포 크기를 측정하기 위하여 ImageJ 1.53k software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 실험군별 평균 지방구의 직경 크기를 산출하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험결과의 통계학적 분석은 GraphPad Prism 5.0 프로그램 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 실시하였다. 모든 측정 항목의 결과는 평균(mean)표준오차 (standard error, SE)로 표시하였고 각 그룹 사이의 비교는 분산 분석(one way analysis of variance, ANOVA)에 이어 Tukey's multiple camparison test를 이용하여 각 그룹 간의 유의성을 \( p<0.05 \) 수준에서 검증하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>체중 증가량, 식이섭취량 및 식이효율</h2> <p>초기 8 주 동안 고지방식이를 제공한 8 개의 실험군(HFD군, PC군, MC군, WS군, MCWS군, FMC 군, FWS군 및 FMCWS군)은 NC군에 비해 유의적인 체중 증가를 보여 비만이 유도되었음을 확인할 수 있었다(Table \( 1,8 ^ {\text { th } } \) week). 이들 군 중에서 7 개 실힘군(MC군, WS군, MCWS군, FMC군, FWS군, FMCWS 군 및 PC군)에 추가적으로 8주 동안 매일 각각 MC, WS, MCWS, FMC, FWS, FMCWS 및 양성대조군으로 캐모마일 추출물(PC)을 경구투여하였다. 단일추출물과 혼합추출물 및 단일 발효추출물과 혼합발효추출물은 각각 \( 200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \mathrm { BW } \) 함량을 사용하였다. 비만을 유도한 후 추가적으로 8 주 동안 각 추출물을 투여한 후 체중 증가량(weight gain)을 분석하였을 때 지속적으로 고지방식이만을 제공한 HFD군(8.42 + 0.57 g)과 비교하여 추출물 투여군(MC군, WS군, MCWS군, FMC군, FWS군 및 FMCWS군)에서 체중 증가가 억제되는 경항성을 보여주었다. 특히 혼합발효추출물 투여군(FMCWS군)의 체중 증가량은 \( 5.83 \pm 0.60 \mathrm { ~g } \) 으로 다른 군들과 비교하여 체중 증가가 크게 억제 되어 체중이 가장 낮게 유지되었다(Table 1). 그러나 HFD군과의 비교에서 유의적인 통계적 차이는 보이지 않았다. 식이섭취량(Food intake)은 NC 군과 비교했을 때 모든 실험군에서 유의적으로 감소하였다. NC군 \( (3.24 \pm 0.17 \mathrm { ~g } / \mathrm { day } ) \) 이 HFD군 \( (2.15 \pm 0.10 \mathrm { ~g } / \) day \( ) \) 보다 약 \( 1.5 \) 배 정도 많은 양을 섭취하였는데 이는 탄수화물 함유량에 따라 마우스의 식이십취 선호도가 다르기 때문인 것으로 사료된다. 그러나 HFD군과 HFD를 제공한 다른 실험군들 사이의 식이십취량은 모두 비슷한 양을 섭취하여 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Table 1). 이는 체중 증가가 억제되는 현상이 식이섭취량에 기인한 것은 아님을 의미한다.</p> <h1>서 론</h1> <p>지방과 탄수화물을 과다 섭취하는 서구화된 식습관의 증가와 운동 부족으로 인해 우리나라 비만 유병률이 지속적으로 증가하고 있다. 또한, 비만으로 인해 유발되는 동맥경화, 심장질환, 뇌졸증, 당뇨병, 고지혈증(고콜레스테롤혈증) 등과 같은 심혈관계 및 대사성 질환은 오늘날 중대한 사회 문제로 대두되고 있다. 특히, 혈중 콜레스테롤과 중성지방의 증가는 심혈관계 질환을 일으키는 중요한 위험인자로 잘 알려져 있으며 WHO는 2030년까지 전세계 약 2,360 만명이 고콜레스테를혈증과 연관된 심혈관계 질환으로 사망하게 될 것으로 예측하였다.</p> <p>비만 문제를 해결하기 위한 노력으로 식사조절과 운동요법이 권장되고 있으나 효과가 나타나기까지 많은 시간과 꾸준한 육체적 운동이 필요하기 때문에 보조식품이나 약물을 이용한 치료에 대한 요구가 증가하고 있다. 임상적으로 이용되고 있는 비만 치료 약물은 주로 식욕 억제제와 탄수화물이나 지방흡수 억제제, 에너지 소비증진 약물이 사용되고 있으나 많은 부작용으로 인해 다수 약물의 승인이 취소되고 있다. 1990년대에 fenfluramine과 dexfenfluramine은 심장 판막 손상으로 인해 시장에서 철수되었고, 2000년 European Medicines Agency는 위험 대 이익 비율이 좋지 않다는 이유로 phentermine, diethylpropion, mazindol을 비롯한 여러 항비만 약물의 시장 철수를 권고헸다. 현재 미국 FDA가 장기 사용을 승인한 비만 치료 약물은 orlistat와 sibutramine 두 가지이다. Orlistat는 장에서 지방 흡수를 억제하여 체중 감량을 유도하는 약물이지만 지방변 및 변을 참을 수 없거나(Fecal urgency) 대변이 약간씩 배설되는 변실금 (Fecal incontinence)과 같은 부작용을 일으킨다. Sibutramine의 경우는 포만감 증대에 의한 식욕억제 작용을 통해 체중감소 효능을 나타내는 비만치료제이지만 교감신경계를 자극함으로써 두통, 입마름, 변비, 수면장애, 어지러움 등과 같은 부작용을 유발 한다고 보고되었다. 따라서, 이러한 각종 부작용을 최소화 하기 위해 안전한 천연물질로부터 체중조절과 비만치료에 효과적인 기능성 소재와 물질을 찾아 치료제로 개발하는 노력이 절실히 필요하다.</p> <p>여주(Momordica charantia)는 박과에 속하는 한해살이 덩굴성 풀로 잎은 크고 콩팥 모양의 원형인 모양은 가지고 있으며 열대 아시아, 아프리카, 지중해 등에서 재배가 되는 쓴맛을 내는 과일로서 비터 멜론(bitter melon)으로도 알려져 있다. 여주에는 비타민C, 사포닌, 알칼로이드, 글루코사이드 등의 유용 물질과 혈당 강하 기능이 있는 charantin이 높게 함유되이 있다. 이러한 성분들로 인하여 인슐린의 분비가 촉진되고 혈당을 낮추며 동맥경화와 고혈압 같은 성인병, 항균작용, 항산화작용, 항암작용, 항괴사작용, 당뇨합병증 예방 및 항당뇨 기능 등의 효능이 보고되고 있다. 특히, 여주추출물을 고지방식이로 유도한 비만마우스 모델에 공급했은 때 체중 증가와 내장 지방의 축적 및 지방 세포 비대를 억제하고 혈중 지방대사 기능을 조절하여 비만을 억제하는 항비만 활성을 지니고 있음이 확인되었다. Withania somnifera는 아쉬아간나(ashwagandha)로 알려진 인도에서 전통적으로 사용되던 약제로서 류머티즘과 관절염뿐만 아니라 건강과 장수를 위해 노인과 임산부들에게 사용되었다. 이 후 많은 연구를 통해 밝혀진 아수아간나의 효능은 항암을 비롯하여 항염, 항산화, 항스트레스, 면역증진, 남성호르몬 증진, 콜레스테롤 저하, 체중감소 등이 있으며 다양한 건강상태를 개선하는 유용한 허브로 사용되고 있다. 특히 아수아간나에서 유래한 steroidal lactone인 withaferin A는 마우스 모델에서 체중 및 체지방량 감소, 간 지방증 감소, 포도당 불내성 및 인슐린 저항성 감소, 그리고 시상하부의 렙틴에 대한 감수성을 회복시킴으로써 렙틴 저항성 감소 효과를 보였다. 따라서 withaferin A는 비만과 비만으로 인해 발생하는 대사성 질환에 대항하는 치료제 개발의 잠재적 후보로 거론되고 있다.</p> <p>앞에서 살펴본 바와 같이 여주와 아쉬아간다는 각각 고유의 지방대사 조절 및 항비만 활성이 있다. 본 연구에서는 두 소재로부터 얻은 각각의 추출물과 혼합추출물 그리고 미생물을 이용해 천연물의 생리활성을 증진시키는 주요한 기술인 유산균 발효를 통해 얻은 각 발효추출물과 혼합발효추출물을 고지방식이로 유도한 비만마우스 모델에 투여하여 혈중 콜레스테롤 및 중성지방 저하, 내장지방 저하 그리고 체중 감소 등의 효능에 대해 시너지 효과가 있는지 분석하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물의 제조</h2> <p>여주는 건조된 유기농 여주를 전남 화순에서 구입하여 분말화하여 사용하였다. 아쉬아간다는 유기농 아쉬아간다 뿌리를 건조한 후 분말화한 제품(Piping Rock Health Products, Ronkonkoma, NY, USA)을 구입하여 사용하였다. 여주 추출물(Momordica charantia extract, MC)은 여주 분말 질량 \( (10 \mathrm { ~g } ) \) 의 10 배에 해당 하는 열수를 첨가하여 교반 추출한 뒤 여과 및 감압농축( \( 0.5 \mathrm { ~g } / \) \( \mathrm { mL } \) )하였다. 여주 발효추출물(fermented Momordica charantia extract, FMC)은 분말화된 여주 \( 10 \mathrm { ~g } \) 당 유산균(Lactobacillus plantarum K1-BR) 약 \( 1 \times 10 ^ { 7 } \) 개를 혼합하고 이 혼합물을 96 시간 동안 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적 발효한 후, \( 10 ^ {\text { 배의 열수를 첨가하여 교반 } } \) 추출한 뒤 여과 및 감압농축 \( (0.5 \mathrm { ~g } / \mathrm { mL } ) \) 하였다. 아위아간다 추출물(Withania somnifera extract, WS) 및 아쉬아간다 발효추출물(fermented Withania somnifera extract, FWS)도 MC와 FMC의 제조와 간은 방법으로 제조하였다. 여주와 아쉬아간다 혼합추출물(Momordica charantia and Withania somnifera extracts, MCWS)은 분말화된 여주와 아쉬아간다를 각각 \( 5 \mathrm { ~g } \) 씩 혼합한 후 10 배의 열수를 첨가하여 교반 추출한 뒤 여과 및 감 압농축 \( (0.5 \mathrm { ~g } / \mathrm { mL } ) \) 하였다. 여주와 아쉬아간다 혼합발효추출물 (fermented Momordica charantia and Withania somnifera extracts, FMCWS)은 분말화된 여주와 아쉬아간다 혼합물 \( 10 \mathrm { ~g } \) 당 \( 1 \times 10 ^ { 7 } \) 개의 유산균을 혼합하고 이 혼합물을 96 시간 동안 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적 발효한 후, 10 배의 열수를 첨가하여 교반 추출한 뒤 여과 및 감압농축 \( (0.5 \mathrm { ~g } / \mathrm { mL } ) \) 하였다. 양성대조군(positive control, PC)으로는 Matricaria recutita에서 유래한 캐모마일 추출물(98 \% apigenin) (KAN phytochemicals, Haryana, India)을 사용하였다. 캐모마일 추출물에는 apigenin과 더불어 quercetin 및 luteolin 등을 주성분으로 한 terpene 및 phenolic compound 등이 포함되어 있다. 이러한 특성으로 인해 캐모마일 추출물은 비만 관련 대사 합병증의 예방 및 치료에 활용되고 있으며 본 실험에는 양성대조군으로 실험군과의 비교 분석에 이용하였다.</p> <p>식이효율은 HFD 군이 \( 0.070 \pm 0.005 \) 로서 NC군 \( (0.020 \pm 0.005) \) 보다 약 3.5배 정도 유의적으로 증가하였다(Table 1). MC 군,WS 군, MCWS 군, FMC군, FWS군 및 PC군의 식이효율을 HFD군과 비교했을 때 유의한 차이성은 나타나지 않았으나 전반적으로 감소하는 경향을 보여 주었다. 특히 FMCWS군 \( (0.041 \pm 0.004) \) 의 식이효율은 HFD군과 비교하여 유의적으로 감소하였다(Table 1). 식이효율은 비만을 나타내는 척도로서 식이 효율이 낮다는 것은 같은 양의 식이를 섭취하더라도 체중 증가가 적어 비만조절 효과가 있음을 의미한다. 따라서 고지방 식이를 제공했을 때 FMCWS 혼합발효추출물의 투여는 HFD군에 비해 식이효율을 감소시키는 활성이 있음을 알 수 있으며 이를 통해 고지방식이 마우스의 체중 증가를 억제하는 경향이 나타나는 것으로 사료된다. 또한 이러한 결과들은 여주와 아쉬아간다 혼합발효추출물의 섭취가 체중 증가를 완화할 수 있는 체중 조절제로서의 가능성이 있음을 시사한다.</p> <h2>복부지방량 변화</h2> <p>고지방식이 유도 비만마우스에 8주 동안 매일 MC, WS, FMC,FWS, MCWS 및 FMCWS 추출물을 경구 투여한 후, 복부지방의 축적 정도를 비교하였다(Fig. 1). 그램(g) 체중 당 복부지방량은 \( HFD군이 \( 0.057 \pm 0.001 \mathrm { ~g } \) 으로 NC군의 \( 0.031 \pm 0.002 \mathrm { ~g } \) 에 비해 약 \( 1.8 \) 배 정도 유의적으로 증가하였다. 그러나, 추출물 투여 군인 MC군은 \( 0.042 + 0.005 \mathrm { ~g } , \mathrm { WS } \) 군은 \( 0.043 \pm 0.003 \mathrm { ~g } \), 그리고 유산균 발효추출물 투여군인 FMC군은 \( 0.044 \pm 0.003 \mathrm { ~g } \), FWS군은 \( 0.043 \pm 0.004 \mathrm { ~g } \) 으로 유의성은 없으나 HFD군보다 각각 \( 22.8 \), \( 24.6,26.3 \% \) 정도 복부지방량이 감소하는 경향을 보였다. 특히 혼합추출물과 혼합발효추출물을 투여한 MCWS군 \( (0.041 \pm 0.002 \) \( \mathrm { g } ) \) 과 FMCWS군 \( (0.039 \Perp 0.004 \mathrm { ~g } ) \) 은 HFD군보다 각각 약 \( 28 \% \) 와 \( 31.6 \% \) 정도의 통계적으로 유의한 복부지방 감소량을 보였다(Fig. 1). 이러한 감소 경향은 여주와 아쉬아간다 추출물이 복부지방량을 줄이는데 긍정적 효과가 있음을 보여주고 있으며 특히 혼합추출물 및 혼합발효추출물의 부여는 더욱 상승적인 시너지 효과를 유도할 수 있음을 의미하는 결과이다. 그러나, 단일추출물 및 단일발효추출물을 투여한 실험군에서의 전체적으로 복부지방량이 감소하는 경향성을 보였으나 이들 사이에 유의적 차이는 나타나지 않았다. PC군의 복부지방량은 \( 0.041 \pm 0.004 \mathrm { ~g } \) 으로 HFD군에 비해 약 \( 28 \% \) 정도 유의적으로 감소하였다.</p> <h2>간 조직의 병리조직학적 관찰</h2> <p>고지방식이를 제공한 비만동물 모델에 MC, WS, MCWS, FMC, FWS 그리고 FMCWS를 8주 동안 경구투여한 후 적출한 간 조직을 H & E 염색과 광학현미경을 이용하여 간 조직 내 지방구의 축적 양상을 관찰하였다(Fig. 3). NC 군의 경우 간에서 유의한 간 병변과 지방간 형태는 관찰되지 않았다. 그러나, 고지방 식이를 제공한 HFD군의 간 조직에서는 NC군에 비하여 간 조직 전체에 걸쳐 지방구가 축적되어 있고 그것의 크기 또한 커져 있음을 관찰하였다. 반면 추출물 투여군인 MC군, WS군, MCWS군, FMC군, FWS군 그리고 FMCWS군에서는 모두 지방구의 축적과 크기가 HFD군에 비해 크게 감소되고 있음을 확인하였다(Fig. 3). PC군도 간 조직 내 크고 작은 공포 모양의 지방구가 HFD군에 비해 현저히 줄어들어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 여주와 아쉬아간다 추출물 및 발효추출물의 투여가 고지방식이에 의해 증가한 지방 성분이 간에 축적되어 형성되는 지방간 병변을 억제하거나 분해하는 기능을 증진시켜 지방간의 위험성을 완화시키는 활성이 있음을 의미한다.</p> <p>즉, 각 추출물의 투여가 고지방식이를 제공한 실험동물의 간 조직 지방대사 개선에 긍정적인 효과가 있으며, 특허 여주와 아쉬아간다 단일추출물(MC와 WS)보다는 단일발효추출물(FMC와 FWS)에서 그리고 혼합추출물(MCWS)보다는 혼합발효추출물 (FMCWS)에서 거대 지방구의 침착과 크기가 더욱 억제됨을 확인하였다.</p> <h2>혈중 지질 분석</h2> <p>고지방식이로 유도된 비만마우스 모델에서 혈중 지질대사에 대한 여주와 아쉬아간다 추출물과 발효추출물의 영향을 측정하기 위하여 총 콜레스테롤(T-CHO), 중성지방(TG) 및 HDL-콜레스테롤의 변화를 측정하였다(Fig. 4). T-CHO의 경우, 정상식이군인 NC군이 \( 127.2 \pm 5.49 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } \) 이고 HFD군은 \( 188.0 \pm 2.66 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } \) 로서 고지방식이로 인해 혈중 총 콜레스테롤 함량이 NC 군에 비해 약 1.5배 정도 유의적으로 증가하였다(Fig. 4A). 그러나, MC군 \( (158.5 \pm 4.42 \mathrm { mg } / \mathrm { dL }) \), WS군 \( (168.2 \pm 4.07 \mathrm { mg } / \mathrm { dL }) \), MCWS군 \( (153.7 \pm 4.82 \mathrm { mg } / \mathrm { dL }) \), FMC 군 \( (158.6 \pm 5.25 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } )\), FWS 군 \((168.4 \pm 3.19 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) FMCWS군 \( (147.3 \pm 4.39 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 및 PC군 \( (164.3 \pm 6.19 \mathrm { mg } / \mathrm { dL }) \)에서는 혈중 T-CHO 함량이 HFD군에 비해 각각 감소하는 경향을 보였으며 특히, MC군, MCWSRNS, FMC군, FMCWS군 그리고 PC군에서는 통계적으로 유의하게 감소하였다. (Fig. 4A).</p> <p>또한, FMCWS군과 NC군 사이에는 통계적 유의성이 나타나지 않는 것으로 보아 공급한 혼합발효추출물이 혈중 T-CHO 함량을 낮추어 일반식이를 공급한 NC 군 수준으로 유지시킬 수 있는 활성이 있음을 확인할 수 있었다. TG의 경우, HFD군 함량은 \( 104.8 + 2.26 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } \) 로서 NC 군 \( (66.38 \pm 4.95 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { dL } \) )에 비해 약 \( 1.6 \) 배 정도로 유의적으로 증가하였다(Fig. 4B). 그러나, WS군(88.53 \( \pm 3.88 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 과 발효추출물군인 FMC군 \( (86.24 \pm 4.61 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 및 FWS 군 \( (83.94 \pm 4.07 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 은 HFD 군에 비해 각각 약 \( 15.5,17.7 \) 그리고 \( 19.9 \% \) 정도 유의하게 감소하였고 또한 MC 군 \( (93.34 \pm 2.44 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 도 약 \( 10.9 \% \) 정도의 감소 경향을 보였다. 특히 혼합추출물과 혼합발효추출물 투여군인 MCWS군 \( (81.10 \pm 1.52 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 과 FMCWS군 \( (79.97 \pm 1.31 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 의 중성지방 함량은 HFD군에 비해 각각 \( 22.6 \) 와 \( 23.7 \% \) 정도의 높은 수준으로 유의하게 감소하였음을 확인하였다(Fig. 4B). 즉, 각 추출물 투여군에서의 TG함량은 전반적으로 감소하는 경향이 있음을 확인하였으며 특허 혼합추출물과 혼합발효추출물을 투여했을 때의 TG 함량은 NC 군의 TG 함량과의 비교했을 때 유의성이 나타나지 않았다. 이는 두 군에서의 TG 수준이 일반식이군의 TG 함량 수준으로 낮아지고 있음을 의미하는 것으로 우수한 중성지방 감경 활성이 있음을 확인하였다. HDL-콜레스테롤의 경우, NC군 \( (76.92 + 5.74 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 과 HFD군 \( (93.08 + 5.31 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { dL } \) )은 통계적인 차이는 보이지 않았다(Fig. 4C). 그러나, MC군 \( (128.9 \pm 4.39 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ), WS군 \( (128.3 \pm 8.56 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ), MCWS군 \( (142.8 + 2.83 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ), FMC군 \( (130.3 \pm 4.16 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \), FWS군 \( (126.2 \pm \) 군에 비해 약 1.4-1.5배 정도의 통계적으로 유의한 증가 및 개선효과가 있음을 확인하였다(Fig. 4C ). PC 군(143.3 \( 5.89 \mathrm { mg } / \mathrm { dL } ) \) 도 HFD군에 비해 약 \( 1.5 \) 배 정도 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 4C). 이러한 결과는 고지방식이에 의해 증가된 총 콜레스테롤과 중성지방의 함량이 여주와 아위아간다 추출물 및 발효추출물의 투여로 인해 낮아지고, HDL-콜레스테롤의 함량을 증가되는 등 혈중 지질대사에 대한 조절 및 개선 효능이 있음을 의미한다. 비만은 대부분 고지혈증이 동반되고 또한 고지혈증은 뇌졸중, 고혈압, 동맥경화증과 같은 심혈관계 질환을 일으키는 원인 중 하나이다. 특히, 여주와 아위아간다 혼합추출물 및 혼합발효추출물은 비만 환자들의 혈중 지질대사의 조절과 심혈관 질환 등의 예방과 치료에 긍정적인 효과를 줄 수 있을 것 으로 사료된다.</p> <h2>실험동물 사육 및 식이</h2> <p>생후 4 주령의 C57BL/6 마우스(DBL Co, Eumsung, Chungbuk)를 구입한 후, 온도 \( 18 \pm 2 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \), 환기 회수 10-20회시간, 조명시간 12시간(점등 08:00, 소등 20:00)으로 설정된 동물실에서 환경적응을 위해 일주일간 고형 배합 사료로 적응시킨 다음, 체중이 약 19-21 g이 되는 마우스를 각 처리군당 6마리씩 9개군으로 나누어 분류하였다. 정상식이(normal control, NC)군에는 기본 고형 배합 사료를 공급하였고, 고지방식이(high-fat diet, HFD)군은 \( 60 \mathrm { kcal } \% \) fat (D12492, Reseach diets Inc., New Brunswick, NJ, USA)의 고지방식이를 8 주 동안 자유급식 방법으로 제공하였다. 이 후, 9 주차부터 다시 8 주동안 각각의 단일추출물(MC, WS, FMC 및 FWS)과 혼합추출물(MCWS와 FMCWS)을 경구 투여하면서 고지방식이를 제공하였다. 추출물은 단일추출물과 혼합추출물을 각각 \( 200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \) \( \mathrm { BW } \) 의 농도로 매일 투여하였다. PC 군에는 캐모마일 추출물 \( (200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \mathrm { BW } ) \) 을 투여하였다. 체중과 식이량은 일주일에 한 번 씩 측정하였고 실험동물의 사육과 사용 등 실험과정은 중원대학교 동물윤리위원회의 승인(JWCUC-201608-001-02)을 받았고 , 윤리위원회의 규정에 저촉되지 않게 실시하였다.</p> <h2>혈장 지질분석</h2> <p>혈장 지질분석을 위해 경구 투여가 끝난 마우스를 마취시킨 후 흉부를 열고 경동맥에서 혈액을 채취하고 \( 13,000 \mathrm { ~mm } \) 으로 10 분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하였고, \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 냉동 보관하며 분석에 사용하였다. 혈중 중성지방(triglyceride, TG) 함량은 중성지방 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd., Korea)를 이용하여 분석 후 \( 550 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 산출하였고, 총 콜레스테롤(total cholesterol, T-CHO) 함량은 총 콜레스테롤 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd.)를 이용하여 분석 후 \( 500 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 산출하였다. High-density lipoprotein (HDL)-cholesterol 함량도 측정용 키트(Asin Pharmaceutical Co. Ltd.)를 이용하여 분석한 후 \( 500 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 산출하였다.</p>	생명
혈관 생리 활성에 미치는 alliin의 효능	<h1>결 과</h1><h2>혈관내피세포 성장 실험결과</h2><p>BAEC 세포를 이용하여 alliin이 혈관 생리 활성 가운데 하나인 내피세포 성장에 어떤 영향을 미치는 지 실험하였다. Alliin을 농도 별(\(0, 0.1, 1, 10, 20 \mathrm{\mu M}\))로 처리한 후 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine 편입을 통해서 세포 성장을 평가하였다. 그림 1에서 보는 바와 같이, alliin의 농도가 증가할수록 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine 편입이 증가하는 것을 알 수 있었으며, 특히 \(20 \mathrm{\mu M}\)의 alliin을 처리하였을 경우, \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine은 2배 정도 현격하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이렇게 농도 의존적으로 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine 편입이 증가하는 것은 alliin이 혈관내피 세포의 증식을 촉진함을 의미한다.</p><h2>혈관내피세포 사멸 실험결과</h2><p>Alliin이 혈관내피세포의 성장을 촉진한다는 것을 확인하였으므로, 다음으로 혈관 내피층에서 일어나는 세포사멸에는 alliin이 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. BAEC은 세포 외 기질에 부착하여 자라는 세포이기 때문에 죽은 세포는 모양이 둥글고 부유하고 있는 세포로 변화한다. 따라서 세포 사멸은 모양이 둥글고 부유하고 있는 세포의 수를 세어서 측정하였다. BAEC의 세포 사멸은 혈청기아로 유도하였고, alliin이 세포사멸에 미치는 효과는 혈청기아 상태에서 alliin을 처리하여 평가하였다. Fig. 2A에서 볼 수 있듯이, alliin을 처리하지 않은 대조군에 비해 alliin을 처리한 실험군에서 세포사멸 정도가 감소하였으며, alliin의 농도가 높아질수록 세포사멸이 더 많이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 alliin이 세포사멸을 억제한다는 사실을 다시 한 번 확인하기 위하여 western blot을 통해 세포사멸과 관련된 단백질인 procaspase-3와 active cas-pase-3양을 검출함으로써 caspase의 활성을 조사하여 세포사멸 억제효과를 확인하였다. Fig. 2B에서 보는 것과 같이, alliin의 처리 농도가 높아질수록 active caspase-3의 양이 감소함을 알 수 있었다. 이는 alliin의 농도가 높아질수록 세포사멸의 정도가 감소함을 의미한다.</p><h2>백혈구의 내피층 부착에 관한 실험결과</h2><p>동맥경화는 동맥혈관 벽의 염증으로 인하여 발생하는 질환으로, 백혈구가 혈관 내피층에 부착하는 것은 이러한 염증 반응의 한 단계이다. 따라서 백혈구가 혈관 내피층에 부착하는 정도를 관찰함으로써 동맥경화의 발생 가능성을 간접적으로 평가할 수 있다. Lipopolysaccharide (LPS)는 그람양성균 세포벽 외막를 구성하는 주요 성분으로 염증반응을 유도한다. 백혈구와 혈관내피세포에 LPS를 처리한 후 배양하면 염증반응으로 인해 두 세포간의 부착이 일어난다. 하지만 alliin을 LPS와 함께 세포에 처리하였을 경우 THP-1 세포와 BAEC 간의 부착이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 alliin이 동맥경화의 발생을 억제할 수 있는 기능을 보유할 가능성이 높을 것임을 암시하는 것이다.</p><h2>혈관내피세포 이동에 관한 실험결과</h2><p>Alliin이 또 다른 혈관기능인 혈관내피세포 이동에 미치는 영향은 어떠한지 조사하였다. 혈관내피세포의 이동은 혈관 형성 과정과 상처 치유 과정 중 일어나는 단계 중 하나로 혈관내피세포 이동 측정은 혈관 형성과 상처 치유 과정에 alliin이 미치는 영향을 평가해 볼 수 있는 방법이다. 본 연구에서는 thymidine을 처리하여 세포 증식을 억제한 후 스크래퍼 찰과기를 이용하여 창상선을 만든 뒤 이동한 세포 수를 세어서 평가하였다. Fig. 4에서 보듯이 혈관내피세포의 이동 정도는 alliin의 농도가 높아질수록 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 alliin이 혈관생성을 유도할 수 있으며, 혈관의 상처 치유에 관여함을 의미한다.</p><h2>백혈구 동종세포간 응집 실험결과</h2><p>혈관에 상처가 생기면 혈전이 형성되어 출혈을 방지하게 되는데, 백혈구 동종세포간 응집은 혈전이 형성되는 단계에서 발생하는 현상이다. 그러나 혈관 안에서 형성하는 혈전은 혈류를 따라 이동하다 혈관을 막아 뇌졸증이나 심근경색과 같은 혈관질환을 일으키기도 한다. Fig. 5에서 보듯이 THP-1 세포에 alliin을 처리하였을 경우 THP-1 동종세포간 응집이 일어나지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 alliin 자체는 혈전을 형성하는 데에는 아무런 영향을 미치지 않음을 의미한다. 그러나 LPS를 THP-1세포에 처리한 경우, THP-1 동종세포간 응집이 일어났고, alliin을 LPS와 함께 THP-1 세포에 처리하였을 경우 LPS만 처리한 양성 대조군에 비해 THP-1 세포의 응집이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과는 alliin이 혈전 형성을 억제하는 기능을 갖고 있음을 의미하며, alliin의 이와 같은 효과는 뇌졸증이나 심근경색과 같은 혈관질환의 발생을 억제기능과 연관되어 있음을 예측할 수 있다.</p><h2>산화질소 생산 측정 실험결과</h2><p>산화질소는 다양한 생리적 기능을 하지만 특히 혈관계와 관련 지어 혈관확장, 혈소판 응집 억제, 호중구의 부착 억제 및 동맥경화 발생 억제와 같은 기능을 하는 다양한 혈관 조절 인자이다. 혈관내피세포에서 산화질소는 eNOS에 의해 L-arginine으로부터 합성된다. 먼저 alliin이 eNOS의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 BAEC에 alliin을 처리한 후 eNOS의 mRNA 발현과 단백질 발현 정도를 각각 RT-PCR과 western blot을 통해 관찰하였다. Fig. 6A에서 보듯이 혈관내피세포에 \( 10 \mu \mathrm{M} \) alliin을 처리하였을 경우 시간이 지날수록 ECE-1의 mRNA 양은 변하지 않지만 eNOS mRNA 양은 감소하는 것을 알 수 있었다. eNOS의 단백질양 정도 역시 alliin의 농도가 높아질수록 감소함을 확인할 수 있었다. Alliin의 장시간 처리가 eNOS의 발현을 억제시킨다는 것은 최소한 alliin이 산화질소의 양을 증가시키지 못함을 의미한다. 한편 alliin이 짧은 시간 내에 eNOS의 활성을 증가시키는지를 알아보기 위하여, alliin을 짧은 시간 동안 처리한 후 산화질소가 세포 내에서 증가하는지 확인해 보았다. 그 결과, Fig. 6C에서 보는 바와 같이 alliin의 단시간 처리는 산화질소의 생성에는 아무런 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 alliin이 가진 다양한 혈관 기능은 산화질소와 관련이 없을 것으로 추측할 수 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>Alliin은 Sigma-Aldrich (USA)사에서 제공하는 시약을 구입하여 증류수에 녹여 사용하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>소 대동맥 내피세포인 BAEC (bovine aortic endothelial cell)은 세포 외 기질에 부착하여 자라는 세포(adhesion cell)로, 소의 대동맥에서 추출한 후 계대 수 3에서 8 사이의 일차세포를 실험에 사용하였다. BAEC은 \(20\%\) 소태아혈청(fetal bovine serum, Wel GENE Inc., Korea)과 \(0.5\%\) 항생제(streptomycin/penicillin)가 포함된 DMEM (glucose \(1\mathrm{g}/\mathrm{liter}\) Wel GENE Inc.)를 이용하여 \(37\mathrm{^\circ C}\), \(5\%\)\( \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. THP-1은 부유세포(suspension cell)로 T-플라스크에 배양하였으며, \(10\%\) 소태아혈청과 \(0.5\%\) 항생제(streptomycin/penicillin)가 첨가된 RPMI1640 (Wel GENE Inc.)를 이용하여 \(37\mathrm{^\circ C}\), \(5\%\) \( \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p><h2>세포성장 실험</h2><p>세포성장은 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine 편입 정도를 측정하여 평가하였다. \(0.5\%\) 소태아혈청이 첨가된 DMEM에 BAEC을 24시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 alliin을 24시간 처리한 뒤, \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine(\(3.3\sim 4.8\)\(\mathrm{TBq}/\mathrm{mM} \))을 1시간 동안 전처리 하였다. 그 후 \(5\%\) trichloroacetic acid (TCA)로 세척한 후, 세포를 \(0.2 \mathrm{N}\) \( \mathrm{NaOH} \), \(2\%\) SDS (sodium dodecyl sulfate)로 분해하여 얻은 분해액을 액체섬광계수기를 이용하여 방사능을 측정하였다. 세포 분해액의 단백질량은 Lowry 분석법으로 정량하여 세포 수의 변이를 보정하였다.</p><h2>세포사멸 실험</h2><p>전면 성장한 BAEC을 \(16\sim18\) 시간 동안 혈청기아시킨 후 다양한 농도의 alliin을 처리하였다. 처리는 0, 2, 4, 8, 16, 24 시간 동안 처리하였고, 시간 경과에 따른 변화를 현미경을 이용해 사진 촬영하여 기록했으며, 세포사멸 세포(둥글고 부유 상태에 있는 세포)를 계산하여 세포사멸 비율을 결정하였다.</p><h2>Western Blot</h2><p>전면 성장한 BAEC에 다양한 농도의 alliin을 20시간 처리한 후 혈청기아 배지에서 20시간 배양한 뒤 분해 완충액(\(50 \mathrm{mM}\) Tris, \(150 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl} \), \(1\%\) NP-40, 0.5\(\%\) Sodium deoxycholate, \(0.1\%\) SDS, \(\mathrm{pH}7.5\))으로 분해하였다. 그 후 원심분리를 통해 상층액을 획득하여, 세포 분해액으로 사용하였다. 각 실험조건에서 얻은 세포분해액은 단백질량을 측정하여 동일한 양의 총 단백질을 포함하는 일정량의 세포 분해액 내의 단백질들을 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리시켰다. SDS-PAGE의 단백질은 PVDF (polyvinylidene fluoride)막으로 이동시켜 고정하고 분석하고자 하는 표적 단백질에 해당하는 1차 항체와 반응 후, 2차 항체를 반응시킨 뒤, 화학발광 검출법을 통해 X-선 필름에 현상한 후 western 결과를 관찰하였다.</p><h2>세포부착 실험</h2><p>전면 성장시킨 BAEC을 혈청기아배지를 이용하여 16 시간 동안 추가로 배양했다. 또한 THP-1 세포를 배양한 후 \(10 \mathrm{\mu M}\)의 Calcein AM (Sigma, USA)을 \(37\mathrm{^\circ C}\), 5\(\%\)\( \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 45 분간 반응시키고, PBS (phosphate buffered saline)를 이용하여 3회 세척하였다. Calcein AM으로 염색시킨 THP-1을 BAEC이 부착된 기판 위에 동량으로 첨가하여 부착된 THP-1 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 부착된 세포와 전체 세포의 비율을 계산하여 정량화 하였다.</p><h2>세포이동 실험</h2><p>전면 성장한 BAEC에 \( 2 \mathrm{mM} \) Thymidine (Sigma-Aldrich)를 24 시간 동안 처리하여 세포의 성장을 중지시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 스크래퍼 찰과기(scraper)를 이용하여 창상선을 만든 후 다시 PBS로 2회 세척하고 다양한 농도의 alliin을 처리하였다. 세포이동 정도는 일정한 시면적에 이동한 세포 수를 세어 이동한 세포수의 비율을 계산하여 평가하였다.</p><h2>THP-1 응집 측정</h2><p>THP-1을 24시간 동안 배양한 후, 혈청기아 배지로 12시간 배양한 후에 alliin을 각 농도 별로 처리하여 8 시간까지 시간별로 진행되는 응집 현상을 현미경으로 관찰하였다.</p><h2>산화질소(NO) 측정</h2><p>\(35 \mathrm{mm}\) 배양접시에 분주된 BAEC을 24 시간 동안 \(37\mathrm{^\circ C}\), \(5\%\)\( \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 배양한 후 혈청기아 배지로 16 시간 동안 배양하였다. HEPES 완충액(\(140 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \),\(5 \mathrm{mM}\) KCl, \(2 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{CaCl}_{2} \), \(5 \mathrm{mM}\) glucose, \(5 \mathrm{mM}\) HEPES, \(1 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{MgCl}_{2} \), \(\mathrm{pH} 7.4\))으로 2회 세척하여 치환한 HEPES 완충액에 alliin을 농도 별로 처리하였다. 그 후 세포를 수확하여 초음파파쇄로 분해한 후 세포 분해액을 \(13,000 \mathrm{rpm}\)으로 10 분간 원심분리를 하여 상층액을 분획하였다. 산화질소를 측정하기 위해 상층액과 \(100 \mathrm{nM}\)의 DAF-2 (diaminofluoresceins)를 15 분간 상온에서 반응시킨 후 형광분석계(Spectrofluorophotometer RF-5301 PC, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 형광스펙트럼(Ex: \(495 \mathrm{nm}\), Em: \(515 \mathrm{nm}\))을 측정하여 분석하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>정량 분석 후 \(2 \mathrm{\mu g}\)의 RNA를 주형으로 사용하면서 역전사효소(M-MLV reverse transcriptase, Promega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 cDNA를 다시 주형으로 하여 PCR로 ECE-1 (endothelin converting enzyme-1)과 eNOS (endothelial nitric oxide synthase)의 전사체를 확인하였다. ECE-1와 eNOS 프라이머의 붙임온도는 \(60\mathrm{^\circ C}\)로 동일하게 하였으며 대조군으로 사용된 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 역시 \(60\mathrm{^\circ C}\)로 동일하게 하였고, 28 주기를 실시한 후, PCR 생산물을 \(1.5\%\) 한천 겔 전기영동으로 확인하였다. 실험에 사용된 프라이머는 아래와 같다.</p> <h1>고 찰</h1><p>마늘은 고대부터 독특한 향과 맛을 지닌 식품으로 많이 이용되어 왔다. 마늘의 성분 중 주로 생리적인 기능을 하는 것은 allicin이다. 하지만 생마늘에는 allicin은 존재하지 않으며, 대신 allicin의 전구체인 alliin과 alliin을 allicin으로 변환시켜주는 allinase가 세포 내 다른 구획에 존재하다가 마늘을 파쇄하거나 잘게 썰게 되면 분비된 allinase에 의해 alliin이 allicin으로 변환된다. Allicin은 휘발성이 크며 화학적으로 불안정하기 때문에 마늘을 통째로 익히거나 가공한 마늘초, 흑마늘, 또는 건조된 마늘을 건강식품으로 이용할 경우 allicin의 형태로 섭취할 수는 없으며, alliin과 allinase의 형태로 섭취하게 된다. 따라서 이렇게 섭취한 alliin이 생체 내에서 어떤 생리활성을 갖는지 평가하는 것은 의미가 있다.</p><p>본 연구를 통해, alliin이 갖고 있는 혈관내피세포의 다양한 생리활성을 조사한 결과, alliin이 혈관내피세포의 기능장애를 개선할 수 있는 생리기능을 갖는 분자로서의 가능성을 확인하였다. 본 연구를 통해 alliin이 세포 수준에서 나타내는 생리활성을 요약하면 다음과 같다. (1) Alliin은 혈관내피세포의 증식을 유발하며 세포사멸은 억제한다. (2) Alliin의 처리는 LPS에 의하여 백혈구가 혈관 내피층에 부착되는 것을 억제시키며, LPS에 의해 촉발되는 백혈구 동종간의 응집도 억제한다. (3) 또한 alliin의 처리는 혈관내피세포의 세포 이동을 촉진한다.</p><p>Alliin이 작용하는 세포수준에서의 기능들은 alliin은 생체 수준에서도 다양한 생리적인 기능을 갖고 있음을 의미한다. 먼저, alliin이 세포의 증식과 이동을 유발하는 세포 수준에서의 기능은, 세포의 증식과 이동이 혈관생성과 혈관의 상처 치유에 필수적인 과정이기 때문에 alliin이 혈관생성을 촉진하고 혈관의 상처 치유에 도움을 줄 수 있다는 것을 의미한다. 또한 백혈구가 혈관 내피층에 부착하는 현상은 염증 반응의 하나로써, 동맥경화의 발생과 밀접한 관련이 있기 때문에, 염증 반응을 유도하는 LPS가 THP-1세포를 혈관내피세포에 부착시키는 것을 억제하는 alliin의 세포 기능은 alliin이 동맥경화의 발생을 억제시킬 수 있음을 의미한다. 동맥경화반이 형성되는 초기 단계의 진행과정을 살펴보면, 단핵구와 같은 혈구세포가 염증반응이 시작하는 병소에 화학주화성물질에 의하여 모이게 되고 이러한 혈구세포가 혈관의 내피층에 부착한 후, 내피층 안 쪽으로 이동하여 포말세포로 분화하여 일어나는 일련의 과정이 동맥경화반 발생 초기에 일어난다. 이와 같이 단핵구의 내피세포 부착은 동맥경화발생의 초기 과정 중에 일어나는 필수적인 과정 중의 하나로, alliin이 보여준 단핵구의 내피층 부착을 억제하는 기능은 동맥경화발생을 억제하는 병리학적 억제 기능과 연계되어 있음을 의미한다.</p><p>한편 본 연구에서 혈전형성과 밀접하게 연관되어 있는 THP-1 동종세포간 응집현상을 관찰해본 결과, alliin은 THP-1 세포의 응집 형성을 유도하지 않으며, 오히려 LPS에 의해 유도된 THP-1 세포의 응집을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 alliin의 세포수준에 보여준 LPS 유발 THP-1 동종간 세포응집 억제현상은 뇌졸증이나 심근경색을 일으키는 혈전의 형성을 억제하는 기능이 있음을 암시한다.</p><p>혈관기능과 연계된 다양한 세포수준에서 일어나는 alliin의 기능을 조사해 보았으나 각 기능에 관한 alliin의 분자생물학적 기전에 관해서는 아직 이해되지 않고 있다. 분자 생물학적 이해를 하기 위하여 혈관기능에 중요한 역할을 하고 있는 산화질소의 생산과 alliin이 어떤 관계가 있는지 알아보기 위하여 eNOS의 발현 혹은 활성에 alliin이 어떤 역할을 하는지 알아보았으나, 산화질소의 생산에 alliin은 관여하지 않음을 알 수 있었다. 오히려 alliin은 산화질소를 생산하는 eNOS의 발현을 억제하는 것으로 보아 alliin이 일으키는 다양한 혈관기능은 산화질소와 관계가 없는 것으로 추측된다.</p><p>본 연구결과를 종합해보면 alliin이 혈관내피세포의 여러 가지 생리활성을 조절하여 동맥경화를 비롯한 다양한 심혈관계 질환의 치료를 위한 물질일 가능성을 제시하고 있다.</p> <h1>서 론</h1><p>마늘(Allium sativum)은 오래 전부터 독특한 맛과 향을 지닌 식품으로 많이 사용되어 왔고, 항균, 항진균, 항바이러스, 면역 반응 개선, 항산화제로서의 기능을 가지고 있다고 알려져 왔다. 또한 마늘 추출물은 isoproterenol 유발 심근이상 억제, 고지혈증 감소효과를 일으키는 등, 죽상동맥경화와 관련한 여러 심혈관 질환을 예방하고 치료하는데 효과가 있다고도 알려져 있다. 마늘추출물을 이용한 세포실험결과에서도 콜레스테롤합성의 중요 조절 효소인 hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase 억제효과가 관찰되는 등, 마늘의 주요 성분이 심혈관 기능과 밀접하게 연계되어 있음을 알 수 있다.</p><p>마늘의 효능을 나타내는 주요 성분은 황 화합물들로 알려져 있고, 대표적으로 알려진 성분은 allicin (allyl 2-propene-thiosulfinate or diallyl thiosulfate), allyl methyl thiosulfonate, 1-propenyl allyl thiosulfate, \(\gamma\)-L-glutamyl-S-alkyl-L-cysteine 등이 있으며, 그 중 allicin이 가장 생리활성이 잘 알려진 성분이다. 생마늘에는 allicin이 존재하지 않으며, 마늘을 잘게 파쇄하거나 분쇄할 경우 아미노산의 하나인 cysteine에서 유래한 sulfoxide인 alliin (S-allyl cysteine sulfoxide)이 allinase에 의해 allicin으로 변환된다. Alliin은 열이나 산에 안정하여, 익힌 마늘, 마늘초, 흑마늘에도 존재한다. Alliin은 항암, 고지혈증 억제, 항당뇨, 항산화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.</p><p>Alliin의 생리기능에 관한 연구는 지난 수년간 많은 연구자들에 의해 진행되어 왔으나 혈관기능에 관한 alliin의 역할을 규명하는 연구는 상대적으로 매우 적었다. 혈관은 내피층과 혈관평활근 그리고 결체조직으로 이루어져 있고, 내피층은 유동하는 혈액과 직접 접촉하면서 혈관의 기능의 항상성을 조절한다. 따라서 혈관 내피층에서 일어나고 있는 내피세포의 성장, 세포사멸, 세포이동이나 세포신호전달체계의 활성 등은 혈관의 생리기능, 예를 들면, 혈관형성, 혈관긴장, 혈관 리모델링 등에 중요하게 관여한다. 따라서 alliin의 혈관기능을 이해하기 위해서 혈관내피세포의 성장과 세포사멸, 혈관이동 및 세포신호전달체계에 alliin이 어떻게 관여하고 있는지를 규명하는 것이 필수적이다. 이와 같은 연구는 혈관의 병리기능에 alliin이 어떻게 역할을 하고 있는지를 이해하는 것과도 밀접하게 연계되어 있다.</p><p>혈관에서 진행되는 대표적인 질환은 동맥경화이다. 동맥경화는 혈관에서 발생하는 질환으로, 초기에는 염증반응으로 진행된다. 염증반응이 시작되는 부위에서 화학주성 사이토카인들이 분비되면 단핵구와 같은 혈구세포가 병소 부위의 내피층에 부착하면서 단핵구나 백혈구 등이 내피층 안으로 이동(trans-endothelial migration)하게 된다. 내막 안으로 들어간 단핵구가 대식세포나 포말세포로 변환된 후 콜레스테롤 등이 축적되면 동맥경화반이 형성된다.</p><p>본 연구에서는 현재까지 많은 연구가 이루어지지 않았던 alliin의 혈관기능을 포괄적으로 이해하기 위하여 혈관 내피 세포의 성장과 세포사멸, 혈관 내 상처를 치유하고 혈관 형성의 중요한 과정 중 하나인 혈관 내피 세포의 이동, 혈관을 확장시키고 혈소판 응집을 방해하는 산화질소 측정, 죽상동맥경화의 발달에 중요한 단계인 이종 세포간 부착현상, 상처 치료의 초기 단계인 혈구 세포의 응집 등 다양한 혈관 기능에 alliin이 미치는 영향을 관찰하고, alliin에 의한 세포 내 신호 전달의 변화와 다양한 유전자의 조절 패턴을 western blot과 RT-PCR을 통해 확인하는 등 세포 수준에서 일어나는 alliin의 다양한 기능을 조사함으로써 alliin의 새로운 혈관 기능에 관한 가능성을 제시코자 한다.</p>	생명
대사공학기술을 이용한 기능성 carotenoids 고 생산 감자의 개발 현황	<h1>감자의 괴경 내 특정카로티노이드를 집적시키기 위한 전략</h1> <p>특정 카로티노이드를 감자의 괴경에 특이하게 집적시키기 위하여 다양한 전략이 사용되었다. 첫째는 특정 유전자를 과 발현시키는 방법으로 \( D x s \) 와 \( C r t B \) 유전자를 감자의 괴경에 특이하게 발현을 유도하는 Patatin promoter와 완두에서 분리한 rbc \( \mathrm{S} \) transit peptide를 이용하여 감자의 괴경내 색소체에 카로티노이드가 집적되도록 하였다. 그 결과 \( D x s \)유전자를 도입한 감자에서 phytoene이 집적되는 것을 확인하였으며 (Morris et al. 2006a), \( \mathrm{Crt} B \) 를 과 발현시켜 \( \beta \)-carotene, lutien, violaxanthin, Anteraxanthin의 함량이 증가된 것을 확인하였으며 특히 lutein의 경우 비형질전환체에 비하여 19 배나 증가하였다고 보고하였다 (Ducreux et al. 2005).</p> <p>두 번째 전략은 anti-sense유전자를 도입하여 특정 유전자의 발현을 down-regulation시키는 방법을 사용하였다.Diretto 등 (2006; 2007b)은 Lcy-e와 Chy유전자의 anti-sense 단편을 Patatin promoter에 연결하여 도입한 결과 전자의 경우에는 총 카로티노이드의 함량이 \( 2.5 \) 배까지 증가함과 동시에 \( \beta \)-carotene의 함량이 14 배 증가하였다고 보고하였으며, 후자의 경우에는 총 카로티노이드의 함량이 \( 4.5 \) 배까지 증가하고 \( \beta \)-carotene의 함량이 38 배까지 증가하는 획기적인 연구결과를 보고하였다. 이러한 결과는 \( \mathrm{a} \)-carotene 의 생산을 위한 분지과정의 첫 단계에 관여하는 Lcy-e 유전자와 \( \beta \)-carotene의 hydroxylation과정을 통하여 그 아래 단계의 zeaxanthin, violaxanthin, antheraxanthin등의 합성을 저해한 결과 전구물질들이 집적된 것으로 사료된다. 이와 유사하게 \(Zep\) 유전자의 anti-sense 단편을 감자에서 분리 한 granule-bound starch synthase 유전자 \((GBSS)\)의 promoter에 연결하여 도입한 결과 총 카로티노이드의 함량이 \( 5.7 \) 배 증가하였고, zeaxanthin의 함량이 4 에서 130 배 증가하였다고 보고하였다 (Römer et al. 2002).</p> <p>다음으로는 하나 이상의 유전자를 동시에 도입하는 co-transformation기술을 도입한 것으로 Erwinia herbicola로부터 분리한 \( Crt B\) , \( Crt I\) , 그리고 \( C r t Y\) 유전자를 Patatin promoter를 이용하여 동시에 감자에 도입한 결과 총 카로티노이드의 함량이 20 배까지 증가함과 동시에 \( \beta \)-carotene의 함량이 3,600 배까지 증가하였다고 하였다 (Direto et al. 2007a). 이 결과는 현재까지 알려진 연구결과로는 가장 성공적인 결과로 밝혀졌다. 뿐만 아니라 황금감자 (golden tuber)라고 불리는 형질전환계통을 대상으로 감자의 괴경내 carotenoid의 함량을 극대화시키면서 다른 유전자의 전사활동 또는 생합성대사과정에 영향을 미치지 않고 농업적 특성을 변화시키지 않는 최적의 계통을 구명하기 위한 추가적인 연구결과도 발표하였다 (Diretto et al. 2010). 한편 \(RNAi \) 기술을 이용하여 \( C C D 4 \) 를 감자에 도입하여 down-regulation 시킨 결과 괴경 내 총 카로티노이드의 함량이 4 배 증가하였으며 특이하게도 violaxanthin의 함량이 4 배까지 증가하면서 노란색 속살을 가진 감자를 생산하였다고 보고 하였다 (Campbell et al. 2010). 뿐만 아니라 잎, 줄기, 뿌리 등에서는 카로티노이드의 함량에 변화가 없었으나 petal에서 특이하게 카로티노이드의 함량이 증가하여 노란색으로 변화하였다고 보고하였다.</p> <p>마지막으로 카로티노이드 등의 화합물을 저장할 수 있는 공간을 보다 많이 제공함으로서 보다 많은 카로티노이드가 집적될 수 있도록 하는 전략이다. 최근에 발표된 연구결과에 의하면 \( O r \) 유전자를 \( G B S S \) promoter에 연결하여 도입한 결과 총 카로티노이드 함량이 6 배까지 증가하였을 뿐만 아니라 phytoene, phytofluene와 같은 카로티노이드 합성과정의 전구물질이 축적된 것을 보고 하였다 (Lopez et al. 2008; Van Eck et al. 2010). 그러나 잡색체 또는 엽록체의 분화 및 소멸과정 등의 분자생물학적 조절 기작에 관하여 아직은 보다 많은 연구가 이루어져야 하며 특히 빛이 없는 땅속에서 발육하는 감자의 괴경 조직 내에서 \( \mathrm{Or} \) 유전자의 발현과 관련된 생리생화학적인 연구결과가 집적되어야 할 것으로 사료된다.</p> <h1>케토형 카로티노이드의 집적을 위한 대사공학 기술</h1> <p>서론에서 언급한 바와 같이 아스탁산틴과 같은 케토형 카로티노이드는 일반적으로 식물은 생산을 하지 않는다. 그 이유는 케토기를 첨부할 수 있는 촉매 기능을 하는 \( \beta \)-carotene ketolase를 암호 하는 유전자가 없기 때문이다. 최근에 \( \beta \)-carotene ketolase유전자가 Synechocystis 와 Haematococcus pulvialis로 부터 분리되어 각각 Crt \( O \) (Gerjets and Sandmann 2006) 와 \(Bkt1 \) 로 (Morris et al. 2006b)으로 명명하였다. 케토형 카로티노이드를 감자에 집적시키기 위하여 현재까지는 두 가지 즉 과발현 (over-expression)과 co-transformation 기술이 보고되었다 (Table 3).</p> <p>첫 번째 전략으로서 \(Bkt1 \) 유전자를 patatin promoter와 감자에서 분리한 \( P d s \) 유전자의 transit peptide를 사용하여 도입한 결과 감자에서는 생산이 되지 않는 astaxanthin이 \( 14 \mu \mathrm { g } \cdot \mathrm { g } ^ { -1 } \) dry weight 그리고 keto-lutein이 \( 9.8 \mu \mathrm { g } \cdot \mathrm { g } ^ { -1 } \) dry weight 수준으로 집적되어 감자의 속살이 붉은 색을 나타내었다고 하였다 (Morris et al. 2006b). 두 번째로 \(Crt B \) 와 \( B k t 1 \) 유전자를 각각 patatin 그리고 \( r b c S \) TP와 \( P d s \) TP에 연결한 것을 co-transformation시킨 결과 keto-lutein이 \( 0.6 \mu \mathrm { g } \cdot \) \( \mathrm { g } ^ { -1 } \), astaxanthin이 \( 0.5 \mu \mathrm { g } \cdot \mathrm { g } ^ { -1 } \), canthaxanthin이 \( 0.2 \mu \mathrm { g } \cdot \mathrm { g } ^ { -1 } \) 수준으로 집적되었다고 보고하여 전술한 \(Bkt1 \) 유전자만을 과 발현 시킨 것 보다 매우 낮은 수준으로 나타났다 (Morris et al. 2006b). 마지막으로 anti-sense \(Zep \) 유전자를 기 도입한 감자에 \( \mathrm { Crt } \) O유전자를 항시발현 프로모터인 \( CaMV35S \)를 시용하여 동시에 도입한 결과 3'-hydroxy-echinenone, 4-keto-zeaxanthin, astaxanthin의 함량의 집적을 확인하였으나 역시 그 수준은 예상한 것 보다는 낮게 나타난 것으로 보고하였다 (Gerjets and Sandmann 2006).</p> <h1>적 요</h1> <p>감자의 괴경에 비타민A의 전구물질인 베타 카로텐 또는 항산화활성이 높으나 일반식물에서는 합성되지 않는 astaxanthin과 같은 케토형 카로티노이드의 집적을 위한 연구가 최근 활발하게 진행되고 있다. 현재까지의 연구 결과를 요약하여 보면 \( \beta \)-carotene의 함량이 \( 47 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \) dry weight으로 대조구에 비하여 3,600 배 까지 증가한 결과가 보고되었다. 또한, 해양 미생물로부터 분리한 \( \beta \)-carotene ketolase 유전자를 도입한 감자의 괴경에서 astaxanthin 등의 케토형 카로티노이드의 함량이 최고 \( 14 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \) dry weight까지 증가하여 감자의 색깔이 붉은 색으로 변하였다고 보고하였다. 따라서 본 논문에서는 이들 형질전환 감자의 생산을 위하여 도입한 유전자의 종류, 대사공학적 전략, 문제점 및 향후 연구 방향 등에 관하여 논하고자 하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>감자는 전 세계에서 4 번째 주식으로 그 소비량이 해마다 증가하고 있다. 특히 감자는 전분의 공급원으로서 주요할 뿐만 아니라, lysine, methionine, tryptophan 등 필수아미노 산의 함량이 높은 단백질을 함유하고 있고, 칼슘, 철, 칼륨 등과 함께 비타민 C의 함량도 높아 영양학적으로 그 가치가 높은 것으로 알려져 있다 (Mullins et al. 2006). 그러나 대부분의 재배종 감자의 괴경에는 비타민A 의 전구물질인 카로티노이드가 합성되지 않거나 그 함량이 아주 낮다. 따라서 최근에는 다양한 분자생물학적 기술의 발달과 함께 감자의 괴경 내에 카로티노이드의 함량을 높이기 위한 연구 결과가 지속적으로 발표되고 있다.</p> <p>식물의 카로티노이드는 이소프렌 (isoprene: \( C_{5} \) ) 구조를 가지는 isoprenyl pyrophosphate (IPP)와 dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP)을 기본단위로 합성된다. 엽록체에서는 2-C-methyl D-erythritol-4-phosphate (MEP)경로를 통하여 IPP와 DMAPP가 합성되나 세포질에서는 Mevalonate (MVA)경로로 알려진 생합성과정을 통하여 합성된다 (Ha et al 2003). 세포질에서 합성된 IPP와 DMAPP는 phytosterol의 생합성에 이용되며, 엽록체로 이동되어 카로티노이드를 포함하여 phytosterol, phytoalexin과 giberrelin (GA), Absicic acid(ABA) 등의 식물호르몬을 합성하는데 이용된다 (Giuliano et al. 2008; Hasunuma et al. 2008). Figure 1에서 간략하게 요약한바와 같이 엽록체의 MEP 경로는 pyruvate와 glyceraldehyde-3-phosphate (GAP)로 부터 1-deoxy-D-xylulose-5 phosphate (DXP)를 합성하고 이는 다시 MEP 그리고 IPP를 합성하는 과정을 거치나 세포질에서 일어나는 MVA 경로는 Acetyl CoA가 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG CoA),MVA 그리고 IPP와 DMAPP로 전환된다.</p> <p>MEP와 MVA 경로를 통하여 합성된 IPP 즉 \( \mathrm{C}_{5} \) 화합물의 순차적인 첨가반응을 통하여 geranyl pyrophosphate (GPP : \( \mathrm{C}_{10} \) ), farnesyl pyrophosphate (FPP : \( \mathrm{C}_{15} \) ), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP: \( \left.\mathrm{C}_{20}\right) \)이 합성된다. GGPP는 phytoene과 lycopene을 거쳐 다시 두 가지 경로를 거치면서 \( a- \) carotene 그리고 \( \beta \)-carotene을 합성한다. 이들은 hydroxylation 과정을 거치면서 zeaxanthin, violaxanthin, neoxanthin 등을 합성한다 (Hirshberg 2001). 특히 최근에는 astaxanthin, 등을 포함한 keto형 carotenoids가 주목을 받고 있는데 이는 항산화성이 토코페롤이나 비타민C 보다 강하지만 식물 에서는 일반적으로 합성이 되지 않는 것으로 알려져 있기 때문이다. 주로 새우 등의 물고기나 바다에 서식하는 미생물에서 \( \beta \)-carotene ketolase에 의하여 keto기를 삽입함으로서 합성된다 (Steiger and Sandmann 2004).</p> <p>이렇게 다양하고 복잡한 카로티노이드 생합성과정에 관여하는 효소들의 기능을 밝히고 이들을 암호 하는 유전자를 클로닝하기 시작하면서 벼, 옥수수, 감자 등의 주곡작물에서 특정 카로티노이드를 집적시키기 위한 대사 공학연구가 성공적으로 이루어지기 시작하였다. 최근에는\( \beta \)-carotene의 함량이 향상된 벼 (golden rice)가 상업화 를 위한 포장시험 등 안전성 평가단계에 있어 조만간에 시장에 출시 될 것이라고 한다 (Ye et al. 2000). 따라서 본 논문에서는 다양한 종류의 특정 카로티노이들 집적시킨 감자의 연구현황을 살펴보고 해결하여야 할 문제점 등을 고찰하여보고자 하였다.</p> <h1>감자내 카로티노이드의 집적을 위하여 사용된 외래 유전자의 현황</h1> <p>현재까지 보고된 연구결과를 통하여 감자의 괴경에 특정 카로티노이드를 집적시키기 위하여 도입한 외래 유전자의 종류를 Table 1 에 요약하였다. 생합성대사과정의 가장<p>첫 단계 즉 MEP경로의 첫 단계로 pyruvate와 GAP를 이용하여 1-deoxy-D-xylulose-5 phosphate (DXP)를 합성하는 1-deoxy-D-xylulose-5 phosphate synthase \( (D x s) \) 유전자를 Escherichia coli에서 분리하였으며 이를 감자에 도입하는데 성공하였다 (Morris et al. 2006a). 그리고 GGPP를 phytoene으로 전환하는 반응을 촉매하는 phytoene synthase (Psy)를 암호하는 유전자\(Crt B \)를 Erwinia uredovora와 Erwinia herbicola로부터 분리하여 감자에 도입한 결과가 발표되었다 (Ducreux et al. 2005; Diretto et al. 2007a). 뿐만 아니라 phytoene을 lycopene으로 전환시키는 반응을 촉매하는 phytoene desaturase ( (Pds) 를 암호 하는 유전자 \( (\mathrm{Crt} \) I) 와 lycopene에 \( \beta \)-ring 을 삽입시켜 \( \beta \)-carotene을 생산하는 반응을 촉매하는 lycopene \( \beta \)-cyclase (Lcy-b)를 암호 하는 유전자 \( ( \) Crt Y) 를 역시 Erwinia herbicola로부터 분리하여 감자에 도입한 결과를 발표하였다 (Diretto et al. 2007a). 한편 \( \mathrm{a} \)-carotene을 생합성하는 분지과정에서의 첫 단계에 관여하는 lycopene epsilon cyclase 를 암호 하는 유전자 \( (L c y-e) \), 그리고 \( \beta \)-carotene의 단계적인 hydroxylation반응을 촉매 하는 \( \beta \)-carotene hydroxylase을 암호 하는 유전자 \((Chy1, Chy2 \))를 감자로부터 분리하여 감자의 대사공학기술에 응용된 결과도 발표되었다 (Diretto et al, 2006; 2007b). 한편 Rômer 등 (2002)은 zeaxanthin을 violaxanthin으로 전환시키는 반응을 촉매하는 zeaxanthin epoxidase를 암호하는 유전자 \( (\mathrm{Zep}) \) 를 감자로부터 분리하여 감자의 괴경내 zeaxanthin의 집적을 유도하기 위한 대사공학기술에 응용하였다. 한편 직접적으로 카로티노이드의 생합성 대사과정에는 관여하지 않지만 색소체의 발달에 관여하는 유전자 \( (O r) \) 을 Cauliflower로부터 분리하는데 성공하였으며 이를 감자에 도입하여 카로티노이드의 함량을 높이는데 성공하였다고 보고하였으며 (Lu et al. 2006; Lopez et al. 2008; Van Eck et al. 2010), carotenoid의 분해과정에서 다양한 종류의 apo-carotenoid를 생산하는 carotenoid cleavage dioxygenase \( 4(C C D 4) \) 유전자를 감자에서 분리하는데 성공하여 감자의 괴경내 carotenoid를 고농도로 집적시키기 위한 대사공학기술에 응용할 수 있었다고 보고하였다 (Campbell et al. 2010).</p>	생명
진탕배양에서 Acetobacter sp. A9로부터 셀룰로오스 생산에 대한 완충성분 및 Bead의 효과	<h1>재료 및 방법</h1> <p>사용균주는 Acetobacter sp. A9이었으며, 기본배지의 조 성은 glucose \( 2.0 \% \), yeast extract \( 0.5 \% \), polypeptone \( 0.5 \% \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.675 \% \), citric acid monohydrate \( 0.115 \% \) 및 ethanol \( 1.4 \%\) pH6.5)이었다. 전배양은 \( 50 \mathrm{~m} \)의 기본배 지가 함유된 \( 250 \mathrm{ml} \) 용량의 conical flask에 평판한 천배지에서 보존중인 균주한 백금이를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간동안 정치배양하였다. 형성된 pellicle로부터 세포를 유리시키기 위하여 10분간 강하게 진탕한 후, 멸균된 거즈로 여과하였다. 이 세포현탁액 \( 5 \%\)(v/v)를 배지 \( 75 \mathrm{ml} \)가 함유된 \( 250 \mathrm{ml} \)용량의 conical flask에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 7일간 회전진탕배양하였다. BC의 정제 및 균 방법에 따랐다. 모든 실험은 triplicates로 실시하였으며, 나타낸 각 결과들은 이들의 평균값이었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>본 균주는 탄소원인 glucose로부터 대량의 gluconic acid를 생성하여 배양액의 pH를 2.5 이하로 감소시키는 것으로 보고되어 있다. 따라서 배양액의 pH가 BC생산성에 중요한 인자로 작용한다는 가정하에, 기본배지에 완충성분으로 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) 및 \( \mathrm{CaCO}_{3} \) 를 \( 0-0.5 \% \)씩 첨가하여 균체 생육도 및 BC생산량을 검토하였으며, 그 결과는 Table 1 및 Fig. 1에서 보는바와 같다. MOPS를 첨가한 경우, 농도 증가에 따라 균체 생육도 및 BC 생산량도 증가하였으나 \( 0.3 \% \) 이상의 농도에 서는 모두 감소하는 경향을 나타내었다. MOPS를 첨가하지 않은 대조구의 경우 \( 4.7 \mathrm{~g} / 1 \)의 BC가 생성되었으며, \( 0.2 \% \) 의 MOPS가 첨가된 경우, \( 6.9 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 의 BC가 생성되었다. 대조구의 최종 pH는 2.5 였으며, 모든 실험구의 최종 pH는 2.9로 일정하였다. \( \mathrm{CaCO}_{3} \) 를 첨가한 경우, 농도 증가에 따라 균체 생육도 및 BC생산량도 증가하였으나 \( 0.4 \% \) 이상의 농도에서는 모두 감소하였으며, \( 0.3 \% \)의 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 첨가되었을 때 \( 7.2 \mathrm{~g} / 1 \)의 BC가 생산되었다. 실험구의 최종 pH는 \( \mathrm{CaCO}_{3} \) 농도증가에 따라 pH감소폭이 적었다. 그리고, 첨가된 두 완충성분 모두 균체 생육을 저해하는 임계농도가 존재하고, 이에 따라 BC생산량이 감소되는 것을 확인 할 수 있었다.</p> <p>배지에 MOPS 또는 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)등의 완충성분을 첨가함으로서 물질 생산성을 증가시킨 예로 Catharanthus reseus로부터 tabersonine의 생산, Streptomyces griseofuscus로부터 physostigmine의 생산, Rhizopus oryzae로부터 lactic acid 생산 등이 있다. Acetobacter spp. 는 pH2.6 이하에서 생육이 저해되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 연구결과는 배지성분으로 완충성분을 첨가하여 배양액의 급격한 pH 변동을 지연 및 최소화시킴으로서 균체 생육이 부양되고, 결과적으로 BC생산량이 증가됨을 시사하며, 본 균주에 의한 BC 생산은 cell growth-associated type이라는 이전 보고를 다시 한 번 확인할 수 있었다. 결론적으로, BC의 대량생산을 위해서는 배양액의 pH 조절이 필수적임을 알 수 있었다.</p> <p>BC는 mechanical homogenization에 의하여 disintegrated또는 fragmented fibrils를 함유한 suspension (disintegrated BC)으로 가공할 수 있다. 아직까지 disintegrated BC를 생성할 수 있는 배양방법은 보고되어 있지 않다. 따라서 bead의 첨가가 생성된 BC의 형태에 미치는 영향을 조사하기 위하여 직경 \( 3 \mathrm{~mm}, 6 \mathrm{~mm}, 10 \mathrm{~mm} \)의 유리 bead를 각각 \( 10 \mathrm{~g} \)씩 기본배지에 첨가하여 배양하였으며, 그 결과는 Fig.2 및 Table 2에서 보는 바와 같다. 직경 \( 3 \mathrm{~mm} \) 및 \( 6 \mathrm{~mm} \)의 bead를 첨가한 경우, 각각 한 개의 큰 덩어리 및 몇 개의 작은 덩어리 형태로 BC가 생성되었으나 \( 10 \mathrm{~mm} \)의 bead를 첨가한 경우, 매우 미세한 pellet 형태로 배양액 전체에 골고루 분산된 disintegrated BC가 생성되었다. 직경 \( 10 \mathrm{~mm} \) 이상의 bead를 첨가하여 진탕배양시, 원심력에 의해 bead와 배양용기 벽면과의 마찰이 발생하고, 이에 따라 세포로 부터 생성되고 있는 BC의 microfibril이 신속하게 절단됨으로서 disintegrated BC가 생성되는 것으로 판단되나 정확한 기작을 이해하기 위해서는 향후 계속적인 실험이 요구 되었다. BC생산량은 직경 \( 6 \mathrm{~mm}>10 \mathrm{~mm}>3 \mathrm{~mm} \)의 순서로 높았으나 큰 차이를 나타내지는 않았다.</p> <p>Disintegrated BC는 ultrafine network으로 구성되어 있기 때문에 수분 보유력이 뛰어나며, disintegrated BC suspension 역시 높은 수분 보유력 및 점성 등의 우수한 물리적 특성을 나타냄으로서 다양한 현탁물질의 thickener, disperser, emulsifier 및 stabilizer로 이용가능하다. 또한, disintegrated BC는 강력한 binding ability를 가지고 있으므로 다른 섬유성 물질과 흔합시 다양한 조성의 sheet가 용이하게 제조된다. 지금까지 homogenizer를 이용한 disintegrated BC의 제조나 homogenizer에 의하여 만들어진 disintegrated BC의 fibril 구조에 대한 연구는 있으나 배양중 disintegrated BC의 생산에 관련된 보고는 본 논문이 최초이며, 에너지 측면에서 효율적인 신기능성 BC 생산공정 확립에 좋은 기초자료가 될 것으로 판단된다.</p>	생명
트립토판 합성효소의 이소조절성에 미치는 리간드	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>\( \beta \) 반응에 미치는 리간드의 영향</h2> <p>Salmonella typhimurium의 트립토판 합성효소를 대상으로 한 결정구조학과 생화학적 연구로 일가 양이온과 \( a \)소단위체의 56 번 잔기인 아스팔산과 \( \beta \) 소단위체의 167 번 리신간의 염다리(salt bridge)가 이소조절성에 중요한 기능을 한다고 밝혀졌다. 여기서는 대장균의 동종효소를 대상으로 그 효과를 살펴보았다. 단백질 자체는 야생종이나 잔기 치환체인 D56E/G/N 모두 유사한 홉광도 양상을 보여 준다. \( 412 \mathrm { ~nm } \)에서 최대 홉광도 파장을 나타내는 데 이것은 단백질의 87번 리신과 조효소 PLP와의 결합체인 internal aldimine의 존재를 나타낸다. 세린이 첨가되면 aminoacrylate가 주로 형성되어 \( 350 \mathrm { ~nm } \) 에서 최대 홉광도를 나타내게 된다. 야생종과 활성이 유사한 D56E의 경우 야생형의 단백질과 비슷하나, 활성도가 낮은 D56G의 경우는 여전히 \( 424 \mathrm { ~nm } \) 에서 높은 홉광도를 보여주고 있고, D56N의 경우도 어느 정도는 \( 412 \mathrm { ~nm } \) 에서의 흡광도가 남아있다. 이는 internal aldimine과aminoacrylate 사이에 형성되는 external aldimine일 가능성이 높다. 이 결과는 잔기 치환체가 야생형 단백 질과는 달리 다른 중간구조체가 보다 더 안정화되어 있음을 나타낸다.</p> <p>다음으로 \( \beta \) 소단위체의 리간드로 알려져 있는 일가 양이온의 영향을 살펴보았다. \(Na ^ { + } \)를 처리하면, 야생종과 D56E은 거의 변화가 없는 반해, D56G와 D56N는 \( 424 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도가 매우 크게 증가하며, \( 350 \mathrm { ~nm } \) 의 흡광도는 매우 감소한다. \( K ^ { + } \)가 첨가된 경우, \(Na ^ { + } \)가 첨가된 경우와 유사하다. \( NH_ { 4 } ^ { + } \)가 첨가된 경우, 일가 양이온이 없을 때와 흡사한 흡광도 양상을 보여준다.</p> <p>이번에는 \(a \)소단위체의 이소조절성 리간드인 glycerophos-phate를 처리하였다. 야생종과 D56E의 흡광도는 서로 비슷하였다. D56G와 D56N는 \( 424 \mathrm { ~nm } \) 에서는 리간드가 없을 때와 비슷한 형태였지만, \( 350 \mathrm { ~nm } \) 에서는 차이를 보여주고 있다.</p> <p>야생종의 경우 56번 잔기의 아스팔산은 음전하를 띄고 있으며 비슷한 활성도를 갖는 D56E의 경우는 글루탐산으로 치환된 것인데 이 역시 음전하를 가지고 있다. 이에 반해 글리신으로 치환된 D56G와 아스파라긴으로 치환된 D56N의 경우는 전하가 변화된 상태이다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>박테리아 균주 및 플라스미드</h2> <p>대장균 균주 RB797 (F' lacl" proL8/arg Nal Rif recA sup lac proXIII) 는 단백질의 과량발현에 사용하였다. 야생종 또는 돌연변이 trpA 유전자와 정상적인 trpB 유전자가 포함한 플라스미드 ptactrpA를 이 균주에 형질전환하여 발현시켰다.</p> <h2>효소와 시약</h2> <p>모든 시약은 순도가 높은 것(ultra pure)을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>단백질의 과량 발현 및 분리방법</h2> <p>야생형 및 잔기치환 단백질들을 과량 발현시키고, 이의 분리는 이미 보고된 방법으로 하였다. 황산암모늄 \( \left ( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \right ) \) 침전법과 이온크로마토그래피 HPLC를 사용하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE을 실시하여 Coomassie Bril-liant Blue R로 염색하여 확인하였다. 순수 정제된 야생형의 \(a \) 소단위체의 농도는 \( \mathrm { E } ^ { 1 \% } { } _ { 278 \mathrm { ~nm } } = 4.4, \beta \) 소단위체의 경우 \( \mathrm { E } ^ { 1 \% } { } _ { 278 \mathrm { ~nm } } \) \( =6.5 \) 를 사용하여 결정하였다. 잔기치환 단백질의 경우에는 야생형을 표준으로 microbiuret 방법을 사용하였다.</p> <h2>분광광도계 측정</h2> <p>\( 50 \mathrm { mM } \mathrm { TEA } \) 완충용액 \( ( \mathrm { pH } 7.8) \) 을 사용하여 \( 200 \sim 820 \mathrm { ~nm } \) 에 서 Varian \( 4 \mathrm { E } \) 분광광도계로 측정하였다. 단백질의 농도는 30 \( \mu \mathrm { M } \) 로 사용하였으며, L-Ser \( 40 \mathrm { mM } , \mathrm { NaCl } 100 \mathrm { mM } , \mathrm { KCl } 100 \) \( \mathrm { mM } , \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } 50 \mathrm { mM } \), 그리고 DL-a-glycerol 3-phosphate (GP) \( 100 \mathrm { mM } \) 를 첨가하여 그 영향을 측정하였다. \( 550 \mathrm { ~nm } \) 의 값을 기준으로 보정하였다.</p> <p>염다리에 관여하는 56 번 잔기를 치환시킨 D56E, D56G, 그리고 D56N에 몇몇 일가 양이온들과 GP를 처리한 본 실험에서 이들 양이온들이 \( a_ { 2 } \beta_ { 2 } \) 복합체의 활성적인 닫힌구조(closed form)의 안정화에 상호작용을 하는 것으로 생각된다. \( Na ^ { + } \)와 \( K ^ { + } \)는 \( \beta \) 소단위체의 동일한 곳에 결합되나 그 후의 반응은 서로 다르다. 즉 \( Na ^ { + } \)가 존재하는 경우 \( \beta \mathrm { Asp } ^ { 305 } \) 의 carboxylate가 BLys167의 \( \varepsilon \)-amino group과 함께 염다리를 형성하게 되지만, \( K ^ { + } \)가 존재하는 경우 \( \beta \mathrm { Asp } ^ { 305 } \) 의 carboxylate가 변화된 형태가 되며, \( \beta \mathrm { Lys } ^ { 167 } \) 의 \( \varepsilon \)-amino group도 \( 7Å \) 정도 움직이게 되어 \( \mathrm { aAsp } ^ { 56 } \) 의 carboxylate와 접하고 있는 소단위체를 가로질러 염다리를 형성하게 된다. \( \beta \mathrm { Lys } ^ { 167 } \) 이나 \( \mathrm { aAsp } ^ { 56 } \) 에 돌연변이가 발생한 트립토판 합성효소의 경우, \(Na ^ { + } , K ^ { + } \)또는 \( NH_ { 4 } ^ { + } \)가 존재할 때 더 높은 효소활성을 보인다고 밝혀졌다. 그러나 지금까지의 실험에서 \( 424 \mathrm { ~nm } \) 에서의 E-Ser 복합체의 양이 D56G와 D56N에 다량으로 존재하는 것으로 보아 기존의 보고와는 다소 차이를 보여준다.</p> <h1>요 약</h1> <p>트립토판 합성효소의 이소조절성에 작용하는 리간드가 알려져 있다. \( \beta \) 반응의 기질인 세린만이 있는 조건에서 일가 양이온과온과 glycerophosphate의 리간드효과를 잔기치환체를 사용하여 조사하였다. 이들 리간드가 이 혀소의 이소조절성에 관여하고 있음을 보여주고 있다.</p>	생명
고단백질 사료의 급여가 다산 한우 암소의 육생산량과 육질에 미치는 영향	<h1>결 과</h1> <p>다산한우 암소전문사료의 급여효과가 증체량, 도체성적 및 육질성적에 미치는 효과는 Table 3에서 보는 것과 같으며, 사용된 3개의 농장의 개별적인 효과와 3개의 농장을 통합적으로 고려한 통합효과를 나타내고 있다.</p> <h2>증체효과</h2> <p>다산한우 암소전문사료의 급여에 따른 일당증체효과는 실험이 수행된 3개의 농장 중에서 2개의 농장에서 정적효과(positive effect)가 나타났다. 즉 전문사료를 급여한 처리구가 일반 비육우사료를 급여한 대조구에 비하여 높은 일당증체율을 나타내었다. 그러나 정적효과를 나타낸 농장 A와 농장B 중에서 농장B에서만 유의성 \( (p=0.01) \)이 나타났다. 반면에 농장C에서는 오히려 일반사료를 급여한 대조구에서 유의적인 수준 \( (p=0.01) \)으로 일당증체량이 높게 나타났다. 각 농장에서 얻어진 효과에 대한 통합효과는 0.07로서 정적효과가 나타났으나 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 통합적인 결과에 대한 각 실험별 가중치의 비중은 모든 농장에서 유사하게 나타났다. 일당증체량에 대한 효과의 Forest plot은 Fig. 1A에서 보는 것과 같다. 농장A와 B 모두 정적효과를 나타내고 있으나, 농장A의 \( 90 \% \) confidence interval은 부적효과(negative effect)와 정적효과 모두에 걸쳐 분포된 것으로 나타났다.</p> <h2>등지방 두께</h2> <p>등지방 두께는 세 개의 실험농장 중에서 2개의 농장에서만 정적효과가 나타났으며, 나머지 하나에서는 부적효과가 나타났다. 또한 통계적 유의성은 정적효과가 나타난 농장A에서만 관찰되었다. 통합적인 효과는 1.29 로서 암소비육 전문 사료의 급여가 일반 비육우사료를 급여하는 것보다는 높은 등지방 두께를 나타내었으며, 확률은 \( 67 \% \)로 나타났다. 등지방 두께에 대한 각 농장들의 효과와 \( 90 \% \) \( \mathrm{CI} \)분포는 Fig. 1B에서 보는 것과 같다. 농장A를 제외하고는 나머지 농장에서 \( 90 \% \) \( \mathrm{CI} \)가 부적효과와 정적효과에 걸쳐있는 것으로 나타났다.</p> <p>등심면적</p> <p>등심면적은 모든 농장에서 정적효과로 나타났으나 \( 95 \% \) 이상의 유의성은 발견되지 않았다. 통합적인 효과는 0.99로서 정적효과였고, 확률값은 \( 49 \% \)로 나타났다. Fig. 1C에서 보는 것과 같이 농장A, 농장C 그리고 농장B의 순으로 \( 90 \%\) \( \mathrm{CI} \) 범위가 넓은 것으로 나타났다.</p> <h2>도체중</h2> <p>도체중은 모든 실험 농장에서 정적효과를 나타내었으나 유의성은 발견되지 않았다. 특히 농장간의 편의를 조정하기 위한 \( \hat{\tau}^{2} \) 수치가 0 에 가까운 것으로 나타나 농장간의 편의가 크지 않는 것으로 나타났다. 통합적인 효과는 5.19로서 정적효과로 나타났으며, 확률값은 \( 45 \% \)로 나타났다. 농장간의 결과에 대한 가중치 비율은 세 개의 농장중에서 효과의 크기가 가장 작은 농장C에서 \( 64 \% \)로 가장 높게 나타났다. Fig. 1D에서 나타난 각 농장별 효과의 \( 90 \%\) \(\mathrm{CI} \) 범위는 농장C에서 가장 좁은 것으로 나타났다.</p> <h2>육량지수</h2> <p>육량지수는 농장A와 C에서는 부적효과를 나타내었으며, 이 중 농장A에서는 \( 99 \% \) 이상의 확률값을 나타내었다. 그러나 농장B에서는 평균차 효과 1.77로 정적효과를 나타내었으나 유의성은 발견되지 않았다. 각 농장의 \( 90 \%\) \(\mathrm{CI} \) 범위는 Fig. 1 E에서 보는 것과 같으며, 세 개의 농장 중에서 농장B가 가장 넓은 범위를 나타내고 있으며, 상대적으로 낮은 가중치가 적용되었다. 통합적인 효과는-0.86으로 부적효과였으며, 확률값은 \( 64 \% \)로 나타났다.</p> <h2>근내지방</h2> <p>근내지방은 농장A에서는 부적효과가 나타났으며, \( 90 \% \) 이상의 유의성이 발견되었다. 그러나 나머지 두 실험농장에서는 정적효과가 발견되었으며, 유의성은 나타나지 않았다. 실험 농장 모두 서로 유사한 수준의 가중치가 적용되었으며, 통합적인 효과는 0.18로서 정적효과로 나타났으며, \( 22 \% \)의 확률을 나타내었다. 각 실험농장에서 얻어진 결과들의 \( 90 \% \) \(\mathrm{CI} \) 위는 Fig. 1F에서 보는 것과 같다. 농장A 그리고 농장B와 C에서 확연히 다른 효과가 나타났음을 알 수 있다.</p> <h2>육색</h2> <p>농장A에서는 다산한우 암소 전문사료의 급여가 높은 육색 점수를 얻는 결과를 나타내었으나 나머지 실험농장에서는 일반 비육우사료의 급여가 보다 높은 육색점수를 얻는 것으로 나타났다. 그러나 농장B에서만 \( 90 \% \) 이상의 유의성이 나타났으며, 나머지 실험농장에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 통합적인 효과는 -0.04로서 부적효과로 나타났으며, 확률값은 \( 19 \% \)로 나타났다. 각 실험농장의 결과들에 대한 \( 90 \% \) \(\mathrm{CI} \) 범위는 서로 매우 다르게 나타났다.</p> <h2>조직감</h2> <p>조직감에 대한 결과는 농장A를 제외한 농장B 및 C에서 부적효과가 나타났으며, 특히 농장B에서는 유의적인 효과가 있는 것으로 나타났다. 통합적인 효과는 -0.08로서 부적효과였으며, 확률값은 \( 27 \% \)로 낮게 나타났다. 각 실험농장의 결과들에 대한 \( 90 \% \) \(\mathrm{CI} \) 범위는 육색에서 나타났던 형태와 매우 유사하게 나타났다.</p> <h2>농장별 사양실험결과의 편의 조사</h2> <p>3개의 농장에서 얻은 다산암소비육 전용사료의 급여효과들에 대하여 랜덤효과 모형으로 분석하여 통합효과를 산출하였고, 산출된 효과에 대한 편의 존재 여부를 조사하였다. 그 결과는 Table 4 에서 보는 것과 같고, 모든 분석항목에서 편의가 발견되지 않았다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험농장 및 실험 두수</h2> <p>본 실험은 경기도 소재 3개의 한우 암소 사육농가에서 수행되었으며, 각 실험농장에서 한우 3산 이상의 다산암소를 선발하였다. 농장에서는 대조구에 3두, 처리구에 29두를 공시하였으며, 농장B에서는 대조구에 3두, 처리구에 8두를 공시하였다. 농장C에서는 대조구에 4두 그리고 처리구에 11두를 공시하였다. 결과적으로 총 3개의 농장에서 다산 한우 암소 48두(평균체중, \( 456 \pm 75 \mathrm{~kg} \))를 처리구 그리고 10두(평균체중,\( 513 \pm 21 \mathrm{~kg}) \)를 대조구로 공시하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>실험사료 및 사양관리</h2> <p>암소 전용 배합사료는 비육전기와 비육후기로 구분하여 아래의 표(Table 1과 Table 2)와 같이 생산하여 실험농가에 공급하고 실험 대상축에 일일 두당 \( 8 \sim10 \mathrm{~kg} \) 수준에서 자유채식하도록 급여하였다. 대조구의 사료는 일반 사료회사에서 판매하는 거세우 비육후기 사료를 이용하였다. 실험기간은 농장여건에 따라서 다소간의 차이는 있었으나 평균 \( 211 \pm 30 \) 일간 급여하였고, 실험개시 후 4 개월 동안은 다산암소비육 전기사료를 급여하였고, 이후 출하시까지의 기간 동안에는 다산암소비육 후기사료를 급여하여 효과를 검정하였다. 급여사료를 제외한 나머지 사양관리 조건은 일반적으로 한우농장에서 사용하는 방법에 준하여 수행되었다.</p> <h2>증체 효과</h2> <p>각 실험 농장에서 실험대상 가축은 우방을 따로 관리하고 실험용 배합사료를 급여하기 전에 생체중을 측정하여 출하시 체중과 비교하여 실험 사료 급여 기간 동안의 일당 증체량을 계산하였다.</p> <h2>도체 성적 분석</h2> <p>쇠고기 시료는 갈비 12번째 마디에서 13번째 마디의 등심 (M. Longissimus dorst) 부위의 냉장육 \( 2.5 \mathrm{~kg} \)을 이용하였다. 농협 부천 공판장에 출하하여 도축된 공시축의 등급판정은 축산물품질평가원 소속 등급사가 측정하였다. 공시축의 육질 등급 요인(근내지방도, 등지방두께, 등심단면적, 육량등급, 육색, 지방색, 조직감, 성숙도)은 20-22시간 냉장된 반도체의 13번째 마디 갈비부위를 절개하여 측정하였다. 결과로 얻어진 육량등급A, B 및 C 등급을 각각 1, 2 및 3 점으로 나타내어 효과 검정에 사용하였다. 근내지방도는 1에서 9까지 등급을 구분하여 평가하였고, 육색은 1에서 7등급으로 나누었으며, 1등급은 선홍색을 나타내며, 7등은 검붉은색을 나타낸다. 조직감은 1에서 3등급으로, 성숙도는 1에서 9등급으로 구분하여 평가하였다. 지방색은 1에서 7등급으로 나누었으며, 1등급은 흰색 그리고 7등급은 노란색으로 구분하였다. 육질등급은 \( 1^{++} \) 등급은 1 점, \( 1^{+} \)등급은 2점, 1 등급은 3점 그리고 2등급과 3등급은 각각 4점과 5점으로 구분하여 평가하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>본 연구는 3개의 서로 다른 농장에서 일반적인 사양관리 방법에 준하여 수행된 것이며 농장마다 서로 다른 기간 동안에 그리고 서로 다른 관리인 및 관리프로그램 아래서 수행되었다. 따라서 농장간 연구결과에는 이질성이 존재할 수 있다. 이에 본 연구에서는 메타분석방법을 이용하여 통합적인 처리 효과를 산출하였다. 3개 농장에서의 처리구와 대조구간 평균 성적 차이를 이용하여 사료급여효과를 분석함에 있어 렌덤효과모형을 적용하였고, 통합적인 효과를 산출하였다. 렌덤효과모형의 산출방법 및 통합효과 분석방법은 Kook 등의 방법에 준하여 실시하였다. 대략적인 방법은 다음과 같다. 다산암소 전문사료의 급여와 일반비육우사료의 급여를 통하여 얻어진 각 성적들의 평균차 \( \left(d_{i}\right) \)를 산출하였고, 렌덤효과모형을 산출하기 위하여, 각 평균차에 대한 근사적 역분산 \( \left(w_{i}\right) \)을 산출하였다. 최종적으로 통합적 효과(summary effect, \( \bar{d}) \)를 아래와 같은 수식을 이용하여 산출하였다.</p> <p>\( \bar{d}=\frac{\sum_{i}^{k} d_{i} w_{i}}{\sum_{i}^{k} w_{i}} \)</p> <p>위의 통합적 효과에서 각 실험농장에서 발생하는 편의를 보정하기 위하여 \( \hat{\tau}^{2} \) (tau-squared)를 산출하였고, 다시 렌덤효과모형의 조정된 근사적 역분산 \( \left(w_{i}^{}\right) \)을 계산하였고 최종적으로 편의가 조정된 렌덤효과모형의 통합적 효과를 산출하였다.</p> <p>\( \hat{\tau}^{2}=\operatorname{Max}\left(0, \frac{Q-(k-1)}{\sum_{i}^{k} w_{i}-\left(\sum_{i}^{k} w_{i}^{2}\right) / \sum_{i}^{k} w_{i}}\right) \)</p> <p>\( w_{i}^{}=\frac{1}{\left(d_{i}+\hat{\tau}^{2}\right)} \)</p> <p>\( \bar{d}^{}=\frac{\sum_{i}^{k} d_{i} w_{i}^{}}{\sum_{i}^{k} w_{i}^{}} \)</p> <p>\( \operatorname{Var}\left(\bar{d}^{}\right)=\frac{1}{\sum_{i}^{k} w_{i}} \)</p> <p>최종적으로 표준화된 효과와 효과의 표준편차를 이용하여 \( Z \)-value를 산출하였고, 정규누적분포의 양측검정을 이용하여 확률값을 산출하였다. 렌덤효과모형으로 얻어진 결과들의 편의 검증은 Egger's regression을 이용하여 검정하였다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>암소비육전문사료의 급여에서 일당 증체량과 도체중이 증가하는 것은 사료내 조단백질의 증가가 육량의 증가를 가져온 결과라고 판단된다. 근내지방도는 암소비육전문사료를 급여 한 군에서 비육전문사료를 급여한 경우에 비하여 유의성은 없지만 높은 결과를 나타내었으며, 암소비육전문사료 급여군의 근내지방도는 최저 3.38에서 최대 4.25로 나타났다. Lee 등의 연구에서 보면 축종별 근내지방도는 거세우 도체가 5.02로 가장 높았으며, 암소는 4.39, 수소는 1.32이었다. 또한 Panjono 등의 연구에서는 거세우와 수소의 근내지방도가 각각 5.05 및 1.53이었다는 결과와 비교해 볼 때, 본 연구에서 나타난 다산 암소의 근내지방도는 거세우보다는 낮고, 일반 암소와 유사하며, 거세우보다는 높게 나타났다. 그러나 Moon 등의 연구 결과에서는 한우암소의 근내지방도가 평균 9.42였고, Song 등의 연구에서는 거세한우 근내지방도 6.50로 나타나, 본 연구의 다산암소보다는 높게 나타났다. 근내지방도의 평가기준은 국가별로 다르기 때문에 외국의 연구결과와 직접 비교하기는 어려우나 여러 연구에서 미경산우가 거세우 보다 근내지방도가 높게 나타났으며 미경산우와 거세우 간에는 큰 차이가 없게 나타났다. 본 연구에서 한우 다산 암소의 육색은 대조구와 비육전문사료 급여군 모두 4.7에서 5.0 사이로 서로 유사하게 나타났다. Lee 등의 결과에서는 암소, 수소, 거세우 도체의 육색은 각각 5.12, 5.08 및4.79로서 암소고기의 육색이 가장 어둡게 나타났고, 한우에 있어서는 한우암소, 한우수소 및 한우거세우의 육색이 각각 4.43,4.71 및 4.36으로 보고되었다. Song 등의 연구에서는 한우 경산우의 육색이 4.0로 나타났다. Panjono 등의 연구에서는 한우수소 및 거세우의 육색이 각각 5.03 및 4.08로 나타났다. 본 연구에서 한우 다산 암소의 조직감은 1.63에서 1.72 사이의 결과를 나타내었다. 이와 같은 결과는 Lee 등의 연구에서 나타난 한우거세우의 조직감(1.31), 암소(1.72) 및 수소(1.99)의 결과와 유사하였고, Park 등의 연구에서 나타난 한우암소(4.17), 수소(4.53) 및 거세우(3.69)의 조직감보다는 낮게 나타났다.</p> <h2>경제성 분석</h2> <p>축산물품질평가원의 2010년 11월 도매가격 평균은 암소의 경우 \( 1^{++} \) 등급이 21,747 원, \( 1^{+} \) 등급이 18,156원, 1등급이 15,679원, 2등급이 11,815원, 3등급이 9,096원이었다. 본 연구를 통하여 얻어진 대조구 및 처리구의 등급판정결과는 Table 5 에서 보는 것과 같다. 다산암소 비육전문사료를 급여한 군의 \( 1^{+} \)등급 출현율은 \( 13.6 \%\) 1등급은 \( 40.9 \%\) 2등급은 \( 45.5 \% \) 및 3등급은 \( 0.0 \% \)로 나타났다. 일반 비육우사료를 급여한 대조군의 \( 1^{+} \)등급 출현율은 \( 10.0 \%\) 1등급은 \( 20.0 \%\) 2등급은 \( 70.0 \% \) 및 3 등급은 \( 0.0 \% \)로 나타났다. 각 처리구별 및 등급별 출현율을 기초로 하여 경제성을 분석하였다. Table 5에 의하면 암소 10두를 출하할 경우 대조구는 46,276천원의 경락가격을 얻고 비육전문사료 급여군은 49,902천원의 경락가격을 얻는다. 또한 2010년 평균성적에 대입할 경우 43,933천원의 경락가격을 얻게 된다. 따라서 다산암소 비육전문사료를 급여시 대조구에 비해서는 3,626천원의 추가이익을 얻을 수 있고, 2010년 평균농가성적과 비교하면 5,969천원의 추가이익이 발생한다. 따라서 다산암소 비육전문사료를 이용한 암소비육이 농가의 생산성 및 수익성 향상에 도움이 될 것으로 판단된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>축산물품질평가원에서 발표한 2009년도의 한우 도체 등급 판정두수는 전체 643,930두이며 암소가 \( 46.6 \% \), 수소가 \( 15.5 \% \), 거세우가 \( 37.9 \% \)를 점유하고 있다. 쇠고기 산업에 있어서 도체 조성 및 쇠고기 품질은 시장가격을 결정하는 주요 요인으로 작용한다. 쇠고기 브랜드 프로그램은 소비자의 높은 인지도와 구매력을 바탕으로 가격경쟁력을 향상시킴에 있어 매우 중요하다. 주요 선진국에서는 소 도체의 가치평가 방법으로 도체 등급제도를 채택하고 있으며 소비자의 구매의식 변화에 따라 품질 인증, 브랜드 인증 등 국가주도의 다양한 프로그램들이 개발되어 적용되고 있고, 일정주기로 분석된 성별 도체 특성 및 육질에 대한 정보는 생산지표, 지도, 연구, 마케팅 및 정책결정에 중요하다. 따라서 성별 도체특성 및 쇠고기 품질에 대한 연구는 유전 육종, 품종, 영양사양, 품질평가 등에 관한 연구는 지속적으로 수행되어져 오고 있으며, 육질 개량 목표설정 및 쇠고기 산업 발전 목표 설정에 중요한 자료로 활용되고 있다.</p> <p>국내 한우 암소의 도체 조성 및 육질에 관한 연구는 도체 등급이 개정된 2004년 12월 이후에 몇몇 연구에서만 수행되었을 뿐 아직까지는 미비한 실정이다. 또한 한우 경산 암소에 대한 비육특성을 고려한 적정 영양소 공급수준에 관한 체계적인 기준이 없는 실정이다. 일반적으로 성숙도(연령)에 의한 연도나 다즙성 및 풍미(맛)와 같은 육질 특성은 나이가 많은 소의 쇠고기가 육질이 질기고, 다즙성이 떨어지며, 좋지 않은 풍미를 가진 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 인식은 암소고기에서 얻어진 분석 결과를 바탕으로 형성된 것이라기 보다는 소가 역우로 가치가 높던 시절, 연령이 오래 된 소를 도축하여 생산된 쇠고기의 품질이 조악했기 때문이라고 판단된다. 이러한 이유에서 현재 국내에서는 다산 암소비육에 있어서 일반 거세비육후기 사료가 급여되고 있으며 이러한 사료 급여는 암소의 비육특성에 적합하지 않아 불가식지방의 증가와 육량의 감소를 유발할 수 있어 다산 암소의 적정 사육방식으로 볼 수 없다. 이에 본 연구에서는 다산 암소의 적정 비육프로그램 개발 연구의 일환으로 다산 암소 고기의 육량과 육질 향상을 위해 영양공급, 특히 단백질 수준을 달리한 사료를 비육전기에 급여하였을 경우 비육성적과 도체특성에 관한 연구를 수행하였다.</p>	생명
Fomitopsis pinicola 균사체로부터 Laccase의 최적생산조건	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주</h2> <p>본 연구에서 사용된 소나무잔나비버섯의 균주(MKACC 54347)는 한국농생명과학연구정보센터에서 분양받았으며, potato dextrose agar(PDA, Difco. Lab.) 배지에 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 상에서 7일 동안 배양한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉장고에 보관하였으며 약 1개월마다 계대배양하였다.</p> <h2>시험배지 및 균사배양</h2> <p>F. pinicola 균사체로부터 laccase의 생산성 비교를 위해 Coriolus versicolor medium(CVM), Czapex Dox medium (CDM), Lentinus edodes medium(LEM), mushroom complete medium(MCM), malt yeast glucose medium(MYGM), potato dextrose medium(PDM), yeast malt extract medium (YM), laccase production medium(LPM) 및 YpSs medium (YSM)을 사용하였으며, 각 배지의 조성은 Table 1 에 나타내 었다. F. pinicola를 \( \mathrm { PDA } \) 평판배지 상에 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 7일 동안 배양한 후 한천배지 상의 균사를 직경 \( 5 \mathrm { ~mm } \) 의 cork borer로 agar plug를 만들어 각각의 액체배지 \( 100 \mathrm { ~mL } \) 에 5 개씩 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 9 일간 \( 80 \mathrm { rpm } \) 으로 진팅배양 하였다. 탄소원, 질소원, 인산원 및 무기질원 등의 영양원에 따른 효소 생산성 관찰을 위하여 복합배지 중 가장 높은 효소 활성을 나타내는 \( \mathrm { MCM } \) 의 조성으로부터 해당 영양원을 제거하고 \( 2 \% \) 탄소원, \( 0.4 \% \) 질소원, \( 0.05 \% \) 인산원 및 무기질원을 각각 첨가하여 실험하였다. 실험에 사용한 모든 배지는 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분 동안 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>Laccase의 효소활성은 Ullrich 등의 방법을 인용하여 측정하였다. Laccase의 활성 측정을 위한 조효소액으로 \( F \). pinicola의 배양액을 \( 8000 \mathrm { rpm } \) 에서 20 분간 원심분리한 상등액을 사용하였으며, laccase 활성은 \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { ABTS } \) 를 기질로 사용하여 \( 100 \mathrm { mM } \) 아세트산나트룸 완충용액 \( ( \mathrm { pH } 3.0) \) 상에서 효소와 반응시켜 생성되는 양이온 라디칼을 \( 420 \mathrm { ~nm } ( \varepsilon = \) \( \left .36,000 \mathrm { M } ^ { -1 } \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 에서 초기 3분 동안 촉정하였다. 효소활성의 단위는 분당 \( 1 \mu \mathrm { mole } \) 의 기질을 산화시키는 효소의 양을 1 unit( \( ( \mathrm { U } ) \) 로 정의하였다.</p> <h2>Activity staining</h2> <p>배양액 중의 효소활성을 확인하기 위하여 \( 10 \% \) native \( \mathrm { PAGE } \) 에 의한 \( \mathrm { ABTS } \) 활성염색법을 수행하였다. 전기영동 한 \( 10 \% \) 겔을 \( 0.5 \mathrm { M } \) 구연산나트륨 완충용액 ( \( \mathrm { pH } 3.0) \) 에 10 분 동안 방치 한 후 동일한 완충용액으로 제조한 \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { ABTS } \) 용액과 상온에서 20 분 동안 반응시켜 효소 활성을 나타내는 띠롤 확인하였다.</p> <h2>최적 \( \mathrm { pH } \) 와 최적 온도</h2> <p>효소활성에 대한 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 조사하기 위해 \( 0.1 \mathrm { M } \) 글리신 완충용액 \( ( \mathrm { pH } 1.5-3.0), 0.1 \mathrm { M } \) 구연산나트륨 완충용액 \( ( \mathrm { pH } \) 3.0-5.0), \( 0.1 \mathrm { M } \) 인산나트름 완충용액 (pH 5.0-8.0)을 사용하여 효소활성을 측정하였다. 효소활성에 대한 온도의 영향은 효스액의 반응온도를 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 \( 5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 간격으로 변화시키며 활성도롤 촉정하였다.</p> <h2>Activity staining</h2> <p>F. pinicola 배양액 중의 효소 활성을 확인하기 위하여 Native-PAGE 수행 후 기질인 ABTS로- activity staining 한 결과 laccase 활성을 나타내는 band가 43 55 \( \mathrm{kDa} \) 사이에서 확인되었다(Fig. 2). 이 결과는 F. faxinea 중의 laccase 및 Cambria 등이 보고한 laccase와 유사하였으나, Yoon 등이 보고한 F. pinicola 중의 laccase 분자량이 \( 32 \mathrm{kDa} \)인 결과와는 상이하였다.</p> <h2>배양시간에 따른 효소 생산</h2> <p>이상의 실험결과에 따라 F. pinicola로부터 laccase를 생산하기 위한 최적배지 조건을 \( 2 \% \) glucose, \( 0.4 \% \) peptone, \( 0.05 \% \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.05 \% \mathrm{CaCl}_{2} \) 로 결정하여 이를 포함하는 배지에 균사체를 시간 별로 배양한 결과, 배양 7 일째 효소활성이 종가하여 배양 8 일째 효소활성이 \( 200 \mathrm{mU} / \mathrm{mL} \)로서 가장 우수한 것으로 나타났으며, 이후에는 효소활성이 급격히 감소하였다(Fig. 3), 균사체를 MCM에서 배양했을 때 효소활성이 \( 114 \mathrm{mU} / \mathrm{mL} \) 인 결과(Fig. 1)와 비교할 때, 최적배지조건으로 배양하였을 때 효소활성이 \( 175 \% \) 증가함을 알 수 있었다. P. cinnabartinus 및 Monotospora \( \mathrm{sp} \). 중의 laccase가 각각 7일 및 8 일 배양 후 최대 활성을 나타낸 결과와 유사하였으며, Sadhasivam 등이 보고한 \( T \). Harzianum 중의 laccase가 배양 4 일 후 효소 활성이 가장 크다는 결과와 비교하였을 때는 배양시간이 비교적 긴 것을 알 수 있었다. 그러나 Cyathus bulleri 중의 laccase는 배양 후 21 일, Phlebia floridensis 중의 laccase는 배양 후 20 일에 최대활성이 나타난 것으로 보아 본 균주의 laccase 생산을 위한 배양기간은 버섯류로부터 laccase 생산을 위한 일반적인 배양기간 범주에 속하는 것으로 사료된다.</p> <h2>기질특이성</h2> <p>F. pinicola 균사체로부터 생성된 배양액 중의 laccase에 대한 기질톡이성을 조사하기 위하여 비페놀계 기질인 ABTS와 페놀성 기질인 2, 6-dimethoxyphenol, syringaldazine, guaiacol 및 \( o \)-tolidine을 기질로 사용하여 활성을 측정한 결과, ABTS에 대하여 활성이 가장 우수하였다(Table 5). 이는 F. fraxinea 중의 laccase가 \( \mathrm{ABTS} \) 에 대하여 가장 높은 효소활성을 나타낸 결과와 일치하였다.</p> <h2>최적 \( \mathrm{pH} \) 와 최적 온도</h2> <p>F. pinicola 균사체로부터 생산된 laccase의 배양액 중의 효소활성을 위한 \( \mathrm{pH} \) 및 온도의 영향을 Fig. 4와 Fig. 5 에 나타내었다. 효소는 \( \mathrm{pH} \) 3에서 최대 활성을 나타내었으며 \( \mathrm{pH} \) 4 에서는 활성도가 \( 30 \% \) 이하로 급격히 감소하여 \( \mathrm{pH} 5 \) 이상에서는 활성을 나타네지 않았다. 한편 효소는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 활성도가 \( 50 \% \) 이하로 나타났으며 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최대 활성을 나타내었다. 이는 Park 등이 보고한 P. cinnabarinum laccase의 최적 \( \mathrm{pH} 3.0 \) 과 일치하였으며, Xiao 등이 보고한 Trametes sp. laccase 및 F. fraxinea laccase가 각각 \( \mathrm{pH} 4.5, \mathrm{pH} 5.0 \) 에서 최대 활성을 나타내는 결과와 상이함을 알 수 있었다. 한편, Trametes \( s p \).로부터 생산된 laccase 의 최적 온도는 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \), F. fraxinea laccase의 최적 온도는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이며, Nagai 등이 보고한 L edodes로부터 생산된 laccase의 최적 온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 로, 균류로부터 생산되는 laccase의 최적온도가 매우 다양함을 알 수 있었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>배지의 영향</h2> <p>F. pinicola 균사체로부터 laccase를 생산하기 위하여 여러종류의 합성배지를 사용하여 균사를 배양한 결과를 Fig. 1 에 나타내었다. 실험에 사용된 합성배지 중 \( \mathrm{MCM} \) 을 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 8 일 동안 배양하였을 때, \( 114 \mathrm{mU} / \mathrm{mL} \) 로 다른 배지에 비해 활성이 가장 우수함을 알 수 있었다. 이 결과는 Park 등이 보고한 \( F \). fraxinea 중의 laccase가 MCM 배지에서 최대의 활성을 나타낸 결과와 일치하였다.</p> <h2>탄소원의 영향</h2> <p>다양한 종류의 탄소원이 F. pinicola laccase의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 복합배지 중 최대 활성을 나타낸 \( \mathrm{MCM} \) 으로부터 dextrose를 제거한 후 각각의 \( 2 \% \) 탄소원을 첨가한 배지에 버섯 균사체를 배양한 후 효소활성을 촉정하였다. 그 결과 \( \mathrm{MCM} \) 의 원 조성인 dextrose가 탄소원으로 첨가되었을 때 다른 탄소원에 비하여 효소활성이 가장 높은 것으로 확인되었다(Table 2). 이 결과는 담자균류로부터 laccase를 생산하기 위한 탄소원중 glucose를 이용한다는 보고와 일치함을 알 수 있었다.</p> <h2>질소원의 영향</h2> <p>각 종류별 질소원이 F. pinicola의 laccase 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 \( \mathrm{MCM} \) 의 질소원을 제거한 후 각 종류의 질소원을 \( 0.4 \% \) 농도로 조정한 배지에 균사체를 배양한 후 효소활성을 측정하였다. 그 결과 peptone이 질소원으로 첨가되었을 때 효소활성이 가장 높은 것으로 확인되었다 (Table 3). \( \mathrm{MCM} \) 의 원 성분인 혼합질소원 \( (0.2 \% \) peptone과 \( 0.2 \% \) yeast extract)을 첨가하였을 때와 \( 0.4 \% \) yeast를 질소원으로 첨가하였을 때 효소활성이 비교적 우수하였으나, 기타 다른 질소원을 첨가하였을 때 효소활성이 나타나지 않았다. 이는 Mikiashvili 등이 T. versicolor로부터 리그닌 분해효소 생산을 위한 질스원으로 peptone이 가장 우수하다고 보고한 결과와 일치하였다. 그러나 \( F \). fraxinea로부터 laccase를 생산하기 위한 질소원 중 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{HPO}_{4} \) 가 가장 우수하다고 보고한 결과와는 상이함을 알 수 있었다.</p> <h2>인산원 및 무기질원의 영향</h2> <p>각 종류별 인산원 및 무기질원이 F. pinicola의 laccase 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 \( \mathrm{MCM} \) 의 인산원 및 무기질원을 각 각 제거한 후 각 종류별 인산원과 무기질원을 \( 0.05 \% \) 농도로 조정한 배지에 균사체를 배양하여 효소활성을 측정한 결과를 Table 4에 나타내었다. 인산원 중 \( \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \). \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 가 첨가되었을 때 효소활성이 가장 우수함을 확인하였으며, 이 결과는 F. fraxinea의 laccase가 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)에 의하여 생산량이 증가한다는 결과와 상이하였다. 무기질원의 경우 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 가 첨가되었을 때 효소활성이 가장 우수함을 알 수 있었다.</p> <h1>서 론</h1> <p>Laccase(benzenediol : oxygen oxidoreductase)는 multi-copper blue oxidase의 일종으로 고등식물, 곤충, 박테리아 등에서 발견되었으나, 대부분의 laccase는 균류에서 연구되어 왔다. Laccase는 목재의 주성분인 것으로 알려진 리그닌의 생분해 반응을 촉매 하는 효소이다. 리그닌은 phenylpropanoid 단위로 구성된 방향족 이형중합체로서 목재조직을 젼고하게 하고 미생물의 공격으로부터 목재를 보호하는 역할을 하며, laccase는 이와 같은 리그닌을 탈중합화하괴 무기질화한다.</p> <p>Laccase와 같이 리-그닌과 인공화합물을 분해하는녜 관여하는 효소로는 manganese peroxidase(MnP: E.C 1.11.1.13)와 lignin peroxidase(LiP: E.C 1.11.1.14) 등이 있다. 그 중에서 리그넌 분해를 위한 LiP와 MnP의 역할이 주로 연구되었으며, 상대적으로 laccase에 대한 연구는 최근에 급속하게 진행되어 왔다. 그러나 리그닌을 분해하는 균주의 대부분이 laccase를 생산하고 \( \mathrm{MnP} \) 와 Lip에 비해 세포 밖으로 분비하는 양이 비교적 많으며, 이리한 균주로부터 laccase가 생산되지 않을 경우 리그닌 분해능이 상실된다는 보고 등을 볼 때 Iaccase가 리그닌 생분해에 결정적인 역할을 할 것이라고 추정되고 있다.</p> <p>일반적으로 laccase는 분자상의 산소를 전자수용체로 이용하는 phenoloxidase로 작용하여 mono- 및 폴리페놀성 기질의 ortho- 및 para-hydroxyl group이나 방향족 아민을 직접적으로 산화하며[10], 산화 환원 매개체로서 작용하는 인공 기질이나 대사산물이 존재할 경우. 비페놀성 리그닌 단위 뿐 만 아니라 몇몇 방향족 인공화합물과 지방족 인공화합물을 분해하는 것으로 보고되어 있다. 다양한 기질에 대하여 촉매반응을 나타내는 특성으로 인해 laccase는 광범위한 산업분야에서 사용되며, 특히 오염된 수질 및 토양환경을 재생, 복원하는 bioremediation 산업과 리그닌 제거, 섬유소 표백 등의 펼프산업 등에서 연구가치가 매우 높다.</p> <p>버섯은 우수한 맛과 독특한 향을 지니고 있어 국내외에서 즐겨 찾는 건강식폼으로 식품적 가치와 더불어 항암, 면역증강, 혈압 상승 억제 및 항균 등의 약리적 효능이 우수함이 밝혀져 있으며, 자연생태계의 물질순환과정에서 생성되는 각 종 부산물을 분해하는 기능이 있어 산업적으로도 중요한 역할을 수행 가능하여 버섯이 쟁산하는 다양한 종류의 효소에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.</p> <p>민주름버섯목 구멍장이 버섯과에 속하는 담자균류인 소나 무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)은 항균, 항암, 혈당강하, 면역중강 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, DDT 등의 살충제를 분해하고 셀룰로오스, 리그닌을 분해하는 것으로 보기된 바 있다.</p> <p>본 연구에서는 다양한 생리활성물질을 함유하는 버섯의 산업적 활용을 위한 기초연구로 F. pinicola 균사체로부터 액체배양법을 이용하여 laccase를 생산하기 위한 최적 배양조건을 조사하였으며 배양액으로부터 효소적 특성을 조사하였다.</p>	생명
Saccharomyces cerevisiae와 Pichia pastoris에서 Bovine Pancreatic Deoxyribonuclease I의 과발현과 특성	<h1>서 론</h1><p>Deoxyribonuclease I (DNase I, EC 3.1.21.1)은 첫 번째로 발견된 DNA 가수분해 효소로 포유동물의 췌장 또는 귀밑샘과 같은 외분비선에서 분비되기 때문에 소화관에서 소화에 중요한 역할을 담당한다. 이미 사람을 비롯하여 소, 돼지, 닭의 췌장 및 쥐의 DNase I cDNA 유전자가 클로닝 되었고 그 염기서열이 밝혀졌다. DNase I은 활성의 조직 분포를 기준으로 포유동물의 DNase I은 췌장성, 이하성, 췌장-이하성 효소의 3개 유형으로 분류하고 있다. 췌장성 효소는 다른 유형보다 낮은 \( \mathrm{pH} \) 에 더 민감하며 사람, 소 및 돼지의 DNase I은 췌장성 효소 형태로 분류된다.</p><p>소 췌장에서 유래된 DNase I은 응용범위가 넓은 효소로 RNA를 취급하는 혈액검사 및 감염성질환과 암 질환검사와 같은 임상진단뿐만 아니라 가축검역 및 질환진단에 활용되며 유전자 발현량 조사, 무작위로 분해된 DNA단편의 제조 및 Real time PCR을 위한 시료제조, 동식물세포 해리 등의 분자생물학적 연구용 효소로도 널리 사용되고 있다. 동식물 세포조직을 해리하고 단세포로 분리시키는 과정에서 일부 세포가 파괴되고 이로부터 누출된 DNA는 해리된 세포를 엉키게 하여 의도하지 않는 세포 덩어리를 형성하게 되는데 이때 DNase I을 첨가함으로써 세포간 응집현상을 방지할 수 있으며, 동식물 세포의 조직배양에 collagenase 또는 trypsin과 함께 사용되고 있어 세포생물학에서 활용도가 매우 높다. 최근 인축에 각종 질병을 야기하는 RNA virus 질환을 효과적으로 진단하기 위해 검체로부터 RNA를 분리하는 과정에 혼재되어 있는 DNA물질을 제거해야만 하는데 이 때 RNA를 분해하지 않고 DNA만을 가수분해하는 RNase-free DNase I이 필요하며 이 효소는 실제 RNA 분리용 정제 kit의 가격경쟁력을 결정하는 중요한 요소이다.</p><p>DNase I을 소 췌장 유래 조직으로부터 분리하여 정제할 때 원료물질에 혼재되어 있는 다량의 RNase와 protease를 제거하기 위해서는 정제단계가 매우 복잡하며, 정제과정 중 protease에 의해 파괴되어 활성을 잃는 경우가 대부분이다. 따라서 국외에서는 재조합 세포를 사용하여 DNase I을 생산하기 위한 연구로 재조합 대장균과 재조합 동물세포주 COS-1을 제조하고 이들이 생산한 효소의 특성을 분석한 바 있다. 재조합 대장균을 이용할 경우 균체 내에 생산된 DNase I에 의한 숙주세균의 사멸을 막기 위해 유도성 T7 promoter로 과발현 하였지만 유도과정 중 사멸된 균체에서 유출된 DNase I이 배양 상등액에 존재하게 되고 사멸되지 않은 균체는 내부에 존재하여 정제에 어려움과 정제된 효소의 비활성이 \( 1,000 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) protein 이하로 낮은 문제점이 있는 것으로 확인되었다. 특히 대장균의 경우 glycosylation이 되지 않아 효소적 기능이 소 췌장조직에서 정제된 천연의 효소와는 차이가 있는 것으로 나타났다. 동물세포인 COS- 1세포에 DNase I의 유전자를 도입하여 얻은 재조합 세포로 생산된 DNase I은 glycosylation은 되지만 생산성과 활성이 낮은 것으로 보고되었다. 이에 본 연구에서는 재조합 숙주균으로 효모 Saccharomyces cerevisiae와 Pichia pastoris를 사용하여 DNase I의 생산균을 개발하고자 하였다.</p><p>본 연구에서 사용한 효모 S. cerevisiae는 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 능력이 뛰어나며 glycosylation과 같은 post translational modification이 가능한 장점이 있다. 하지만 S. cerevisiae 숙주의 장기간 발효시 발현 벡터의 불안정성, 당단백질의 과당화(hyperglycosylation), 박테리아 발현 시스템에 비해 낮은 생산성 등의 문제점들을 보안하기 위하여 여러 다른 효모 시스템이 대체숙주로서 개발되고 있다. 특히 메탄올 자화 효모 Pichia pastoris는 여러 독특한 특징으로 인해 재조합 단백질 대량생산을 위한 이상적인 숙주시스템으로 각광을 받고 있다. 즉 외래유전자를 숙주세포 발현계의 염색체 DNA에 삽입시킬 수 있어 발현계의 안정성이 높아지며, 고농도 세포 배양시 발생되었던 단백질 발현율 저하를 막을 수 있다. 또한 메탄올 자화 효모는 강력한 메탄올 유도성인 alcohol oxidase 1 (AOXI) promoter를 이용하여 외래단백질의 대량생산에 유리할 뿐만 아니라 진핵세포로서 고등생물 유래의 유전자와 전사 및 번역 시스템이 유사하여 splicing을 통한 intron의 제거와 고등동물의 골지체와 유사한 분비기관을 갖추고 있어, post translational modification을 통해 활성형 단백질을 생산분비 할 수 있다.</p><p>본 연구에서는 재조합 숙주균으로 S. cerevisiae와 P. pastoris를 사용하여 DNase I의 생산균을 개발하고자 하였으며, 이를 위해 DNase I의 생산성이 높고 균체 외로 분비할 수 있도록 재조합 효모균을 제조하고, 이를 이용하여 DNA 분해와 같은 DNase I의 특성을 조사하였다.</p>	생명
청둥오리 압란유의 항암 효과	<h1>고 찰</h1><p>상기의 실험결과 압란유가 순환기계에 대한 약리효과와 암세포 등에 대한 저지작용을 가질 수 있음을 시사하였으며, 아울러 생체의 면역계가 다른 생체기관들과 상호 유기적으로 연관되어 있음을 고려할 때 압란유가 면역반응 조절자(immuno response modifier)로서의 작용 가능성도 고려된다. 압란유가 림프구의 증식반응에 미치는 영향을 살펴 본 바 비장세포의 증식이 어느 정도 항진되었다. 이는 압란유가 \(T\) 또는 \(B\) 세포를 선택적으로 증식시키는 polyclonal activity로서의 작용할 수 있음을 시사한다고 하겠다. 따라서 압란유가 \(T\) 또는 \(B\) 세포에 대한 선택적 polyclonal activity로서의 활성에 대하여는 \(T\) 또는 \(B\) 세포를 순수 분리하여 증식반응을 측정하든지 압란유의 생체내 및 시험관내 효과를 Thy-1, 2 및 막 \(\mathrm{IgM}\)을 비롯한 \(T\) 또는 \(B\) 세포특이 분자에 대한 단클론 항체를 이용한 flow cytometric analysis 실시함이 보다 분명하게 구명되리라 사료된다.</p><p>또한 마우스 lymphoma cell의 증식반응은 억제되었는데 이러한 차이는 trypan blue dye exclusion에 의한 세포 생존검사로 확인한 결과, 압란유가 각 세포에 대한 직접적인 세포 독성의 차이에 기인하지는 않는 것으로 생각된다. 압란유를 마우스에 투여한 후 비장세포의 \(T\) 세포아형의 변화에서는 helper \(T\)\( \left(\mathrm{CD4}^{+}\right) \)세포 및 suppressor \(T\)\( \left(\mathrm{CD8}^{+}\right) \)세포의 증가는 보였으나 \( \mathrm{CD4}^{+} / \mathrm{CD8}^{+} \) \(T\) 세포의 비는 변하지 않았으며, IL-2 수용체의 발현은 항진되었는데 이는 시험관내 활성 뿐만아니라 생체내에서도 면역계를 활성화시킬 수 있음을 보여주는 결과로 기대된다. 탐식기능이 있는 단핵탐식세포계 세포를 활성화 시킬 수 있는 세포가 생산하는 림포카인들의 자극을 받으면 탐식세포는 superoxide나 hydrogen peroxide와 같은 반응성 산소중간 물질(reactive oxygen intermediate:ROI)이나 NO와 같은 반응성 질소중간물질(reactive nitrogen intermediate:RNI)을 생성하여 탐식한 세포내 미생물을 사멸시키거나 증식을 억제한다. NO는 산화를 통하여 효소의 작용을 조절하고 혈소판의 기능과 신경전달기능 및 림프구 증식을 변화시켜 암세포와 미생물에 대한 대식세포의 세포독성을 매개한다. 또한 TNF- \( \alpha \)는 활성화된 대식세포로부터 생산되는 물질로서 특정 암세포주에 대한 세포 독성과 항비이러스 작용이 있고 급성 및 만성 염증 질환에서 일어나는 생체반응에도 중요한 역할을 하는 사이토카인이다. 따라서, 압란유가 기회성 진균인 C. neoformans의 제거능에 미치는 영향을 실험한 결과 압란유 급식 마우스의 장기로부터의 C. neoformans의 검출이 감소하였고 압란유를 급식한 마우스에서 B16F10 세포의 폐전이가 억제되었고 전이된 암세포의 증식도 대조군에 비하여 그 크기가 작았음으로 억제함을 알 수 있었다. 이는 \(T\) 세포에 의한 IL-2 및 IFN - \(\mathrm{v} \)그리고 본 실험 결과 항진되었던 TNF- \( \alpha \)와 NO외에도 복강대식 세포로부터의 IL-12, IL-15등의 생산을 항진시켜 이에 의한 대식세포를 비롯한 면역계의 효과 세포들의 기능이 항진된 결과로 생각된다. 본 연구 결과 압란유를 이용한 항암제 또는 면역기능의 강화를 위한 면역반응 보조제로서의 개발 가능성이 기대되며 이를 기본 자료로 하여 이러한 기작들에 관한 연구가 앞으로 수행되어야 할 것이다.</p> <h1>서 론</h1> <p>암은 세계적으로 사망원인이 높은 것으로 알려져 있으나 암은 그 발병 메카니즘이나 치료 방법이 잘 알려져 있지 않다. 지금까지 효과적으로 암을 치료할 수 있는 약품을 개발하고 있으나, 임상적으로 사용할 때 정상세포의 사멸 내성발현등 치명적인 부작용을 나타내고 있어 큰 문제점으로 대두되고 있다. 이러한 점을 보완하기 위하여 정상세포에 독성이 없고 면역체계를 활성화시킴으로서 암을 정복하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이에 따라 최근에는 각종 천연자원으로부터 새로운 항암성분을 탐색하고 개발하려는 연구보고가 많다. 그중에서도 청둥압란유도 생리활성이 높은 것으로 알려져 있다.</p> <p>청둥오리는 우리주변에서 방목하는 가축 중 다른 동물과는 다르게 1년에 360개의 알을 생산할 정도로 번식력이 대단하며 가정하수나 공장폐수, 오염된 하천에서도 무엇이든 먹고 잘 자라며, 해충을 잡아 먹어 무공해 작물을 재배 하는데 큰 공을 세우는 특이한 동물로 알려져 있다. 오리는 민간약으로 중풍, 고혈압, 동맥경화 등 성인병의 특효약으로 동의보감, 중약 대사전에 기록되어 있다. 특히 오리알은 영양분이 골고루 들어 있고 그 자체만으로도 새로운 생명을 탄생시키는 완전식품이다. 이와 같이 오리알에서 추출하여 정제한 난유에는 우리의 건강을 증진시키는 각종기능성 성분이 듬뿍 들어 있으며 특히 특수성분으로는 유황함유 아미노산인 메티오닌(methionine)과 성인병 치료에 효과가 뛰어난 새로운 아미노산으로 각광을 받고 있는 타우린(taurine)이 들어 있다. 지방산으로는 필수지방산인 리놀레산 및 아라키톤산이 이상적인 비율로 함유되어 있고 특히 성인병 예방은 물론 노인성 치매나 어린이의 두뇌발달에 큰 역할을 한다. 그리고 레시틴은 사람의 뇌 속에 많이 함유되어 있는 특수성분의 하나로 노인성 치매나 어린이에게는 기억력을 증강시킨다.</p> <p>한편, 우리나라는 식생활의 서구화로 성인병이 늘어나고 있으며 이에 대한 예방과 치료는 화학합성품인 의약품에 주로 의존하고 있으며 옛날부터 전해내려오는 민간약으로도 치료효과를 보고 있으나 후자의 경우 그 과학적 근거가 모호하다. 그러므로 민간약에 대한 과학적인 실험결과를 도출하여 약효를 재평가하는 것이 건강식품의 과학화를 위해 절실한 실정이다. 그러므로 성인병의 예방과 치료에 탁월한 효과가 있다고 알려진 청둥오리의 알에서 추출 정제한 난유 성분의 기능적 특성을 밝혀 미이용 신기능성 소재로 활용하므로서 성인병을 예방하고 치료도 인해 고통받는 사람이 건강한 삶을 영위하는데 도움을 줄수 있을 것으로 기대된다. 따라서 본 연구는 청둥오리알을 일정한 온도에서 추출 정제한 난유를 각종 암세포를 이용하여 항암결과를 실험하였다.</p> <h2>암세포 및 정상면역세포에 대한 세포독성 측정</h2> <p>MTT를 이용한 방법을 변형하여 실시하였다. MTT를 PBS용액에 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \)의 농도가 되도록 녹인 다음, 무균 여과하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)의 어두운 곳에 보관하였고, 보관된 지 3주 이내의 것을 검사에 사용하였다. 배양중인 microplate 의 각 well에서 상층의 배지를 조심스럽게 \( 160 ~\mu \mathrm{L} \)씩 첨가하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 well에도 MTT 희석액을 가해 주었다. \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \)에서 4시간 배양한 후 상층의 배지를 제거하여 세포 손실을 막기 위해 약 \( 40 ~\mu \mathrm{L} \) 정도는 남겼다. 각 well에 \( 100 ~\mu \mathrm{L} \)의 DMSO를 가한 후 실온에서 plate shaker로 약 20-30분간 흔들어 준 다음 ELISA reader (Micro plate EL311)를 사용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \) 및 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 well을 blank로 하고 650 \( \mathrm{nm} \)는 비교치로서, \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 측정한 값을 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서의 측정치를 감하고 이 값을 결과치로 사용하여 hexane, acetone, ethyl ether, methanol 및 water로써 추출한 용액들이 항암제의 세포독성에 어떠한 변화를 줄 수 있는가를 조사하였다.</p> <h2>T림프구 아형</h2> <p>T림프구 아형의 구성비는 phycoerythrin(PE)-conjugated rat anti-mouse CD4(L3T4)mAb와 FITC conjugated rat anti-mouse CD8(Ly-2)mAb를 이용하고 IL-2 수용체는 FITC-cojugated rat anti-mouse CD25 mAb를 이용하여 제조회사의 설명에 따라 분석하였다.</p> <h2>대식세포에 의한 Nitric Oxide (NO)생산 측정</h2> <p>복강대식세포를 세포배양판에 \( 5 \times 10^{5} / \mathrm{mL} \)의 세포가 되도록 재부유하여 IFN-v \( (10 \mathrm{~U} / \mathrm{mL}) \)와 LPS \( (1 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)의 자극하에 48시간 배양하고 그 배양 상청액 내의 NO를 Griess 반응에 의해 측정하였다. 즉 \( 100 \mathrm{~uL} \)의 배양 상청액에 \( 1 \% \) sulfanilamie(\(30\%\) acetic acid)와 \(0.1\%\) N-(1-naphthyl) eth-ylenediamine dihydrochloride\( (60 \% \) acetic acid \( ) \) 혼합액 \(100 \mathrm{~uL} \)를 가하여 실온에서 방치하였다. 20분 후 ELISA 판독기(Bio Tek Instruments Inc, model EL311SL)를 사용하여 \( 800 ~\mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{mL} \)의 유지 농도에서 \( 570 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Tumor necrosis factor의 역가 측정</h2> <p>Tumor necrosis factor(TNF)의 측정은 ELISA kit(Genzyme, Boston, MA)를 사용하여 시행하였다. 즉 24시간동안 항 TNF 항체를 96 well plate에 부착시킨 뒤 세척하고 여기에 검체 \( 100 \mathrm{~uL} \)를 넣고 1시간 동안 96 well plate에서 반응시켰다. Tween 20이 \( 10 \% \)가 되게 첨가된 인산완충액(PBS)으로 새척 후 90분 동안 항 TNF 단세포군 항체와 반응시켰다. 이를 세척한 후 60분 동안 peroxidase가 결합된 항 IgG 항체를 반응시키고 다시 세척한 다음 orth-ophenylene diamine용액을 15분간 반응시켰다. \( 0.5 \mathrm{N}\) HCl 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 \( 450 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 TNF용액을 3200, 1600, 800, 400, 200, 100 및 \( 50 \mathrm{pg} / \mathrm{mL} \)의 농도로 조절하여 함께 측정하고 표준용액에서 측정된 흡광도를 근거로 polynomial standard regression curve를 작성하고 작성된 곡선방정식을 기준으로 검체내에 포함된 TNF의 양을 구하였다.</p> <h2>대식세포의 탐식능 측정</h2> <p>복강대식세포의 탐식능은 fluorescent microbead를 이용하여 flow cytometer로 측정하였다.</p> <h2>흑색종 세포(B16F10)의 폐전이 실험</h2> <p>본 실험에 공시한 암세포주는 B16F10 마우스 흑색종 세포(Tumor Repoitory of the National Cancer Institute, Bethesda, MD)로서 \( 10 \% \) 우태아혈청, sodium pyruvate, nonessential amino acids 및 L-glutamine이 함유된 RPMI-1640 배지에 유지하였다. 암세포의 준비는 대수증식기의 암세포를 \( 0.05 \% \) trypsin-\( 0.02 \% \) EDTA 용액으로 수집하여 2회 수세하여 PBS롤 농도를 조정하였다. B16F10 세포 \( (2 \times \) \( 10^{5} \))를 마우스 미정맥을 통하여 주사한 후 14일째에 폐를 제거하여 흑색종의 수를 관찰하여 산정하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 동물</h2><p>5-6 주령의 수컷, C57 BL/6계 마우스를 대한실험동물센타 (충북 음성)에서 구입하여 사용하였다. 온도는 \( 20 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 명암주기가 12시간 단위로 유지하며 고형사료와 물을 충분히 공급하였다. 실험전 마우스를 동일한 조건하에서 사육하여 동물실 환경에서 적응시켰다. 사료는 삼양유지 사료사와 항생제 무첨가 마우스용 펠렛을 공급하였다.</p><h2>압란유</h2><p>청둥오리 압란유(고온에서 추출)는 보성식품(주)(경북 청도면 매전면 구촌리)에서 제공받아 사용하였다.</p><h2>공시세포</h2><p>비장으로부터 림프구의 분리는 다음과 같이 시행하였다. 마우스로부터 얻은 비장은 Hanks' balanced salt soution(HBSS, Sigma, St. Louis, Mo)에서 두 장의 멸균된 slide glass로 부드럽게 압착하여 림프구를 비장으로부터 유리시켰다. 이 속에 포함된 적혈구는 멸균된 림프구증류수를 사용하여 hypotonic shock로 제거하며 분리된 림프구는 완전 배지에 부유시켰다. 복강대식세포는 Yoon 등의 방법에 따라 분리하였다. 마우스의 복강내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) \( 3 \mathrm{~mL} \)를 주사한 3일 후, \( 1 \% \) fetal calf serum(FCS), \( 10 \mathrm{~mM} \) HEPES, 그리고 페니실린\( (100 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 및 스트렙토마이신\( (100 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)이 첨가된 \( 10 \mathrm{~mL} \) HBSS(calcium 및 magnesium 무첨가)를 이용하여 복강 삼출세포를 수집하였다. 이를 RPMI 1640 완전배지에 재부유시켜 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 배양한 후 부착되지 않은 세포들을 인산완충액으로 세척하여 제거하고 부착세포들은 \( 2.5 \mathrm{~mM} \) pyrophosphate와 rubber policeman을 이용하여 수집하여 복강대식세포로 사용하였다. 암세포주로는 mouse mammary carcinoma 세포와 mouse leukemia 세포, human histocytic lymphoma를 사용하였다.</p><h2>정상 면역 세포의 증식에 미치는 압란유의 영향 측정</h2><p>상기에서와 같이 준비한 세포를 flat bottomed 96 well plate 의 각 well에 분주한 다음 여기에 여러 농도의 압란유를 가하여 총량이 \( 0.2 \mathrm{~mL} \)씩 되도록 조정하고 \( 37{ }^{\circ} \mathrm{C} ~5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \)배양기에 넣고 72시간 배양하였다. 이 때 배양세포의 \( { }^{3} \mathrm{H} \)-thymidine( \( { }^{3} \mathrm{H} \)-TdR, specific activity: \( 2.0 \mathrm{~Ci} / \mathrm{mmol} \), ICN Biomedicals, High Wycombe, Bucks, England) pulse는 \( 0.5 \mathrm{uCi} \)의 \( { }^{3} \mathrm{H} \)-TdR을 각 well에 배양종료 18시간 전에 가하여 실시하고, \( { }^{3} \mathrm{H} \)-TdR incorporation의 측정은 cell harvestor로 glass fiber에 세포를 수확한 후 \( \beta \)-counter을 이용하였다.</p>	생명
무세포 단백질 합성법을 이용한 활성형 SARS-3CL protease의 발현	<h1>서 론</h1> <p>사스(Severe acute respiratory syndrome, SARS)는 사람의 신종 폐렴인 중증 급성 호흡기 질환으로 2002년에 중국의 광동성에서 최초로 발생하여 아시아를 중심으로 세계 여러 나라로 급속히 확산되어 인류의 생존을 위협했다. 세계보건기구의 보고에 의하면 2003년 8월까지 약 8500명 이상의 사스 감염자가 발생하였으며 그 중 800명 이상이 사망했다. 그 후,이 질병을 일으키는 원인으로 신종의 RNA 바이러스인 SARS-Coronavirus (SARS-CoV)가 2003년에 발견되었다. SARS-CoV는 나도바이러스목 코로나바이러스과에 속하는 positive-sense, single-stranded RNA 바이러스로 사람이외의 동물의 소화기관 및 호흡기관에서 염증을 일으키는 바이러스가 돌연변이를 일으켜 사람에게 전염된 것으로 감염경로는 동물의 분비물이나 배출물의 접촉에 의한 것으로 밝혀졌다. 원인 바이러스인 SARS-CoV에 노출된 후 2∼7일 정도의 잠복기가 지나면 발열, 무력감, 두통, 근육통 등의 신체 전반에 걸친 증상이 나타난다. 심한 경우에는 증상이 2주이상 지속되며 호흡 기능이 크게 나빠지고 급성 호흡곤란 증후군 및 다기관 부전증으로 진행되어 사망에 이르는 경우도 있다.</p> <p>SARS-CoV가 숙주 세포 표면에 흡착하면 세포 내 전송 및 막 융합 과정을 거쳐 숙주 세포 내부에 침입하게 되며, 침입한 바이러스는 대량으로 복제\( \cdot \)증폭되고, 복제된 바이러스는 다시 숙주 세포 밖으로 방출되어 확산 된다. 이런 SARS-CoV의 복제, 전사 및 단백질 합성 과정은 2개의 복제효소 복합 단백질, pp1a (\(486 \mathrm{kDa}\))와 pp1ab (\(790 \mathrm{kDa}\))에 의해 결정되는데, pp1a와 pp1ab는 불활성형으로 합성된 후 3C-like protease (3CLprotease) 및 papain-like protease (PL2 protease)에 의해 특정 절단부위가 절단됨으로써 여러 가지 활성형 단백질로 전환되어 바이러스의 복제를 개시한다. 따라서, SARS-CoV의 3CL protease와 PL2 protease는 SARS-CoV의 복제, 전사 및 단백질 합성 과정을 조절하는 복제효소 복합체의 프로세싱에 결정적인 역할을 담당하는 효소들이며 이들 효소의 활성을 저해함으로써 바이러스의 복제 및 증식을 차단할 수 있다. 특히 3CL protease의 효소활성을 저해하면 복제효소 복합체의 특정 절단부위 14 곳 중 11곳 이 절단되지 않아활성형 복제효소관련 단백질들이 생산되지 않으며 그 결과, SARS-CoV가 숙주 세포 내부에 침입하여도 세포 내부에서 바이러스의 복제반응이 개시되지 않고 바이러스의 증식이 억제되어 사스의 치료에 크게 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 이유로 3CL protease는 사스 치료제 개발의 중요한 표적으로 주목받고 있다. 사스가 출현한 2003년 이후 현재까지 SARS-3CL protease의 저해제 개발을 위해 여러 연구자들이 High-Throughput Screening (HTS) 법을 이용한 compoundlibrary screening법 및 In silico screening법을 이용하여 SARS-3CL protease의 효소활성을 저해하는 다양한 종류의 화합물을 발견하였다. 그러나 신약 후보 물질로 이용할 수 있는 높은 저해활성과 안정성을 가지면서 인체에 안전한 물질은 현재까지 발견되지 않고 있다. SARS-3CL protease의 저해활성물질의 스크리닝 뿐만 아니라 효소활성발현 메커니즘의 명확한 해명은 유사 바이러스성 질환의 치료제 개발을 위해서도 중요하다.</p> <p>본 연구에서는 SARS-3CL protease의 구조 및 기능 상관에 관한 연구 및 저해활성물질 탐색에 필요한 활성형 3CLprotease를 생산하는 최적 방법을 고안하고자 하였다. 다양한 발현계를 작성하여 효소 생산에 최적인 발현 벡타 및 단백질 발현 방법을 검토하였다. 그 결과 pET29a/3CLP 발현 벡타를 이용한 무세포 단백질 합성방법이 SARS-3CL protease의 단백질 발현 및 생산에 최적인 것으로 확인되었다. 또한 발현된 SARS-3CL protease의 정제를 위해 High Q column, Mono P column, 및 Sephacryl S-300 겔 여과법을 이용한 3단계의 간단한 정제방법을 확립하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 시약</h2> <p>본 연구에서 사용한 E. coli strain DH5\(\alpha\), BL21 (DE3) 및 plasmid pET29a는 Novagen (Madison, USA)으로 부터 구입하였다. ATP, UTP, GTP, CTP, Creatine phosphate (CP),Creatine kinase (CK), phosphor-enolpyruvate, Escherichia colitotal tRNA mixture, T7 RNA polymerase 및 S30 extract는 Roche Applied science (Indianapolis, USA)에서 구입하였다. Pyruvate kinase, L(-)-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid(folinic acid), cAMP, potassium glutamate, polyethyleneglycol (PEG) (average MW 8,000) 및 acetyl coenzyme A는Sigma Aldrich사로부터 구매하여 사용하였다. 각종 아미노산, dithiothreitol (DTT) 및 diethylpyrocarbonate (DTNB)는 Nacalai Tesque (Kyoto, Japan)로부터, Recombinant Pfu DNA polymerase, T4 DNA ligase, alkaline phophatase (CIP) 및 제한효소는 Stratagene (La Jolla, USA)에서 구입하였다. 그 외에 본 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.</p> <h2>발현 벡타의 구축</h2> <p>SARS-3CL protease의 유전자를 pMAL vector (New England BioLabs Inc., USA)의 cloning site에 재조합한 pMAL/3CLP plasmid (N. Yamamoto, Tokyo Medical and Dental University, Japan) DNA를 E. coli DH5\(\alpha\)에서 발현\( \cdot \)정제한 후 template DNA로 사용하였다. SARS-3CL protease 유전자의 증폭은 아래의 primers를 사용하여 polymerase chainreaction (PCR) 법으로 실행하였다. Forward primer (5’-CGTGGATCCCAGACATCAATCACTTCTGCTGTTCTGCAGAGTGGTTTTAGGAAAATGGC-3')에는 BamHI site (밑줄)와 천연 pplab polyprotein의 SARS-3CLP의 N-말단의 상부에 해당하는 10개의 아미노산(QTSITSAVLQ)을 코딩하는 30 nucleotides를 도입하였다. Reverse primer (5'-GGTG CTCGAGAGTGCCCTTAACAATTTTCTTGAACTTACCTT GGAAGGTAACACCAGAGC-3')에는 XhoI site (밑줄)와 연 pp1ab polyprotein의 SARS-3CLP의 C-말단의 하부에 해당하는 10개의 아미노산(GKFKKIVKGT)을 코딩하는 30 nucleotides를 도입한 것을 사용하였다. PCR 조건은 변성 온도 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), annealing 온도 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \), 합성 온도 \( 68^{\circ} \mathrm{C} \)이었고, 총 25 cycle을 수행하였다. PCR 생성물은 \( 1 \% \) agarose gel 전기영동으로 확인한 후, PCR purification kit (Quagen)로 정제하여 발현계의 구축에 사용하였다. 정제된 SARS-3CL protease 유전자와 발현벡터 pET29a를 제한효소 BanHI과 XhoI로 절단한 다음, 재조합 pET29a/3CLP 벡터를 작성하였다. 그 결과 생성되는 예상 단백질인 SARS-3CL protease의 도식은 Fig.1A에 나타내었다.</p> <h2>무세포 단백질 발현 반응 및 정제</h2> <p>SARS-3CL protease의 단백질 발현은 Kigawa 등의 무세포 단백질 합성 반응법에 따라 실시하였다. 반응액은 다음과 같이 조제하여 사용하였다: \( 55 \mathrm{~mM} \) Hepes-KOH buffer \( (\mathrm{pH} ~7.5\)); \( 1.7 \mathrm{~mM} \) DTT; \( 1.2 \mathrm{~mM} \) ATP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)); 각 \( 0.8 \mathrm{~mM} \)의 CTP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)), GTP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)), 및 UTP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)); \( 80 \mathrm{~mM} \) CP; \( 250\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) CK; \(4.0 \% \) PEG 8000; \( 0.64 \mathrm{~mM}\) 3' ,5'-cyclic AMP; \( 68\ \mu \mathrm{M} \) folinic acid; \( 175\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) E. coli total tRNA; \( 210 \mathrm{~mM} \) potassium glutamate; \( 27.5 \mathrm{~mM} \) ammonium acetate; \( 10.7 \mathrm{~mM} \) magnesium acetate; 각 \( 1.0 \mathrm{~mM} \)의 20종 아미노산; \( 2 \sim 32\ \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 발현벡타(pET29a/3CLP plasmid); \( 93\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) T7 RNA polymerase; \( 30 \% \) (v/v) S30 세포 파쇄액; \( 0.05 \% \) sodium azide. 투석액은 반응액에서 CK, E. coli total tRNA, 발현벡터, T7 RNA polymerase, 및 S30세포 파쇄액을 제외하고 조제하여 사용하였다. 반응액을 투석막(Spectra/Por 7 MWCo: 15,000, Spectrum Laboratories, Inc., USA)에 넣고 투석액에 대하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간 투석하여 발현 반응을 실행하였다.</p> <p>단백질 합성반응이 종료한 반응액을 회수하여 완충액 A \(20 \mathrm{~mM}\) Tris-HCl, \( (\mathrm{pH} ~7.6\)), \( 1 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT)로 투석하고 원심분리 \((12,000 \times g\), 20 min, \(4^{\circ} \mathrm{C}) \)하였다. 상층액을 완충액 A로 평형화시킨 High Q (\(12.6 \times 40 \mathrm{~mm}\) Bio-Red) 컬럼에 주입하고, 충분한 양의 완충액 A로 세척한 후, 완충액 A의 \(\mathrm{NaCl}\) 농도가 \( 0 \sim 0.2 \mathrm{~M} \)에 이르도록 농도 기울기법으로 분별 용출하였다. 효소 단백질이 함유된 분획을 회수하여 완충액 B (\(25 \mathrm{~mM} \) Imidazole-HCl, \( \mathrm{pH} ~7.6\), \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT)로 투석하여, 원심분리 \((12,000 \times g\), 20 min, \(4^{\circ} \mathrm{C}) \)하였다. 동일한 완충액 B로 평형화 시킨 Mono P 컬럼\( (5 \times 200 \mathrm{~mm}\) GE Healthcare)에 위의 상층액을 주입하고, 비흡착 단백질을 완충액 B로 세척한 후, 완충액 C (1/8 Polybuffer74, \( 1 \mathrm{~mM}\) DTT)로 분별 용출시켰다. 효소 단백질이 함유된 Mono P 컬럼 분획을 회수하여 완충액 D (\(20 \mathrm{~mM}\) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} ~7.5\), \(1 \mathrm{~mM}\) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT, \( 0.1 \mathrm{~M} \) \(\mathrm{NaCl}\)로 투석하였다. 이 단백질용액을 완충액 D로 평형화된 Sephacryl S-300 컬럼(\(26\times600 \mathrm{~mm}\), GE Healthcare)에 주입하여 동일한 용액으로 단백질을 분별 용출시켜 SARS-3CL protease의 효소활성을 나타내는 분획을 회수하였다. 이상의 과정으로 정제한 효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 정제 효소의 특성 실험에 사용하였다. 정제 효소의 단백질 정량은 소 혈청 알부민을 표준 단백질로 사용하여 Bicinchoninic acid (BCA)법으로 측정하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>SARS-3CL protease의 효소 활성은 형광 펩타이드 기질, Nma-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys(Dnp)-\(\mathrm{N H}_{2} \) (Peptron, Korea)을 사용하여 분석하였다. 효소활성은 \(100 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \( (\mathrm{pH} ~7.3\)) \(/ 1 \mathrm{~mM} \) DTT 완충액 \( 150\ \mu \mathrm{l}, 1 \mathrm{~mM} \) 기질 용액 \( 20 \mu \mathrm{l} \), 및 효소용액 \( 30 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 효소 반응을 연속적으로 측정하였다. 효소 반응은 기질 첨가로 시작되고, 효소활성은 microplate reader (Tecan Infinite 200 , Austria)를 사용하여 excitation wavelength, \( 320 \mathrm{~nm} \) 및 emission wavelength, \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 연속적으로 형광의 세기를 측정하여 분석하였다. 기질의 분해 정도는 Nma/Dnp type fluorescence-quencing 기질에 대한 표준형광물질인 D-A2pr(Nma)-Gly 및 Ala-Phe-Pro-Lys(Dnp)-D-Arg-D-Arg (Peptide, Japan)의 혼합물의 농도로 환산하여 계산하였다. 3CL protease의 효소 활성 \(1 \mathrm{~unit}\)는 \( 1 \mathrm{~min} \) 당 생산된 \( 1 \mathrm{~nmol} \) 기질 분해 펩타이드 농도로 정의하였다.</p> <h2>Western Blot 분석 및 기타</h2> <p>무세포 단백질 합성법으로 발현된 단백질 용액은 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)로 분리하여, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad, USA)에 전사하였다. 이 PVDF membrane을 \(5\%\) skim milk로 1시간 동안 blocking 한 후, TBS-T 완충액 (\(20 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( \mathrm{pH} ~7.6\), \( 137 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(0.1 \% \) Tween 20)으로 10분간 3회 세척하였으며 적정 희석된 1차 항체, anti-SARS-CoV 3CL protease, mouse mAb (Genesis Biotech Inc., Taiwan)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 TBS-T 완충액으로 세척하고 2차 항체, ECL HRP-conjugated anti-mouse antibody (Amersham Biosciences, NJ, USA)로 추가 반응시켰다. 반응 후 TBS-T 완충액으로 다시 10분간 3회 세척하였으며, ECL Western detection reagents (Amersham Biosciences, USA)를 사용하여 반응시키고, LAS-3000 Luminescent Image Analyzer (FUJIFILM, Japan)로 발현 수준을 분석하였다.</p> <p>정제 단백질의 분자량은 MALDI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems Voyager-DE STR mass spectrometer, USA)를 사용하여 측정하였다. N-말단 아미노산 서열 분석은 Porcise\( ^{\circledR} \) cLC System Model 492 cLC (Applied Biosystem, USA)를 사용하여 Edman 분해법으로 분석하였다.</p>	생명
과발현 형질전환벼에서 CCCH type zinc-finger protein 유전자 \(OsZF2\) 기능 분석	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>OsZF2 유전자의 벼 형질전환 및 과다발현 동형접합 형질전환체 선발</h2><p>벼에서 분리된 OsZF2 유전자는 CCCH 형태의 zinc-finger 도메인을 2 개 함유하고 있으며 애기장대의 꽃 분화와 관련된 PEⅡ 유전자와 높은 상동성을 보인다. OsZF2 유전자는 벼에서 저온 스트레스에 의해 발현이 약하게 유도되며 캘러스와 이삭에서 발현이 검출되고 일반적인 기저 수준에서는 발현이 거의 검출되지 않는다. OsZF2 유전자의 식물체 내에서 기능을 분석하기 위하여 벼에서 유전자 과발현 형질전환체를 육성하였다. 벼형질전환용 벡터는 35S 프로모터를 사용하였고 형질전환체 선발은 하이그로 마이신 항생제 저항성 유전자를 사용하여 운반체를 작성하여 pCAM333이라 명명하였다. pCAM333 운반체를 아그로박테리움에 도입한 후 낙동벼를 이용하여 배상체 캘러스를 유기하여 공동배양 하였다. 선발된 캘러스는 cefotaxime과 hygromycin 이 첨가된 배지에 치상하여 재분화를 유도하였으며 재분화된 식물체는 순화과정을 거쳐 온실에서 재배되었다. 재분화된 형질전환체에서 OsZF2 유전자가 벼 염색체에 삽입된 것을 확인하기 위하여 OsZF2 유전자에서 유전자 특이 forward 프라이머를 제작하고 Nos 터미네이터 부위에서 reverse 프라이머를 작성하여 PCR 분석을 실시하여 벼에 내재적으로 존재하는 유전자와 구별하였다. 벼 형질 전환체 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR 검정을 한 결과 대조구인 낙동벼에서는 유전자 단편이 증폭되지 않았으나 형질전환체에서는 positive control로 사용된 pCAM333과 같이 모두 \( 650 \mathrm{bp} \) 크기의 OsZF2 유전자 단편이 증폭된 것을 확인하였다. 35S: 0sZF2 형질전환체에서 OsZF2 유전자가 항상성 있게 과발현 되는지를 확인하기 위하여 total RNA를 분리하여 OsZF2 유전자를 탐침으로 하여 Northern 분석을 하였다. 대조구에서는 발현이 거의 되지 않았으나 CaMV 35S promoter와 융합되어 도입된 OsZF2 유전자는 형질전환체에서 발현이 되는 것을 확인할 수 있었다. 도입 유전자에 대한 동형접합체 계통을 선발하기 위하여 40 립 이상의 T2 종자에 대하여 하이그로마이신 저항성을 검정한 결과 낙동벼의 경우 발아는 하였으나 거의 자라지 못하고 형질전환체는 정상적으로 자라는 것을 관찰하였다. 검정한 계통 중에서 치상한 40립의 종자 모두 저항성을 나타내어 정상적으로 자라는 동형접합체 계통을 선발하였다.</p><h2>OsZF2 형질전환체의 내염성 검정 및 표현형 분석</h2><p>35S:OsZF2 형질전환체에서 OsZF2 유전자 발현이 강하게 나타난 LS333-8 계통에서 동형접합체 라인을 선발하여 스트레스 저항성을 검정하기 위하여 MS 배지와 \( 100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \) 을 함유한 MS 배지에서 일주일간 생육시킨 후 23 개체의 총 중량과 지상부 잎과 뿌리의 길이를 각각 측정하여 평균값을 구하였다. 무처리 상태에서 35S:OsZF2 형질전환체의 생육과 중량이 대조구인 낙동 벼보다 다소 우수하였으며 \( 100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \) 을 함유한 배지에서도 35S: OsZF2 형질전환체가 낙동벼보다 생육이 다소 양호한 것으로 나타나 기내 실험에서는 어느 정도 내염성 효과를 보였다. 애기장대에서 분리된 CCCH type의 zinc finger 유전자인 AtSZF1과 AtSZF2의 경우 염스트레스에 의해 발현이 유도되고 내염성 증진에 중요한 역할을 한다고 보고하였다. 벼에서 분리된 OsCOIN의 경우 저온에서 발현이 유도되는 RING finger 단백질로서 또한 저온, 염, 건조에 저항성을 보이는 것으로 보고되었다. zinc finger 유전자는 스트레스 내성을 증가시키는 전사인자로서 알려져 있으므로 OsZF2도 저온에 의해 발현이 유도되는 유전자로서 스트레스에 관련되어 있을 것으로 추정된다. GMO 포장에 이식하기 위하여 형질전환 벼와 대조구인 낙동벼를 모판에서 4주 간 생육시켰으며 유묘의 성장에는 35S:OsZF2 형질전환 벼와 대조구인 낙동벼 두 품종 간에 별다른 차이가 없었다. 그러나 이앙 후 8 주 후까지 35S:OsZF2 형질전환체는 생육이 지연되어 왜화현상 을 보여주며 또한 출수도 낙동벼 보다 열흘 정도 지연되는 현상을 나타내었다. 그러나 출수 후 등숙기에는 낙동벼와 비슷한 초장을 유지하며 생육지연과 관련하여 등숙시기도 낙동벼와 비교하여 지연되는 것을 관찰하였다. Kong 등 (2006)이 보고한 벼에서 분리된 OsDOS는 OsZF2와 같이 2개의 CCCH 형태의 zinc finger 도메인을 함유하고 있는 유전자로서 잎과 이삭에서 발현이 높으며 잎의 노화를 지연시키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 이는 OsZF2 유전자가 잎에서 발현이 되지 않고 이삭에서 발현이 증가하는 것과는 약간 다른 양상을 보여주고 있으나 왜화 현상을 보이는 성장 지연과 이에 따른 출수지연 및 등숙 지연 등 zinc finger 단백질로써 성장 발달에 영향을 주는 것으로 추정된다. 벼에서 분리된 zinc finger 유전자인 OsLOL2의 경우, OsLOL2 발현을 저하시킨 역 전사 형질전환벼의 경우 GA 합성과 관련되어 왜화 현상을 보이고 벼의 성장 발달에 영향을 주며 과발현 형질전환벼의 경우 벼 흰잎 마름병에 저항성을 보이는 것으로 보고하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>운반체 제작</h2><p>벼 형질전환체를 육성하기 위해 사용된 운반체인 pCAMBIA13 OOPRON은 pCAMIA1300을 기간으로 하여 CaMV 35 S promoter와 3'-nos 터미네이터 사이에 멀티클로닝 제한효소부위를 삽입하여 클로닝이 용이 하도록 제작되었다. OsZF2 유전자를 클로닝하기 위하여 EST library에서 사용되었던 pBluescript 벡터에 삽입된 LS333 유전자를 BamHI과 KpnI으로 절단한 후 \( 1.2 \mathrm{~kb} \) 크기의 밴드를 분리한 후 pCAMBIA1300PRON 벡터의 BamHI과 KpnI1위치에 삽입하여 pCAM333 이라 명명하였다. 운반체의 선발마커로는 하이그로마이신 항생제 저항성 유전자(hptⅡ)를 사용하였으며 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환하여 벼 형질전환에 사용하였다.</p><h2>벼 형질전환 및 동형접합 전환체 선발</h2><p>형질전환된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 YEP \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) kanamycin) 액체배지에 접종하여 48시간 진탕 배양하였다. 낙동벼를 이용하여 배상체 캘러스를 유기한 후 Agrobacterium 배양액과 공동 배양하여 감염시킨 다음 hygromycin 선발배지에서 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 3주 마다 계대 배양하였다. 선발된 형질전환체는 hygromycin \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{l}) \) 이 첨가된 MS 배지에 50 립을 치상하여 hygromycin 저항성 개체수를 확인하였다.</p><h2>PCR 분석</h2><p>형질전환된 재분화 식물체에 OsZF2 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질전환벼의 genomic DNA는 Genomic DNA Prep Kit for Plant (SolGent, Daejeon, Korea)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였다. PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 예비변성한 다음 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 변성, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 풀림, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 신장하는 과정을 35 사이클 반복하고 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 신장 시켰다. PCR 반응에 사용된 forward 프라이머는 OsZF2 유전자 특이 프라이머 (5'-ACT CGCCGC TGT CGC TCT CC-3')를 사용하고 reverse 프라이머는 3'-nos terminator 부위에서 작성하여 (5'-ATTGCCAAATGTTTGAACGA-\( 3^{\prime} \) ) 사용하였다. PCR 산물은 \( 0.9 \% \) agarose gel에서 전기영동 하였으며 EtBr로 염색하여 밴드를 확인하였다.</p><h2>RNA 분리 및 Northern 분석</h2><p>형질전환체에서 OsZF2 유전자 발현을 확인하기 위하여 벼 잎에서 토탈 RNA를 Trizol로 분리하여 Northern 분석을 실시하였다. \( 10 \mu \mathrm{g} \) RNA를 \( 1.1 \% \) formamide/agarose gel에서 전기영동 후 나일론 멤브레인 (Hybond N+, Amersham) 으로 전이 시킨 다음 OsZF2 유전자를 \( { }^{32} \mathrm{P}-\mathrm{dCTP} \) 로 표식 시킨 후 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간 동안 잡종화반응을 시켰다. 멤브레인은 워싱 용액에 세척하고 포스포이미지 강화 스크린에 감광시킨 후 밴드를 확인하였다.</p><h2>내염성 검정 및 형태적 관찰</h2><p>소독한 벼 종자 25립을 MS 배지와 \( 100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \) 이 첨가된 MS 배지에 각각 치상하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \), 광 상태에서 1주간 배양한 후 발아된 23 립의 총 중량과 지상부 잎 길이 및 뿌리 길이를 측정하여 평균값과 표준편차를 측정하였다. 포장에서 형태적 발달 상태를 관찰하기 위해 50공 모판에서 재배하여 4주 후 유전자변형식물체 시험포장에 이앙하여 형태적 특성과 출수시기를 확인하였다.</p><h2>Microarray 분석</h2><p>벼 \( 20 \mathrm{~K} \) 올리고 chip (NSF rice oligonucleotide array \( 20 \mathrm{~K} \) )을 사용하여 microarray 분석을 하였다. 고 순도의 RNA를 분리하기 위하여 column을 사용하는 RNeasy isolation Midi kit (QIAGENE, Hilden, Germany)를 사용하여 벼 잎으로부터 RNA를 분리하였다. total RNA는 Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, USA)를 이용하여 28S rRNA/18S rRNA ratio를 측정하여 RNA QC를 수행한 후 microarray 분석에 사용하였다. Labelling은 Amino Allyl MessageAmp \( { }^{\mathrm{TM}} \) aRNA Kit (Ambion Catalog #1752)을 사용하여 제조사의 방법으로 RNA를 합성한 후 \( 10 \mu \mathrm{m} \) antisense amino allyl RNA (aRNA)를 cye dye coupling에 사용하였다. 대조구는 cy3, 처리구는 cy5 dye를 사용하여 라벨링된 cRNA \( 20 \mu \mathrm{m} \) 을 잡종화 반응에 사용하였다 (Eom et al. 2006). MAUI 잡종화시스템에서 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \), 16 시간 반응 후 Axon4000B 스캐너에서 GenePix Pro v6.0 (Axon Instrument, Union City, USA) 프로그램을 이용하여 cy3, cy5의 강도를 측정하였다. Normalization과 발현분석은 Genespring5.1 프로그램을 사용하여 분석하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>벼는 중요한 주곡작물로서 비교적 작은 게놈 사이즈로 인해 단자엽 식물의 모델 식물로서 이용되며 또한 전체 유전체 염기서열이 해독됨에 따라 유전자 기능분석을 위해 많은 노력이 시도 되고있다. 벼는 유전적 현상을 해석하기 위한 다양한 유전자 지도가 작성되어 있으며 생물학적/비생물학적 스트레스에 대한 연구 또한 활발히 진행되고 있다. 벼에서 저온스트레스는 온대성 기후에서 급격한 기상이변과 고랭지 지역 등에서 벼 생산과 직결되는 주요한 자연재해 중의 하나로서 유묘기 내냉성 및 수잉기 내냉성은 벼 육종의 중요한 목표 중의 하나이다. 일반적으로 한발, 고염 및 저온과 같은 환경 스트레스는 공통적인 대응 메커니즘이 있는 것으로 알려져 있으며, 다양한 환경스트레스간에 유전자 발현을 공통적으로 조절하는 신호전달 경로가 있는 것으로 보고되고 있다 (Rabbani et al. 2003; Yamaguchi-Shinozaki et al. 2006). 이러한 스트레스에 식물체가 노출되면 많은 유전자의 발현이 유도되어 세포 손상을 보호하거나 신호전달에 관련된 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려졌다 (Yamaguchi-Shinozaki et al. 2006). 애기장대에서는 많은 스트레스 유도성 유전자들이 알려져 있으며 대표적인 내재해성 유전자로서 CBF/DREB는 AP2/ERF 그룹의 전사인자로서 저온에 의해 발현이 유도되며 이들 유전자의 과발현 형질전환체는 내냉성뿐만 아니라 내염, 내건성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Thomashow 1999; Maruyama et al. 2004). 애기장대에서 보고된 CBF/DREB 전사인자 이외에 보리, 벼 등에서 DREB ortholog 유전자를 분리하여 과발현 형질전환체에서 스트레스 내성을 증진시킨다는 많은 보고가 있다 (Jung et al. 2007; Oh et al. 2007). 이러한 스트레스 신호전달에 관련된 AP2/ERF 전사인자에 관한 연구뿐만 아니라 bZIP 단백질, NAC domain 단백질, zinc finger 단백질 등이 또한 스트레스 내성을 증진시키는 전사인자로서 알려져 있다 (Yamaguchi-Shinozaki et al. 2006; Kim et al. 2006; Nakashima et al. 2007). 벼에서 저온처리에 의해 발현이 유도되는 OsCOIN 유전자는 RING finger 단백질로서 proline 함량을 증가시켜 저온, 건조, 염해 등에 저항성을 증진시키는 것으로 알려졌으며 NAC-type의 전사인자 또한 환경스트레스에서 발현이 유도되며 내재해성을 증진시키는 것으로 나타났다 (Nakashima et al. 2007).</p><p>zinc finger 단백질은 zinc 이온과 결합하는 아미노산의 배열에 따라 여러 그룹으로 나뉘며 전사인자로서 역할을 수행하거나 단백질 등 다른 분자와의 상호작용에 의해 세포 내에서 중요한 생물학적 과정을 수행한다. 현재까지 식물체에서 알려진 zinc finger 그룹은 RING-finger, ERF, WRKY, DOF, LIM등이 알려져 있으며 대부분은 DNA-결합 전사인자로서 역할을 하거나 단백질-단백질 상호 작용에 의해 유전자발현을 조절하는 것으로 그 기능이 알려져 있다 (Wang et al. 2008). CCCH type zinc finger 단백질은 사람과 효모에 이르기까지 많은 그룹을 차지하고 있으며 동물에서는 RNA 프로세싱과 관련된 RNA-결합 단백질로 추측되며 단백질 안정화와 초기 배 발달에서 암컷의 수정 능력과 세포의 운명에 관여하는 등 그 기능이 많이 알려졌으나 식물체에서는 일부분만 그 기능이 알려져 있다 (Addepalli et al. 2008; Ramos et al. 2004). 애기장대에서 알려진 PEI1은 배아 특이 CCCH zinc finger 단백질로써 배발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌으며 (Li et al. 1998), 벼에서 분리된 OsDOS는 핵에 위치하는 단백질로써 jasmonate 경로에 의한 발달 단계 시그널에 관여하여 잎의 노화를 지연시키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Kong et al. 2006).</p><p>본 연구에서는 벼에서 저온처리 및 이삭에서 유전자 발현이 증가하는 CCCH zinc finger 단백질을 코딩하는 OsZF2유전자 (Lee etal. 논문 준비중)가 과발현되는 형질전환체를 제작하고 환경스트레스 및 관련 표현형을 분석하여 유전자 기능을 확인하기 위하여 실시되었다.</p>	생명
Thelephoric acid의 CYP2J2 효소 활성 저해제 평가	<h1>결과 및 고찰</h1><p>지난 15 년 동안, CYP2J2 동효소는 아라키돈 산 대사능인 epoxygenase 활성에 대해 많은 관심을 받아 왔다. 그러나, 최근 CYP2J2 단백질이 정상조직에 비해 종양조직에 과발현되어 있음이 보고된 이후, CYP2j2 단백을 표적으로 하는 표적 항암제에 대한 연구가 일부 연구자에 의해 활발히 진행되고 있다. Lafite 등은 CYP2J2 효소 활성에 강한 저해능을 보이는 terfenadone 유도체를 발굴하였으며, 윤 등은 에바스틴의 대사체인 hydroxyebastine 이 강력한 CYP2J2 동효소 활성 저해능을 가지고 있음을 보고한 바 있다. 또한 Chen 등은 terfenadine 유도체의 종양세포 증식 억제 및 세포 사멸 기전을 규명하였다. 그러나, 현재까지 CYP2J2 효소 활성을 억제한다고 알려진 물질은 terfenadone 유도체, hy-droxyebastine, miconazole을 포함하여 일부에 불과한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 식물 및 미생물에서 분리된 화합물을 대상으로 인체 CYP2J2 효소 활성에 저해능을 보이는 화합물을 발굴함으로써, 표적 항암제 후보물질 개발에 이용될 수 있는 유효물질(Hit)을 도출하고자 하였다. 천연물 10종을 대상으로 CYP2J2 동효소 저해 활성을 평가한 결과, \( 5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 thelephoric acid 가 O-desmethyl aste-mizole 형성을 \( 70 \% \) 이상 저해하는 것으로 나타났다.</p><p>또한, thelephoric acid의 CYP2J2 효소 저해 활성에 대한 기질특이성을 조사하기 위하여, CYP2J2의 다른 기질약물인 ebastine 및 terfenadine을 대상으로 CYP2J2 효소 활성 저해능을 재평가하였다. 그 결과, astemizole 에서 가장 큰 저해능\( \mathrm{( IC_{50}}=3.23 \mu \mathrm{M}) \) 을 보였던 thelephoric acid는 CYP2J2 매개 ter-fenadine 대사 \( \mathrm{(IC_{50}}=3.27 \mu \mathrm{M}) \) 및 ebastine 대사 \( \mathrm{(IC_{50}}=5.32 \mu \mathrm{M}) \)를 유사하게 억제하는 것으로 나타났다.</p><p>본 연구 결과, thelephoric acid가 CYP2J2의 기질 약물인 aste-mizole, ebastine 및 terfenadine의 대사를 보편적으로 저해하는 것으로 나타났다. 따라서, thelephoric acid 는 종양세포에 선택적으로 과발현되어 있는 CYP2J2 단백을 표적으로 하는 선택적 저해제로 작용할 것으로 판단된다.</p><p>최근 terfenadine 유도체들이 세포사멸 촉진 및 종양 세포의 성장 억제 등과 같은 기전을 통하여 표적 항암제 후보물질로 사용될 수 있다는 결과가 보고되어 있다. 따라서 본 연구를 통하여 CYP2J2 저해능이 발견된 thelephoric acid의 경우에도, 유사한 골격을 가진 화합물 합성을 통한 구조-활성 상관성 연구를 통하여 CYP2J2 효소 활성 저해능이 우수한 유효물질의 발굴이 가능할 것으로 판단된다. 그러나, 이를 위해서는 상기 화합물에 대한 다른 CYP 동효소 활성 저해능 평가, 세포 독성 평가 및 종양세포 사멸 기전 등과 같은 추가 실험이 더 필요할 것이다.</p>	생명
팽이버섯의 유전적 변이	<h1>서 론</h1> <p>팽이버섯(Flammulina velutipes)은 Tricholomataceae과에 속하는 담자균으로 늦가을부터 이른 봄에 걸쳐 발생하는 겨울버섯으로 한국, 일본, 중국 등에서 가장 많이 선호하는 식용버섯의 하나다.</p> <p>식용 팽이버섯의 대부분은 자실체가 야생의 갈색이 아니라 육종에 의해 개발된 순백색이고 현재까지 우리나라의 대부분 농가에서 재배되고 있는 것들은 일본에서 개발 된 것들이다. 그러나 우리나라가 2002년 국제 식물 식품 종 보호조약(International Union for the Protection of New Varieties of plants, UPOV)에 가입하였고, 2008년부터 팽이버섯이 품종보호 대상에 해당됨에 따라 현재 이용되고 있는 외국 품종을 그대로 재배한다면 이용료를 지불해야 하므로 선호도가 높은 국산 팽이버섯의 개발이 절실하다.</p> <p>신품종은 형태적, 생리적 특성의 구별성, 균일성이 분명해야 하나 팽이버섯 품종들의 경우 재배환경에 따른 특성의 변이가 커서 특이성을 뒷받침할 수 있는 분자 유전적 표지 개발이 중요하다. 그러나 새로운 품종의 개발과 이의 평가의 바탕이 될 수 있는 팽이버섯의 유전적 특성에 관한 연구는 많이 이루어져 있지 않다.</p> <p>팽이버섯 자실체 색의 유전양식과 자실체와 연관된 분자마커, 팽이 수집 품종들에 대한 RAPD 분석, RAPD에 의한 단포자의 유전적 변이, 팽이버섯 발생에 따른 EST(expressed seguence tags), genome의 크기와 핵형 등이 보고된 바 있고, 현재 팽이버섯 유전체를 밝히고자 하는 연구가 진행되고 있다.</p> <p>그러나 팽이버섯은 세계적으로 200여 종류의 품종이 있지만 품종들을 식별하고 이를 바탕으로 교배육종을 설계 혹은 품종평가를 할 수 있는 분자유전적 보고는 일부분에 불과하다. 한편 유연관계를 밝히고 분자 마커를 개발하기 위한 방법으로 RFLP(restriction fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), STS(sequence target site) 등 여러가지 방법을 이용하여 새로운 primer의 개발로 인하여 ITS(internally transcribed spacer), RAPD(random amplified polymorphic DNA) 등을 이용한 방법 연구들이 지속적으로 이루어져 이에 따른 성과를 얻고 있다.</p> <p>이러한 점들과 관련하여 본 연구에서는 팽이버섯을 가장 많이 육종, 생산, 이용하고 있는 한국, 일본, 중국의 야생 팽이버섯들과 상업용 육종 팽이버섯 등의 유전적 변이를 ITS 및 다양하게 개발된 primer들을 이용한 RAPD 방법으로 분석하여 지역 간 혹은 상업용 품종간의 유전적 유사도와 그 특성을 밝히고자 하였다. 또한 새로운 품종 개발에 활용할 수 있고 유전적 정보와 분자 유전마커로서의 가능성을 평가하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 균주</h2> <p>본 실험에서 사용된 팽이버섯(Flammulina velutipes) 균주 29종은 한국, 일본, 중국의 야생 갈색 균주(한국 10종, 일본 2종, 중국 2종)와 이미 육종된 백색균주(한국 2종, 일본 8종, 중국 5종)등 총 29종의 균주를 각각 인천대학교, (주)그린피스, 농업기술원에서 분양받아 ITS와 PCR-RAPD 분석을 위한 실험 재료로 사용되었다(Table 1).</p> <h2>균주의 배양</h2> <p>팽이버섯 균주 배양은 PDA (Difco USA) 배지를 이용하였으며, \( 39 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \)의 용량으로 조제하여, \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 15분간 멸균한 뒤 clean bench에서 \( 90 \mathrm { ~mm } \) petri dish에 \( 20 \mathrm { ml } \) 씩 분주하여 완전히 식힌 뒤 medium으로 사용하였다. 또한 균주의 계대 배양시 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 incubator에서 20일간 배양하여 본 실험에 사용하였다.</p> <h2>Genomic DNA 추출</h2> <p>Genomic DNA의 추출을 위해 PDA 배지에서 20일에서 23일간 배양한 균사를 사용하였으며, DNA 추출법은 Lee 등의 방법을 약간 변형하여 사용하였다.</p> <p>배양한 균사를 \( 0.2-1 \mathrm { ~g } \) 채취하여 mortar에 넣고 liquid nitro-gen으로 급냉 시켜 냉동상태에서 미세하게 마쇄한 다음 lysis buffer [ \(50 \mathrm { mM } \) Tris-HCl (pH 7.2), \( 50 \mathrm { mM } \) EDTA (pH 8.0), \( 3 \% \) SDS, \( 1 \% \) 2-Mercaptoethanol] \( 500 \mu \mathrm { l } \)를 넣어 잘 섞고, \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) Water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) (Effendorf 5415 centrifuge, German) \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분간 원심분리 후 상등액만 취하였다. 여기에 동량의 phenol:chloro-form:isoamylalcohol (25:24:1) 용액을 첨가 \( 15,000 \mathrm { rpm } \)에서 5분간 원심분리하여 새로운 tube에 상등액만 취하였다. DNA가 녹아있는 상등액에 2배의 absolute ethanol을 넣고 20-30분간 DNA를 침전시켜 \( 15,000 \mathrm { rpm } \)에서 5분간 원심분리 하였다.</p> <p>DNA함량을 측정하기 위해 DNA를 100 배 희석하여 spec-trophotometer-(Shimadzu UV-VIS1201, Japan)로 \( 260 \mathrm { ~nm } \)와 \( 280 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도(OD)를 측정하여 농도를 계산하고, PCR을 위한 template DNA로 사용하였다.</p> <h2>ITS primer와 증폭</h2> <p>ITS 염기서열을 분석하기 위하여 증폭한 부분은 White 등에 의해 보고된 fungi의 ITS영역 즉 partial 16S ribosomal DNA, complete ITSI, 5.8S ribosomal DNA 및 partial 28S ri-bosomal DNA였다. 증폭을 위해 ITSP1, ITSP2, ITSP3, ITSP4 primer들을 사용하였다(Fig. 1). 증폭은 Bioneer PCR kit를 사용하였다. 본 실험은 MJ Research PTC 150 minicycler에서 수행하였으며 thermal cycle의 program은 primer ITSP 1 과 2, ITSP3과 ITSP4를 달리하여 사용하여 반응시켰다.</p> <p>ITSP 1과 2와 PCR 반응 조건은 template DNA 변형을 위해 \( 94 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초간 denature, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 초 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 extension을 1분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 cycle로 하여 40 cycle로 수행하였다. ITSP3과 ITSP4 primer를 이용한 PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초간 변성시키고, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 extension 것을 1 cycle로 하여 40 cycle로 수행하였다.</p> <h2>PCR product의 정제 및 ITS 염기서열 분석</h2> <p>ITS Ⅰ 영역의 PCR 산물은 전기영동하여 나타나는 DNA band를 확인한 후, QIA-quick PCR purification kit (Qiagen Inc., USA)를 이용하여 정제하였다.</p> <p>정제된 PCR산물을 이용하여 Perkin-Elmer applied bio-systems ABI 377A (Perkin-Elmer Co.,USA)를 이용하여 PRISM Dye Dideoxi Terminator Cycle Sequencing로 분석하였다. 얻어진 염기서열을 Gene Bank 데이터베이스에 등록된 것들과 상동성을 비교하였다.</p> <p>염기서열은 Sequencher (Gene codes Co., USA), Clustal X를 이용하여 alignment 시킨 후, 최종 세부 정열은 수작업으로 보정하였다.</p> <h2>RAPD primer와 PCR</h2> <p>본 연구의 PCR 실험 시 RAPD를 위해 사용한 primer는 식물과 버섯들에 대한 유전적 다양성 및 유연관계 분석에 활용되는 상업용 kti primer (OPA 01~20, OPB 01~20) (Operon Technologies, USA)를 사용하였다. code name과 sequence \( \left (5 ^ {\prime } \right . \) to \( 3 ^ {\prime } \) )는 Table 2에 나타내었으며, G + C의 함량은 \( 60-70 \% \)이었다.</p> <p>PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Bioneer PCR kit를 사용하였다. PreMix kit에 genomic DNA \( 1.0 \mu \mathrm { l } \), primer \( 1.0 \mu \mathrm { l } \)를 넣고, 전체 반응 용액이 \( 20 \mu \mathrm { l } \)가 되도록 3차 증류수를 첨가하였다.</p> <p>본 실험의 RAPD 증폭반응은 MJ Reserch PTC 150 mini-cycler에서 thermal cycle의 program은 Park 등의 방법에 따라 수행하였다. Template DNA 변형을 위해 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분간 predenaturation한 다음, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초간 denaturation, \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 elongation 을 5분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 Cycle로 하였으며, 이 실험에서는 45 cycle로 수행하였다. DNA 증폭이 끝난 후 최종적인 합성을 위해 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 안정화한 다음, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관 사용하였다. 이때 각각의 primer에 대한 상기의 PCR 과정을 통한 screening을 실시하여, 선택된 primer 별로 3회 이상의 반복실험을 수행하여 재현성이 뚜렸한 것만을 유용한 primer로 결정하였다.</p> <p>RAPD의 경우 40개의 primer들 중 16개의 primer의 분석대상이었던 29품종 모두에서 재현성이 뛰어난 band들이 나타났다. 또한 primer들에 따라 band의 양상에 차이가 있어 OPA-2, 9, 10 등 2~4 종류의 primer들을 같이 사용 할 경우 모든 품종에 대하여 차별화된 밴드를 확인 할 수 있으므로 이들은 품종을 식별하는데 분자 maker로서의 이용이 가능하다고 사료된다.</p> <p>그러나 모든 대상 품종들에 대한 다양한 형태적, 생리적 분석결과가 이루어져 있지 않아 이러한 형질들과 본 연구의 RAPD에 의한 품종들의 band 양상과의 관계를 규명할 수 없었다. 이를 위하여 각 품종들의 형태, 생리적 특성에 대한 추가적 분석과 연구결과 등의 계량화가 요구 된다고 본다.</p> <p>또한 교배 육종 시에 단핵균주를 사용해야 하고 단핵균주들의 분자 유전적 특성이 다르다는 점을 고려할 때 본 연구결과에 사용한 균주들은 이핵균주들이므로 육종을 위해서 단포자 균사의 RAPD 분석이 요구된다. 그리고 일본산 백색종 (JW), 중국산 백색종 (CW), 중국산 야생종 (CB)간의 band 의 패턴은 거의 유사하게 나타났다. 또한 중국 인공백색팽이 (CW)의 경우 일본산 인공백색팽이(JW)와 유전적 변이도는 \( 3 \sim 20 \% \) 차이가 났다. 이를 보면 대부분의 중국산 인공백색팽이의 경우 일본산 인공백색팽이와 유전적 변이가 비교적 없었다. 중국의 경우 육종 시 모균주를 일본산에 많이 의존하는 것으로 판단이 되며, 이미 육종기술이 많이 앞선 일본산 인공팽이를 가져와 약간의 변형만 있었을 뿐 독립적인 개발이 의심스러운 것으로 추정이 된다.</p> <p>KB-1~10 한국산 야생종의 경우 band의 패턴 분석 결과 매우 다양한 패턴으로 전개되는 것으로 보아 자연상태에서 유전적 변이가 상당히 이루어져 온 것으로 보인다. 이는 팽이육종의 근간이 되는 야생종 특히 한국 고유종의 팽이를 육종할 경우 다른 국가와 차별화될 수 있는 팽이를 육종할 가능성이 높을 것으로 판단된다.</p> <p>유전적 비유사도 지수행렬의 종간 가장 낮은 것은 CB-1, CB-2 등의 중국산 야생팽이로 \( 3.3 \% \)의 변이도를 나타냈다. 이는 두 품종이 동일 종으로 판단 된다.</p> <p>품종간 가장 높은 변이는 한국야생종 KB-10과 일본 백색종 JW-6로 \( 45 \% \)로 인위적인 육종으로 인해 종내의 변이를 넘어 종분화의 수준에 이르렀음을 보여 주었다.</p> <p>일본산 백색팽이 (JW)와 한국산 야생종(KB)과는 \( 30 \sim 45 \% \)의 유전적 변이도를 보였다. 또한 중국산 야생팽이(CB)와 \( 20 \sim 28 \% \)의 변이도를 보였으며, 일본의 백색팽이는 한국과는 유전적으로 많이 차이가 나 그들만의 독자적인 팽이를 육종한것으로 보인다.</p> <p>RAPD를 수행한 PCR product는 \( 5 \mathrm { ng } / 100 \mathrm { ml } \)의 농도로 ethidium bromide를 첨가한 \(1.2 \% \) agarose gel (SIGMA, USA)에서 1x TAE buffer에서 \( 50 \mathrm { mV } \)로 전기영동 하였으며, UV상에서 나타나는 DNA band를 확인하였다.</p> <h2>Data 분석</h2> <p>RAPD 결과, 반응이 나타난 16개의 primer에서 다형성이 인정되는 3,030개의 band를 발견하였다. 먼저 각 band를 하나의 형질로 취급하여 코드화하였으며, 그리고 전체 코드화한 자료를 바탕으로 자료행렬을 작성하였다. 분지도는 UPGMA (unweighted pair-group method, arithmetic aver-age method) 방법을 사용하였고, phylogenetic analysis에서 PAUP 4.02b version 을 사용하여 parsimony analysis를 실시하였으며, 분석방법으로는 Heurestic search를 이용하였다. 이에 따른 option으로 ACCTRAN, MULPARS 및 TBR을 이용하였다. 또한 Nei의 유전적 거리지수를 다소 변형한 Nei-Li의 거리지수를 이용하여 상사도 행렬을 도출하였다. 도출된 자료행렬에 따라 산출된 유전적 유사도를 기초로 하여 neighbour joining tree (NJ) 를 작성하였다. 그리고 종간의 유전적 유사도 계수(similarity coefficient)는 Sneath와 Sokal의 방법에 따라 구하였다. 또한 각 분계도의 지지정도는 jack-knifing, bootstrap을 이용하여 분석하였다. 이러한 분석방법은 1,000 회 반복 실시하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>ITS 염기서열</h2> <p>Primer ITS 1, 2, 3, 4를 이용한 ITS 염기서열 분석한 결과 전체 720개의 염기서열을 확인하였다(Table 3). 29개의 품종 모두 동일하였으며, 이는 Genebank에 수록된 것과 동일하였다.</p> <h2>RAPD</h2> <p>29개의 팽이품종들을 40개의 primer를 이용하여 RAPD 분석을 한결과 모든 품종에 반응들이 나타내었고 3번의 반복실험을 통하여 재현성이 확인된 것은 전체 40개 중 16종류의 primer였다(Table 2). 그 중 특히 polymeric band의 빈도가 높아 유전적 다양성을 잘 나타낸 primer들은 OPA-2,4,3,9,10,20 이었다.</p> <p>PCR에 의하여 증폭된 band들은 \( 400 \mathrm { bp } \)에서 \( 2,000 \mathrm { bp } \) 사이의 구간에 분포하고 있었으며 primer에 따라서 8~16개의 band들이 나타내었다. 특히 primer OPA 3과 20을 이용한 RAPD 분석결과를 보면 일본과 중국품종의 JW1~7과 CB 1-2, CW 1-5에서 band들이 500~1,600 bp 사이에 유사하게 나타나지만 한국의 야생종 KB 1~10들은 200~2,000 bp에서 매우 다양하게 나타냈다(Fig. 2). 그러나 OPA-2, 9, 10과 OPB-7들을 이용한 경우 band 분포가 모든 품종간에 다양성이 매우 컸다(Fig. 3). 또한 RAPD band 를 바탕으로 팽이버섯 형태 특징과 비교할 때 일본, 중국, 한국 백색팽이버섯 (JW, CW, KW) 그룹은 갓, 대의 형태가 일률적인 반면 특히 한국산 야생팽이 KB 그룹은 형태가 다양하였다(Table 1). 이는 RAPD band 분석에서 일본, 중국, 한국 백색팽이 그룹 band의 분포 범위가 좁고, 비슷한 양상을 띄었으며, 한국 야생팽이 그룹의 경우 band 분포 범위가 보다 넓고 다양하게 표현되었다(Fig. 2).</p> <p>16개의 random primer로부터 자료분석을 위한 3,030개의 scrabble RAPD band들을 marker로하여 Nei-Li's의 방법을 이용한 비유사도 지수행렬을 조사한 결과(Table 4) 종내 유전적 변이는 \(3.3 \sim 45 \% \)로 나타났다. 종내 가장 낮은 변이는 CB-1, CB-2 중국산 야생품종들로 행렬도에 나타난 비유사도지수는 \(3.3 \% \)였으며, 가장 높은 변이는 KB-10와 JW-6로 \( 45 \% \)였다.</p> <p>한국산 야생팽이인 KB-1~10 품종간 비유사도는 \(17 \sim 38.6 \% \)로 나타났다. 한국산 야생팽이(KB)를 기준으로 일본산 야생팽이(JB), 일본산 백색팽이(JW)의 비유사도지수는 각각 \(23 \sim 42 \% \), \( 30 \sim 45 \% \)로 나타났으며, 중국산 야생팽이(CB)와 백색팽이(CW)는 각각 \( 25 \sim 38 \%, 27 \sim 43 \% \)여서 한국산 야생팽이나 일본산 백색팽이는 품종에 따라 다른 종에 가까울 정도로 분화되었음을 알 수 있었다.</p> <p>일본산 백색팽이(JW)는 종내 비유사도지수는 \(4 \sim 20 \% \)로 나타났고, 일본산 백색팽이(JW)와 중국산 백색팽이(CW)들 간의 비유사도지수는 \(4 \sim 20 \% \)로 나타났다. 특히 CW-2~5와 JW-7~8간의 비유사도가 \(4 \sim 10 \% \)로 국가별 품종간의 가장 낮은 유전적 변이도가 나타났다.</p> <p>Band의 변이에 기초하여 neighbor-joining tree (NJ) 분석결과 5개의 cluster를 형성하였다(Fig. 4). 각 cluster마다 국가, 지역, 품종간의 구분을 볼 수 있었다. cluster Ⅰ의 경우 69/69 jacknife/bootstrap 지지도를 나타났으며, 특히 KB-1, KB-3는 97/95 jacknife/bootstrap의 지지도를 얻었다. Cluster Ⅱ 중국산 야생품종 CB-1, CB-2 100/100 jacknife/bootstrap 지지도를 나타내고 있다. cluster Ⅲ 한국산 백색품종 2개와 일본산 야생팽이가, cluster Ⅳ 중국산 백색팽이와 일본산 백색팽이가 97/93의 jacknife/bootstrap 지지도를 얻으며, 무리를 이루었다. Cluster Ⅴ의 경우 일본산 백색팽이들로만 cluster를 이루었다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>본 연구결과 ITS 염기서열은 품종간의 유의적인 차이가 없어 품종을 구별할 수 있는 분자 지표나 팽이 품종간의 유연관계 분석을 위한 자료로서는 모두 적합하지 않다고 생각된다. 그러나 능이버섯이나 민자주방망이 버섯의 경우 본 연구에서와 같이 동일 ITS 서열을 분석한 결과 민자주방망이 버섯은 지역간 품종의 비유사도가 \( 1.58 \sim 11.4 \% \)이고, 능이는 \( 1.8 \% \)였던 것과 비교하여보면 팽이버섯의 지역간, 품종간 ITS 염기서열의 높은 유사도의 원인은 분명치 않다. 백색종들의 경우는 각종의 모 품종이 유사한 것들이었을 것으로 보인다. 국가 등 지역 간의 경우는 팽이버섯 ITS 염기서열의 특이성으로 더 많은 분석을 해야 한다고 생각된다.</p> <p>특히 한국산야생팽이의 경우 중국이나 일본의 야생 팽이와는 유전적 거리가 멀게 나타났다. 이는 지리적 격리의 영향을 어느정도 받은것으로 보인다. 한국에서 개발된 백색팽이인 KW-1, KW-2의 경우 국산 야생팽이의 유전적 변이도는 \(28 \sim 45 \% \) 차이가 나지만, 비교적 일본야생팽이(JW)와 변이도는 \( 14 \sim 25 \% \)의 차이를 나타내고 있고, 마찬가지로 일본산 백색팽이와 \(18 \sim 23 \% \)로 나타났다. 이는 한국에서 육종된 KW-1,2가 한국산 팽이보다 일본산 야생, 백색팽이에 더 가까운 것으로 보아 한국 팽이 육종이 비교적 독립적으로 종의 차이를 두는 것 같으나 일본산 팽이를 바탕으로 육종되는 것으로 생각된다.</p> <p>이상의 결과들로 RAPD 분석결과를 통하여 분자 유전적으로 교배 육종의 과정, 신품종 평가를 위한 분자 유전적 기준등으로의 활용이 가능하다고 본다. 또한 형태 생리적인 변이와 특성들과 연관된 RAPD 특이성, 각 품종들의 단핵균주의 RAPD 양상 등의 추가적 연구가 이루어진다면 품종개발의 자료로 활용 될 수 있다고 본다. KB-1~10 한국산 야생종의 경우 band 패턴 분석 결과 매우 다양한 패턴으로 전개되는 것으로보아 자연상태에서 유전적 변이가 상당히 이루어져 온 것으로 보인다. 이는 팽이육종의 근간이 되는 야생종 특히 한국 고유종의 팽이를 육종할 경우 다른 국가와 차별화될 수 있는 팽이를 육종할 가능성이 높을 것으로 판단된다.</p> <h1>초록 : 팽이버섯의 유전적 변이</h1> <p>ITS 염기서열과 RAPD를 이용하여 F. velutipes 29개의 팽이버섯 품종 간의 유전적 변이를 분석하였다. ITS 부위에서 \( 720 \mathrm { bp } \)의 염기서열을 확인 하였으나 29개의 팽이품종간에 유의적인 차이가 없었다. RAPD 분석 결과 40개의 random primer 중 다형성을 나타내는 primer는 16개였으며, 그 중 뚜렸한 다형성을 띄는 primer는 OPA-2,4,3,9,10,20이었다. 이들 29개 품종에서 primer에 의해 증폭된 밴드는 모두 3,030개 였으며, DNA 단편의 크기는 \(200 \sim 2,000 \mathrm { bp } \) 사이에 위치하였다. 또한 3,030개의 scrabble RAPD band들을 marker로 하여 Nei-Li's의 방법을 이용한 비유사도 지수행렬을 조사한 결과 전체 29개 품종의 종내 유전적 변이는 \(3.3 \sim 45 \% \)였고, 특히 한국야생팽이의 종내 유전적 변이도는 \(17 \sim 38.6 \% \)로 품종 간 다형성을 확인하였다. RAPD 변이에 기초하여 neigh-bor-joining tree (NJ) 분석에서는 5개의 cluster로 구분되었으며, 각각의 cluster는 품종, 지역 적 특성을 나타내었다. 본 연구 결과 RAPD와 실험을 통해 확인된 OPA, OPB primer의 경우 미확인 팽이품종들을 검색 하는데 분자유전적 표지 maker로써 이용 할 수 있는 것으로 생각된다.</p>	생명
latroscan에 의한 한국산 오징어의 부위별 콜레스테롤 함량 측정	<h2>오징어 각 부위별 지방종 조성비 및 latroscan법에 의한 콜레스테롤 함량 정량</h2><p>TLC-FID system인 Iatroscan으로 간단히 지방종들의 조성비를 구해본 결과, 여러 부위 중 간장만 지방종이 중성지방이 \( 92.1 \% \)나 차지하고 인지질은 \( 5.0 \% \)에 지나지 않았으나, 그 외 부위 중의 지방종 조성은 인지질이 \(70.4 \sim 87.9\%\)로서 대부분을 차지하였다(Table 3). 그런데, 중성지방의 경우 간장을 제외시킨 내장 부위에서 \( 10.2 \% \)로서 간장 이외의 다른 부위에서 중성지방이 차지하는 비율이 \( 0.7 \sim 1.3 \% \)인데 비하면 매우 높은 수준이었다. 그렇지만, 간장 부위 중의 중성지방 비율에 비하면 매우 큰 차이를 보였다. 이와 같은 오징어 부위별 지방종 함유 경향은 물오징어 이외의 종에서도 거의 비슷한 양상이었다. 특히 본 Iatroscan법으로 총지질 중에서 차지하는 콜레스테롤 존재 조성비도 확실히 알 수 있어, 시료에 내재해 있는 다른 지방종들과 겹치지 않는 내부표준물질만 잘 선택하면 충분히 Iatroscan법으로 번거로운 전처리 조작없이 신속하게 콜레스테롤 정량이 가능하리라 판단하였다. 그래서, 그 내부표준물질로 오징어 각 부위별 유지 중의 내재 지방종들과 전혀 \( \mathrm{R}_{f} \)치가 겹치지 않는 \( 5 \alpha \)-cholestane을 선택하여 Iatroscan에 의한 신속정확한 콜레스테롤 정량을 시도하였다. 그 결과, Table 4에 각 부위별 중량 \( 100 \mathrm{~g} \)당 콜레스테롤 함량으로 나타낸 바와 같이 주 가식부인 오징어 몸통 육에는 \( 178.9 \mathrm{mg} \% \) 수준으로 존재하였고, 비가식부인 껍질이나 간장에 각각 \( 608.8\mathrm{mg} \%\), \(634.2 \mathrm{mg} \% \) 로 다량 존재해 있었다. 또한, 또 다른 가식부인 다리육 부위에 의외로 몸통육보다 횔씬 많은 \( 321.4 \mathrm{mg} \% \) 수준으로 콜레스테롤이 존재해 있었다. 일반적인 콜레스테롤 정량법으로 많이 사용되어져 오고 있는 효소법이나 GC법으로도 같은 시료에 대해 콜레스테롤 정량을 시도해 본 결과, Table 4에 나타낸 바와 같이 Iatroscan법에 의한 결과치와 큰 차이는 없었다. 그러나, 간장 부위의 콜레스테롤치는 GC법에 의한 수치가 매우 낮은 수치를 보였는데, 이는 다른 부위와는 달리 인지질보다는 중성지방이 많은 특성상 전처리 과정 중에 최대로 회수되지 못하고 loss가 일어난 때문으로 사료된다. 이렇게 생각되는 근거로 오징어 중의 스테롤은 \( 91 \% \) 이상이 콜레스테롤이기 때문에 여타 스테롤을 인식할 가능성이 효소법이나 Iatroscan법에서 거의 없다. 일반적인 지방종을 Iatroscan으로 정성분석이 아닌 정량분석까지 하려던 시도는 Itoh등이 처음이었는데, 매우 복잡한 지방종으로 구성되어 있는 간장 시료 이외에는 큰 무리없이 Iatroscan법에 의한 콜레스테롤 정량이 가능하리라 판단하였고 실제로 그들 간장 시료내의 많은 지방종들과 본 연구에서 사용한 내부표준물질인 \( 5 \alpha \) -cholestane이 전혀 겹치지 않기 때문에 Data상의 오차는 크지 않았다고 본다. 본 Iatroscan에 의한 콜레스테롤 정량법은 별다른 전처리가 필요없어 비싼 효소 키트가 필요한 효소법 보다 더욱 더 쉽게 정량할 수 있다고 본다. 아울러, 복잡한 검화과정과 분리조작 등의 전처리가 필요한 GC법에 의한 콜레스테롤 정량법보다도 Iatroscan에 의한 콜레스테롤 정량은 횔씬 신속하고 간편한 방법이라고 판단된다. 물론 Iatroscan법으로 콜레스테롤을 정량하기 위해서는 GC 가격 수준인 Iatroscan이란 장치가 필요하지만, 설사 Iatroscan이 구비되어 있지 않다 할지라도 일반 TLC와 ensitometer만 구비해 있어도 Iatroscan과 동일한 방식으로 쉽게 콜레스테롤을 정량할 수 있다.</p><p>따라서, 복잡한 전처리없이 추출지방만으로 용이하게 정확한 콜레스테롤 정량을 Iatroscan으로 할 수 있음을 알 수 있었다. 아울러, 오징어 가식부 중 몸통보다는 다리육에 콜레스테롤양이 많았으며, 특히 껍질부위는 간장부위와 함께 난황중의 콜레스테롤치의 \( 2 / 3 \) 수준으로서 상당량의 콜레스테롤이 함유되어 있음을 본 연구로 알 수 있었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 실험에 사용된 오징어 시료는 강원도 강릉 근해에서 1998년 1월에 어획된 물오징어, Todarodes pacificus STEEN STRUP이었고, 평균 체중 \( 295.7 \mathrm{~g} \), 전장 \( 40.5 \pm 1.1 \mathrm{~cm} \), 외투장 \( 23.3 \pm 1.0 \mathrm{~cm} \) 이었다. 구입 즉시 귀, 몸통, 다리와 족살, 눈, 간장, 간장 이외의 내장 부위로 각각 나누어 \( -40^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 저장하여 두고서 필요시 꺼내어 실험하였다.</p><h2>시약</h2><p>콜레스테롤과 \( 5 \alpha \)-cholestane은 Nakarai chemicals Ltd(Kyto, Japan), 효소법에 의한 콜레스테롤 정량용 키트는 Wako chemicals Ltd (Oosaka, Japan)에서 구입하여 더 이상 정제없이 그대로 사용하였다. 기타 시약과 용매는 분석급 수준의 것을 사용하였다.</p><h2>수분함량 측정</h2><p>상압가열법으로 시료 중의 수분함량을 측정하였다.</p><h2>시료 지질의 추출 및 지방함량 측정</h2>Bligh and Dyer법에 의해 총지질을 추출한 뒤, 그 추출물을 감압농축하여 중량 측정함으로써 지방함량을 결정하였다.</p><h2>지방종 분석 및 latroscan법에 의한 골레스테롤 정량</h2><p>추출 시료 지방을 일정량 취하여 TLC에 spot하고서 Hexane-Ethylether-Formic acid (\(80:20:1\)) 전개 용매내에서 분리한 뒤 TLC-FID system인 Iatroscan TH-10 (Iatroscan Laboratories, Japan)으로 지방종 분석을 행하였다. 한편, 콜레스테롤 정량을 위해서는 시료유지에 일정량의 \( 5 \alpha \)-cholestane을 내부표준물질로서 첨가하여 Iatroscan 전용 TLC봉에 loading한 후 Hexane-Ethylether-Formic acid (\(80:20:1\)) 전개용매 내에서 분리한 뒤 Iatroscan으로 분석하였다. 콜레스테롤 함량은 Fig. 1에 나타낸 검량선으로부터 환산하여 정하였다.</p><h2>효소법에 의한 콜레스테롤 정량</h2><p>Wako chemicals Ltd (Oosaka, Japan)에서 시판 중인 콜레스테롤 분석용 키트를 사용하여 Nakagawa등의 방법에 준해 분석하였다.</p><h2>가스크로마토그래피(GC)법에 의한 콜레스테롤 정량</h2><p>시료로부터 추출한 불검화물 획분에 내부표준물질로서 5\( \alpha \)-cholestane을 일정량 첨가하여 \( \mathrm{GC} \) 로 분석하였다. 분석조건은 다음과 같았다. 장치는 GC Sciences GC-380 (Japan), 유리칼럼 \( 3 \mathrm{~mm} \times 100 \mathrm{~cm} \) 에 일본 크로마토공업 시판의 DMCS (80-100mesh)를 충전하였다. 이동상 가스 \( 70 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), 칼럼 온도 \( 260^{\circ} \mathrm{C} \), 시료기화실 온도 \( 290^{\circ} \mathrm{C} \), 검출기 온도 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \) 로 설정, 정량값은 기본적으로 반치폭법에 의해 면적비를 구해 산출하였다. 최종 분석치는 Fig. 2에 나타낸 \( 5 \alpha \)-cholestane에 대한 콜레스테롤의 면적비와 중량비로써 구해둔 콜레스테롤 검량선으로부터 계산하여 정하였다.</p> <h1>걸과 및 고찰</h1><h2>오징어 각 부위별 중량 및 중량비</h2><p>먼저 한국의 강릉시 근해에서 어획한 물오징어의 부위별 중량과 중량비를 구해보았는데, 그 결과는 Table 1에 나타내어져 있다. 오징어 부위 중 귀는 \( 7.9 \% \), 동체는 \( 37.8 \% \), 다리 및 족살은 \( 26.4 \% \), 눈부위는 \( 3.3 \% \), 간장은 \( 13.9 \% \), 간장을 제외한 내장 부분은 \( 7.9 \% \), 껍질은 \( 2.6 \% \), 연골은 \( 0.2 \% \) 를 나타내었다. 일반적인 가식부 및 껍질부위의 중량비는 여타 화살오징어나 갑오징어, 원양산 빨간오징어, 멕시코산 대왕오징어 등에 비해서 큰 차이를 보이지는 않았다. 아울러, 내장이 차지하는 비율도 여타 오징어에 비해 그렇게 크지 않았다. 단지 통상적인 가식부가 \( 72.1 \% \)나 되어 이 부분의 콜레스테롤 함량이 어느 정도 되는지 정량하는 것이 가장 중요할 것으로 생각된다. 그렇지만, 최근 껍질째 가공되는 오징어 제품도 많아 오징어 껍질의 중량비는 \( 2.6 \% \)로서 그렇게 크지 않으나 이 중의 콜레스테롤 함량 측정도 필요하다고 본다.</p><h2>오징어 각 부위별 수분 및 지방 함량</h2><p>Table 2에 한국산 물오징어의 부위별 수분 및 지방의 함량을 나타내었다. 수분함량의 경우는 눈부위가 \( 83.6 \% \)로서 특히 높고 간장부위가 \( 50.4 \% \)로서 매우 낮았으며, 그 외 부위들은 \( 74.7 \sim77.1 \% \) 정도로 서로 큰 차이는 없었다. 지방 함량의 경우는 간장 부위가 \( 15 \% \)로서 가장 높았고, 껍질 부분이 \( 4.7 \% \)로서 그 다음이었으며, 그 외 부위들은 \( 1.9 \sim 2.4 \% \)로서 서로 큰 차이는 보이지 않았다. 이런 경향은 여타 오징어종과도 별반 차이가 없었다. 오징어 중의 콜레스테롤은 전부 그 지방층에 존재하고 있기 때문에 각 부위별 \( 100 \mathrm{~g} \)당 차지하는 콜레스테롤 함량 못지않게 지방의 함량 자체도 그 부위에 차지하는 콜레스테롤 비율을 올리는 데에 중요하게 작용하리라 생각된다.</p>	생명
P. aeruginosa ATCC 39324 생산 아세틸알긴산의 분해반응에서 아세틸알긴산 아세틸분해효소와 알긴산 분해효소의 상승효과	<p>CF 환자들이 P. aeruginosa균에 감염되었을 경우 P. aeruginosa균들이 생산하는 아세틸알긴산들과 염증반응 때문에 증가하는 중성백혈구 유래 DNA와 actin 등이 당단백질과 결합하여 호흡기에 바이오필름을 형성하게 된다. Alipour 등에 의하면 DNase 및 알긴산 분해효소와 함께 aminoglycoside를 처리한 경우 항생제 활성이 증가한다고 하였으며 Hatch와 Schiller는 알긴산 분해효소의 처리가 P. aeruginasa가 생성하는 세포외 다당류 속으로. 항생제를 확산시키는데 도움이 된다고 하였다. 본 실험의 결과로 보아 알긴산 분해효소 만으로 박테리아가 분비하는 점성이 높은 세포외 다당류를 분해하기는 십지 않고 아세틸알긴산 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소를 함께 처리하는 것이 항생제의 활성을 더욱 높여줄 것으로 생각된다.</p> <h2>아세틸알긴산 효소분해물의 FPLC 분석</h2> <p>\( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 스펙트럼을 측정하기 위하여 \( 0.5 \% \) ( \( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 고분자 아세틸알긴산에 \( \mathrm { Ni } \)-sphepharose 친화력 크로마토그라피로 정제한 알긴산 분해효소만을 가한 것과 아세틸분해효소 및 알긴산 분해효소를 함께 가하고 반응시켜 얻은 생성물을 FPLC로 분석한 결과는 Fig. 5 와 같았다. Fig. 5A는 정제한 KS-408 알긴산 분해효소를 가한 것으로 점성이 높고 아세틸기가 붙어있는 기질을 분해하기 어려워 tetramer 이상의 분자량이 큰 올리고머들이 적은 양 생성될 수 있었던 것으로 보인다. MJ-3 AcAlgE를 가하여 아세틸기를 먼저 제거한 후 알긴산 분해효소를 넣어 반응시킨 생성물의 FPLC 분석 결과는 Fig. 5B와 같았다. AcAlgE를 넣지 않고 KS-408 알긴산 분해효소만 넣었을 경우 생성되는 올리고머들의 함량에 비하여 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소를 함께 넣어서 생성되는 dimer, trimer, tetramer 등 적은 분자량의 올리고머 함량을 계산하면 20배 이상 생성되었음을 알 수 있었다. 이들 결과들로 보아 병원성균 P. aeruginosa가 생산하는 바이오필름의 구성성분인 고분자 아세틸알긴산을 효과적으로 분해하기 위해서는 아세틸기 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소를 함께 처리하는 것이 좋을 것이다.</p> <p>그러나 Sphingomanas sp. MJ-3에서 얻은 AcAlgE 유전자를 thioredoxin protein 이나 glutathione S-transferase 등과 융합시켜 soluble 한 형태로 발현시키고자 하였으나 pET21, pET32 또는 pET42 vector 들에 발현시켰을 때 다량의 inclusion body만을 얻을 수 있었다(data not shown). Maltose binding protein (MBP)과 융합되어 재조합 단백질을 발현시킬 수 있 pMal-c2X vector에 cloning 하여 MBP-AcAlgE 단백질을 얻었을 때에는 soluble 형태로 얻을 수 있었으나 낮은 온도인 \(22 \text { - } 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적 활성을 보여 CF 환자들에게 응용하기에는 문제가 있을 것으로 생각되었다. 따라서 site-directed mutagenesis 또는 transmembrane domain 제거 등을 통한 방법을 이용하여 높은 온도에서 활성을 가지는 재조합 단백질을 얻을 수 있도록 연구를 진행하고 있다.</p> <h1>서론</h1> <p>Pseudomonas속 균주들은 세포외 다당류(exopolysaccharide, EPS)로 아세틸알긴산을 분비하여 바이오필름(biofilm)을 형성하므로서 먹이에 부착할 수 있고 백혈구들에게 잡혀먹히지 않으며 바이오필름을 형성하지 않는 균들보다 항생제에 수백배 수천배 저항성이 있다고 알려진 바 있다. 토양균인 Azotobacter속 균주들도 불리한 환경조건에서 균체가 건조되는 것을 방지하기 위하여 아세틸알긴산을 생성한다고 알려져 있다. 미역이나 다시마와 같은 갈조류의 세포벽 구성성분으로 셀루로우즈, 알긴산, 퓨코이단 등이 있으며 그 중 알긴산은 L-guluronate가 \( \alpha \)(1-4) 결합되어 있는 polyG block과 D-mannuronate가 \( \beta \)(1-4) 결합하고 있는 polyM block, 그리고 L-guluronate와 D-mannuronate가 \( \alpha \)(1-4) 결합 또는 \( \beta \)(1-4) 결합하고 있는 random block (MG/GM)들로 이루어진 선상 산성다당류이다. 그러나 특히 P. aeruginosa가 생산하는 알긴산은 갈조류의 알긴산과는 달리 L-guluronate는 거의 없으며 D-Mannuronate가 \( \beta \)(1-4) 결합으로 연결되어 있는 polyM 구조이며 mannuronate의 2번 또는 3번 탄소의 수산기(- \( \mathrm { OH } \))가 아세틸화(- \( \mathrm { OCOCH_3 } \))되어 있다.</p> <p>알긴산 분해효소(alginate lyase)에 대한 연구는 유전병인 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자를 치료하기 위하여 시작되었다. 낭포성 섬유증이란 염소이온 수송을 담당하는 막단백질(CFTR)의 유전적 결함( \( \triangle \)F508)으로 폐와 이자에서 과잉의 점액질이 생산되며 호흡과 소화작용에 문제가 생기는 질병으로 알려져 있다. 이러한 환자들은 두꺼운 점액질 때문에 쉽게 세균에 감염이 되고 특히 Pseudomonas 균에 감염이 되면 항생제를 보통 환자들보다 많은 양 주사하여도 아세틸알긴산으로 바이오필름을 형성한 세균들을 치료하기 힘들다고 한다. Hatch 및 Schiller와 Alipour 등은 알긴산 분해효소 특히 polyM 분해효소를 사용하면 Pseudomanas 가 생성한 바이오필름의 아세틸알긴산을 분해하여 항생제 양을 줄일 수 있다고 보고한 바 있다.</p> <p>알긴산 분해균주들은 알긴산을 유일한 탄소원으로 이용하여 에너지원으로 사용하기 때문에 알긴산 operon 또는 알긴산 분해관련 유전자 cluster를 가지고 있다. 본 연구실에서 Sphingomonas sp. strain MJ-3 및 Stenotrophomonas maltophilia KJ-2 균주의 알긴산 operon (alg operon)을 분석하던 중 operon의 마지막 유전자로 만들어지는 단백질이 GDSL-like esterase 단백질과 상동성을 가지는 것으로 분석되었다. 이 유전자를 재조합하여 생화학적 특성을 연구한 결과 P. aeruginasa ATCC 39324 균주로부터 분리한 아세틸알긴산의 아세틸기를 가수분해하는 아세틸알긴산 탈아세틸화효소(AcAlgE) 활성을 가지는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 재조합 AcAlgE 및 polyM block을 특이적으로 분해하는 알긴산 분해효소를 각각 또는 함께 Pseudomonas aeruginosa 균주가 생산하는 세포 외 다당류인 아세틸알긴산과 반응시켰으며 그 생성물을 NMR 및 FPLC로 분석 비교하였다.</p> <h2>아세틸알긴산 효소분해물의 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 스펙트럼 분석</h2> <p>고분자 아세틸알긴산 및 산가수분해로 얻은 저분자 아세틸알긴산에 MJ-3 AcAlgE 또는 KS-408 알긴산 분해효소만을 처리하였거나 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소를 함께 처리하였을 때 생성된 분해물을 동결건조하고 \( \mathrm { D_2O } \) 로 녹인 다음 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 스펙트럼을 측정한 결과는 Fig. 4 와 같았다. Fig. 4A에서와 같이 고분자 아세틸알긴산에 AcAlgE만을 처리하였을 때 \( 2.2 \mathrm { ppm } \) 의 peak 크기로 보아 총 아세틸기가 많이 남아있음을 알 수 있고 \( \mathrm { M } \)-2' 및 \( \mathrm { M } \)-3' peak들도 남아있음을 알 수 있었다. Poly \( \mathrm { M } \)-block에 KS-408 알긴산분해효소를 처리하면 Fig. 4C에서와 같이 거의 다 분해되어 불포화 dimer와 trimer를 생성하며 NMR 스펙트럼에서는 \( \underline {\triangle } \)-4- \( \mathrm { M } \) peak ( \( 5.8 \mathrm { ppm } \)), \( \underline {\mathrm { M } } \)- \( 1 _ { red } \) peak ( \(4.9 \mathrm { ~ppm } \) 및 \(5.4 \text { - } 5.2 \mathrm { ~ppm } \))등 분해산물들의 peak들이 보이는데 고분자 아세틸알긴산의 경우 \( \underline {\triangle } \)-4- \( \mathrm { M } \) peak ( \(5.8 \mathrm { ppm } \))가 거의 보이지 않는 것을 보아 Fig. 3의 결과에서와 같이 높은 점성으로 인한 효소접근성이 떨어져 \( \mathrm { M } \)- \( \mathrm { M } \) 사이의 분해가 제대로 일어나지 않은 것으로 보인다. 그러나 아세틸기 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소인 KS-408 분해효소를 함께 처리한 경우에는 \( 2.2 \mathrm { ~ppm } \)의 아세틸기 peak가 많이 감소하고 \( \underline {\triangle } \)-4- \( \mathrm { M } \) ( \( 5.8 \mathrm { ~ppm } \)) 및 \( \underline {\mathrm { M } } \)-1 \(_ { red } \) ( \(5.2 \text { 및 } 4.9 \mathrm { ppm } \)) 등 비환원말단을 나타내는 peak들이 증가하였으므로 AcAlgE와 KS-408 분해효소를 함께 처리하면 아세틸알긴산의 분해효과가 높아짐을 알 수 있다. 산가수분해하여 20-50개의 mannuronate가 결합된 저분자 아세틸알긴산에 효소들을 처리한 경우는 Fig. 4B와 같았다. AcAlgE를 처리하였을 때 Fig. 4A의 경우보다 아세틸기 ( \( 2.2 \mathrm { ~ppm } \))가 많이 제거되었으며 \( \mathrm { M } \)-1 peak ( \(4.7 \mathrm { ~ppm } \))가 증가하는 반면 \( \mathrm { M } \)-2' 또는 \( \mathrm { M } \)-3' peak가 많이 감소하여 탈아세틸화가 많이 진행되었음을 볼 수 있었다. KS-408 분해효소를 처리하였을 경우에도 \( \underline {\triangle } \)-4- \( \mathrm { M } \) ( \(5.8 \mathrm { ~ppm } \))가 증가한 것을 보아 고분자 아세틸알긴산보다는 올리고머가 많이 생성되었음을 알 수 있고 TBA 방법으로 실험한 결과와 유사함을 알 수 있었다. 아세틸기 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소인 KS-408 분해효소를 함께 처리한 경우 아세틸기는 완전히 제거되었고 \( \underline {\triangle } \)-4- \( \mathrm { M } \) ( \( 5.8 \mathrm { ~ppm } \)) 및 \( \underline {\mathrm { M } } \)-1 \(_ { red } \) ( \(5.2 \text { 및 } 4.9 \mathrm { ppm } \)) 등 비환원말단을 나타내는 peak들이 증가하여 polyM block을 알긴산 분해효소로 분해하였을 때와 같이 분해산물에서 나오는 peak들을 관찰할 수 있었다.</p> <h2>\( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR과 FPLC에 의한 세균 아세틸알긴산의 분해산물의 분석</h2> <p>\( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 분석을 위한 시료의 준비는 Kam 등의 방법에 따랐다. 동결건조한 시료를 \( \mathrm { D_2O } \)에 녹여 \( 400 \mathrm { Hz } \) \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR spectroscopy (ECX-NMR, JEOL, USA)에서 측정하였으며 NMR 스펙트럼은 Grasdalen 및 Zhang 등의 방법에 따라 해석하였다. 내부 표준물질로 TMSP ( \(0.75 \% \) 3-(trimethyl-silyl)-2,2 ' ,3,3' -tetradeuteropropionic acid, \( \mathrm { Na } \) salt)를 사용하였으며 data 수집은 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 행하였다. 시료의 spinning, proton spectral width, scan 횟수, relaxation delay, proton pulse angle 및 data 수집시간 등은 각각 \( 15 \mathrm { Hz } \), \(-5 \sim15 \mathrm { ppm } \), \(64, 5 \mathrm { s } \), \( 90 ^ {\circ } \) 및 \(4.098 \mathrm { s } \)이었다.</p> <p>P. aeruginosa ATCC 39324 를 배양하여 얻은 아세틸알긴산 은 고분자로서 점성이 너무 높아 NMR 분석결과가 분명하지 않았으므로 알긴산 고분자를 산가수분해하는 표준방법에 따라 산가수분해하여 중합도를 20~50으로 낮추어 저분자 아세틸알긴산으로 사용하였다. 기질 및 효소분해 생성물들은 동결건조한 후 \( \mathrm { D_2 } \mathrm { O } \)에 녹여 다시 동결건조 시키고 소량의 \( \mathrm { D_2 } \mathrm { O } \)에 녹여 NMR 및 FPLC의 시료로 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>P. aeruginosa ATCC 39324로부터 정제한 acetylalginate의 아세틸기 함량 분석</h2> <p>바이오필름을 형성하는대 사용하기 위하여 세포외 다당류들을 생성한다. 해조류 유래 알긴산은 a-L-gluronate와 \( \beta \)-D-mannuronate들로 이루어진 선상다당류인데 비하여 박테리아성 알긴산은 \( \mathrm { O } \)-2, \( \mathrm { O } \)-3번 또는 \( \mathrm { O } \)-2,3 위치에 \( \mathrm { O } \)-아세틸화(- \( \mathrm { OCOCH_3 } \)) 되어있으며 그 중 P. aeruginosa ATCC 39324가 생산하는 아세틸알긴산은 거의 D-mannuronate로만 구성된 아세틸알긴산이다. CF 환자의 가래로부터 분리한 P. aeruginosa ATCC 39324를 ATCC로부터 구입하여 PIA 고체배지에서 배양하고 세균이 분비한 아세틸알긴산을 분리정제하였다. 동결건조한 아세틸알긴산의 아세틸기를 hydroxamic acid 반응으로 분석한 결과 배양조건에 따라 조금씩 차이가 있었으나 28-30 \( \% \)의 아세틸기를 함유하고 있었다. Skjåk-Braek 등은 P. aeruginasa DE27은 \(37 \text { - } 57 \% \), P. mendocina 10541은 \(30 \% \), P. putida 1007은 \( 4 \% \)의 아세틸기를 함유하였으며 A. vinelandii TL은 \( 22 \% \), A. vinelandii IV는 \( 4 \% \)의 아세틸기를 함유하였다고 보고하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 시약</h2> <p>본 연구에 사용한 AcAlgE 및 polyM-specific 알긴산 분해효소는 본 연구실에서 Sphingomonas sp. strain MJ-3 및 Pseudomonas sp. strain KS-408로부터 각각 재조합하여 얻은 효소들로 Park 등과 Kam 등의 방법에 따라 재조합단백질을 과발현시킨 다음 효소들을 분리정제하여 사용하였다 아세틸알긴산은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입한 P. aeruginosa ATCC 39324를 PIA 고체배지(Pseudomonas Isolation Agar F, Difco, USA)에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양한 후 May 및 Chakrabarty의 방법에 따라 분리정제하여 사용하였다. 해조류유래 알긴산은 Sigma에서 구입하였으며 polyM block은 Haug 등의 방법에 따라 산 가수분해하여 분리 정제하였다. 탈아세틸 알긴산(De-O-acetylated alginate)은 P. aeruginosa ATCC 39324 로부터 얻은 아세틸알긴산을 \(0.1 \mathrm { N } \) \( \mathrm { NaOH } \)용액에 \( 0.2 \% \) ( \( \mathrm { w } / \mathrm { v } \)) 되도록 녹인 후 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 가열하고 \( 0.1 \mathrm { N } \) \( \mathrm { HCl } \) 용액 동량을 가한 다음 중화하고 투석하여 얻었다.</p> <h2>정제한 아세틸알긴산의 acety\|기 함량 분석</h2> <p>P. aeruginosa ATCC 39324가 PIA 고체배지에서 분비한 아세틸알긴산을 분리하고 정제한 후 아세틸알긴산이 함유한 acetyl기의 함량을 hydroxamic acid 반응법을 사용하여 분석하였다. 표준물질 glucose pentaacetate를 이용하여 만들어진 표준곡선으로부터 아세틸기 함량을 분석하였으며 \(520 \mathrm { nm } \)에서 측정하였다..</p> <h2>아세틸알긴산 esterase 효소활성시험법</h2> <p>아세틸알긴산 esterase의 활성실험은 Fig. 1B와 같이 알긴산분해효소 coupling assay 방법을 이용하였다. 해조류 유래 알긴산과는 달리 박테리아 유래 알긴산은 D-mannuronic acid가 \( \beta \)(1-4) 결합을 한 고분자로 mannuronan 형태이며 2번 탄소 및 3번 탄소에 결합된 산소에 \( \mathrm { O } \)-아세틸화 되어있거나 2번과 3번 위치 모두에 아세틸화 되어 있다. Park 등의 방법에 따라 정제한 재조합효소들을 사용하였으며 기질로는 고분자 아세틸알긴산 및 산가수분해하여 얻은 저분자 아세틸알긴산을 사용하였다. 기질에 MJ-3 AcAlgE 및 KS-408 알긴산 분해효소를 각각 가하여 분해산물을 얻거나 또는 먼저 아세틸알긴산 기질에 MJ-3 AcAlgE를 적정한 시간 동안 반응시켜 탈아세틸화한 후 생성된 mannuronan을 polyM-specific 알긴산 분해효소인 KS-408 lyase로 분해하여 생성물을 얻었다. 이때 생성된 분해물은 비환원말단에 이중결합을 가진 dimer, trimer, tetramer 등 oligomannuronate이므로 TBA와 반응시켜 생성된 붉은 색을 얻은 후 \( 548 \mathrm { nm } \)에서 측정하였다.</p> <h2>정제한 P. aenuginosa ATCC 39324 아세틸알긴산의 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 분석</h2> <p>P. aeruginosa로부터 정제한 아세틸알긴산은 \( 400 \mathrm { kDa } \) 정도의 높은 분자량을 가지며 Fig. 1B와 같이 아세틸기를 가지고 있어 점성이 아주 높다. Fig. 2A는 고분자 아세틸알긴산의 NMR 스펙트럼으로 \( 2.2 \mathrm { ppm } \) 정도에서 아세틸기를 확인할 수 있었으나 점성이 높아 구성성분인 mannuronate에 의한 signal은 구별할 수가 없었다. 점성을 낮추고 NMR의 해상도를 높이기 위하여 산가수분해를 행한 결과 Fig. 2B와 같이 mannuronate의 \( \mathrm { C } \)-1에 결합된 proton signal ( \( \mathrm { M } \)-1, \( 4.8 \text { - } 4.6 \mathrm { ppm } \)), mannuronate의 \( \mathrm { O } \)-아세틸기(- \( \mathrm { OCOCH_3 } \))가 결합된 \( \mathrm { C } \)-2와 \( \mathrm { C } \)-3의 proton signal ( \( \mathrm { M } \)-2' 및 \( \mathrm { M } \)-3')을 확인할 수 있었으며 \( 2.2 \mathrm { ppm } \)에서 아세틸기도 확인할 수 있었다. ATCC39324 아세틸 알긴산으로부터 알칼리 가수분해를 행하여 얻은 탈아세틸 알긴산의 NMR 스펙트럼은 Fig. 2C와 같이 \( \mathrm { O } \)-2 및 \( \mathrm { O } \)-3 에 결합되어 있던 아세틸기가 제거되어 \( \mathrm { M } \)-2' 및 \( \mathrm { M } \)-3' peak가 없어지고 \( 2.2 \mathrm { ppm } \)에서 보이던 아세틸기도 나타나지 않았다. 또한 P. aeruginosa 탈아세틸화 알긴산은 Fig. 2D에 보이는 해조류 유래 polyM-block의 NMR 스펙트럼과 유사하였으며 이로 부터 P. aeruginosa ATCC 39324유래 알긴산은 아세틸기가 결합한 mannuronan임을 알 수 있었다. 알긴산을 생성하는 또 다른 박테리아인 A. vinelandif는 P. aeruginosa와는 달리 guluronate가 \(67 \text { - } 93 \% \) 함유되어 있고 아세틸기는 mannuronate에만 결합되어 있다고 하였다.</p> <h2>MJ-3 AcAlgE와 KS-408 lyase에 의한 아세틸알긴산의 분해</h2> <p>본 실험실에서는 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 genomic DNA library로부터 알긴산 오페론 유전자를 분리하였으며 염기서열을 분석한 결과 아세틸자일란 가수분해효소(acetylxy-lan esterase)와 상동성을 가지는 유전자가 포함되어 있었고 이 유전자로부터 발현된 효소(AcAlgE)는 실험결과 4-methylumbelliferyl acetate를 가수분해하는 esterase 활성을 가지며 아세틸알긴산의 아세틸기를 가수분해하는 효소활성이 있음을 보고한 바 있다. AcAlgE의 활성을 측정하기 위하여 기질은 고분자 아세틸알긴산과 저분자 아세틸알긴산을 사용하였으며 효소액은 MJ-3 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소 유전자를 과발현 시킨 대장균의 lysozyme 균질액을 사용하였다. Fig. 3에서와 같이 고분자 아세틸알긴산은 점성이 너무 높아 효소의 접근성이 떨어져 D-mannuronate 와 D-mannuronate의 \( \beta \)(1-4) 결합을 분해하는 KS-408 알긴산 분해효소만 처리하였을 때(KS-408 only) 불포화 oligouronate의 생성이 낮은 것에 비해 산가수분해로 얻은 저분자 아세틸알긴산은 KS-408 알긴산 분해효소에 의해 2.6배의 불포화 oligouronate가 생성되었다. KS-408 알긴산 분해효소는 아세틸기가 결합되지 않은 \( \mathrm { M } \text { - } \mathrm { M } \) 결합을 분해하므로 아세틸기가 결합되어 있는 Ac \( \mathrm { M } \)-Ac \( \mathrm { M } \)은 분해하지 못한다. 먼저 MJ-3 AcAlgE 효소로 아세틸알긴산의 아세틸기를 제거한 다음 KS-408 알긴산 분해효소로 10분 동안 반응시켰을 경우(AcAlgE + KS-408) KS-408분해효소만 처리하였을 때 보다 알긴산의 분해가 잘 되었음을 알 수 있었다. 또한 고분자 아세틸알긴산은 점성이 높아 저분자 아세틸알긴산보다 AcAlgE에 의한 아세틸기 제거가 쉽지 않고 따라서 이후의 KS-408 첨가 결과 불포화 oligouronate의 생성도 낮은 것을 알 수 있었다. 과일의 pectin이나 식물의 세포벽 구성성분인 xylan 등은 acetylgalacturonan methylester 또는 acetylxylan 등으로 되어있다. Biely 등은 acetylxylan을 xylanase로 완전히 분해할 수 없어 바이오연료로 응용하기 위해서는 먼저 xylan acetylesterase로 분해하여 당분해효소(xylan 분해효소)의 효율을 높일 수 있다고 하였다. 또한 과일에 병을 일으키는 균들이 pectin을 에너지원으로 사용하기 위하여 pectin acetylesterase, pectin methylesterase, galacturonan lyase 등을 가지고 있다고 하였다. Acetylxylan을 효율적으로 분해하기 위하여 xylan 아세틸기 가수분해효소를 처리하는 것과 같이 병원성균 P. aeruginosa가 분비하는 아세틸 알긴산도 먼저 아세틸기를 제거한 다음 알긴산 분해효소를 처리하였을 때 효율적으로 분해되었음을 알 수 있었다.</p>	생명
국내 자생 향장식물 에탄올 추출물의 항균 효과	<h1>고찰</h1> <p>식물에 존재하는 천연물질은 인간의 건강을 유지하거나 질병을 치료하기 위하여 예로부터 전통적으로 다양하게 이용되어 왔고, 최근 들어서는 morphinem ephedrine 등과 같이 천연물질에서 유래한 의약품이 질병치료에 널리 응용되고 있다. 본 연구는 항균제로 널리 알려진 향장 식물을 에탄올로 추출하여 피부병을 유발시키는 병원성 미생물 중 P.aeruginosa, S. aureus, C. albicans, M. furfur, P. acenes를 선정하여 항균활성도를 측정하여 확인되지 않았던 천연 항균물질의 가능성을 검토하였다.</p> <p>그 결과 황련, 오배자, 작약, 지유, 황금, 찔레, 스테비아, 단삼, 때죽나무, 창포, 후리자아, 생강나무, 구절초, 학술, 고삼, 관중에서 강한 항균력을 보였다. 그 중 5가지 균 모두에서 항균력을 보인 황련(Coptis chinensis)은 많은 연구를 통해 berberine이라는 성분을 확인하여 항균력을 나타내는 성분이라는 것을 밝혀냈다. Berberine이라는 성분은 세균의 탄수화물 대사를 억제하고 세균의 단백질 합성도 억제하는 것으로 알려졌다. 또한 균체 내의 DNA와 복합체를 형성하여 DNA 복제에 영향을 미쳐 세균의 생장과 번식을 억제하여 항균력를 나타내는 것이다. 또한 단독으로 사용하였을 때보다 감초와 흔합하여 추출하였을 때 생성되는 침전물이 수종의 그람양성세균과 그람음성세균에 대해 나타내는 항균력이 합성방부제와 유사하게 나타났다고 알려져 있다.</p> <p>C. albicans 종을 제외한 실험균주 모두에서 오배자와 작약이 항균력을 나타냈다. 2가지 이상의 균에 대해서는 지유, 황금, 찔레(Rosa multiflora), 스테비아(Stevia rebaudiana), 단삼에서 항균력을 나타냈다. 지유(Sanguisorba officinallis L.)와 오배자(Galla rhois)에는 탄닌산이라는 성분이 함유되어있는데 이 성분 때문에 항균력을 나타낸다. 지유에는 탄닌산 외에도 항균 유효 성분이 들어있는데 주로 껍질에 분포되어 있으며, 황색포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴구균, 장티푸스균 등에 대하여도 뚜렷한 억균작용과 살균작용이 있다고 보고되었다. 황금(Scutellaria baicalensis Geogri.)과 관중(Cinnamomum cassia Blume)의 성분 중에는 flavonoid의 일종인 바이칼린이라는 성분이 함유되어 있다. 이는 항균작용, 항진균작용뿐만 아니라, 해열작용, 이뇨작용, 항바이러스 작용, 등이 알려져 있다. 뿐만 아니라 flavonoid 계열의 색소 성분 중 안토시아닌계 색소는 유색미, 자색고구마, 포도, 오디(Morus bombycis), 적환무우, 맨드라미꽃, 나무딸기, 버찌, 들깻잎 등에 많이 함유되어 있다. 안토시아닌계 색소는 항균력을 나타낼 뿐만 아니라 항노화, 망막 장애 치료 및 시력 개선에도 효과가 있으며 Mouse 실험 결과 Mouse 피부의 종양세포의 생장을 지연시킨다고 알려져 있다. 단삼(Slavia miltorrhiza Bunge)은 phenol성 화합물이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이는 항균, 소염, 항암 등에 효과가 있다고 알려져 있다.</p> <p>때죽나무(Styrax japonica), 창포, 후리지아(Freesia refracta), 오디, 생강나무(Lindera obtusiloba), 구절초, 학술(Carpesium abrotanoides L.), 고삼(Sophora angustifolia Sieb), 관중이 S. aureus와 P. acenes에 대해 항균력을 나타냈다. 창포(Acorus calamus)에는 방향성 정유물질이 함유되어 있고, 방향성 건위 성분을 추출하여 의약품을 제조해 내고 있으나, 항균력을 나타내는 성분으로 규명되지 않았다. 하지만 본 실험 결과는 방향성 정유물질 중에 항균력을 나타내는 물질이 함유되어 있을 가능성을 시사한다. 구절초(Chrysanthernum zawadskii)는 luteolin과 acacetin이 함유되어 있다. 이의 화학물질은 항암효과가 있다고 규명되어 있으나 항균효과를 나타내는 성분에 대해서는 규명되지 않았다. 그러나 본 실험 결과는 구절초에도 항균효과를 나타내는 성분이 포함되어 있음을 시사한다.</p> <p>산초(Zanthoxylum schinifolium)의 잎에는 hexadecannoic acid라는 물질이 함유되어 있는데 이러한 성분 때문에 산초가 항균력을 나타낸다고 알려져 있다. 하지만 본 실험에서는 항균력을 나타내지 않았다. 다른 연구에 의하면 물 추출물에서는 약하게, chloroform 추출물은 강하게 항균효과를 나타냈지만 에탄을 추출물에서는 항균효과를 나타내지 않았다고 알려져 있다. 이는 항균력을 나타내는 hexadecannoic acid 성분이 분석한 후 물과 chloroform에는 항균효과를 나타내지만 에탄올에 의해서는 항균효과를 보이지 못하는 것이 아닌가 생각된다.</p> <p>실험 결과, 향장식물의 추출물은 황련은 S. aureus, C. albicans에서 단삼은 P. aeruginosa에서, 황금은 C. albicans에서 합성방부제보다 항균력이 높게 나타났다. 특히 오배자는 P. acnes에서 항균력이 가장 강하게 나타나는 것으로 보아 혐기성 환경에서 성분이 가장 뛰어나게 반응할 것이라고 추측할 수가 있었다. 앞으로는 더 나아가 향장 식물의 항균력을 나타내는 성분을 분석하고, 추출물의 조건에 대한 항균력의 변화에 대한 연구 진행하여, 그 효능을 증진시키기 위한 연구와 성분 분석 및 효능에 대한 연구를 진행하여 기존에 사용하고 있는 합성 방부제의 대체 물품으로 사용할 수 있음을 보여주고 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물</h2> <p>본 실험에 사용된 향장 식물 및 한약재는 Table 1에 제시하였다. 이들로부터 에탄올로 추출한 추출물은 (주)핀에서 준비한 것을 제공받아 사용하였다.</p> <h2>균주배양 및 배지</h2> <p>항균활성측정을 위해 사용한 균주는 그람 음성균 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (P. aeruginosa), 그람 양성균 Staphylococcus aureus ATCC 6538 (S. aureus), Candida albicans ATCC 10231 (C. albicans), Malassezia furfur ATCC 44338 (M. furfur), 혐기성 세균인 Propionibacterium acnes ATCC 6919 (P.acnes)로 한국 세포주 은행(ATCC)에서 구입하였으며 생육배지로는 Tryptic Soy Agar (TSA, Difco U.S.A.), Patato Dexrose Agar (PDA, Difco U.S.A.), Dixon's Agar (DA, Difco U.S.A.), Brain Hart infusion Agar (BHIA, Difco U.S.A.)를 사용하여 배양하였다.</p> <h2>항균 활성 실험</h2> <p>항균 활성 실험은 한천배지확산법(paper disk diffusion method)을 이용하여 측정하였다. 사면 배양하여 보관중인 시험균주를 여러 번 계대 배양하면서 활성화시켰다. 최적 배지, 온도에 접종하고, 각각의 실험균주 \( 300 \mathrm {\mu l } \left (6 \times 10 ^ { 7 } \mathrm { CFU } / \right . \mathrm { ml } \) )씩을 도말하였다. 완전히 굳은 배지 위에 지름 \( 6 \mathrm { mm } \) filter paper disk를 배지 위에 올려놓고, 추출물을 \( 25 \mathrm {\mu l } \)씩 점적하였다. 각 균주의 최적배양조건에서 배양한 후 dick 주위의 생육저해환(clear zone)의 크기로 항균활성을 측정하였다. 이때 양성대조군으로 페녹시에탄올 \( 20 \mathrm {\mu l } \)를 동일한 방법으로 항균력을 측정하고 다양한 추출물들의 효과를 양성대조군에 대한 백분율로 구하였다.</p> <h1>결 과</h1> <p>본 연구는 항균력이 우수한 천연 항균력 물질을 검색하여 응용제품에 적용할 수 있도록 항균제로 널리 알려진 향장 식물을 에탄올로 추출하여 피부병을 유발시키는 병원성 미생물 중 P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans, M. furfur, P. acenes를 선정하여 항균활성도를 측정하였다.</p> <p>양성 대조군인 페녹서에탄올을 처리한 군에서의 저해존의 크기에 대한 실협군의 상대적 비율을 분석한 결과 P. aeruginosa에 대해서는 단삼과 오배자에서 강한 항균력이 나타났으며, S. aureus에 대해서는 소나무추출물 등이 어느 정도의 항균성을 나타냈다. 이러한 항균 실험을 다양한 향장식물 및 한약재의 에탄올 추출물에 대해 반복 수행하여 통계적인 의미성을 분석하고 그 결과를 Table 3에 제시하였다.</p> <p>P. aeruginosa에 대해서는 양성 대조군에서 보인 저해존에 대해 단삼의 경우 \(97 \% \), 황련의 경우 \(84 \% \)에 해당하는 항균력이 보였고, 그 외에도 작약, 스테비아, 때죽나무, 후리지아, 생강나무, 뽕나무, 오배자, 지유, 황금에서 항균력이 나타났다. S. aureus에 대해서는 오배자, 황련, 단삼이 가장 강한 항균력을 나타났는데 이는 양성 대조군에서 보인 저해존의 오배자의 경우 78%,황련의 경우 \(99 \% \), 단삼의 경우 92%에 해당하였다. 또한 작약, 찔레, 스테비아, 창포, 후리지아, 오디, 생강나무, 구절초, 고삼, 관중, 지유, 황금, 은행나무, 소나무, 인동초, 이나무에서 항균력을 나타냈다. C. albicans에 대해서는 황금의 경우 \(35 \% \), 황련의 경우 \(33 \% \)의 항균 활성을 보였다. M. furfur에 대해서는 오배자에서 가장 강한 항균력이 나타났는데 양성 대조군에서 보인 저해존의 \(57 \% \)에 해당하였으며 그 외에도 작약, 찔레, 황련, 진피, 목단피에서 항균력이 나타났다.</p> <p>P. acnes에 대해서는 황련, 단삼, 오배자, 작약에서 가장 강한 항균력이 나타났다. 이는 양성 대조군에서 보인 저해존의 황련과 단삼의 경우 \(99 \% \), 오배자의 경우 \(87 \% \) 에 해당하였으며, 작약의 경우 꽃에서 추출한 경우 \(89 \% \), 줄기에서 추출한 경우 \(35 \% \), 뿌리에서 추출한 \(22 \% \)에 해당하였다. 또한 찔레, 스테비아, 창포, 오디, 오이, 은방울꽃, 생강나무, 구절초, 고삼, 관중, 지유, 후박에서도 항균력이 나타났다. 이상의 결과에서 지리산 자생식물 중에서는 작약, 찔레,생강나무, 구절초, 소나무에서, 한약재 중에서는 황련, 오배자, 지유, 단삼, 황금에서 강한 항균력을 보였다. 하지만 생강나무의 줄기, 계피, 박하, 청미래덩굴, 산초, 복분자는 모든 균에서 항균력을 나타내지 않았다.</p> <h1>서 론</h1> <p>인간은 오래전부터 식물들을 채취하여 식용과 약용으로 사용해왔다. 대표적으로 허브는 서양에서부터 국내까지 널리 향신료로 사용하고 있으며 그 외에도 우리나라에서는 솔잎, 마늘, 파, 고추 등을 천연 향신료로 사용하고 있다.</p> <p>천연 항균물질에는 전통적으로 사용해 온 소금, 식초 등 일반 식품소재 외에도 동물, 식물, 미생물 등에서 유래한 것들이 많이 있으나, 식품에 적용하기 위해서는 관능적인 측면에서 해결되어야 할 문제가 남아있는 것도 있고, 항균력이 약하거나 항균 스펙트럼이 좁아 아직까지 천연 항균제로 개발되어 상품화된 제품은 극히 일부에 지나지 않고 있다. 생약제와 식용식물, 향신료 등은 천연 보존료를 개발하기 위한 좋은 소재가 되며 항균제 및 방부제의 실험이 활발하게 이루어지고 있는데 황금, 오배자, 감귤, 황백, 허브, 자몽, 도꼬마리, 고삼, 연교 등의 추출물은 이미 책이나 논문 더욱 나아가 시장 등을 통해서 각각의 특정 미생물에 대한 항균력을 나타낸다는 사실이 알려겨 있다. 특히 황금과 관중, 오디에서 추출된 flavonoid, 황백이나 황련 등에서 추출된 berberin, 감귤과 과피에 포함된 hesperidin 등의 성분이 항세균 효과를 가지며, 충치 유발균인 Streptococcus mutans 증식억제 효과를 가진 생약제 및 향신료, 초피 추출물의 항암효과, 심황으로부터 분비된 phenol 화합물의 항암효과 등 다수가 보고 된 바 있다. 또한 녹차를 비롯한 식품 중에 함유된 성분을 분리하여 항균, 항암 및 각종 생리기능 효과에 관한 수많은 연구가 수행되어 있다.</p> <p>최근 들어서는 식물의 이차대사산물들을 의약품, 향신료, 방향제, 색소, 살충제 및 화학 제품 등의 다양한 용도로 사용되고 있으며, 세계 의약품 시장의 \(25\%\)를 차지하고, 미국에서만 90억 달러 이상의 판매고 및 매년 1,600개 이상 식물 유래의 신물질이 발견되어왔다. 그러나 미용과 화장품 산업에서는 미생물의 오염을 방지하기 위해 파라벤(paraben)류, 페녹시에탄을(phenoxyethanol) 등의 화학약품 방부제를 사용하고 있는데 이들은 독성성분들을 띄고 있어 피부에 부작용을 일으킬 뿐만 아니라 미생물들의 내성을 일으켜 많이 문제 되고 있다. 이에 따른 천연성분을 이용한 항균 및 방부제의 개발 등이 활발하게 이루어지고 있다.</p> <p>본 실험은 지리산을 중심으로 자생하는 60여 종의 향장식물과 한약재돌을 에탄올로 추출하여 병원성 미생물인 Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Malassezia furfur, Propionibacterium acnes에 대한 항균력을 알아보고, 기존에 사용하는 화학적 방부제나 항균제와 비교함으로써 대체 약품으로 사용할 수 있는지에 대한 가능성을 검토하고자 하였다.</p>	생명
생쥐 비만모델에서 Weissella confusa WIKIM51 식이에 따른 지방합성 및 에너지 대사 조절로 인한 체지방 감소 효과	<h2>혈중 지질 및 간 기능 지표에 미치는 영향</h2> <p>장기간의 고지방식이는 비정상적인 지질대사를 하게 되며, 이는 이상지질혈증 및 지방간을 야기하게 된다. 고 지방식이에 의해 영향을 받는 혈액 내 중성지방(Triglyceride, TG) 및 총 콜레스테롤(Total cholesterol, TC) 증가는 대표적인 이상지질혈증이며, 혈중 GOT 와 GTP 는 간기능을 반영하는 지표로 알려져 있다. 10 주간의 고지방식이와 W . confusa WIKIM51을 급여한 마우스의 혈청 내 지질대사 및 간기능 지표 분석 결과는 Fig. 3 에 나타냈다. 정상식이군 ND 에 비해 HFD 군의 혈중 TG, TC 의 수준이 상당히 증가된 반면, WIKIM51 섭취군에서 유의적인 감소를 확인하였다. 특히, 혈중 TG 의 함량은 ND 군과 비슷한 수준까지 감소되었으며, 유산균의 농도 의존적인 양상을 보였다. 또한, WIKIM51 섭취군은 혈중 glucose와 간기능 지표 인 혈중 GOT와 GPT를 개선시켰다. 혈중 BUN 은 간에서 단백이 분해될 때 생기는 노폐물로, 신장을 통한 제거로 혈중 농도를 조절하게 된다. 즉, 신장 기능의 지표가 되는 혈중 BUN 은 모든 군 간의 차이를 보이지 않았다. 이 는 10 주간의 고지방식이 및 W. confusa WIKIM51의 섭취가 신장기능 이상을 초래하지 않고, 체중 증가 억제 효능을 나타내는 것으로 사료된다.</p> <h2>부고환 주위 복부내장지방에 미치는 영향</h2> <p>고지방식이를 통하여 비만을 유도한 C57BL/6 마우스에 W. confusa WIKIM51을 경구 투여했을 때, 부고환지방의 무게에 미치는 영향을 확인하였다. 부고환지방의 무게는 HFD 군과 비교하였을 때, W. confusa WIKIM51섭취에 따라 유의적인 차이로 감소되었다. 적출한 부고환 지방조직을 고정하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 통하여 지방의 형태학적 관찰을 수행한 결과는 Fig. 4B 와 같다. 정상식이를 한 ND 군에 비해 고지방식이를 한 HFD 군에서 부고환 지방세포의 크기가 커진 반면, WIKIM51 섭취군에서는 ND 군과 유사하게 지방세포의 크기가 감소한 경향을 보였다.</p> <p>고지방식이에 의해 유도된 부고환지방의 증가를 억제하는 메커니즘을 이해하기 위해 부고환 지방 형성 과정에 관여하는 지질대사 관련 주요 전사조절인자인 \( P p a r \gamma, C / E B P \alpha \), Srebp-1c, Fas, 그리고aP2 의 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과, ND 군 대비 HFD 의 부고환 주위 복부내장지방에서 발현하는 지방 대사 관련 유전자의 발현이 유의적으로 증가 되었다. 반면, WIKIM51 섭취에 따라 지방산 합성에 관련된 \(Ppar \gamma, C / E B P \alpha, S r e b p-1 c \), 그리고 \( F a s \) 의 발현이 유의적으로 감소되었으며, WIKIM51 유산균 섭취 농도의존적인 양상을 보였다. 또한, 지방세포에서 주로 발현되는 지 방산의 운반 단백질인 \( a P 2 \) 및 \( \beta \)-산화( \( \beta \)-oxidation)에 관련된 \( \operatorname { Pgcla } , \operatorname { Ppar } \alpha \), 그리고 \( \operatorname { Cpt } 1 \) 의 발현이 유의적으로 개선되었다. 실제로 지방세포에서 분비되는 지방대사, 에너지 항상성 및 인슐린 감수성 조절을 통해 비만 관련 대사 질환의 주요 영향인자로 알려진 adipokine 및 endocrine 호르몬의 수준을 확인한 결과, WIKIM51 섭취군의 혈중 adiponectin, leptin, 및 insulin의 함량이 HFD 군에 비해 유의적인 개선 효과를 보였다. 이 결과는 앞서 보았던 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 혈청 내 지질함량의 수준이 감소된 효과와 일치하며, 유산균의 섭취가 지질 대사 관련 유전자의 발현 조절 및 에너지 대사 활성을 통해 지방축적을 억제하는 것으로 사료된다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>3T3-L1 전지방세포의 지질 축적에 미치는 영향</h2> <p>3T3-L1 전지방 세포가 지방세포로 분화됨에 있어 W.confusa WIKIM51 유산균의 지방세포 분화에 미치는 영향을 알아보았다. WIKIM51 유산균은 \( 2.5 \times 10 ^ { 7 } - \) \( 1 \times 10 ^ { 8 } \mathrm { CFU } / \) well 용량으로 처리하였으며, 지방세포 분화를 유도한 후 Oil red O 염색법을 이용하여 지방 축적 정도를 측정하였다. 그 결과, 대조군 대비 WIKIM51 처리군에서 각각 약 \( 60 \%, 78 \% \), 그리고 \( 80 \% \) 이상의 지방축적 억제능을 확인하였다.</p> <p>전지방 세포에서 지방세포로 분화하는 과정에는 지방 축적에 의한 지방구 생성의 형태학적 변화뿐만 아니라 지방세포 분화와 관련된 인자들의 발현이 나타난다. 지방축적을 억제하는 메커니즘을 이해하기 위해 지방 분화에 관여하는 전 사인자인 peroxisome proliferator-activated receptor- \( \gamma \) (Ppar \( \rangle \) ), CCAAT/enhancer-binding protein- \( \alpha(C / E B P \alpha) \), sterol regulatory element-binding protein-1c (Srebp-1c), adipocyte protein 2 (aP2), fatty acid syntheas (Fas), Stearoyl-CoA desaturase1 \( (S c d 1) \), Type I Diacylglycerol acyltransferase (Dgat1), Type II Diacylglycerol acyltransferase \( ( \operatorname { Dgat } 2) \) 의 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과, 지방세포를 분화시킨 대조군 대비 WIKIM51 처리군의 지방세포에서 발현하는 지방 대사 관련 유전자의 발현이 유의적으로 감소되었으며, 용량에 의존적인 양상을 보였다. 이를 통해 W. confusa WIKIM51은 주요 유전자들의 발현을 억제함으로써 세포 내 지질 축적을 감소시킬 수 있었던 것으로 판단 되어진다.</p> <h2>체중증가 및 식이 섭취량에 미치는 영향</h2> <p>3T3-L1 지방세포에서 지질 축적을 감소시키는 W. confusa WIKIM51의 in vitro 결과를 바탕으로 고지방식이로 유도된 비만 마우스 실험모델을 이용하여 항비만 효능을 평가하였다. 실험동물은 고지방식이를 공급하여 비만을 유도함과 동시에 W. confusa WIKIM51 유산균 (in vitro 실험에서 사용한 것과 동일한 제제)의 생균수가 다른 2 개의 군을 설정하여, \( 1 \times 10 ^ { 9 } \mathrm { CFU } / \mathrm { head } / \) day (WIKIM51(9))와 \( 1 \times 10 ^ { 10 } \mathrm { CFU } / \) head/day (WIKIM51(10))의 용량으로 경구투여하였다. W. confusa WIKIM51이 체중증가 및 식이섭취량에 미치는 영향을 확인하기 위해 10 주간 고지방식이를 공급하며 관찰하였다. 그 결과, 고지방식이군(HFD) 보다 유산균 WIKIM51 섭취군에서 체중 증가량이 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다. 하지만, 용량을 달리한 W. confusa WIKIM51을 경구 투여한 군 간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 군 간의 식이 섭취량은 모든 군에서 차이를 보이지 않았으며, 이는 체중증가 억제 효능이 식이 섭취량 감소에 기인한 것이 아님을 나타낸다. 이 결과는 W. confusa WIKIM51의 섭취가 체중 증가를 억제할 수 있는 체중 조절제로서의 가능성이 있음을 시사한다.</p> <h2>체중 및 사료 섭취량 측정</h2> <p>체중은 주 1 회 일정한 시간에 측정하였으며, 예비사육 직 후의 체중을 초기(initial) 체중으로 하고 10 주 후의 체중을 마지막(final) 체중으로 하여 체중 증가량을 계산하였다. 식이는 주 2 회 동일한 시간에 공급하였고, 전에 남은 사료의 양과 새로 공급한 사료의 양을 측정하여 그 차이로 사료 섭취량을 계산하였다.</p> <h2>해부 및 장기 무게 측정</h2> <p>실험 종료 전, 실험동물은 최소 12 시간 절식시킨 후 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스 흡입 안락사 방법으로 희생하였다. 복부를 개복한 다음, 하대정맥에서 채혈하였다. 채혈된 혈액은 \( 2,500 \mathrm{rpm} \) 에 서 20 분간 원심분리하여 혈청을 분리한 뒤 실험에 사용하였다. 간, 부고환 지방은 적출하여 생리 식염수에 세척하고, 여과지로 수분을 제거한 후, 중량을 측정하였다. 혈청 및 조직은 분석 직전까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) deep freezer에 보관하였다.</p> <h2>혈청 생화학적 분석</h2> <p>혈청 중의 total cholesterol (TC), triglyceride (TG), glucose (Glu), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT), BUN은 자동 생화학 측정기(FUJI DRI-CHEM 7000i, Fujifilm, Japan)를 이 용하여 측정하였다.</p> <h2>혈청 Adipokine 분석</h2> <p>혈청 중의 adipokine인 adiponectin, leptin, insulin의 함량은 Bio-Plex Pro Mouse Diabetes Assay 8-plex (Bio-rad) 를 사용하여 Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader에서 측정하였다.</p> <h2>조직학적 분석</h2> <p>부고환 지방을 적출하여 생리식염수로 세척하고, \( 10 \% \) 중성포르말린에 고정하였다. 고정된 조직은 파라핀 블록을 제작하여 \( 5 \mu \mathrm{m} \) 두께로 절편하고, hematoxylin과 eosin (H\&E) 염색을 실시하였다. 염색된 부고환 지방조직은 광학현미경 (200×; Olympus DP 73)으로 관찰되었다.</p> <h2>장내 미생물 군집 분석</h2> <p>맹장을 적출한 후, 액제질소에 급속 동결시켜 \( -150^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. Genomic DNA는 FastDNA Spin Kit (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 추출하고, 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하고, \( 250 \mathrm{bp} \) 이상의 DNA가 선별되었다. Illumina MiSeq (Illumina, USA) 장비를 사용하여 염기서열 정보를 확보하였으며, EzBioCloud software (Chunlab, Inc., Korea)를 이용하여 분석하였다.</P><h2>통계처리</h2> <p>모든 분석결과는 GraphPad Prism (Version 6.0, GraphPad Software Inc., USA)을 이용하여 평균 \( \pm \) 표준편 차로 표시하였고, 각 군간의 통계적 유의성 검증은 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였다. 장내 미생물과 비만 관련 지표 사이의 상관관계는 Pearson을 이용하여 분석하였다. 실험군 간의 유의성은 \( p<0.05, p<0.01 \), 그리고 \( p<0.001 \) 수준에서 검증하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>Weissella confusa WIKIM51 유산균 분리 및 준비</h2> <p>민들레 김치 유래 W. confusa WIKIM51은 한국미생물보존 센터에 미생물 특허기탁(KCCM11914P) 되어 있으며, 본 실 험에 사용된 W. confusa WIKIM51은 식품 및 식품 첨가물 공 전에 등록된 개별 조성물을 이용한 혼합배지에 전 배양과 본 배양을 거쳐 회수된 균체를 동결건조 보호제와 혼합하여 동 결건조 한 분말을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하며 실험에 이용하였다.</p> <h2>3T3-L1 전지방세포주의 배양 및 분화유도</h2> <p>3T3-L1 전지방세포주를 \( 10 \% \) calf serum (CS)와 100 unit/ml의 페니실린과 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 스트렙토마이신을 함유 한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, \( \mathrm{USA} \) ) 배양액을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 가 유지되는 배 양기에서 배양하였다. 이때 배지를 교환할 때마다 phosphatebuffered saline (PBS) 용액을 사용하여 세포표면을 세척하 였고, 신선한 \( 10 \% \mathrm{CS} \) 배지를 포함하는 DMEM 배양액으로 교환하였다. 세포가 단일층으로 플라스크 바닥에 \( 80 \% \) 정도 부착하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하여, \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA (Gibco) 용액을 첨가한 뒤 원심분리 하였다. 이들 세포를 6-well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) cells을 균등하게 분주하 였으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)와 100 unit/ml의 페니실린과 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배양액을 사용하였다. \( 100 \% \) confluent stage 2 일 후, \( 10 \% \) FBS를 함유한 DMEM 배양액에 adipogenic cocktail인 dexamethasone \( 0.05 \mu \mathrm{M} \), IBMX \( 0.25 \mathrm{mM} \), 인슐린 \( 2 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 이 함유된 배양액으로 교환하여 3 일 분화를 유도하였다. 3 일 후 배양액 교환 시 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 인슐린만을 포함하는 \( 10 \% \) \( \mathrm{FBS} \) 를 함유한 DMEM 배양액으로 3 일간 처리하였고, 마지 막 3 일간은 \( 10 \% \mathrm{FBS} \) 를 함유한 DMEM 배양액을 사용하 였다.</p> <h2>지질 축적량 측정(Oil Red O staining)</h2> <p>시료들이 지방분화과정에서 지방축적(lipid accumulation) 정도에 미치는 효과를 알아보기 위해 Oil Red O 염색을 실 시하였다[21]. \( 100 \% \) confluent stage 2 일 후, adipogenic cocktail 첨가 배양액, insulin 첨가 배양액, FBS 배양액 교 환 시, 시료들을 농도별로 처리하였으며, 9 일의 분화 후 배 양액을 제거하고 \( \mathrm{PBS} \) 로 세척한 다음 \( 10 \% \) 포름알데히드로 10 분간 고정시켰다. \( 10 \% \) 포름알데히드를 제거하고 다시 포 화된 포름알데히드를 넣어 1 시간 이상 세포를 고정시켰다. 그 후 \( 60 \% \) isopropanol을 넣고 바로 제거한 후 증류수로 세 척하고 Oil Red O 염색용액으로 30 분간 지방구를 염색한 후 증류수로 세척하였다. 염색된 지방구의 세포 내 지방축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안적으 로 시료들이 지방분화 시 지방축적에 미치는 영향을 관찰하 였다. 축적된 지방 확인을 위해 잘 건조된 상태에서 isopropanol을 첨가하여 Oil Red O dye를 용출한 뒤 multiplate reader를 사용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였 다. 이때 isopropanol을 blank로 사용하였다.</p> <h2>3T3-L1 지방세포 및 조직 내 유전자 발현 측정(Real-time PCR)</h2> <p>Real-time PCR 방법을 통해 유전자 발현을 측정하였다. 3T3-L1 지방세포 및 지방 조직 내 total RNA는 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 분리하고, UV/ visible spectrophotometer를 이용하여 정량하였다. 각각의 분리된 RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \) 을 TOPscript \( { }^{\mathrm{TM}} \) cDNA Synthesis kit (Enzynomics, Korea)와 S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)을 사용하여 \( \mathrm{cDNA} \) 를 합성하였다. 합성된 \( \mathrm{cDNA} \) 를 각 각의 primer (Table 1), nuclease-free water, TOPreal \( { }^{\mathrm{TM}} \) qPCR 2x PreMIX (SYBR Green)를 넣고 BioRad CFX-96 Real Time System (Bio-Rad)을 이용하여 증폭하였다. Realtime quantitative PCR의 조건으로서: initial denaturation 은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분, 그리고 40 cycles을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초간 수행하였다.</p> <h2>실험동물 사육 및 식이</h2> <p>본 연구에서 수행된 동물실험은 세계김치연구소 동물윤리 위원회의 승인을 받아 진행하였다(WIKIM IACUC 202034). 실험동물은 생후 5 주령의 수컷 \( \mathrm{C} 57 \mathrm{BL} / 6 \) 마우스를 (주)오리엔 트바이오(Korea)에서 구입하였다. 상업용 고형사료로 7일간 사육환경에 적응시킨 후, 정상식이군(ND), 고지방식이 대조 군(HFD), W. confusa WIKIM51 \( 1 \times 10^{9} \mathrm{CFU} \) 섭취군, W. confusa WIKIM51 \( 1 \times 10^{10} \mathrm{CFU} \) 섭취군 총 4 개의 군으로 분리하였다. 실험동물은 물과 실험식이를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 실험식이는 Research Diets (New Brunswich, USA)의 AIN-95 식이를 변형하여 정상식이 (Normal diet, ND; \( 10 \% \) fat kcal)와 고지방식이(High fat diet, HFD; \( 45 \% \) fat kcal)를 구입하여 섭취하도록 하였다. 실험동물에 적용한 유산균 W. confusa WIKIM51은 매일 PBS 에 현탁하여 경구투여하면서 10 주간 사육하였다. 실험 환경 은 온도 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \pm 5 \% \) 로 유지하였고, 12 시간 명암 주기로 일정하게 유지되는 동물 사육실에서 수행하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>현대사회에서 비만은 흔한 질환이지만, 대사증후군, 고혈 압, 심장병, 암, 수면장애 등의 합병증을 유발할 수 있는 심각한 건강문제로 전 세계의 공중 보건을 위협하고 있다. 비만은 만성적인 잉여 에너지가 체지방의 형태로 축적되는 현상으로 단순하게 체중이 증가하는 것이 아닌 지방세포의 과도한 증식 및 분화를 야기함으로써 체중이 증가된 상태를 말한다. 체내 지방의 축적을 유발하는 환경적 요인 중에는 고지방 및 고단백 식이를 하는 서구화된 식생활 습관이 주요원인으로 간주되고 있다.</p> <p>최근, 차세대 염기서열분석(NGS) 기술의 발전으로 인체에 존재하는 미생물에 대한 많은 연구가 진행되고 있으며, 비만과 장내 마이크로바이옴의 관련성을 입증하려는 연구 또한 활발하게 진행되고 있다. 장내 마이크로바이옴은 숙주의 식 생활과 밀접하게 연관되어 있으며, 비만은 장내 미생물의 군집 및 기능의 변화를 초래하여 장내 미생물 불균형(dysbiosis) 으로 이어질 수 있다고 보고되고 있다. 실제로 비만 마우스의 장내 미생물을 정상 또는 무균 마우스에 이식하자 체중 증가 및 대사 장애가 발생하였으며, 이는 장내 미생물이 식이 에너지 이용과 지방 및 간 조직의 지방산 대사 조절과 관련이 있다고 보고되고 있다. 따라서 장내 미생물 군집의 조절은 비만 개선에 있어 대사 장애에 대해 독성이 없고, 안전한 잠재적 치료법이 될 수 있다.</p> <p>프로바이오틱스(probiotics)란, 사람을 포함한 동물의 위장 관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 의미한다. 프로바이오틱스의 유익한 효과는 장내 균총의 개선, 정장작용, 항비만, 항암, 면역활성 등이 보고되고 있음에도 불구하고 프로바이오틱스에 대한 전반적인 이해는 부족한 실정이다.</p> <p>김치는 다양한 원부재료와 부재료로 만든 한국의 전통 발효 식품이다. 특히, 김치의 발효는 다양한 유산균에 의해 이루어지며, 그 중 Weissella는 초기 또는 중기 발효단계에서 다량 존재하는 우점균이다. Weissella 속의 유산균의 정장작용 및 면역 증강 효과는 이미 잘 알려져 있으나, 비만 관련 연구는 매우 미비한 실정이다.</p> <p>따라서, 본 연구는 고지방식이로 비만을 유도한 동물실험을 통해 김치 유래 유산균 Weissella confusa WIKIM51이 지질대사에 미치는 영향을 통해 항비만 효과를 평가하였다. 그 결과, W. confusa WIKIM51은 고지방식이로 유도된 체중 증가, 부고환 지방의 축적, 지방 대사 관련 유전인자의 발현을 억제하였으며, 비만으로 인한 장내 미생물의 불균형이 개선되는 효과를 확인하였다.</p> <h2>장내 미생물군집 변화에 미치는 영향</h2> <p>인체 내에 존재하는 미생물 중 약 \( 95 \% \) 미생물이 위장관 내에 서식하고 있으며, 숙주의 식생활에 영향을 받아 비만과 같은 대사질환은 장내 미생물 군집의 불균형을 일으키게 된다. 따라서 고지방식이에 의해 유도된 장내 미생물 군집의 불균형 개선 효과를 평가하기 위해 항비만 효능이 가장 뛰어난 WIKIM51(10) 섭취군의 맹장(cecum) 내 미생물군집 분석을 수행하였다. 군당 5 마리의 마우스에서 총 805,627 개의 염기서열이 얻어졌으며, 마우스 개체당 평균 53,708 개의 염기서열을 얻었다(범위 26,497-99,802). 각 군의 alphadiversity는 OTUs와 ACE 지수를 이용하여 확인하였다. W. confusa WIKIM51 섭취 시 종(species)의 풍부도를 나타내 는 OTUs와 ACE 지수가 HFD 군 대비 ND 군 수준으로 개선 되었다. 반면, 동일 군 내 존재하는 미생물의 종 간 균일성을 나타내는 Simpson 지수는 \( \mathrm { HFD } \) 군과 다르지 않았 다. 이는 특정 미생물 종의 증가 및 감소를 반영한다. Betadiversity 분석 결과는 Fig. 6B 에 나타냈다. ND 군, HFD군, 그리고 WIKIM51 섭취군 모두 각각 먼 거리에 클러스터링 되는 것으로 보아, 고지방식이와 W. confusa WIKIM51 섭취에 의해 장내 미생물 군집이 변화한다는 것을 확인할 수 있다. 모든 마우스의 시료는 Firmicutes, Bacteroidetes, Deferribacteres, Proteobacteria 및 others \(<<1 \% \) relative abundance) 총 5 개 문(phylum)으로 구성되었으며, Firmicutes (30-69 \%)와 Bacteroidetes (3-48 \%)의 비율이 가장 큰 비중을 차지했다. 비만 환자에게서 대체로 높은 Firmicutes/Bacteroidetes ( F/B ) 비율이 보고되고 있는 것과 일치하게 \HFD군의 F/B비율이 ND 군에 비해 증가하였으며, WIKIM51 섭취군에서 유의적으로 감소하였다.</p> <h2>장내 미생물군집과 비만 임상 지표 간의 상관관계 분석</h2> <p>ND군, HFD군, 및 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 특이적으로 많은 미생물을 확인하기 위해 linear discriminant analysis (LDA) effect size (LEfSe)를 사용하여 군 간의 차이를 특성화하는 LDA score 2 이상을 나타내는 종을 식별 하였다. 군 간의 차이를 보이는 장내 미생물 총 21 종 ND군 6종, HFD군 9종, WIKIM51군 6종)을 Fig. 7A에 나타냈다. Bacteroides sartorii, Muribaculum intestinale, Parabacteroides goldsteinii, 그리고 Bacteroides caecimuris 의 relative abundance가 HFD군에서 유의적으로 감소된 반면, WIKIM51 섭취군에서 증가되었다. 또한, ND군 대비 HFD군에서 유의적으로 증가된 Desuldesulfo fairfieldensis, Enterorhabdus muris, Lactococcus lactis, Anaerotruncus colihominis의 relative abundance가 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 유의적으로 감소되었다. 앞서 분석한 비만 임상 지표와 군 간의 차이를 보이는 장내 미생물 21 종의 상관관계를 분석한 결과는 Fig. 7A아래와 같다. ND군에서 증가된 미생물군은 body weight gain (BWt, \( r = -0.66 \pm \) \( 0.08 \) ), epididymal fat weight (EWt, \( r=-0.72 \pm 0.05) \), 혈중 TC \( (r=-0.65 \pm 0.08) \) 와 leptin \( (r=-0.73 \pm 0.08) \) 에 음의 상관관계를 나타냈으며, 혈중 adiponectin \( (r=0.59 \pm \) \( 0.04) \) 과는 양의 상관관계를 나타냈다. HFD군에서 증가된 미생물군은 \( \mathrm { BWt } (r=0.7 \pm 0.16) \), \( \mathrm { EWt } (r=0.7 \pm 0.15) \), 혈중 TG \( (r=0.5 \pm 0.23) \), TC \( (r=0.64 \pm 0.14) \), glucose \( (r=0.55 \pm \) \( 0.20) \), 그리고 leptin \( (r=0.68 \pm 0.14) \) 에 양의 상관관계를, 혈중 adiponectin \( (r=-0.66 \pm 0.15) \) 과 음의 상관관계를 나타내었다. 마지막으로, W. confusa WIKIM51 섭취군에서 증가된 미생물 중 Bacteroides caecimuris만 BWt \( (r=-0.81 \) ), \( \mathrm { EWt } (r=-0.7) \), 혈중 TG \( (r=-0.74) \), TC \( (r=-0.6) \), glucose \( (r=-0.55) \), 그리고 leptin \( (r=-0.75) \) 에 음의 상관관계를, 혈중 adiponectin \( (r=0.61) \) 과 양의 상관관계를 나타내었다.</p> <p>본 연구의 결과를 종합하면, 민들레 김치에서 분리된 W. confusa WIKIM51의 섭취는 지질 생합성 및 에너지 소비 조절을 통해 비만 개선효과를 나타냈으며, 이는 W. confusa WIKIM51이 건강기능식품 후보소재가 될 수 있다는 것을 제시한다.</p> <h1>요 약</h1> <p>비만은 지질대사 불균형으로 인한 이상지질혈증과 밀접한 관련이 있으며, 장내 미생물의 군집 및 기능의 변화를 유도 하여 장내 미생물 불균형을 초래할 수 있다. 본 연구에서는 민들레 김치에서 분리한 김치 유래 유산균 W. confusa WIKIM51의 항비만 효능을 in vitro와 in vivo에서 평가하였다. 먼저, WIKIM51은 지방세포 분화를 유도한 3T3-L1 세포 에서 지방대사 관련 유전자의 발현 조절을 통해 지방구 생성을 억제하였다. 후천적 비만 동물 모델을 이용한 in vivo 실험에서 10 주간 W. confusa WIKIM51의 경구 투여는 고 지방식이에 의해 유도된 체중 증가를 현저히 감소시켰다. 특히, 부고환 주위 지방량, 조직학적 분석을 통한 지방구의 크기 및 혈중 지표인 TG, TC, adiponectin, 그리고 leptin의 수준이 HFD군에 비해 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 유의적으로 개선되었다. 또한 W. confusa WIKIM51 섭취군은 산 합성 관련 유전자의 발현을 억제하였고, 반면 에너지 소비 관련 유전자 Ppar \( \alpha \) 와 \( C p t 1 \) 의 발현은 증가시켰다. 더 나아가, W. confusa WIKIM51은 고지방식이로 인해 유도된 Firmicutes/Bacteroidetes 비율을 정상식이군의 수준으로 감소시켜 장내미생물의 불균형을 개선시켰다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, W. confusa WIKIM51의 섭취는 고 지방식이로 인한 지방 축적을 억제하여 효과적으로 비만을 개선할 수 있으며, 이는 항비만 기능성 소재 및 식품 개발로의 활용이 가능함을 제시한다.</p.	생명
DGGE를 이용한 PCE 및 TCE의 혐기적 탈염소화 군집의 미생물 군집분석	<h2>염소화합물 분석</h2><p>염소화합물 분석을 위한 표준물질 TCE와 PCE는 Aldrich에서 구입하였다. 염소 화합물의 농도는 Gas Chromatography-flame ionization detector (Varian 3400CX, CA, USA)로 분석하였으며, DB-624 capillary column \( (30 \mathrm{~m} \times 0.32 \mathrm{~mm} \times 1.8 \mu \mathrm{m}\), J&W, CA, USA)을 이용하여 headspace 부분에 잔존하는 염소 화합물을 분석하였다. TCE와 PCE분석을 위한 오븐 조건은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 8분간 머문 후 \( 6^{\circ} \mathrm{C} / \)분으로 승온시켜 최종온도 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 정지하였다. 이때, 주입기와 검출기의 온도는 각각 \( 225^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 250^{\circ} \mathrm{C} \)로 설정하였다. 이상의 조건에서 VC, 1,1-DCE, cis-DCE, trans-DCE, TCE, PCE 각각의 체류시간은 각각 \(1.5, 2.21, 4.9, 3.2, 8.4, 14.6\)분 이었다. 그리고, VC, cis-DCE, TCE, PCE의 검출한계는 각각 \( 0.35,0.48,0.056,0.12 \mu \mathrm{mole} / \mathrm{bottle} \)이었다. 염소화합물의 정량은 Sung 등의 방법을 따랐다.</p><h2>DNA 추출 및 PCR 조건</h2><p>4주간 PCE와 TCE를 첨가하여 혐기 배양한 농화배양액에서 \( 3 \mathrm{~mL} \)을 취한 후, FastDNA Spin Kit for Soil (Bio101, CA, USA)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 미생물 다양성을 확인하기 위하여 농화배양으로부터 얻은 DNA를 주형으로 16S rRNA gene을 PCR 반응하여 증폭하였다. 1차 PCR은 27f((5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1541r (5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3')을 이용하여 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 안에 \( 1 \times\) PCR buffer, \( 20 \mathrm{mM} ~\mathrm{MgCl}_{2} \), \( 40 \mathrm{mM} \) dNTP mixture, 각 primer \( (1 \mu \mathrm{M}) \), template DNA(\(50\mathrm{ng}\)), \( 0.5 \mathrm{U} \) Taq polymerase를 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 DNA를 변성시킨 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\)에서 1분, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1.5분으로 25 cycle을 수행한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7분 동안 final extension을 수행하였다. 각각의 PCR 산물들은 ethidium bromide 염색 후 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인하였다. 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였으며, 사용된 primer는 40 개의 GC clamp가 붙은 341fGC (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 786r (5'-CGA CCA GGG TAT CTA ATC-3')을 이용하여, PCR을 실시하였다. 이때 사용된 PCR mixture는 1차 PCR에 사용된 것과 동일하며, 사용된 PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 DNA를 변성시켜, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7분 동안 final extension을 수행하였다. Annealing 온도를 초기에는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 시작해서 1 cycle당 \( 0.5^{\circ} \mathrm{C} \) 감소하게 20 cycle 수행하였고, 그 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15 cycle을 수행하여 PCR을 완료하였다. 얻어진 2차 PCR 증폭산물은 ethidium bromide 염색 후 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인 후, DCode System (Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 DGGE를 수행하였다.</p><h2>DGGE 조건</h2><p>PCR 증폭산물은 Dcode \( { }^{\mathrm{TM}} \) System (Bio-Rad, Hercules, USA)을 이용하여 DGGE를 수행하여 분석하였다. Denaturing gradient gel은 \( 10 \% \) polyacrylamide \( (37.5: 1= \) acrylamide :bisacrylamide)에 urea와 formamide 변성제를 \( 40\sim 70 \% \)까지 농도구배가 연속적으로 형성되도록 첨가하여 gradient gel을 제작하였다. 이와 같이 제작된 gel에 PCR증폭산물을 \( 30 \mu \mathrm{L} \)씩 loading하여 \( 1 \times \)TAE buffer \( (40 \mathrm{mM} \) Tris, \( 20 \mathrm{mM} \) acetic acid, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0) \)에서 \( 60^{\circ} \mathrm{C}, 75 \mathrm{~V} \) 로 20시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 ethidium bromide에서 염색한 후, UV로 확인하였다.</p><h2>염기서열분석</h2><p>Denaturing gradient gel 상에서 다른 위치에 존재하는 DNA 단편들을 회수하기 위하여 각각의 밴드를 선택한 후, 각각 잘라내어 3차 증류수 \( 50 \mu \mathrm{L} \)를 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하롯밤 동안 방치한 후 원심분리 (\( 6,300 \times \mathrm{g}\), 5분)하여 상등액을 취하였다. 각 밴드에서 회수한 DNA를 주형으로 341fGC와 786r primer를 이용하여 위와 같은 방법으로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물은 gel extraction kit (Cosmo, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 automatic DNA sequencer (model 377; Applied Biosystems, Foster, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였으며, 결정된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Genbank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>산업화에 따라 수많은 유기성 물질이 대량으로 생산되어 토양 및 지하수를 오염시키고 있다. 이들 중 perchloroethylene (PCE)와 trichloroethylene (TCE)는 염소계 유기화합물로 우수한 탈지능력과 세정력을 가지고 있어, 드라이클리닝, 금속 산업의 세정용매 등으로 널리 사용되어 왔다. 그러나 사용 후 부실한 관리로 인해 자연계에 방출되어 지하수와 지표수를 오염시키고 있다. 염소계 유기화합물은 휘발성이 매우 강하고, 발암성을 가지고 있으며, 분자구조가 매우 안정한 난분해성 물질로, 처리에 있어서 많은 시간과 비용이 요구된다. 따라서 염소계 유기화합물의 오염에 따른 광범위한 수질오염과 이들이 인체에 미치는 영향에 대한 심각성이 제기되어 국내에서도 1993년부터 PCE 및 TCE를 폐수 배출기준에 포함시켰으며, 현재 먹는 물 수질기준의 경우 PCE와 TCE는 각각 \( 0.01 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)와 \( 0.03 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)로 규제되고 있다.</p><p>이러한 염소계 유기화합물의 처리는 유지관리 비용이 많이 드는 물리-화학적 방법보다 생물학적 처리법이 경제적이고 친환경적인 방법으로 알려지고 있다. 생물학적 처리에 있어서 PCE나 TCE는 호기성 조건에서는 분해되기 어려우나 혐기성 조건에서 hydrogenolysis에 의해 PCE의 염소 이온이 수소이온과 치환되는 환원반응에 의해 단계적으로 PCE, TCE, cis-1,2-dichloroethene (cis-DCE), vinyl chloride(VC), ethene으로 탈염소화 된다. 또한, 치환된 염소수가 많을수록 환원전위가 증가하여 환원적 탈염소화 반응이 더 잘 일어난다고 알려져 있다. 자연계에는 다양한 미생물이 존재하지만 미생물 탐색 및 분리의 어려움으로 지금까지 밝혀진 혐기성 탈염소화 미생물종은 매우 적으며, 혐기성 상호대사에 의한 탈염소화가 미생물이 염소화합물을 분해하는 주된 기작으로 여겨지고 있다. Dehalococcoides ethenogenes strain 195와 Dehalococcoides sp. strain FL2는 각각 PCE와 TCE를 ethene으로 완벽하게 탈염소화시키는 능력을 가지고 있다. 그러나, Dehalococcoides sp. 195와 FL2는 무해한 ethene으로의 전환이 항상 나타나는 것이 아니며, cis-DCE, VC에서 탈염소화반응이 종결되는 경우도 자주 관찰되고 있다. 하지만, PCE와 TCE에서 ethene으로 전환시 영향을 미치는 요인(전자 수용체, 전자 공여체, 온도등)에 의해서 저해되거나 촉진되는지에 대한 명확한 규명이 현재까지 밝혀지지 않았다. 이러한, 알려지지 않은 성장요인에 의하여 일반적인 분리 및 배양이 매우 어렵기 때문에, 미생물 단독에 대한 연구가 힘든 상황이다. 그리고, 각각의 미생물들은 주변 환경에 따라 다른 미생물들과 상호작용을 통해 군집을 형성하기 때문에, 미생물군집의 특성은 개별적으로 존재하는 미생물과는 다른 특성을 가지며, 매우 복잡한 상호작용을 통해 발현적 특성을 가진다. 따라서 미생물 각각을 이해하는 것보다 미생물군집을 이해하는 것이 매우 중요하게 여겨지고 있다. 이러한 미생물 군집 구조와 다양성을 이해하기 위한 조사하는 방법으로 16S rRNA 염기서열 분석을 이용하는 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Fluorescent in situ Hybridization (FISH) 등 여러 분자생물학적 방법들이 개발되어, 생태학적인 관계를 규명하기 위해 사용되고 있다.</p><p>본 연구에서는 하천의 저니와 해양의 저니로부터 염소계 유기화합물인 PCE 및 TCE의 혐기성 탈염소화에 관련하는 미생물을 농화배양하여 DGGE 방법으로 미생물 군집 분석을 수행하였다. 본 연구를 통한 생태학적인 기초 지식과 미생물간의 탈염소화 과정에서의 상호작용 이해는 성공적인 생물정화에 기여할 것으로 판단된다.</p> <h2>미생물 군집분석</h2><p>전국의 시료를 각각PCE와 TCE를 넣고 배양한 후, 탈염 소화율이 우수한 3개의 시료(광양, 하남, 여천)를 선발 하였으며, 4주간 집적배양한 배양액으로부터 전체 DNA를 획득하여 세균용 universal primer로 알려진 34fGC와 786r primer를 이용하여 PCR 증폭산물을 얻었으며, agarose gel 상에서 예상되는 486 bp의 밴드를 확인하였다. 미생물 군집다양성을 확인하는데 유용한 기법인 DGGE를 이용하여 미생물 군집의 다양성을 조사했다.</p><p>각 배양액의 DGGE profile에서 다양한 밴드들을 확인할 수 있었으며, 각 시료는 기질(PCE와 TCE)에 따라 다른 밴드 pattern을 나타내고 있다. 각 환경시료의 PCE 및 TCE의 집적배양 전과 집적배양 후의 DGGE profile은 매우 다르며, 집적배양 전 시료에 나타나는 밴드가 집적배양 후에는 대부분 보이지 않고, 새로운 밴드들이 나타남을 확인하였다. 이것은 오염물질에 따른 미생물 군집은 시간에 따라 변화됨을 의미한다.</p><p>Table 1과 같이 DGGE gel에서 다른 위치에 존재하는 56개의 밴드를 분리하였고, 분리된 밴드에서 DNA를 추출하여 염기서열을 분석하였으며, NCBI의 GeneBank를 이용하여 상동성을 비교 검색하였다. 각 군집의 주요 미생물은 DGGE gel에서 강한 intensity를 나타내는 밴드로 9번 밴드는 Tissierella praeacuta (X80833)로 분석되었다. 20번과 31번 밴드는 Sedimentbacter sp. (AY221992, AY766467)로 Y-TCE시료와 H-TCE 시료에서 공통적으로 나타났다. 30, 33번 밴드는 uncultured bacteria로 분석되었으며, 36, 46번, 55번 밴드는 Clostridium-like bacteria(U27711, CR933216)로 분석되었다.</p><p>G-TCE 시료 농화배양의 주요 미생물은 9번 밴드(Tissier-ella praeacuta, X80833)와, 19번 밴드(Clostridium sp. EBR, AB 186360)이다. 그러나 이 밴드들은 G-PCE 시료 농화배양에는 나타나지 않았다. G-PCE 시료 농화배양의 주요 미생물은 1번 밴드(Unidentified eubacterium, AJ229210)와 3번 밴드(Unidentified eubacterium, AJ229206)로 나타났다. H-PCE시료 농화배양와 H-PCE 시료 농화배양도 다른 pattern을 보이고 있다. H-TCE 시료 농화배양의 31번(Sedi-mentibacter sp., AY766467), 36번(Clostridium-like species, U27710), 37번(Desulfotomaculum ruminis, Y11572)이 주요 미생물이며, 이 밴드는 H-TCE 시료 농화배양에만 나타났다. 한편 Y-TCE 시료 농화배양와 Y-PCE 시료 농화배양는 38번(Clostridium hastiforme, X77848), 44번(Uncultured Clostridiaceae bacterium, AB218338), 45번(Desulfosporo-sinus youngii, DQ117470), 46번(Clostridium-like sp., U27711), 47번(Desulfotomaculum carboxydivorans, AY961415) 밴드가 같은 위치에서 관찰되었다. 그러나 주요미생물은 Y-TCE에서는 38번(Clostridium hastiforme, X77848), 49번(Un-cultured bacterium, CT574058)이고, Y-PCE 의 주요 미생물은 44, 45, 46, 47번으로 다르게 나타났다.</p><p>DGGE 분석결과, 탈염소화와 관련된 미생물들로는 황산염 환원 세균(sulphate-reducing bacteria, SRB)와 아세테이트 산화세균(acetate-oxidizing bacteria, AOB)가 우점하는것으로 분석되었다. SRB로 분석되어진 29, 37번 밴드는 각각 Desulfotomaculum nigrificans(AB026550)와 \( 100 \% \), Desul-fotomaculum sp. (Y11572)와 \( 94 \% \) 유사하였다. 밴드 37, 45, 47, 28, 29번 밴드는 각각 Desulfotomaculum sp. (Y11572)와 \( 100 \% \). Desulfosporosinus youngii (DQ117470)와 \( 99 \% \), Desulfotomaculum carboxydivorans (AY961415)와 \( 96 \% \), D. aeronauticum (X98407)와 \( 97 \% \), Desulfotomaculum nigrificans (AY742958)와 \( 94 \% \) 유사한 것으로 확인되었다. SRB균주는 탈염소화 효율을 증대시키는 것으로 알려져 있으며, 과거 PCE나 TCE에 오염된 지역의 토양에서 종종 발견되었으며, 탈염소화 미생물의 co-culture로서 인식되고 있다. 최근 몇몇 세균들은 염소계 알칸(chlorinated alkanes)의 탈염소화 과정을 통해 성장에 필요한 에너지를 얻는다고 알려져 있다.</p><p>아세테이트는 혐기성 조건에서 메탄을 생성하는 선구물질로 알려져 있으며, AOB에 의하여 \( \mathrm{H}_{2} \)와 \( \mathrm{CO}_{2} \)로 전환된다.\( \mathrm{H}_{2} \)는 PCE 및 TCE의 염소를 제거하는데 이용되며, 혐기성 배양에서 중요한 역할을 한다. Clostridium sp.는 AOB에 속하며, 혐기성 배양조건에서 아세테이트를 메탄, \( \mathrm{H}_{2}, \mathrm{CO}_{2} \)를 생성한다고 보고되어지고 있다. 농화배양된 시료의 군집분석을 통하여 Clostridium sp. (6, 19, 35, 36, 38, 40, 46, 53, 55번 밴드)이 모든 시료에 존재하는 것을 확인하였다.</p><p>DGGE gel에서 전자 수용체에 따라, 다른 미생물 다양성과 community profiles을 나타냄을 확인하였다. 또한, 농화 배양 시료 미생물의 DGGE를 통한 군집분석에서 혼합균주를 구성하고 있는 균주들은 대부분 uncultured 미생물, Clostridium sp.와 SRB등으로 조사되었다.</p> <h1>실험재료 및 방법</h1><p>하천의 퇴적물과 해양준설토로부터 염소계 유기화합물인 PCE와 TCE의 탈염소화에 관여하는 미생물군집을 탐색하고 혐기성 상호대사에 의한 탄염소능을 확인하며, 이로부터 안정화된 미생물 혼합균주 확보 및 군집분석을 수행하였다.</p><h2>시료채취 및 보관</h2><p>탈염소화에 관여하는 미생물들은 주로 저니에서 발견된다고 보고되고 있으며, 혐기성 조건의 하천, 해양의 저질에 존재한다고 보고되었다. 또한, 이전에 PCE 및 TCE로 오염된 지역의 저질에 분포할 가능성 크기 때문에 이를 근거로 하천, 해양의 저니에서 시료를 채취하였으며, 광양(준설토) \( \left(34^{\circ} 55^{\prime} 47^{\prime \prime} 127^{\circ} 40^{\prime} 40^{\prime \prime}\right) \), 하남(퇴적토)( \( \left.35^{\circ} 14^{\prime} 25^{\prime \prime} 128^{\circ} 38^{\prime} 47^{\prime \prime}\right) \), 여천(토양) \( \left(34^{\circ} 48^{\prime} 54^{\prime \prime} 127^{\circ} 37^{\prime} 53^{\prime \prime}\right) \)등 전국에서 시료를 채취하였다. 시료 채취는 라이너 토양채취기(SJD-1600, \(50 \times 300 \) \( \mathrm{mm} \) )(Sinjung, Changwon, Korea)와 PVC pipe를 이용하여 약 \( 30-40 \mathrm{cm} \) 정도의 깊이에서 채취하였다. 채취한 토양은 기밀용기(Wheaton, NJ, USA)에 넣은 다음 질소포기를 약 3분간 실시하여 토양의 산소를 제거하고 외부공기와 접촉을 차단시킨 후, ice box를 이용하여 \( 0 \sim 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 시료를 운반하였다.</p><h2>혐기성 배양 조건</h2><p>탈염소화능을 가지고 있는 혐기성 미생물을 탐색하기 위해 회분식 실험(batch experiment)을 실시하였다. 실험에 사용된 배지는 Sung 등이 사용한 무기염 배지를 사용하였으며, PCE와 TCE를 전자 수용체로 하고, 아세테이트를 전자 공여체로 사용하여 배양 하였다. 무기염 배지의 조성은 \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.5 \mathrm{g}\) ; \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{SO}_{4}, 0.3 \mathrm{g}\) ; \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{SO}_{4}, 0.3 \mathrm{g}\) ; \(\mathrm{CaSO}_{4} \). \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.015 \mathrm{g}\); resazurin, \( 0.0025 \mathrm{g} \); \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{S} \cdot 9 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.048 \mathrm{g} \); \( L \)-cysteine, \( 0.035 \mathrm{g} \); \( \mathrm{NaHCO}_{3}, 2.52 \mathrm{g} \); trace element solution(A) \( 1 \mathrm{mL} \), trace element solution(B), \( 1 \mathrm{mL} \); yeast extract \( 0.2 \mathrm{g} \)와 같다. 무기염 배지는 질소 flushing \( \left(\mathrm{N}_{2}: \mathrm{CO}_{2}=\right. \) \( 80: 20 \) )을 통해 산소를 제거하였다.</p><p>회분식 실험을 위해 총 용량 \( 160 \mathrm{mL} \)의 혈청병에 채취한시료 \( 1 \mathrm{g} \)(습중량)과 무기염 배지 \( 50 \mathrm{mL} \), 전자 공여체로는 2\( \mathrm{mM} \) 아세테이트를 주입하였고, \( 2 \mathrm{mM} \)의 TCE와 PCE를 각각 기질로 함께 주입한 다음, 테프론 재질의 Gray Butyl Septa (Wheaton, NJ, USA)를 사용하여 완전히 밀폐시켰다. 밀폐된 혈청병은 암조건의 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 정치 배양하였으며, 3반복으로 진행되었다. 4주에 한번 새로운 배지로 3회에 걸쳐 집적배양 하였다. 새로운 배지로의 접종은 전체 용량에 \( 10 \% \)로 하였고, 계대 배양 시 마다 혈청병내에 존재하는 PCE 및 TCE를 측정하여 탈염소화능을 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>미생물에 의한 PCE와 TCE의 탈염소화</h2><p>염소화합물을 분해하는 미생물 혼합균주 확보를 위하여 하천, 해양저질 등에서 채취한 시료를 이용하여, 무기염 배지에서 혐기배양을 실시한 뒤에 탈염소화 효율을 조사하였다. 본 연구에서 PCE나 TCE의 탈염소화 반응생성물은 측정하지 않았으며, headspace 부분에 잔존하는 염소 화합물을 분석하고, 배양시에 대조구와 시료내의 PCE와 TCE의 변화를 관찰함으로서 탈염소화 효율을 평가하였다. 또한, 환경 시료에서 탈염소화 관련 혐기성 미생물을 보다 우점화 시키기 위해 집적배양하였다. 집적 배양을 수행하면 탈염소화 효율은 큰 변화가 없지만, 탈염소화 활성이 증대되어진다. 이는 환경시료로부터 탈염소화에 관련된 혐기성 미생물을 탐색하는데 있어서 집적배양은 반드시 필요하며, 이는 탈염소화 활성에 긍정적인 영향을 미친다고 볼 수 있기 때문에 본 연구에서도 집적배양을 수행하였다.</p><p>4주간 집적배양을 통해 광양, 하남, 여천시료가 PCE와 TCE의 탈염소화율이 우수한 것으로 나타났으며, 그 밖의 다른 시료도 PCE 및 TCE로 농화배양을 수행하였으나, 시료마다 그 효율에 있어 차이를 보이고 있다. 또한, 배양기간에 따라 PCE 및 TCE가 약간 감소하였으나, 탈염소화율은 \( 20\sim 30 \% \)정도로 매우 낮게 나타났다.</p><p>Fig. 1은 4주간의 집적배양 후, 잔존하는 PCE와 TCE농도를 초기농도와 비교하여 탈염소화율을 나타낸 것이다. 광양, 하남, 여천시료의 PCE 탈염소화율은 \( 59.56 \% \), \( 80.73 \% \), \( 87.37 \% \)를 나타내고 있으며, PCE의 평균 분해능은 \( 75.8 \% \)를 나타내고 있다. PCE 탈염소화능은 여천 >하남 >광양시료의 순으로 나타났다. 또한, TCE 탈염소화율은 \( 83.74 \% \), \( 75.47 \% \), \( 84.46 \% \)로 TCE 평균 분해능은 \( 81.2 \% \)로 높게 나타내고 있으며, TCE 탈염소화능은 여천 \( >\) 광양 \( >\) 하남시료의 순으로 여천시료가 가장 높은 탈염소화능을 갖는 것으로 분석되었다. PCE와 TCE 탈염소화능은 광양, 하남, 여천시료 중에서 가장 우수한 시료는 여천 시료로 \( 85 \% \) 이상의 PCE와 TCE 탈염소화율을 보이고 있다. 이와 같이 다양한 탈염소화율을 보이는 것은 시료마다 탈염소화에 관련된 혐기성 미생물들이 존재하기는 하나 탈염소화율이 우수한 시료에 보다 많이 존재하며, 탈염소화 미생물이 우점종을 차지하고 있기 때문인 것으로 판단된다.</p><p>PCE와 TCE의 탈염소화 효율을 상대 비교하였을 때 동일한 환경시료를 이용했음에도 PCE와 TCE의 탈염소화 효율은 차이를 보이고 있다. 하남, 여천시료는 PCE 탈염소화율이 TCE 탈염소화율 보다 우수한 것으로 나타났다. 이러한 원인을 탈염소화 반응속도차에 의한 것이라 기존의 연구에서 보고하고 있다. 혐기성 미생물의 탈염소화 반응을 통해 PCE는 최종산물인 ethene을 생성하며, 중간 생성물인 TCE, DCEs, VC를 생성하는데 탈염소화 반응속도를 비교해보면 치환된 염소의 수가 많은 화합물일수록 탈염소화 반응속도가 증가한다. 따라서 PCE의 첫 번째 혐기성 탈염소화 중간생성물인 TCE를 주입하였을 때와 PCE를 직접 주입하였을 때를 비교하면 같은 시료에 존재하는 미생물의 TCE 탈염소화 반응속도는 상대적으로 PCE의 탈염소화 반응속도보다 낮아서 탈염소화 효율이 낮은 것으로 판단되어진다.</p><p>탈염소화 반응속도 이외에 PCE와 TCE의 탈염소화 효율은 우점하는 미생물 종에 따라 영향을 받으며, 광양시료의 경우 PCE의 탈염소화율은 높은 반면, TCE 탈염소화율은 낮게 나타났는데, 이는 시료내에 PCE보다 TCE를 쉽게 탈염소화하는 미생물이 우점한다는 것을 간접적으로 시사하고 있다.</p>	생명
폐글리세롤을 탄소원으로 트레할로스 생산을 위한 재조합 대장균 배양 조건 최적화	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>주식회사 M 에너지 사(Pyeong-taek, Korea)로 부터 폐글리세롤을 입수하였다. 포도당, 효모추출액(yeast extract), 트립톤(tryptone)은 Difco 사(USA)로부터 구입하였고 IPTG, 엠피실린(ampicillin), 및 기타 시약들은 Sigma-Aldrich 사(USA)에서 구입하였다. 발리다마이신(순도, \( 66 \% \) )은 (주)한농 (Korea)에서 입수하였다. 대장균 발현 벡터인 pTrc99A (Amersham Bioscience, USA)에 대장균 트레할로스 생합성 오페론 (otsBA)이 삽입된 재조합 플라스미드(PT-otsBA)는 본 실험실에서 제작되었다.</p> <h2>폐글리세롤의 전처리</h2> <p>Pyle 등이 제안한 방법에 따라 폐글리세롤 용액으로부터 지방산 염을 제거하였다. 폐글리세롤 용액에 산을 첨가하여 용액의 \( \mathrm { pH } \) 를 낮추면 지방산 염이 지방산으로 전환된다. 이를 저온에 방치 시 용해도가 낮은 지방산이 침전되는데, 여과 또는 원심분리에 의해 폐글리세롤 수용액과 지방산을 분리할 수 있다. 본 연구에서는 폐글리세롤을 탈이온 증류수와 4: 1 비율로 혼합한 후, 염산( \(37 \% \))을 첨가하여 혼합 용액의 \( \mathrm { pH } \) 를 \( 3.0 \) 으로 조절하였다. 이를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12시간 방치한 후 생성된 침전물을 제거하기 위하여 진공펌프를 이용하여 세공크기가 \( 0.2 \mathrm { ~mm } \) 인 멤브레인 필터 (OD \(47 \mathrm { ~mm } \), Whatman, Germany)에 용액을 통과시켰다. 필터를 통과한 여액(filtrate)은 지방산이 제거된 폐글리세롤 용액이 된다. 전처리 폐글리세롤 용액의 \( \mathrm { pH } \) 가 낮아서 이를 \( \mathrm { NaOH } \) 로 중화( \( \mathrm { pH } \ 7.0 \))시킨 후 미생물 배양용 기질로 사용하였다.</p> <h2>균주, 배지 및 배양 방법</h2> <p>호스트 균주로 사용된 E. coli DH 5 \( \alpha \) 에 PT-otsBA 플라스미드를 도입시킨 재조합 대장균을 제작하고 이를 트레할로스 생산균주로 사용하였다. 재조합 플라스미드 및 재조합 균주 제작 방법은 참고문헌에 자세히 기술되어 있다. 모든 실험에서 \( 500 \mathrm { ml } \) Erlenmeyer 플라스크에 엠피실린(최종농도, \( 100 \mathrm { mg } / l) \) 이 첨가된 \( 50 \mathrm { ml } \) 배지를 넣고 이를 진탕배양기 (Jeio Tech Co., Ltd., Korea)에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 150 \mathrm { rpm } \) 으로 배양하였다.</p> <p>본 실험결과는 생산균주가 전처리 폐글리세롤을 사용하여 순수 글리세롤을 사용한 배양에서와 비슷한 양의 트레할로스를 생산할 수 있음을 보여준다. 이는 고부가가치 생리활성 물질을 생산하기 위한 미생물 배양에서 전처리 폐글리세롤을 탄소원으로 활용할 수 있는 가능성을 시사한다.</p> <h2>배양온도와 IPTG induction이 트레할로스 생산에 미치는 영향</h2> <p>배양 온도는 미생물 생장과 생물질 합성에 영향을 미치는 주요 환경 인자이다. 일반적으로 대장균은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적 생장을 보이는 반면 재조합 유전자 발현에 의한 고활성 단백질 생성은 이보다 낮은 온도에서 촉진되는 것으로 알려졌다. 생산균주가 함유한 PT-otsBA 플라스미드에는 IPTG에 의해 유전자 발현이 유도되는 trc 프로모터가 존재한다. 따라서 트레할로스 생산을 위한 재조합 대장균 배양에 적합한 온도의 결정과 IPTG induction에 의한 영향을 조사하기 위한 실험을 수행하였다. Table 1은 배양 온도 \( \left (37 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) 와 \( \left .27 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 와 IPTG induction 유무에 따른 생산균주의 트레할로스 생산량을 보여준다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하는 경우(Run 1 과 Run 2 )가 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양(Run 3과 Run 4)하는 경우 보다 세포밀도와 트레할로스 생산이 높았다. Induction 하지 않은 배양(Run 2 와 Run 4)에서 트레할로스 생산이 관찰되었으나 IPTG로 induction한 경우가 더 많은 트레할로스를 생산하였다. 본 실험 결과는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 IPTG로 induction 하는 배양에서 가장 높은 세포밀도와 트레할로스 생산을 달성할 수 있음을 보여준다.</p> <p>일반적으로 야생형 대장균은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 세포의 해당작용(glycolysis)이 촉진되어 피루브산을 생성하는 속도가 TCA 회로에 의해 이를 소모하는 속도보다 빨라 잉여 피루브산이 발생한다. 이는 세포 내 아세트산 생합성을 촉진시켜 과량의 아세트산이 생성되어 분비되기 때문에 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 가 급격히 떨어진다. 야생형 균주와 달리 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양된 생산균주의 배양액에서 두드러진 \( \mathrm { pH } \) 감소가 없었다. 생산균주가 발현하는 트레할로스 생합성 효소는 글루코오스와 UDP-글루코오스를 결합하여 트레할로스 생합성을 촉진한다. 탄소원으로 사용된 글리세롤은 생산균주에 글리세롤-3-인산 형태로 흡수된 후, 다이하이드록시아세톤 인산(DHAP)으로 전환되어 해당작용에 편입된다. 트레할로스를 생합성하는 생산균주에서는 다이하이드록시아세톤 인산(DHAP)의 일부가 포도당 신생합성(gluconeogenesis)을 활성화시켜 트레할로스 전구물질인 글루코오스와 UDP-글루코오스 생합성이 촉진되는 것 같다. 이로 인해 야생형 균주보다 피루브산 생성량이 적고 궁극적으로 아세트산 생성이 최소화되어 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 감소폭이 적은 것으로 추측된다. 생산균주의 단위 세포당 생산량(specific productivity)은 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양한 경우가 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보다 \( 1.4 \) 배 높았는데, 이는 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 발현된 효소의 활성이 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 발현된 것보다 높기 때문인 것으로 판단된다. 그러나 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양에서 얻은 세포농도가 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 얻은 것보다 \( 1.9 \) 배 높아 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 더 많은 트레할로스가 생산된 것으로 판단되었다.</p> <p>본 결과는 배지에 고삼투성 조건을 형성할 정도의 충분한 \( \mathrm { NaCl } \) 을 첨가하고 IPTG를 최소한으로 첨가하여 재조합 otsBA 오페론의 적절한 발현을 유도하는 것이 트레할로스 생산을 극대화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 일반적으로 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 IPTG를 첨가하는 경우에 유도발현벡터에 삽입된 외래유전자가 최대로 발현하는 것으로 알려져 있다. 그러나 외래 유전자의 과도한 발현은 오히려 생산균주의 대사 회로를 교란시킴으로써 세포에 대사부담(metabolic burden)을 가중시켜 세포생장 및 생산성의 저해를 초래할 수 있다. 본 결과는 재조합 대장균 배양을 통한 트레할로스 생산에서 반응표면 분석법을 사용하여 배양조건을 최적화함으로써 트레할로스 생산량을 극대화시킬 수 있음을 시사한다.</p> <h1>요 약</h1> <p>전처리 폐글리세롤을 기질로 사용한 재조합 대장균 배양에서 트레할로스 생산성에 영향을 미치는 핵심 변수들을 도출하고 반응표면 분석법을 사용하여 트레할로스 생산을 극대화하기 위한 최적조건을 탐색하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 IPTG로 induction 하는 배양이 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 또는 induction 하지 않은 배양에 비하여 세포생장 및 트레할로스 생산성이 높았다. Box-Behnken design 실험계획법을 사용하여 배지중의 \( \mathrm { NaCl } \), 발리다마이신 및 IPTG의 농도를 최적화하였다. 통계분석결과 IPTG와 \( \mathrm { NaCl } \) 의 농도는 트레할로스 생산에 영향을 미쳤으나 발리다마신의 영향은 크지 않은 것으로 확인되었다. 등고선도 분석을 통해 \( 298 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 이 첨가되고 \( 0.1 \mathrm { mM } \) 의 IPTG로 induction되는 배양에서 가장 많은 양의 트레할로스가 생산되는 것으로 예측되었다. 최적화된 조건에서 생산균주는 세포 밀도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) \) \(5.4 \pm 0.2 \) 에서 \( 304 \pm 15 \mathrm { mg } / \) 의 트레할로스를 생산하였다.</p> <p>\( -70 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관된 생산균주의 glycerol stock \( 400 \mu \mathrm { l } \) 를 LB배지에 접종하였다. 세포밀도를 나타내는 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 가 \( 0.6-0.8 \) 에 도달하였을 때, 접종균 \( 2.5 \mathrm { ml } \) 를 본 배양용 배지에 접종하였다. 일반적으로 대장균은 \( 20 \mathrm { ~g /l}\) 글리세롤에서 세포생장이 저해받지 않으므로 본 배양 배지의 전처리 폐글리세롤 농도를 \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 로 고정하였다. 초기실험에서 본 배양을 위하여 M9 배지에 \( 20 \mathrm { ~g } / l \) 의 전처리 폐글리세롤, \( 300 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { NaCl } \) 및 \( 0.1 \mathrm { mM } \) 의 발리다마이신을 첨가하였고 otsBA 발현을 유도하기 위하여 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 가 \( 0.6-0.8 \) 에 도달하였을 때 IPTG(최종 농도 \( 0.1 \mathrm { mM } ) \) 를 첨가하였다. 그러나 최종적으로 \( 20 \mathrm { ~g } / \) 의 전처리 폐글리세롤이 첨가된 M9 배지를 기준배지로 하여 \( \mathrm { NaCl } \), 발리다마이신 및 IPTG의 최적 농도 결정을 위한 실험을 수행하였다.</p> <h2>배양 조건 최적화</h2> <p>배지에 첨가되는 \( \mathrm { NaCl } \), 발리다마이신 및 IPTG의 최적농도를 결정하기 위하여 Box-Behnken design(BBD) 실험계획법을 사용하였다. 실험이 종료된 후 버전 9.1 SAS 프로그램(SAS Institute, USA)을 이용하여 실험데이터의 회귀분석을 수행하여 통계적으로 의미있는 계수 값들을 선별하였고 이를 이용하여 이차다항식 모델을 수립하였다. 엑셀 프로그램을 이용하여 모델 방정식의 해를 구하고 Sigma plot 프로그램을 이용한 반응표면분석을 수행하여 세 성분들의 최적 농도를 구하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>세포 내에 축적된 트레할로스의 정량분석을 실시하였다. \( 1 \mathrm { ml } \) 배양액을 채취하여 \( 9,800 \times g \) 로 10분간 원심분리한 후 세포 펠릿(cell pellet)과 상등액(supernatant)을 분리하였다. 상등액 중의 잔류 글리세롤 농도를 측정하기 위하여 글리세롤 에세이 킷(K-GCROL, Megazyme, Ireland)을 사용하였다. 세포 펠릿을 \( 1 \mathrm { ml } \) 탈이온 증류수에 현탁시켰다. 현탁액을 포함하는 튜브를 얼음통에 넣고 세포파쇄기(ultrasonic homogenizer, Sonics & Materials, USA)의 팁을 세포현탁액에 담근 후 sonication(10초 파괴, 30초 쉬기를 두 번 반복)에 의해 세포를 파쇄하였다. 가열블럭(heating block)을 이용하여 세포 파쇄액(lysate)을 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 가열처리함으로써 세포 내에 존재하는 트레할로스 분해 효소들을 불활성화시켰다. 세포 파쇄액을 \( 9,800 \times \mathrm { g } \) 로 10분간 원심하여 세포 잔사물(cell debris)을 분리한 후, 상등액만을 채취하였다. 상등액 중의 트레할로스 농도를 측정하기 위하여 트레할로스 에세이 킷(K-TREH, Megazyme, Ireland)를 이용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>전처리 폐글리세롤을 포함하는 배지에서 otsBA를 발현하는 재조합 대장균의 세포 생장 및 트레할로스 생산</h2> <p>기존 연구에서 제시된 배지에 순수글리세롤을 전처리 폐글리세롤로 대체하여 생산균주를 배양하고 IPTG로 induction하며 균주의 생산특성을 조사하였다. Fig. 1은 시간에 따른 세포 밀도, 글리세롤 잔류농도 및 균주가 생산하는 트레할로스 농도를 나타낸다. 생산균주는 지연기 없이 생 장을 시작하여 24 시간 만에 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 가 \( 4.9( \pm 0.2) \) 에 도달한 후 생장을 멈추었다. 균주의 생장과 함께 트레할로스 생합성이 시작되었고 세포 생장이 멈춘 후에도 지속적으로 생합성 되어 배양 36시간만에 최대치인 \( 321( \pm 45) \mathrm { mg } / \) 에 도달하였다. 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 는 배양 시작 \( 7.0 \) 에서 시작하여 배양 종료 후 \( 6.0 \)으로 배양기간 동안 큰 변화가 없었다. 생산균주는 배양 48시간 만에 첨가된 글리세롤의 \( 85 \% \) 를 소모하였는데, 배양 단계별로 글리세롤의 소모속도가 달랐다. 글리세롤 속모 속도는 지수 생장기 \( ( \sim 25 \mathrm { ~h } ) \) 에서 \( 0.5 \mathrm { ~g } ^ { -1 } \mathrm { l } ^ { -1 } \mathrm { ~h } ^ { -1 } \) 였고 지수생장 후반기(25-36 h)에는 \( 0.3 \mathrm { ~g } ^ { -1 } \mathrm { l } ^ { -1 } \mathrm { ~h } ^ { -1 } \) 로 감소하였고 배양말기(36 h이후)에는 \( 0.06 \mathrm { ~g } ^ { -1 } \mathrm { l } ^ { -1 } \mathrm { ~h } ^ { -1 } \) 로 더욱 감소하였다. 세포의 지수생장 기간 동안 글리세롤 소모속도가 가장 높은 반면 지수생장 후반기에 소모속도가 감소한 것은 생산균주가 지수생장 기간 동안 세포 생장과 트레할로스 생합성에 글리세롤을 사용한 반면 지수생장기 후반기에는 세포생장이 멈추어 글리세롤이 트레할로스 생합성에만 사용되었기 때문인 것으로 판단된다. 또한 배양 말기에는 생산균주가 더 이상 트레할로스를 생합성하지 않고 세포생존을 위한 대사유지활동(maintenance)에만 글리세롤을 사용하는 것으로 여겨진다.</p> <p>\( \mathrm { Y } = 249.780-33.475 \mathrm { X } _ { 1 } + 25.225 \mathrm { X } _ { 3 } -35.225 \mathrm { X } _ { 1 } \mathrm { X } _ { 3 } -122.477 \mathrm { X } _ { 3 } { } ^ { 2 } \)</p> <p>식에서 \( \mathrm { Y } \) 는 생산된 트레할로스 농도 \( ( \mathrm { mg } / \mathrm { l } ) \) 이고, \( \mathrm { X } _ { 1 } \) 과 \( \mathrm { X } _ { 3 } \) 는 각각 IPTG 농도와 \( \mathrm { NaCl } \) 농도의 부호화 값(coded value)이다.</p> <p>Table 3에 실험값들과 모델식을 이용하여 계산한 예측값들을 나타내었다. 두 값들이 거의 비슷하여 모델의 정확도가 높다는 것을 알 수 있다. 모델식에서 각 변수들의 계수들 부호는 상대적 영향력을 나타낸다. 양의 부호를 갖는 독립변수 \( ( \mathrm { X } ) \) 를 증가시킴에 따라 응답값 \( ( \mathrm { Y } ) \)이 증가함을 나타내고 음의 부호를 갖는 독립변수 \( ( \mathrm { X } ) \) 를 증가시킴에 따라 응답값 \( ( \mathrm { Y } ) \) 이 감소함을 나타낸다. 즉, 모델식에 따르면 트레할로스 생산량을 증대시키기 위해서 \( \mathrm { X } _ { 3 } \left ( \mathrm { NaCl } \right . \) 농도)를 증가시키거나 \( \mathrm { X } _ { 1 } \) (IPTG 농도)을 감소시켜야 한다. 그러나 어느 지점에서 최대량의 트레할로스를 얻을 수 있는지를 구체적으로 알기 위하여 구축된 모델식을 이용하여 등고선도(contour plot) 분석을 실시하였고 엑셀 프로그램을 이용하여 최적조건을 계산하였다. Fig. 2 는 IPTG 농도 \( \left ( \mathrm { X } _ { 1 } \right ) \) 와 \( \mathrm { NaCl } \) 농도 \( \left ( \mathrm { X } _ { 3 } \right ) \) 변화에 따른 트레할로스 생산량을 나타내는 등고선도이다. IPTG 농도 \( \left ( \mathrm { X } _ { 1 } \right ) \) 가 \( -1(0.1 \mathrm { mM } ) \) 이고 \( \mathrm { NaCl } \) 농도 \( \left ( \mathrm { X } _ { 3 } \right ) \) 가 \( 0.24(298 \mathrm { mM } ) \) 일 때 가장 많은 양의 트레할로스가 생산되는 것으로 예측되었다. 발리다마이신이 통계적으로 트레할로스 생산에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 예측되었으나, 대장균 내에서 트레할라이즈의 활성을 저해함으로써 생합성된 트레할로스가 분해되는 것을 방지해 준다. 따라서 모델식의 정확성을 검증하기 위한 실험에서 최소량의 발리다마이신을 첨가하였다. 즉, \( 298 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } \), \(20 \mathrm { ~g } / \) 의 전처리 글라이세롤, \( 30 \mathrm { mM } \) 발리다마이신이 첨가된 M9을 본 배양용 배지로 사용하여 총 5회의 실험을 수행하였다. 전 배양된 생산균주를 본 배양용 배지에 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하였고, \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 가 \( 0.6-0.8 \) 에 도달하였을 때 IPTG(최종 농도 \( 0.1 \mathrm { mM } \) )를 첨가하였다. 36시 배양 후 측정된 배양액의 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) (세포밀도)는 \( 5.4 \pm 0.2 \) 였고 트레할로스 농도는 \( 304 \pm 15 \mathrm { mg } / \) 였다. 이는 예측치 \( (291 \mathrm { mg } /) \)와 비슷한 값으로 모델방정식의 정확도가 높다는 것을 시사한다. 한편, 최적화 전·후 \( \mathrm { NaCl } \) 과 IPTG 농도는 큰 차이가 없고 발리다마이신 농도는 1 / 3 수준으로 감소하였다. 최적화 전조건에서 생산된 트레할로스 농도는 \( 321( \pm 45) \mathrm { mg } / \) 인데, 실험 편차를 고려하면 최적화된 조건에서 생산된 트레할로스 농도와 큰 차이가 없다. 이는 발리다마이신 농도가 트레할로스 생산에 큰 영향을 미치지 않고 순수 글리세롤 또는 전처리 폐글리세롤을 사용하는 배양의 최적 조건이 비슷함을 시사한다.</p> <h1>서 론</h1> <p>트레할로스는 두 개의 글루코오스가 \( \alpha- \alpha \)-1,1-glycosidic linkage(글리코시딕 결합)로 연결된 비환원성 이당류로 감미료, 화장품 보습제, 단백질 의약품 보존제로 널리 사용된다. 초기 트레할로스 생산은 효모균(Saccharomyces cerevisiae)발효에 의해 이루어졌으나 상대적으로 수율이 낮고 생산단가가 높다는 문제점이 지적되어 효소 전환 공정으로 대체되었다. 그러나 미생물 유전자 조작 및 대사공학 기술의 발 달로 고생산성 균주개발이 가능해지고 농업 또는 산업현장에서 발생되는 부산물을 고부가가치 유용물질 생산에 사용할 수 있다는 장점으로 인하여 미생물공정을 이용한 트레할로스 생산이 재조명되고 있다.</p> <p>산업현장에서 다양한 형태의 부산물이 발생하는데, 폐글리세롤이 대표적인 예이다. 바이오디젤 생산공정의 부산물인 폐글리세롤은 최근 들어 과잉으로 발생하여 이를 정제하여 판매하는 것이 가격 경쟁력을 상실하고 있을 뿐만 아니라 새로운 환경오염 유발원으로 대두되어 미국을 포함한 전 세계적으로 이의 처리 방안을 고심하고 있다. 폐글리세롤을 미생물 배양 기질로 사용하여 바이오 연료(케미컬) 생산을 위한 많은 시도가 있었으나, 다른 탄소원을 사용하는 경우에 비하여 발효기간이 길고 생산성이 낮다는 지적을 받아왔다. 폐글리세롤에는 지방산 염, 메탄올 및 나트륨/칼륨 등의 불순물들이 다량으로 존재한다. 폐글리세롤 용액에 존재하는 나트륨/칼륨 농도가 세포 생장을 저해할 정도로 높지 않고 대장균을 포함한 많은 미생물들이 메탄올에 어느 정도 내성이 있기 때문에 미생물 배양에 있어서 폐글리세롤에 존재하는 나트륨/칼륨과 메탄올은 크게 문제되지 않는다. 지방산 염은 그 자체가 독성물질로 작용하여 미생물의 생장을 억제할 수 있다. 뿐만 아니라 폐글리세롤을 멸균하는 과정에서 폐글리세롤에 포함된 지방산 염이 고온에서 산화되어 다량의 퍼옥사이드로 전환된다. 퍼옥사이드는 미생물의 생장을 저해하거나 살균력을 갖는 물질이다. 따라서 미생물 배양용 기질로 폐글리세롤을 사용하기 위해서는 폐글리세롤에 존재하는 지방산 및 퍼옥사이드에 저항성을 갖는 미생물을 개발하거나 폐글리세롤로 부터 지방산을 제거하는 것이 바람직하다.</p> <p>본 연구팀은 대장균의 트레할로스 생합성 오페론(otsBA)을 과발현 시키는 재조합 대장균을 개발하였다. 기존 연구에서 배지에 첨가되는 \( \mathrm { NaCl } \) 농도를 증가시킴에 따라 재조합 균주의 세포 파쇄액으로부터 얻은 조효소(crude enzyme)의 트레할로스 생합성 효소 활성뿐만 아니라 트레할로스 분해 효소(trehalase) 활성도 증가함을 발견하였다. 트레할라이즈(trehalase) 저해제인 발리다마이신(validamycin A)을 배지에 첨가한 경우 트레할로스 생산량이 월등히 증가하였다. 뿐만 아니라 트레할로스 생산량은 ots BA의 induction을 위하여 첨가되는 opropyl \( \beta \)-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 농도에 상당한 영향을 받았다. 본 연구는 지방산이 제거된 폐글리세롤(pretreated crude glycerol, 전처리 폐글리세롤)을 탄소원 기질로 사용하여 트레할로스 생산균주 배양을 통해 트레할로스 생산 가능성을 조사하고 상기 핵심 배양 조건들을 최적화함으로써 트레할로스 생산성을 높이는데 그 목적이 있다. 이를 위하여 전처리 폐글리세롤이 함유된 배지에서 생산균주의 세포생장 및 생산거동을 조사하였다. 배양온도와 IPTG 첨가에 따른 영향을 조사하였다. 반응 표면 분석법을 사용하여 \( \mathrm { NaCl } \), 발리다마이신 및 IPTG 농도를 최적화하였다.</p> <p>본 연구에 사용된 배지는 \( 300 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { NaCl } \)을 포함하는 고장성 용액으로 대장균에 삼투압 스트레스를 유발시켜 트레할로스 생산을 촉진시킬 수 있다. 기존연구에서 야생형 대장균이 고장성 배지에서 약 \( 40 \mathrm { mg /l}\)의 트레할로스를 생산하였다. 따라서 IPTG를 첨가하지 않은 배양에서 생산균주가 트레할로스를 생산한 것은 배지의 고삼투성에 기인한 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 생산균주가 함유하는 재조합 유전자의 leaky expression으로 인하여 otsBA 오페론이 소량 발현되어 트레할로스 생산에 기여하였을 것으로 판단된다. 재조합 유전자가 탑재된 \( p \operatorname { Trc } 99 A \) 벡터의 leaky expression이 몇몇 논문에서 보고되었다. 본 결과를 바탕으로 모든 배양을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 IPTG로 induction 하며 실시하였다.</p> <h2>트레할로스 생산 극대화를 위한 IPTG, 발리다마이신 및 NaCl 농도 최적화</h2> <p>IPTG는 재조합 유전자를 induction시키고 발리다마이신은 트레할라이즈 활성 저해제이며 \( \mathrm { NaCl } \)은 삼투압 상승제로서 생산균주의 트레할로스 생산양을 증가시키는데 기여하는 핵심물질들이다. 따라서 Box-Behnken design 실험계획법을 사용하여 IPTG, 발리다마이신 및 \( \mathrm { NaCl } \) 농도를 최적화하기 위한 실험을 수행하였다. Table 2에 나타내었듯이, IPTG는 \( 0.1-1 \mathrm { mM } \), 발리다마이신은 \( 0.01-1 \mathrm { mM } \) 및 \( \mathrm { NaCl } \) 은 \( 50-450 \mathrm { mM } \) 농도 범위를 선정하였고 각각 세가지 농도 범위 \( (-1,0, + 1) \)에서 테스트를 수행하였다. 총 17개의 플라스크 실험을 수행하였는데, 중심점에서는 5회의 반복실험을 수행하여 실험의 재현성을 조사하였다.</p> <p>실험데이터를 이용하여 SAS 프로그램에서 완전 2차식으로 분석하였다. F-테스트와 분산분석 결과를 토대로 생성된 모델 방정식의 적합성을 평가하였고 그 결과를 Table 4에 나타내었다. 일반적으로 Prob > F 값이 0.05보다 작으면 모델이 유의미하다는 것을 나타내고 0.1보다 크면 보통 무의미한 것으로 간주된다. 2차식 모델의 Prob > F 값은 0.0020으로 나타나 높은 유의성을 나타내었다. 이는 ANOVA 절차에서 얻어진 모델이 적절하다는 것을 보여준다. 관측점들의 변동을 표본 회귀선들이 얼마나 잘 설명해주는가를 상대적으로 나타내는 결정계수인 \( \mathrm { R } ^ { 2 } \) 값도 \( 0.9668 \)로 높은 값을 나타내었다. 모델 방정식의 독립변수들 중에 \( \mathrm { X } _ { 1 } \)(IPTG 농도), \( \mathrm { X } _ { 3 } \)( \( \mathrm { NaCl } \) 농도), \( \mathrm { X } _ { 3 } { } ^ { 2 } \), \( \mathrm { X } _ { 1 } \mathrm { X } _ { 3 } \)가 유의미함을 나타내었고 \( \mathrm { X } _ { 2 } \)(발리다마이신 농도) 또는 이를 포함한 항은 통계적으로 무의미하였다. 이는 IPTG 농도와 \( \mathrm { NaCl } \) 농도가 트레할로스 생산에 영향을 미치는 핵심 변수인 반면 발리다마이신 농도의 영향은 크지 않음을 나타낸다. 따라서 예측 모델 방정식 수립 시 발리다마이신의 기여항을 고려하지 않았다. 이로부터 얻은 신뢰성 있는 모델 방정식은 다음과 같다.</p>	생명
	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 시료의 조제</h2> <p>본 실험에 사용된 해조류들은 갈조류 17종, 홍조류 11종 및 녹조류 7종의 35종으로, 최근 보고와 동일한 시료를 사용하였다(Table 1). 메탄올 추출물 조제를 위해서는 해조류들의 이물질을 제거하고 수돗물로 세척한 후 실온에서 음건하고, 건조 해조류들을 믹서기로 분쇄한 후 건조분말 해조류에 10배 부피의 메탄올을 가한 후 상온에서 2일 추출하였으며, 이를 4회 반복한 후 추출액을 모아 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압 농축하여 추출물을 제조하였다.</p> <h2>항산화 활성</h2> <p>조제된 추출물은 dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항산화 활성을 평가하였으며, 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) anion 소거능, 2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) cation 소거능 및 환원력을 측정하여 평가하였다. 대조구로는 vitamin C (Sigma Co., USA)를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각각 3회 이상 반복한 실험의 \( \operatorname{mean} \pm \mathrm{SD} \)로 표시하였으며, 소거능 평가에서 \( 50 \% \)의 소거능이 나타나는 시료 농도를 \( \mathrm{IC}_{50} \)로 나타내었다.</p> <h2>DPPH scavenging activity (DSA)</h2> <p>DSA평가는 기존의 보고한 방법과 동일한 방법을 사용하였다. 다양한 농도로 희석한 시료 \(20 \mathrm{\mu l}\)에 \( 99.5 \% \) 에탄올에 용해시킨 \( 2 \times 10^{-4} \mathrm{M} \mathrm{DPPH} \) 용액 \(380 \mathrm{\mu l}\)를 넣고 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시킨 후, \( 516 \mathrm{~nm} \) 에서 microplate reader (Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하고 다음의 식에 의해 DSA를 결정하였다. DSA \( (\%)=[1-(\mathrm{S} / \mathrm{C})] \times 100, \mathrm{C}: \) 용매 대조구 DMSO 첨가 시의 흡광도, S, 시료 첨가시의 흡광도.</p> <h2>ABTS scavenging activity (ASA)</h2> <p>ASA평가를 위해 \( 7 \mathrm{mM} \) ABTS (Sigma Co., USA) \( 5 \mathrm{ml} \)와 \( 140 \mathrm{mM} \) potassium persulfate 88 씨를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰으며, 이후 이 용액을 \( 414 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 에탄올로 희석하였다. 조제된 희석용액 \(190 \mathrm{\mu l}\) 와 해조류 시료 \(10 \mathrm{\mu l}\)를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 다음의 식에 의해 ASA를 결정하였다. ASA\( (\%)=(C-S) / C \times 100, C: \) 용매 대조구 DMSO 첨가시의 흡광도, S, 시료 첨가시의 흡광도.</p> <h2>환원력 측정(reducing power: RP)</h2> <p>에탄올에 용해시킨 해조류 시료 \( 2.5 \mathrm{ml} \)에 \( 0.2 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.6) \( 2.5 \mathrm{ml} \) 와 \( 10 \% \)potassium ferricya-nide \( 2.5 \mathrm{ml} \) 를 첨가하고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분 동안 반응시킨 후, \( 10 \% \) trichloroacetic acid \( 2.5 \mathrm{ml} \) 를 넣어 반응을 종료하고 \( 4000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 \( 0.1 \% \) ferric chloride 용액과 5:1 (v/v) 비율로 혼합하고 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 환원력을 평가하였다.</p> <h2>Nitrite 소거활성(Nitrite scavenging activity: NSA)</h2> <p>해조류 추출물의 NSA평가를 위해, 아질산염 용액 \( (1 \mathrm{mM}) \)에 시료용액을 가하고, 여기에 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \)을 가해 \( \mathrm{pH} 1.2 \) 로 조정한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시킨 후 Griess reagent (Sigma Co., USA)를 가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA (\(\%\))는 다음의 식에 의해 계산하였다.</p> <p>NSA \( (\%)=[1-(\mathrm{A}-\mathrm{C}) / \mathrm{B}] \times 100 \), A: \( (1 \mathrm{mM}) \)nitrite 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도, B: \( (1 \mathrm{mM}) \) nitrite 용액의 흡광도, C : 해조류 시료의 흡광도.</p> <p>대조구로는 vitamin C (Sigma Co., USA)를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각각 3회 이상 반복한 실험의 mean \( \pm \) SD로 표시하였으며, 소거능 평가에서 \( 50 \% \)의 소거능이 나타나는 시료 농도를 \( mathrm{IC}_{50} \)로 나타내었다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>실험 결과는 SPSS 18.0버전을 사용하여 mean \( \pm \) SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA Tukey LSD 통계처리방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 \( p \times 0.05 \) 로 하였다. 항산화 활성 평가 결과들의 상관관계 검토는 SigmaPlot 2001 (Ver 7.0)의 linear regression을 이용하였다.</p> <p>선별된 9종 해조류 추출물을 대상으로 다양한 농도에서의항산화 및 NSA를 평가한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 전체적으로 해조류 추출물 농도 증가에 따라 평가 활성의 증가가 나타났다. DSA의 경우 \( 62.5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 이하의 저농도에서는 대황과 감태가 가장 우수하였으나, \( 250 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상의 고농도에서는 모자반과 야마다모자반에서 우수한 소거능을 나타내었다. ASA 의 경우 모든 시험농도에서 감태, 곰피 및 대황 추출물이, 환원력 평가의 경우 대황 추출물이 다른 해조류 추출물과 비교할 때 우월한 활성을 나타내었다. NSA의 경우에는 곰피, 대황, 감태 추출물이 모든 시험농도에서 가장 강력한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 기존의 감태 곰피, 톳, 서실, 및 파래에 집중된 항산화 관련 연구를 다양한 해조류에 확대할 필요가 있음을 제시하고 있다.</p> <p>1차 선별된 9종 해조류의 항산화능 및 NSA의 \( \mathrm{IC}_{50} \)를 Fig. 2의 결과에 기초하여 계산하였다. Table 3 에 나타낸 바와 같이 vitamin C의 DSA, ASA및 NSA의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 각각 13.7, 5.7, 및 \( 9.5 \mathrm{lg} / \mathrm{ml} \)으로 계산되었다. 해조류의 경우 DSA 평가에서 대황, 감태, 모자반, 곰피 추출물은 \( 72.1 \sim 91.9 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \)를, 패, 넓패, 알송이모자반, 야마다모자반 및 잘피 추출물은 \( 108.8 \sim 232.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \)를 나타내었다. ASA 평가에는 대황, 감태, 곰피에서 \( 26.3 \sim 39.3 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 를, 야마바모자반 및 넓패에서 \( 90 \sim 112.8 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \)를 나타내었다. 또한 NSA평가의 경우 대황, 감태, 곰피에서 \( 9.8\sim 10.6 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \)를, 그 외의 7종에서는 \( 31.6 \sim 77.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{IC}_{50} \)를 나타내었다. 이러한 결과로서 기존에 알려진 대황, 감태, 곰피의 우수한 항산화능 및 NSA를 재확인할 수 있었으며, 추가적으로 야마다모자반 및 넓패 등의 유용 활성을 확인하였다. 본 연구에서 우수한 항산화능으로 최종선별된 넓패의 경우, 항고혈압 활성 및 항균활성이 확인되어 있으며, 최근 항산화능을 가지는 phlorotannins 화합물이 학술대회에서 보고된 바 있다. 따라서 본 연구에서의 넓패의 항산화 활성과 phlorotannins 물질이 관련이 있을 것으로 판단된다. 한편 강력한 항산화능을 나타낸 야마다모자반은, 모자반속으로 한국은 물론 중국, 타이완 일본 등지에 광범위하게 분포하고 있으며, 한국에서는 모자반, 괭생이모자반, 야마다모자반 등의 20여 종이 주로 보고되어 있다. 그러나 현재까지 야마다모자반에 대한 생활사 및 생리활성 연구가 진행된 바는 없다. 따라서 야마다모자반에 대해서는 추가적인 연구가 필요하며, 특히 야마다모자반의 우수한 항혈전 활성이 최근 확인되었으므로, 항산화, NSA 및 항혈전능을 동시에 가지는 유용 해양생물소재로 개발할 필요가 있다고 판단된다. 현재 최종선정 해조류들을 대상으로 활성물질의 정제 및 기작 연구가 진행 중에 있다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>국내 연안에서 수확된 33종의 해조류와 2종의 베트남 및 인도네시아의 해조류의 항산화능을 광범위하게 비교하였다(Table 1). 먼저 해조류 추출물 농도 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 DSA를 평가한 결과, 17 종의 갈조류에서는 감태, 곰피, 대황, 넓패, 패, 모자반, 알송이모자반 및 야마자모자반의 8 종에서 \( 60 \% \) 이상의 활성을 나타내었으며, 홍조류의 경우 11 종 모두에서 \(6 \% \)~ \(20 \% \)의 매우 낮은 DSA를 보였다. 녹조류의 경우 잘피에서만 \( 76.4 \% \)의 활성을 보인 반면 나머지 시료들은 \(2.3 \% \)~ \(9.5\% \)의 매우 약한 활성을 보였다(Table 2). 이러한 결과는 해조류들의 DSA가 각각의 polyphenol 함량과 비례한다는 기존에 보고를 고려할 때, 일반적으로 갈조류들이 녹조류 및 홍조류보다 polyphenol함량이 높음을 의미하며, 실제 기존의 본 연구팀에서 보고한 35종 해조류의 total polyphenol 함량 분석결과와도 일치하는 결과이다.</p> <p>ASA분석의 경우, 패와 고리메를 제외한 모든 시료에서 DSA분석결과와 유사한 패턴을 나타내었다. 패 추출물의 경우 \( 500 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 DSA는 \( 60.45 \% \)로 우수한 반면 ASA는 \( 45.01 \% \)로 나타나 상대적으로 음이온 소거능이 우수함을 알 수 있었으며, 고리메 추출물의 경우 DSA는 \( 11.01 \% \)로 미미하 였으나 ASA는 \( 51.09 \% \)로 양이온 소거능이 매우 강력하였다. RP측정의 경우, DSA 및 ASA 분석결과와 다른 양상을 나타낸바, 감태, 곰피 및 대황의 3 종만이 0.88이상의 강력한 활성을 나타내었다. 활성대조구로 사용된 vitamin C의 경우, \( 12.5 \mu \) \( \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 DSA, ASA 및 RP는 각각 \( 47.94 \%\, 87.97 \% \) 및 0.517을 나타내어 우수한 활성이온 소거능 및 환원력을 가짐을 확인하였다.</p> <p>35 종 해조류 추출물 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 대상으로, 식품에서의 발암인자인 nitrosoamine생성억제와 관련된 NSA평가의 경우 17 종의 갈조류 중 11 종에서 \( 70 \% \) 이상의 활성을 나타내었으나,홍조류의 경우 방사무니김 1종에서만 \( 80.82 \% \)의 소거능을 나타내었다(Table 2). 녹조류의 경 우에는 구멍갈파래를 제외한 모든 시료에서 \( 65 \% \) 이상의 소거능을 보여 갈조류와 녹조류가 홍조류보다 일반적으로 NSA가 높음을 알 수 있었다. 이러한결과는 vitamin C \( (12.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)의 NSA가 \( 71.25 \% \)임을 고려하 면 해조류의 NSA활성이 강력함을 의미하며, 감태, 곰피, 구멍 쇠미역의 NSA가 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 \( 79 \% \) 이상이라는 기존의 연구결과와도 일치한다.</p> <p>한편 해조류의 다양한 항산화능 및 NSA 분석 결과의 상관 관계는 Fig. 1에 나타내었다. 해조류의 경우 DSA와 ASA분석 결과는 약 0.8555의 상관계수를 나타내어, 대부분의 항산화 활성을 나타내는 해조류 시료는 음이온 및 양이온 소거능을 동시에 가짐을 추측할 수 있었다. 그러나, DSA와 RP (상관계수0.536), ASA와 RP(상관계수 0.70), ASA와 NSA (상관계수 0.345, DSA와 NSA (상관계수 0.323) 및 RP와 NSA (상관계수 0.23) 는 상관 관계가 높지 않았다. 이러한 결과는 해조류에서 는 polyphenol 물질 이외의 다양한 물질들이 항산화 및 nitrite 소거에 관여함을 추측하게 한다. 따라서 35 종의 해조류 중 항산화능 및 NSA활성을 동시에 나타내는 감태, 곰피, 대황, 패, 넓패, 모자반, 알송이모자반, 야마다모자반 및 잘피의 9종을 1차 선별하였다.</p> <h2>서 론</h2> <p>생명체는 생명을 영위하기 위해 에너지 생산이 필수적이며, 에너지 생산과정 중 산소를 최종전자 수용체로 사용하는 경우 활성산소(reactive oxygen species)의 생성은 불가피하다. 이러한 반응성이 강한 산화성 물질들은 생체 내 비특이적 항산화 물질들과 특이적 항산화 효소 시스템에 의해 제거되어야 하며, 그렇지 못한 경우 세포막 지질 및 DNA 손상, 세포사멸, 노화 및 암 등을 유발하게 된다.<p>인류는 오래 전부터 육상 천연물로부터 다양한 항산화 물질을 선별, 이용하여 왔으며, 최근에는 신규의 경제성 있는 항산화 물질을 개발하고자 해양자원을 적극 활용하고 있다. 삼면이 바다로 둘러싸여 있는 한국은 다양한 해양생물을 식용, 약용 및 화장품 등으로 이용하여 왔으며, 해조류 생산이 전 세계 4위에 달할 만큼 해조류 이용 및 양식산업이 매우 발달해 있다. 특히 김, 미역, 다시마, 청각, 파래, 톳 등의 해조류는 국내 주요 식품재료이며, 이들을 이용한 다양한 건제품, 염장품, 조미품 및 식품 첨가물을 가공, 판매하고 있다. 해조류의 경우 주로 재배, 수확 및 저장에 관한 연구에서 벗어나, 다양한 생리활성에 대한 연구가 진행되면서 식품, 의약품 및 화장품 분야의 이용이 빠르게 증가되고 있다. 실제 해조류의 고지혈증 및 고혈압 예방, 항당뇨, 항돌연변이, 항암, 멜라린 생성억제, 항염증 및 항응고 등의 기능들이 보고되면서 해조류를 건강기능성 식품원료로 인식하고 있으며, 최근에는 해조류의 fucoidans과 같은 다당류의 항혈전, 항암 및 중금속 제거 활성이 각광받고 있다. 또한 해조류는 항미생물 활성이 우수하여 항충치 및 항적조제로의 개발도 가능하다고 알려져 있다. 본 연구팀에서도 해조류를 이용한 건강기능성 식품소재 개발연구의 일환으로, 35종 해조류의 인간 트롬빈 저해활성을 포함하는 항혈전 활성을 검토하여 곰피, 대황, 넓패 등의 갈조류가 매우 우수한 항혈전 활성을 가짐을 보고한 바 있다.<p>본 연구에서는 35종의 해조류 추출물을 대상으로 in-vitro 항산화 및 nitrite 소거활성을 평가하였다. 기존 해조류의 항산화 활성 관련연구는 개별 해조류에 대한 다양한 활성 연구중의 일부로 보고되어 있으며, 주로 감태 곰피, 톳, 서실 및 파래 등에 집중되어 있다. 또한 일부 연구가 다수의 해조류를 대상으로 항산화 활성을 상호 비교 검토한 바 있으나, 강원 지역의 7종 해조류(다시마, 괭생이모자반, 곰피, 구멍쇠미역, 고리매, 김, 지누아리), 국민 다소비 해조류 5종(다시마, 톳, 미역, 파래, 김)등의 제한된 시료를 대상으로 이루어져 왔다. 따라서 본 연구에서는 해조류를 이용한 기능성 식품소재 개발의 기본자료로 이용하고자 국내 연안에서 수확된 33종의 해조류와 전 세계적으로 식용으로 널리 사용되는 포도송이해초(베트남산) 및 코토니(인도네시아산)를 대상으로 항산화능을 광범위하게 비교하였다. 그 결과 곰피, 대황, 감태, 야마다모자반 및 넓패에서 강력한 항산화 활성과 nitrite 소거활성을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.</p>	생명
한국 자생나리의 휘발성 향기성분	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>휘발성 향기성분 분석용 자생나리인 중나리(L. leichtliniivar. tigrinum Nichols.), 하늘나리(L. concolor var. parthneion Bak.), 하늘말나리(L. tsingtauense Gilg.), 섬말나리(L. hansonii Leichtl.) 및 털중나리(L. amabile Palibin.)는 2004년에 채취한 신선한 나리재료를 보존 \( \left(-20^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 한 것을, 전처리 없이 사용하였다. 각 시료는 자른 후 분쇄기(Heung sang trading Co., LTD)로 분쇄하여 사용하였다. 각 휘발성 향기성분의 동정에 이용된 탄화수소, 알코을류, 알데히드류, 케톤류 및 산류의 표준시약으로는, 각각 limonene 1-penten-3-ol, hexanal, \( (E) \) -2-octenal, (E,Z)-2,6-nonadienal (Aldrich, Milwaukee, WI, USA), 1-pentanol, 2-pentanol, nonanal, (E)-2-decenal, \( (E, E) \) -2,4-nonadienal, phenylacetaldehyde, \( (E, E) \)-2,4-nonadienal, (E, E)-2,4-decadienal, hexanoic acid, heptanoic acid, octanoic acid, dodecanoic acid (Wako, Osaka, Japan), 2-phenethy-lalcohol, 3-methylbutanol (Sigma, St. Louis, MO, USA), 그 외 시약은 Tokyo kasei, Fluka등의 특급 시약을 사용하였다.</p> <h2>휘발성 성분 농축물의 제조</h2> <p>자생나리 휘발성 향기성분 추출에는 Likens와 Nickerson 형 연속 증류 동시 용매추출장치를 사용하였다. 즉, 31 의 증류용 둥근플라스크에 분쇄한 자생나리 시료 각 \( 200 \mathrm{~g} \), 증류수 \( 1000 \mathrm{ml} \) 및 내부표준물질(I.S.)로서 tetradecane (tetra-decane을 dichloromethane중에 \( 80 \mathrm{ppm} \) 농도로 조제) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 넣고 중류하였다. 용매플라스크에는 \( 50 \mathrm{ml} \) 의 정제한 diethyl ether와 비등석을 넣고 \( 38 \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \) 의 수욕 온도에서 에테르증기를 환류하여 휘발성 향기성분을 추출하였다. 추출시간은 1 시간으로 설정하였다. 얻어진 휘발성 향기성분은 무수 황산나트륨을 가해 하룻밤 탈수 후, 상압에서 용매에테르를 제거하여 질소가스를 흘리며 약 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 까지 농축하였다. 얻어진 휘발성 향기성분 농축물 중 각 \( 0.6 \mu \mathrm{ll} \) 를 GC 및 GC-MS 분석에 사용하였다.</p> <h2>휘발성 성분의 분석 및 동정</h2> <p>연속 증류 동시 용매추출에 의해 얻어진 휘발성 향기성분 농축물은 Shimadzu model GC-17A (Kyoto, Japan)형의 gas chromatograph (GC)에 의해 분리하였다. 휘발성 향기성분의 검출에는 FID (불 꽃이온화검출기), 칼럼은 HP-5MS capillary column \( (30 \mathrm{~m} \times 0.25 \mathrm{~mm} \) i.d. \( \times 0.25 \mu \mathrm{m} \) film thickness : J & W Scientific, USA)을 사용하였으며, 오븐 온도는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 유지시킨 후 \( 220^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 \( 22^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \) 의 속도로 승온하였다. GC 주입부 및 검출기의 온도는 \( 200^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지하였다. Carrier gas는 질소가스를 이용하였으며, 유속은 \( 1.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 으로 하였다. 분석시 split mode로 split ratio는 \( 1: 38 \) 을 유지하였다. GC-MS 분석장치는 HP 6890와 HP 5973 Mass Selective Detector (Palo Alto, CA, USA)가 연결된 것을 사용하였다. GC-MS 분석시 GC 주입부, 검출기 및 interface 온도는 \( 200^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하였으며, 질량수측정범위는 \( 25 ~ 450 \mathrm{~m} / \mathrm{z} \), carrier gas는 helium, 선속도는 \( 40 \mathrm{~cm} / \mathrm{sec} \), electron multiplier voltage는 \( 1500 \mathrm{~V} \), MS의 이온화 전압은 \( 70 \mathrm{eV} \) 로 하였다. 그 외 column 및 분석 조건은 GC의 조건과 동일하게 하였다. GC에 의해 분리된 각 peak성분의 동정은 표준물질의 머무름 시간( \( \left(t_{\mathrm{R}}\right) \) 및 GC-MS분석 결과로 얻은 mass spectral library data와 비교하여 확인하였다. 각 성분의 정량치는 내부표준물질의 면적에 대한 각 peak 면적의 상대비로 계산하였다.</p> <p>관상의 대상인 꽃은 색과 모양이 무엇보다 중요하지만, 향기 또한 꽃의 기호도를 결정하는 중요한 인자로 작용한다. 나리(Liliaceae)는 세계적으로 가장 오랫동안 재배되어 왔으며, 특유의 모양과 색으로 인해 꽂꽂이, 부케, 종교의식, 화환 등으로 많이 이용되고 있으며, 민간요법, 향기치료 등 꽃을 이용한 문화적인 만족감과 생활의 여유를 제공하기도 한다. 우리나라의 경우 민간이나 한방에서는 나리에 비타민 C, 전분, 지방, 당분 및 소량의 알칼로이드가 함유되어 있어 음을 보하고 열을 내리며 폐를 다스려 심신을 안정시키는 효과가 알려지면서 나리의 인경이나 꽃을 이용한 죽, 나리차 등이 이용되기도 하였다. 또한, 말린꽃이나 잎을 베개 속에 넣어 사용하거나 향낭을 만들어 몸에 지넘으로 방향이나 장식목적 뿐만 아니라 향기치료로 이용한 것을 볼 수 있다. 우리나라의 자생 나리류의 경우 대체로 향이 은은하지만, 시판되는 나리의 경우 몇몇 종은 향이 우수하고 강하기 때문에 향장류의 원료로 이용된다. 특히 향이 강한 Madonna lily (L. candidum)의 경우, 발이나 피부질환에 치료 효과가 있어 약용 및 향수제조에 이용되기도 하며, 신선한 향기를 함유하고 있어 라일락과 시클라멘의 향을 강조하기 위해 합성정유, 조합향료로 사용되기도 한다[3]. 이와 같이 향장류의 원료로 이용가치가 높은 나리의 향기성분에 관한 연구는 장미, 양란, 프리지아 등 동일한 이용가치를 지닌 꽃에 비해 국내외적으로 연구가 부족한 실정이다.</p> <p>우리나라의 경우 꽃의 향기에 관해서는 거의 관능적인 평가를 주로 해왔으나, 최근 들어 분석기기를 통한 구체적인 향기성분 분석도 보고되어 있다. 하지만 자생나리의 향기성분에 관한 연구는 거의 되어 있지 않으므로, 전체적인 향기성분과 key compound를 밝힌다면 분화용 및 절화용 자생나리의 개발에 일조할 뿐 아니라 동정된 향기성분을 조합하여 국산향수 또는 방향제 개발의 자료로 이용 가능할 것이다.</p> <p>우리나라는 매우 중요한 나리 원산지 중의 한 곳으로 변종 10종을 포함하면 모두 22종이 자생하고 있으며, 자생나리의 대부분은 유색계로서 꽃의 모양이나 색이 아름답고, 내병성과 내한성 등 우수한 형질을 많이 지니고 있어 원종 자체만으로도 상당한 경쟁력을 지니고 있을 뿐만 아니라 개발가치가 매우 높다.</p> <p>본 연구는 우리나라 자생나리 중 분화용, 화단용 및 절화용으로 이용 가치가 높고 향이 뛰어난 중나리(L. leichtlinii var. tigrinum Nichols.), 하늘나리(L. concolor var. parthneion Bak.),하늘말나리(L. tsingtauense Gilg.), 섬말나리(L. hansonii Leichtl.) 및 털중나리(L. amabile Palibin.)를 중심으로 휘발성 향기성분을 분석하여 비교함으로서 나리의 향료용, 약용 및 아로마테라피 등에 대한 이용 가능성을 알아보고자 한다. 또한, 유사한 다른 종류의 국내산 꽃의 향기성분 분석 및 개발의 기초 자료로 활용함으로서 국내산 꽃과 식물의 정유성분을 구성하는 화합물의 규명, 국내산 꽃과 식물 정유를 이용한 방향제 개발 자료로 활용 가능한 것과 나아가 수입품에 의존하는 향기요법의 치료제를 국산으로 대체할 계기를 마련할 수 있을 것이다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>자생나리 종류별 향기성분 비교</h2> <p>실험에 사용된 5종류의 자생나리는 관능적인 향기에서 차이를 나타내었다. 형태와 색이 다른 자생나리의 휘발성 향기 성분 화합물의 결과는 Table 1 에 나타내었다. 자생나리류의 휘발성 향기성분으로는 hexanal, nonanal 등의 aldehyde류 28종, B-ionone 등의 ketone류 9종, linalool 등의 alcohol류 8종, methyl hexanoate 등의 ester류 5종, 2-furoic acid 등의 acid류 5종, 2-pentyl furan 등의 furan류 3종 및 기타 2종 등 60 종의 화합물을 추정 또는 동정하였다.</p> <p>중나리(sample A)는 다른 종류에 비해 향이 좀 약하였으나, 은은한 향과 토마토를 갈았을 때 나는 신선한 향을 느낄 수 있었다. 46종의 화합물을 동정 또는 추정하였는데 (E)-2-hexenal의 함량이 많았고 hexanal, hexanol 등의 함량도 많았다. 이들 탄소수 6 개의 알코올이나 알데히드는 풋풋한 풀 냄새에 기여하는 것으로, 국내산 반발효차에 특히 많이 함유되어 있다. 또한, 꽃향에 기여하는 phenylacetaldehyde가 소량 존재했지만, 동일하게 꽃향에 기여하는 화합물로 알려진 nonanal의 경우 함량이 특히 많았다.</p> <p>하늘나리(sample B)의 경우 호박을 삶았을 때 느낄 수 있는 달콤한 냄새를 top-note로 느낄 수 있었다. 동정된 휘발성 향기성분으로서는 풋풋한 풀냄새에 기여하는 (E)-2-hexenal 과 hexanal, 꽃향이나 산뜻한 과일향을 띄는 linalool의 함량이 많았다. 또한, 꽃향에 기여하는 phenylacetaldehyde도 동정되었으나, 특이하게 달콤한 꿀향이나 머스크향으로 알려져 있는 methylphenyl acetate가 많이 함유되어 있었다. 또한, 하늘나리에서는 약한 불쾌취도 느낄 수 있었는데 이들 불쾌취는 hexanoic acid, nonanoic acid 등 몇 종류의 산에서 기인하는 것으로 생각되어진다. 하늘나리에서의 불쾌취는 홍화꽃에서와 같이 강하지는 않았지만 홍화꽃의 불패취는 3-methylbutanoic acid을 비롯한 10 종류의 산에 의해 기인되는 것이 보고되어 있다. 3-Methylbutanal과 2-methylbutanal과 같은 저비점 알데히드도 있었는데 이 향은 달콤한 쵸콜릿 향을 낸다고 한다. Methylphenyl acetate, 3-methylbutanal 및 2-methylbutanal 등은 하늘나리의 특징인 달콤한 향에 기여하는 것 같다.</p> <p>하늘 말나리(sample C)는 관능적으로 하늘나리와 유사한 향을 띄고 있었으며 gas chromatogram의 pattern도 상당히 일치하였으나, linalool의 함량이 많고 장미꽃 향을 띄는 phenylethyl alcohol을 함유하고 있었다. 고비점부에 phenylethyl valerate 같은 ester도 함유하고 있어 하늘나리와는 약간의 차이가 있었다.</p> <p>섬말나리(sample D)는 약하지만 감홍시의 달콤한 향과 신선한 풀향기가 약하게 느껴졌다. 풋풋한 풀냄새에 기여하는 (E)-2-hexenal의 함량이 5 개의 시료 중 가장 많은 peak 함량을 나타내었고 강한 풀냄새를 내는 2,6-nonadienal도 함유되어 있어 이들이 섬말나리의 신선한 향에 기여하는 것 같다. 꽃향에 기여하는 nonanal의 함량도 중나리 정도 들어 있었고 중나리에 거의 없었던 linalool도 많이 함유하고 있었다. 달콤한 꿀향을 내는 methylphenyl acetate도 소량 함유되어 있었다.</p> <p>털중나리(sample E)는 신선한 풀향기를 주로 느낄 수 있었다. 풋풋한 풀냄새에 기여하는 (E)-2-hexenal의 함량이 많고 강한 풀냄새를 내는 2,6-nonadienal도 함유하고 있었다. 중나리와 마찬가지로 linalool은 거의 함유되어 있지 않았다. 특이한 점은 (E)-2-octenal의 함량이 많고 다른 나리에는 소량 함유하고 있었던 장미향을 띄는 phenylethyl alcohol의 함량이 특히 많은 것이 톡징이었다.</p>	생명
표면적이 증가된 반코마이신 결정화 공정에서 이온성 액체의 영향	<p>본 실험에 사용된 반코마이신은 토양으로부터 분리한 미생물인 Norcardia orientalis 배양을 통하여 얻었다. 발효액으로부터 균체를 제거하고, 반코마이신을 함유한 발효 배양액을 정제하였다. 양이온 교환수지와 음이온 교환수지 및 다공성 양이온교환수지를 연속 통과하여 암모니아로 용출 한 뒤, 알루미나 및 약산성 양이온 교환수지를 이용하여 색소 및 단백질 등의 불순물을 제거한 염산염 형태의 반코 마이신(순도: \( 88 \% \) )을 얻어 결정화 공정에 이용하였다.</p> <p>실리카겔을 이용한 표면적이 증가된 결정화 공정의 개략도를 Fig. 1에 나타내었다. 먼저 시료(반코마이신 순도: \( 88 \% \) ) 를 \( 1 \mathrm { ~N } \) 염산으로 \( \mathrm { pH } 2.5 \), 전도도는 염화나트름을 이용해 \( 20 \mathrm { ~ms } / \mathrm { cm } \) 로 조절한 증류수에 용해하고 이온성 액체의 종류와 양을 달리하여 반코마이신이 녹아 있는 증류수 용액에 첨가하였다. 본 실험에서는 범용으로 사용되는 대표적 이온성 액체인 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIm]Cl), 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate ([BMIm] [PF \( \mathrm { PF } _ { 6 } \) ), 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([BMIm] \( \left . \left [ \mathrm { BF } _ { 4 } \right ] \right ) \) 를 사용하였으며 이들의 주요 특성을 Table 1에 나타내었다. 반코마이신 \( 0.1 \mathrm { ~g } \) 을 증류수와 이온성 액체 혼합 용액 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 녹여 반코마이신 용액을 제조하였다. 염화나트륨는 \( \mathrm { pH } \) 에 영항을 주지 않기 때문에 \( \mathrm { pH } \) 부터 먼저 조절하였다. 교반 \( (640 \mathrm { rpm } ) \) 하에서 \( 3.5 \mathrm { ml } \) 아세톤을 \( 1.0 \mathrm { ml } \) 반코마이신 용액에 떨어뜨렸다. 교반을 중단하고 반응엑액부피당 표면적 증가를 위해 실리카겔(입자크기: \( 230-400 \) mesh, 기공지름: \( 60 \AA \), 기공부피: \( 0.79 \mathrm { ~cm } ^ { 3 } / \mathrm { g } \), 표면적: \( 405 \mathrm { ~m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \) )을 첨가 \( (0.15 \mathrm { ~g } \) silica gel \( / 4.5 \mathrm { ml } \) solution)하고 결정을 유도하였다. 생성된 반코마이신 결정을 여과지 \( (150 \mathrm { ~mm } \), Whatman,Buckinghamshire, UK)로 여과와 동시에 아세톤으로 세척하여 결정 표면에 불순물을 제거하였다.</p> <h1>표면적이 증가된 반코마이신 결정화 공정에서 이온성 액체의 영향</h1> <p>반코마이신은 그람양성 세균의 세포벽 합성을 억제하여 세균을 괴사시키는 최초의 당펩타이드계 항생물질이다. 메티실린에 내성을 갖는 황색 포도상 구균 치료와 폐니실린 또는 세팔로스포린에 알레르기가 있는 심내막염 치료에 널리 사용되고 있다. 또한 심장 수술, 정형외과 수술, 뇌 수술시 예방적 치료 목적으로도 많이 사용되고 있다. 미국 및 유럽 약전에 등재된 반코마이신의 경우 반코마이신 함량, 전체 불순물 함량 및 각각의 불순물 함량을 엄격하게 규제하고 있다. 이러한 규정을 충족시키기 위하여, 여러 단계의 분리 및 정제 공정을 거치게 된다. 일반적으로 항생제와 같이 고순도로 정제된 의약품 생산 공정에서 최종 정제 단계로 결정화 공정을 많이 도입하고 있다. 결정화는 최종제품의 순도향상뿐만 아니라 제품의 물성과 형태도 조절할 수 있는 기술로 에너지 소모가 적고 환경 친화적이다. 일반적으로 생물제품과 같이 용해도가 비교적 높은 용질의 경우 과포화도에 이르기 어려워 핵생성 속도가 매우 느리다. 따라서 결정화 장치 내부의 표면(반응기 벽, 교반장치 등)의 도움을 받아 결정핵이 생성된다. 반코마이신 결정화 역시 핵생성에 많은 시간이 소요되고, 결정화를 위한 반응기 내부 표면적 증가로 핵생성 속도를 증가시킬 수 있다. 반코마이신 결정화에서 주요 공정 변수들(용매, 보관온도, 시간, 전도도, \( \mathrm { pH } \), 온도, 교반속도, 초기농도 등)을 최적화하여 고순도, 고수율로 반코마이신을 생산할 수 있는 방법이 2010년에 보고되었다. 그러나 반코마이신 결정 생성에 많은 시간 \( ( \sim 24 \) 시간이 소요되어 결정화에 의한 반코마이신 대량생산에서 생산성을 저하시키는 원인이 되었다. 이러한 단점을 보완하고자 2011년과 2012년에 유리구슬 또는 이온교환수지를 이용하여 반응액 부피당 표면적(surface area per volume of reaction solution)을 증가시켜 반코마이신의 결정 생성 시간을 12시간까지 단축시킬 수 있었다. 하지만 생성된 반코마이신 결정의 질이 떨어지고 결정화에 여전히 많은 시간이 소요되고 있는 실정이다.</p> <p>이온성 액체는 낮은 증기압, 높은 열안정성, 높은 이온 전도도 등의 특성을 가지고 있어 기존의 휘발성 유기용매 대체 물질로 각광받고 있는 환경 친화적 용매이다. 이러한 이온성 액체의 독특한 특성 때문에 최근 단백질이나 유기성분의 결정화에 많이 응용되고 있다. 특히 단백질 결정화 과정에서 이온성 액체는 결정 양상(핵 생성, 결정 성장, 결정 형태/상태, 안정성)에 많은 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 연구에서는 실리카겔(silica gel) 을 이용한 반응액 부피당 표면적이 증가된 반코마이신 결정화 공정에 이온성 액체(ionic liquid)를 최초로 접목하여 결정화 효율, 특히 결정화에 소요되는 시간 단축 및 결정 질 (crystal quality)을 향상시키고자 하였다. 또한 최적의 이온성 액체의 종류와 농도를 선정하여 반코마이신 결정화 효율을 극대화하고자 하였다.</p> <p>반코마이신 결정 형태 및 크기 측정을 위하여 전자현미경 (SV-35 Video Microscope System, Some Tech., Korea)을 사용하였다. 결정화 공정을 통해 얻은 반코마이신 입자를 고배율 \( ( \times 500) \) 에서 관찰하였다. 관찰된 반코마이신 입자는 IT-Plus system (Some Tech., Korea)에서 동화상으로 확인하였으며 이를 통해 반코마이신 결정의 형태와 크기를 확인하였다.</p> <p>본 연구에서는 이온성 액체의 반코마이신 결정화에 응용가능성을 확인하기 위하여, 실리카겔을 이용한 표면적이 증가된 결정화에서 이온성 액체가 반코마이신 결정화에 미치는 영향을 조사하였다. 세 종류의 대표적 이온성 액체([BMIm]Cl, [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)],[BMIm][ \(P F_ { 6 } \)] 를 사용하여 실험을 수행하였다. 이온성 액체의 종류와 농도를 달리하여 결정화 9시간에서의 반코마이신 결정 양상을 Fig. 2 에 나타내었다. 이온성 액체 [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)]와 [BMIm][ \(P F_ { 4 } \)]는 모든 농도 범위 \(10-25 \% \), (v/v)에서 반코마이신 결정이 생성된 반면 [BMIm]Cl는 모든 농도 범위에서 결정이 생성 되지 않았다. 결정이 성공적으로 셍성된[BMIm][ \(B F_ { 4 } \)] 와[BMIm][ \(P F_ { 4 } \)]의 경우, 이온성 액체 첨가량이 증가함에 따라 반코마이신 결정의 모양이 보다 균일하고 일정해짐을 알 수 있었다. 이러한 결과는 이온성 액체가 결정성장 과정에서 물질 확산 속도를 매우 느리게 저해함으로써 일정한 모양의 결정이 깨끗하게 성장하는 곳으로 판단된다. 반면 이온성 액체 첨가량이 증가함에 따라 반코마이신 결정 크기는 오히려 감소함을 알 수 있었다. [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)]의 경우 이온성 액체 첨가량 \(10 ,15,20,25 \% \)(v/v)에서 입자 크기(평균 반지름)는 각각 148,130,95,53 \( \mu \mathrm { m } \) 를 나타내었다. 이러한 양상은 이온성 액체 첨가량 증가에 따라 단백질(xylanase)의 결정 크기가 증가한다는 기존의 보고와 상반된 결과로 표면적 증가물질인 실리카겔의 첨가에 따른 영향으로 분석된다. 즉, 이온성 액체 첨가량 증가에 따른 물질 확산 속도 감소로 실리카겔 표 면에서의 결정핵 생성이 촉진됨으로써 생성된 결정의 개수가 많은 반면 생성된 결정의 성장은 저해되어 결정 크기는 감소하는 것으로 판단된다.</p> <p>결정이 성공적으로 생성된 [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)]와 [BMIm][ \(P F_ { 4 } \)] 를 이용하여 이온성 액체 농도 \( (10,15,20,25 \%, ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)) 와 결정화 시간 (2,4,6 h) 변화에 따른 영향을 조사하였다. [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)] 의 경우, 결정화 2 시간, 이온성 액체 농도 \(10 , 15 \% ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)에서 결정이 생성 되지 않았다. 이온성 액체 농도 \( 20 \% \ ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 이상에서는 결정이 생성된 것치럼 보이지만 많은 부분이 뭉치거나 무정형 입자가 존재하였다. 결정화 4 시간에서는 결정화 2 시간에서와 마찬가지로 이온성 액체 농도 \( 10,15 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 에서는 결정이 생성되지 않았지만 \( 20,25 \%( \mathrm { v } / \) v)에서는 결정이 뚜렷하게 생성되었다. 결정화 6 시간에서는 이온성 액체의 농도와 상관없이 모든 조건에서 결정이 생성 되었다. 결국, 이온성 액체 [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)]의 경우 이온성 액체 농도 \( 20 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 첨가에 의해 결정화에 소요되는 시간을 4 시간으로 단축시킬 수 있었다. 또한 결정화 시간이 증가함에 따라 결정 성장에 의해 결정 크기도 증가함을 알 수 있었는데, \( 20 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } )[BMIm][ \(B F_ { 4 } \)] 첨가의 경우 결정화 4 , 6 시간에서의 입자 크기(평균 반지름)는 각각 \( 45,89 \mu \mathrm { m } \) 를 나타내었다. [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)] 의 경우, 결정화 양상은 [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)]의 경우와 다르게 나타났다. 결정화 2,4 시간에서는 모든 농도 범위에서 결정이 생성되지 않았다. 하지만 결정화 6 시간에서는 이온성 액체의 농도와 상관없이 모든 조 건에서 결정이 생성되었다. 결과적으로 최소의 시간으로 반코마이신 결정을 얻을 수 있는 이온성 액체는 [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)] 이며 이온성 엑체 농도 \( 20 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 와 결정화 4 시간에서 결정을 얻을 수 있었다. 결론적으로 실리카겔을 이용한 표면적이 증가된 결정화에서 이온성 액체 \( (20 \%, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 를 첨가한 경우 결정화 4 시간에 반코마이신 결정이 생성되었으며 실리카겔과 이온성 엑체를 사용하지 않은 경우보다 결정화에 소요되는 시간을 6 배 정도 단축시킬 수 있었다.</p> <h1>요 약</h1> <p>본 연구에서는 실리카겔을 이용한 반응액 부피당 표면적 (surface area per volume of reaction solution)이 증가된 반코마이신 결정화 공정에서 이온성 액체의 영항을 조사하였다. 실리카겔로 표면적을 증가시킨 경우에 이온성 액체 [BMIm][ \(B F_ { 4 } \)] 를 접목하면 결정화 효율을 더욱 향상시킬 수 있었다. 실리카겔을 이용한 표면적이 증가된 결정화에서 이온성 액체 \( (20 \%, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 를 첨가한 겅우 결정화 4 시간에 반코마이신 결정이 생성되었으며 실리카겔과 이온성 액체를 사용하지 않은 경우보다 결정화에 소요되는 시간을 6 배 정도 단축시킬 수 있었다. 또한 이온성 액체 첨가량이 증가함에 따라 반코마이신 결정 입자크기가 감소할 뿐만 아니라 결정이 균일하고 일정해짐을 알 수 있었다.</p>	생명
Endoplasmic recticulum stress와 관련된 유전자기능과 전사조절인자의 in silico 분석	<h1>고 찰</h1> <p>ER은 단백질 합성 및 새로 만들어진 단백질의 합성 후 변형이 일어나는 세포소기관으로 세포내 칼슘이온의 저장에도 중요한 역할을 담당한다. 그러나유전자의 손상에 의한 돌연변이, 포도당 결핍과 같은 대사이상이나 감염, 약물 등의 스트레스에 의해 소포체내에 비정상적인 단백질이 증가하면 ER stress 반응기전이 활성화된다. 이러한 ER stress 반응의 초기단계에서는 단백질합성억제, 비정상적 단백질제거 등의 적응반응을 통해 보상될 수 있으나, 적응한계를 넘어서는 과도한 ER stress의 경우 궁극적으로 세포는 세포사멸(apoptosis)을 일으키는 등 질병을 유발하게 된다.</p> <p>ER stress 반응에 관여하는 전사조절인자로는 ATF6, ATF4, CHOP, XBP-1등이 알려져 있으나, 다른 전사조절인자들에 대해서는 구체적으로 규명되지 않은 상태이다. 최근에는 ER stress가 당뇨병의 핵심 병태생리로 작용한다는 것이 알려지고 있으나, 구체적으로 ER stress 반응중 어떠한 조절인자가 작용하며, 어떠한 기전으로 당뇨병에서 나타나는 인슐린 분비 장애나 인슐린 저항성 등을 유발하는 지는 아직 구체적으로 알려진 바가 없다.</p> <p>그런데 ER stress 유도에 따른 표적유전자규명과 유전자네트워크구성은 gene expression microarray와 유전자의 pro-moter 영역에 해당하는 염기서열을 분석하는 생물정보학적방법을 이용하면 가능하다. 특히, 고등동물의 전사적조절이 다수의 전사조절인자와 결합염기서열간의 다양한 결합패턴에 의해서 결정된다는 점을 고려할 때, 훨씬 많은 수의 전사인자가 ER stress에 관여할 것으로 예측되어진다. 결국 전사조절인자들의 상위 및 하위레벨에 해당하는 또 다른 전사인자와 이들과 상호작용하는 유전자들이 밝혀져야 할 것이다. 따라서, 본 연구에서는 ER stress 반응을 유도하는 조건하에서 당뇨관련조직인 간세포에서 유전자발현의 profiling을 확보하고, 이를 이용하여 ER stress에 의한 유전자들의 기능적 변화와 핵심전사조절전사인자를 in silico로 분석하였다.</p> <p>Thapisigargin을 시간별로 처리한 Sk-Hep1 세포에서 total RNA를 분리하고 expression microarray을 행하여 유전자 발현 profiling을 확보하였다. 매우 유의적으로 expression co-herence을 나타내는 gene set을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene set을 다시 발현이 비슷한 것끼리 묶어 약 12 종류의 cluster로 분류하였다. 이들의 유전자들 기능을 GSECA 의 방법으로 분석하였을 때, lysosome, sugar binding, ER lumen (Cluster 6)에 관련된 기능이 증가하는 반면, mRNA processing, mitosis, nuclear mRNA splicing, DNA replication, DNA repair, cell cycle, electron transport chain, response to DNA damage, helicase activity, helicase activity, electron transport chain, response to DNA damage 등의 기능은 감소하였다. 이러한 기능의 변화는, ER stress가 유도되면 ER에 관련된 기능(ER lumen, ER to Golgi transporter)이 증가하여, ER stress에 대응하여 세포를 방어하는 기능들이 증가하나, 새로운 단백질의 생성(DNA replication, mRNA processing)이나, ATP 생성(Electron transport chain), DNA 수선(Response to DNA damage, DNA repair)과 세포분열(Mitosis) 등의 기능은 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 ER stress가 유도되면, 1) ER에 주어지는 과도한 부하를 감소시키는 기능들이 증가되어지나 2) ER stress가 점차 더 증가하면 mRNA transcription, ATP 생성이나 DNA repair 더 나아가 세포분열의 기능이 감소하여 세포의 활성이 감소됨을 알 수 있었다.</p> <p>ER stress에 의한 유전자의 조절에 관련된 전사조절인자들을 역시 생물정보학적 방법(GSECA)으로 분석하였을 때, FOXO4, AP-1, FOXO, HNF4, IRF-1, GATA 등의 전사인자들이 ER stress에 의해 발현이 증가하는 유전자들의 promoter에 공통적으로 존재하였으며, E2F, Nrf-1, Elk-1, YY1, CREB, MTF-1, STAT-1, ATF 등의 전사인자들이 발현이 감소하는 유전자들의 promoter에서 공통적으로 존재하여, 이들의 전사인자들이 ER stress에 의한 유전자의 발현조절에 중요한 역할을 하는 전사조절인자임을 알 수 있었다.</p> <p>이들 전사조절인자 중 HNF4, Foxo, AP-1 등은 gluconeo-genesis에 관여하는 phosphoenolpyruvate carboxylase kin-ase (PEPCK)의 발현을 증가시키는 대표적인 전사인자로, ER stress가 HNF4, Foxo, AP-1 등의 전사조절인자의 활성증가를 통해 PEPCK의 발현을 증가시켜 당뇨병을 유발할 것으로 판단되었다. 또한 미토콘드리아 biogenesis에 매우 중요한 전사인자인 Nrf-1이 ER stress에 의해 발현이 감소되는 유전자들의 promoter에서 발견되어 겼는데, 이는 ER stress에 의해 전자전달계의 기능이 감소하는 데에 관여할 것으로 생각 되어졌다. 즉, ER stress에 의해 Nrf-1의 활성이 감소됨으로써 전자전달계에 관여하는 유전자들의 발현이 감소되어, 전자전달계의 기능이 감소할 뿐만 아니라 미토콘드리아의 기능도 감소할 것으로 판단되었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양</h2> <p>실험에 사용한 세포주는 간암세포인 SK-Hep1으로 ATCC로부터 분양받았으며, \(15 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 2 \mathrm { ~mM } \) glutamine, \( 100 \mathrm { ~IU } / \mathrm { ml } \) penicillin, \( 100 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin등 이 포함된 DMEM 성장배지를 사용하여 \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 조건에서 배양하였다. ER stress 유도를 위해 SK-Hep1에 thapsi-gargin을 \( 1 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 4, 8, 12, 24, 48 시간 처리하였다.</p> <h2>RNA 분리 및 Affymetrix GeneChip</h2> <p>Thapsigargin을 시간별로 처리한 cell들과 처리하지 않은 cell들로부터 total RNA를 TRizol reagent (GibcoBRL, Invitrogen Corporation, USA)으로 분리하였으며, 이를 이용하여 double stranded cDNA 합성하였다. Biotin-labelling은 Affymetrix Labelling Assay kit (Affymetrix Inc, USA)을 이용하여 cDNA로부터 cRNA을 합성하면서 labelling하였으며, factionation된 biotin-labelled cRNA는 Human U133-Plus 2.0 (Affymetrix Inc) chip과 18 시간 동안 hybridization을 행하였다. Hybridization image는 GeneChip operating Software (Affymetrix Inc)으로 scan하였으며, Affymetrix Inc에서 제공하는 Biconductor package로 expression level을 정량하였다.</p> <h2>Functional gene sets 작성</h2> <p>Normalization값을 gene ontology (GO) 데이터베이스를 이용하여 유전자를 기능적으로 분류하였고, 통계프로그램인 Hypergeometric distribution (GSEA)를 이용하여 유의한 유전자군의 기능을 밝혔다. 유전자들을 기능별로 분류하기 위해 public gene database인 GO, KEGG, GenMAPP들을 바탕으로 유전자들을 grouping하였다.</p> <h2>Functional gene sets의 expression coherence을 이용한 functional clustering</h2> <p>각 functional gene set에 대해 GSECA을 이용하여 각 유전자들의 상관성을 결정하였다. 모든 가능한 유전자쌍들에 대해 Pearson correlation coefficient (PCC)을 계산하여 그 평균값을 각 functional gene set에 대해 expression coherence로 사용하였다. 매우 높은 expression coherence를 가진 func-tional gene set을 위해 gene set에 속해있는 평균 expression값을 계산하여 비슷한 expression pattern을 나타내는 functional gene set을 hierachical clustering으로 나타내었다.</p> <h2>Functional cluster들의 전사조절인자 확인</h2> <p>Regulatory motif gene set을 이용하여 각각의 functional cluster의 putative transcriptional regulator을 GSEA 방법을 변형하여 분석하였다. 전반적인 방법은 GSEA방법과 유사하나, GSECA에서는 gene ordering parameter로서 single to noise ratioo (SNR) 보다는 PCC를 사용하였다.</p> <h1>결과</h1> <h2>ER stress을 유도한 SK-Hep1에서 gene expression microarray</h2> <p>SK-Hep1에 ER stress를 유도하기 위해 ER stress 유도물질인 thapsigargin을 시간별 0, 4, 8, 12, 24, 48 시간)로 처리하였으며, ER stress marker protein인 peIF를 측정함으로써 ER stress 가 유도되었음을 확인하였다(data not shown). Expression mi-croarray은 thapsigargin을 처리한 각각의 세포로부터 total RNA을 분리한 후 Affymetrix의 Human U133-Plus 2.0 chip을 사용하여 유전자들의 발현을 분석하였다.</p> <h2>ER stress 에 의한 유전자의 기능적 변화</h2> <p>ER stress에 의한 유전자들의 기능변화를 GSECA의 방법으로 분석하였다. 매우 유의적으로 expression coherence을 나타내는 gene sets을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene sets을 다시 발현이 비슷한 것끼리 묶고 일반적인 k-means clustering algorithm을 이용하여 약 12종류의 clusters을 분류하였다. 이들 중 발현이 ER stress 유도에 따라 증가하는 cluster들과 감소하는 clus-ter들에 대해 유전자들의 기능들을 분석하였다. Table 1 에서 보는 바와 같이 ER stress 유도에 따라 lysosome, sugar binding, ER lumen에 관련된 기능이 증가하는 반면, mRNA processing, mitosis, DNA replication, DNA repair, cell cycle, electron transport chain, response to DNA damage, helicase activity, small nucleolar ribonucleoprotein complex, DNA-dependent ATPase activity, RNA transcription 과 관련된 기능은 감소하였다.</p> <h2>ER stress에 관련된 전사조절인자</h2> <p>각각의 functional clusters에 속해있는 유전자들의 발현을 조절하는 조절인자를 확인하기 위해, 각 유전자들의 promoter 에 존재하는 putative transcription factor motif을 이용하여 GSECA의 방법[2]으로 분석하였다. Cluster 3, 5, 7 과 cluster 5, 8, 7, 9의 유전자들의 전사조절인자를 분석한 결과, ER stress 유도에 따라 발현이 증가하는 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에 대해서는 FOXO4, AP-1, FOXO3, HNF4, IRF-1, GATA 등의 전사인자들이 공통적으로 존재하였으며, ER stress유도에 따라 발현이 감소하는 유전자들의 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에서는 E2F, Nrf-1, Elk-1, YY1, CREB, MTF-1, STAT-1, ATF 등의 전사조절인자들이 공통적으로 존재하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>Endoplasmic reticulum (ER)는 단백질 합성 및 새로 만들어진 단백질의 합성후변형 뿐만 아니라 세포내 칼슘이온의 저장 등에도 중요한 역할을 담당한다. 대부분의 분비단백 혹은 막결합단백은 ER에서 정상적인 구조를 획득하여 분비경로를 따라 이동하게 되나, 그렇지 못한 단백질(misfolded or unfolded protein)의 경우 ER의 분해기능에 의해서 제거된다. 그런데 ER stress는 이러한 ER의 단백질처리능력과 부하간의 불균형로 인해 일어나는 현상으로, 초기단계에서는 chaperon의 발현증가를 통한 단백질의 합성 후 변형 능력증가, 단백질합성억제, 그리고 비정상적 단백질제거 등의 보호반응(Unfolded Protein Response, UPR)으로 세포가 대처하나, 적응한계를 넘어서는 과도한 스트레스의 경우, 세포사멸(apoptosis)을 포함한 여러 가지의 병리적인 현상들을 유발한다.</p> <p>지금까지 과도한 ER stress는 프리온병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 신경질환의 원인으로 보고되어졌으나, 최근에는 ER stress가 제2형 당뇨병의 발병에도 중요한 병인으로서 관여함이 보고되어졌다. 당뇨병의 경우, 여러 조건에서 유발되는 ER stress가 c-jun N-terminal kinase (JNK)의 활성화를 통해 간이나 지방조직에서 인슐린 저항성(insulin resistance) 을 유도하고, 인슐린을 분비하는 췌장조직에서 \( \beta \)-cell의 세포 사멸을 유발함으로써 당뇨병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히, 비만유도가 된 동물모델과 고열량식을 섭취한 동물의 간과 지방조직에서 ER stress가 증가하고, 이에 따라 in-sulin receptor substrate-1 (IRS-1)의 tyrosine 인산화와 Akt의 serine 인산화가 감소하여 인슐린저항성이 유도됨을 밝혀, 비만에 의한 ER stress 증가가 당뇨병의 원인이 됨을 증명하였다. 한편, 이러한 ER stress을 감소시키는 chemical chaperon들을 처리하면 당뇨쥐에서 당뇨상태가 개선됨이 또한 보고되었다.</p> <p>ER stress와 질병과의 관련성에도 불구하고 ER stress에 의한 기능적인 변화 및 핵심적인 조절인자는 극히 일부만이 밝혀진 상태이다. ER stress에 의한 유전자발현의 조절은 전사적 수준(transcriptional level)에서 이루어져, ATF6, ATF4, CHOP, XBP-1 등의 몇몇 전사조절인자가 관여하는 것으로 알려져 있으나, 고등동물의 전사조절이 다수의 전사조절인자 및 조절특이염기서열의 복잡한 조합으로 이루어진다는 점을 고려할 때 횔씬 많은 수의 전사조절인자가 상호작용하여 ER stress 반응을 조절할 것으로 여겨진다. 그러므로 ER stress 와 관련된 핵심적인 전사조절인자를 찾아 이들의 작용기전을 밝히면, 질병발병에서의 역할규명 및 분자적 중재 방법 등을 개발할 수 있을 것이다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 ER stres와 관련된 기능적 변화와 핵심적인 조절인자를 규명하기 위해, 인슐린 작용조직인 간세포에서 ER stress를 시간별로 유도한 후, expression micro-array로 유전자의 발현을 분석하였고, 이 expression profiles 을 GSECA의 방법으로 분석하였다.</p>	생명
고강도의 윙게이트 테스트 후 식초섭취에 의한 회복기의 에너지기질 변화 연구	<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>신체적으로 건강한 체육학과 재학생 남자 7명을 피험자로 선정하였다. 피험자들은 최소한 3개월 이전에 어떠한 약물 복용 전력이 없었으며, 건강보조식품을 섭취하지 않았으며, 실험기간 중에도 섭취를 하지 않도록 교육하였다. 이들은 정규수업 교과목 이외에 약 1시간 정도의 자발적인 운동을 2개월 정도 실천하고 있었고, 엘리트 운동선수의 경험이 없는 상태였으며, 흡연을 하지 않는 피험자로 구성되었다. 피험자들은 실험에 참가하기 전에 본 실험의 목적과 방법에 대한 교육을 받았으며, 실험의 중요성과 위험성에 대한 설명을 듣고 실험참가 동의서를 제출하였다. 피험자들의 신체적 특징은 Table1 과 같다.</p><h2>실험진행</h2><p>피험자들은 12시간 이상의 공복을 유지한 상태에서 윙게이트 테스트 2시간 전에 실험실에 도착하여 용변을 본 후 피험자의 양 손과 발을 전해질 티슈로 청결하게 하고, 8개의 극점에 정확하게 위치할 수 있도록 지도한 후 체성분 분석기(InBody720 , 바이오스페이스, 대한민국)를 사용하여 체지방률을 분석하였다. 그 후 안정상태에서 \( 300 \mathrm{kcal} \) 의 균형영양식(단백질 \( 20 \% \), 지방 \( 25 \% \), 탄수화물 \( 55 \% \); 메디푸드 1.5, 한국메디칼푸드,대한민국) 2개를 섭취하여 섭취영양소에 대한 간섭을 최소화하였다. 1시간 30분의 안정상태를 유지한 후 10분간 가벼운 스트레칭으로 준비운동을 실시하였다.</p><p>윙게이트 테스트기(Excaliber Sport, Sweden)를 이용한 테스트를 실시하기 직전 안정상태에서의 혈액을 상완주전정맥에서 \( 10 \mathrm{cc} \) 채혈하였다. 각각의 피험자의 하지길이와 무릎 각도를 맞춘 후 기록하여 2차 실험 시에도 동일하게 적용하였다. 우선 안장의 높이를 맞추고 상체의 기울기를 일정하게 하기 위하여 손잡이의 거리를 조절한 후 페달에 발을 고정시킨 후 2분간 워밍업을 실시하였다. 이후 3초간 \( 50 \mathrm{rpm} \)으로 운동을 하면서 시작 5초 전부터 마이너스 카운트를 하여 30초가 되었을 때 [시작]이라는 구두신호와 함께 30초간 최대한 빠르게 실시하여 5초 간격으로 축의 회전 수를 기록하였다. 또한 30초의 전력운동이 끝난 후 30초의 휴식이 이어졌으며, 다시 동일한 반복운동을 하는 것을 3회 실시한 선행연구를 응용하여 적용하였다. 또한 테스트 2시간 후 회복기의 변화를 조사하기 위하여 동일한 방법으로 4회째의 윙게이트 테스트를 부하하였다. 이때의 운동능력은 컴퓨터와 연결되어 자동 측정되었으며, 최대파워, 평균파워 등을 분석하였다.</p><p>3회의 윙게이트 테스트가 종료된 직후 2차 채혈을 하였으며, 15분이 경과되었을 때, 식초군(Brown-rice vinegar: BRV)에게는 \( \mathrm{pH} 2.93\)의 현미식초 \( 50 \mathrm{ml} \)을 1차 증류수에 4배 희석하여 섭취시켰다. 윙게이트 테스트 직후 섭취하지 않은 이유는 예비실험 시 나타난 구토증상을 제거하기 위함이었다. 섭취한 현미식초의 초산함량은 최대 \( 4.55 \% \)이다. 또한 대조군(Control:CON) 에게는 동일한 양의 수분을 섭취하도록 하였다. 식초의 강한 향의 특성상 교차분석법(Cross-over de-sign)만을 실시하였으며, 1주일 간격으로 동일한 피험자를 대상으로 하였다. 또한 운동 후 30분, 60분, 그리고 120분에 각각 채혈을 실시하였다. 채혈시기와 동일하게 호흡수, 산소포화도, 심박수를 측정하였다. 호흡수는 누운 상태에서 피험자의 눈을 감게 하고 안면부에서 입과 코의 상단부에서 \( 10 \mathrm{~cm} \) 떨어진 곳에 \( 10 \mathrm{~cm} \times 10 \mathrm{~cm} \) 의 유산지를 위치한 후 1회의 움직임이 있을 때마다 카운터계(RS-4, Orion counter, Korea)를 이용하여 1분간의 횟수를 기록하였다. 심박수와 산소포화도 \( \left(\mathrm{SpO}_{2}\right) \)는 산소포화도측정기(Oxy9, Bionet, Korea)의 의료용 전극(WA-101 , 메디니스(주), 대한민국)을 오른손 검지에 장착하여 실시하였다.</p> <p>한편, 최대 무산소성 운동능력을 향상시키기 위해서 저장 에너지원의 효과적인 이용뿐만 아니라 피로요인을 최소화시키는 것은 매우 중요한 요소이다. 혈중 암모니아는 단백질의 이화작용에 의해 나타나며, 암모니아 농도의 상승은 중추신경계 피로를 유발하여 운동능력을 저하시키게 되고, 간에서의 제거능이 저하하고 뇌와 같은 기관에 노출됨으로 인하여 독성을 유발하게 된다. 그러나 일반적으로 수소이온농도가 5.0 이하로 나타나면 암모니아 생성이 감소하며, 실제로 \(\mathrm{pH} 3.0 \) 인 목초액에 의해 암모니아 농도가 감소하였다고 보고와 지구성 운동시 목초액 섭취에 의하여 혈중 암모니아 농도가 유의하게 저하한 연구결과가 있다. 본 연구에서도 섭취한 식초의 \(\mathrm{pH}\)가 2.93으로 매우 낮았으며, 혈중 암모니아 농도 역시 운동 후 회복기에 CON에 비하여 유의하게 낮게 유지된 결과는 젖산이 최대강도의 운동 중 급격하게 상승하는데 반하여 암모니아는 고강도의 운동 중 상승이 유발되지 않는다는 제언과 동일하다. 이는 운동 후 식초의 섭취는 운동 후에 의해 증가하는 암모니아 상승과 관련된 피로회복에 도움이 될 수 있다는 점을 시사하고 있다.</p><p>본 연구에서 분석한 코티졸은 스트레스 호르몬의 일종으로서 체내에서 이화작용을 증가시키며, 운동강도와 운동시간에 따라 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 코티졸의 상승은 두 집단 모두 운동 직후에 이루어졌으나, 회복기에 집단 간 차이가 없이 회복하는 경향을 보였다. 이는 섭취한 식초에 의한 영향은 나타나지 않은 것으로 생각되며, 탄수화물 섭취에 의하여 글루코스 농도가 높게 유지되었고 코티졸 농도가 낮게 유지되었다는 결과에 착안해볼 때, 본 연구에서 운동 후 회복기 120분에 BRV에서 글루코스 농도가 높게 유지되었다는 것과 관련이 있을 것이라 예상하며, 추후 지속적인 연구가 필요하다고 생각된다.</p><p>한편, 120분간의 휴식이 끝난 후 다시 1회의 윙게이트 테스트를 부하하였을 때 나타난 결과를 보면, 평균파워에서는 유의한 차이가 없었으나, 최대파워와 체중당 최대파워에서 BRV가 유의하게 높은 회복율을 나타내었다. 이러한 결과는 위에서 제시된 바와 마찬가지로 식초의 초산성분에 의한 피로회복의 촉진과 회복기 중의 탄수화물 산화 억제로 인하여 나타난 결과라 판단된다. 따라서 탈진적인 고강도 운동 후 식초 섭취는 최대파워능의 회복에 도움을 주어 반복적인 경기가 이루어지는 종목에 도움을 줄 수 있다고 생각된다. 따라서, 반복적인 윙게이트 테스트에 의해 유도된 탈진 이후의 식초 섭취는 피로물질의 제거 촉진과 회복기 탄수화물 산화의 억제를 유도함으로써 에너지원 회복에 도움을 주며, 반복적인 경기가 이루어지는 종목에 효과적으로 이용될 수 있는 영양보조물로서의 가능성이 있다고 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>피로회복은 단순하게 운동능력의 증진뿐만 아니라 개인의 건강증진 및 개선에도 매우 중요할 것이다. 실제로 규칙적인 운동을 하는 경우에도 운동에 의해 유발된 피로에 의하여 우울증 유발과 삶의 질 점수가 낮게 유지되며, 말초피로에 의한 신경근 장애 유발 및 부상의 위험성이 증대된다는 점을 고려해 볼 때, 피로회복은 매우 필요하여 운동 훈련 후에 나타나는 피로의 회복 촉진을 위해 다양한 연구가 시도되고 있다.</p><p>운동성 피로회복 또는 발생 지연을 위해 선택하는 방법으로는 가벼운 유산소성 운동에 의한 회복, 손바닥 냉각, 마사지 등에 관한 연구와 최근에는 운동에 의한 피로를 지연 또는 억제시킬 수 있는 영양보조물에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 실제로 항피로효과가 있는 영양보조물의 섭취로 인하여 운동에 의해 유발된 근피로가 억제되었다는 보고도 있다.</p><p>한편, 건강에 관한 관심의 증가에 대한 요구에 부응하기 위하여 건강식품의 개발과 판매가 확대되고 있다. 특히 비타민, 미네랄 등 미량 영양소의 제한적인 판매가 이루어졌던 과거와는 달리, 최근에는 식품으로서의 기능성을 추구하고자 하는 현상이 나타나고 있다. 우리나라는 오래 전부터 발효과정을 거친 식초를 섭취하고 있었으며, 최근에는 건강 기능성 식품으로서 광고 및 공중파에서도 건강증진에 효과가 있는 것으로 알려지면서 소비가 증가되고 있다. 그 효과로서는 피로회복 촉진, 혈중지질 감소, 식욕억제 효과 등이 보고되고 있으며, 지구성 운동시 지방산화의 증대의 결과도 나타나고 있다. 이러한 식초의 주성분은 초산이 대부분이며, 다양한 아미노산과 미네랄 역시 포함하고 있다. 초산은 간과 골격근의 대표적인 두 조직에서 phos-phofructokinase type I, II의 활성을 억제하는 작용을 하기 때문에 초산의 탄수화물 산화 억제 효과를 고려할 때 운동에 의해 유발되는 피로의 회복을 촉진하는 기능성 식품으로서의 효과가 있을 것이라 생각되며, 식초섭취에 의하여 지구성 운동 중에 자각적 피로도가 유의하게 낮았다는 선행 연구도 있다. 초산은 단쇄지방산이 일종으로서 식이를 제한하더라도 조직 내의 PFK-I의 활성을 억제하여 해당과정을 억제하는 작용을 한다.</p><p>운동과 관련된 기능성 식품으로서의 활용도를 증대시키기 위하여 다양한 방법으로 검증이 필요하며, 다양한 종류의 식초가 판매되고 있는 현실을 감안할 때 운동선수뿐만 아니라 운동을 즐기는 일반인의 운동성 피로의 회복촉진 관련 연구는 천연식품으로서의 식초의 우수성을 인정받는데 필요하다고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 식초가 고강도의 탈진적인 윙게이트 테스트 후 회복기의 에너지 기질 이용의 회복에 미치는 영향을 조사함으로써 기능성 식품뿐만 아니라 영양보조물로서의 가능성을 제시함으로써 천연식품의 이용증대와 운동에 참여하고 있는 개인에게 다양한 선택을 할 수 있는 자료를 제공하고자 한다.</p> <h1>고 찰</h1><p>본 연구는 반복적이고 탈진적인 고강도의 윙게이트 테스트에 의하여 피로를 유발한 후 식초 섭취가 회복기의 에너지 기질 이용에 미치는 영향을 조사하고자 신체적으로 건강한 남자 대학생 7명을 대상으로 수행하였으며, 윙게이트 파워의 변화와 혈액성분을 분석하였다. 본 연구에서 사용한 윙게이트 테스트는 단시간에 최대파워에 도달하게 되고, 무산소성 해당 과정을 통해 젖산의 축적과 근피로를 유발하는데 적절한 방법이다. 실제로 최근의 연구에서도 근피로를 유발하는 연구방법으로 선택하고 있으며, 완전한 탈진을 유도하기 위하여 고강도 운동의 적용방법으로서 3회의 반복을 응용하여 적용하였다. 또한 반복적인 윙게이트 테스트는 일회성 윙게이트 테스트에 비하여 운동 후 안정시까지의 회복시간이 더욱 요구되므로 120분까지를 회복기로 설정하였다.</p><p>우선, 본 연구의 Table 2에 나타난 윙게이트 테스트 전후와 회복기의 호흡수, 산소포화도, 그리고 심박수는 두 집단간 차이가 나타나지 않았다. 산소포화도는 실험 조건이 운동 전후와 회복기 모두 저산소 혹은 저기압 환경으로 실험환경을 통제하지 않았기 때문에 변화하지 않았을 것으로 판단되며, 만성폐색성폐질환자의 정상범위로 인정되는 것보다 높게 유지되었으므로 섭취한 식초에 의해 변화하지 않았다고 할 수 있다. 오히려, CON과 BRV 모두 집단 간 유의한 차이 없이 운동직후의 변화 이후에 회복 120분 동안 안정상태로 회복되었다는 것은 동일한 운동강도가 부하되었다는 점을 시사한다고 생각된다.</p><p>혈중 글루코스 농도는 운동 시 항상성을 유지하기 위하여 안정상태의 범위를 유지하는 것이 일반적이며, 고강도의 탈진적인 운동 시에는 증가하는 것으로 나타난다. 본 연구에서도 글루코스 농도는 운동 직후 소량 상승하는 것으로 나타났으나, 유의차는 없었다. 그러나 회복기 120분에 CON이 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 이는 윙게이트 테스트 의한 영향이라기 보다는 오히려 운동 2시간 전에 섭취한 식사가 소화·흡수되었으며, BRV의 경우 운동 직후 섭취한 식초의 초산이 탄수화물의 산화를 억제시켰기 때문이라 생각된다. 또한 식초섭취에 의하여 포만감이 연장되었으며, 식후의 글루코스 농도 역시 높게 유지되었다는 결과를 고려할 때 고강도의 운동 후 초산이 함유되어 있는 식초의 섭취는 탄수화물 농도의 유지에 효과적이라 사료된다. 실제로 식초를 섭취한 이후에 최대산소섭취량의 \( 60 \% \) 강도로 트레드밀 운동을 부하한 결과 탄수화물의 사용이 소량 억제되는 연구결과도 나타나고 있다.</p><p>일반적으로 탈진적인 고강도의 운동을 실시하게 되면 분해된 젖산에 의해 산성화가 유발된다. 그러나 본 연구의 결과에서 나타난 젖산 농도가 회복기 60분과 120분에 BRV에 비하여 CON에서 높음에도 불구하고 \(\mathrm{pH}\)는 CON과 BRV 모두 유의한 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 식초 섭취와 지구성 운동능력을 조사한 연구에서 보면, 식초 섭취군에서 운동 중 \(\mathrm{pH}\)가 대조군에 비하여 유의하게 낮은 것으로 나타나 본 연구의 \(\mathrm{pH}\)가 차이가 없는 것과는 다소 차이가 나타난다. 이는 본 연구에서는 부하한 운동 강도가 탈진적인 고강도 운동이었으나, 회복기에 나타난 변화를 알아보고자 운동 직후부터 신체활동을 최대한 제한하였고, 120분간의 회복시간 동안에 젖산의 지속적인 회복이 이루어졌기 때문이라 생각된다. 또한 젖산의 결과를 볼 때, 섭취한 식초 성분 중 대부분이 초산이었다는 점을 고려한 연구 즉, 실험쥐를 20시간 절식시킨 후 식이에 초산을 혼합하여 섭취시킨 결과 실험군이 대조군에 비하여 유의한 수준에서 젖산이 식후 8시간까지 낮게 나타났으며, 그 이유로서 고농도의 cAMP, 낮은 X-5-P,PFK-2/F26Bpase의 증가로 인한 F-2,6-P2의 감소 때문이라는 보고를 볼 때, BRV는 식초에 의하여 젖산의 생성이 감소하였다고 생각된다. 실제로 식초의 주성분인 초산 섭취에 의하여 탄수화물 산화가 억제되는 결과가 제시되고 있다. 또한 식초에 의해 억제된 탄수화물 산화와 함께 유리지방산의 변화는 운동 전후에는 집단간 차이가 나타나지 않았으나, 회복기 60분과 120분에 BRV가 높은 것으로 나타났다. 본 연구진의 선행연구에서도 식초 섭취에 의하여 유리지방산농도가 높게 유지되는 것으로 보고한바 있다. 이는 초산의 지방합성 억제 작용 때문이며, acetate +CoA+ATP \( \operatorname\Leftrightarrow \) acetyl-CoA + AMP + pyrophosphate의 과정이 발생되므로, AMP-activated protein kinase의 활성과 CPT-1 mRNA의 증가, 인슐린 농도의 감소 등의 결과가 작용하였으리라 생각된다. 따라서 운동과 관련된 식초의 효과는 탄수화물 산화를 효과적으로 억제함으로서 지방산화를 유지하는 결과가 나타난다는 점을 시사하고 있다.</p> <h2>혈액분석</h2><p>채취된 혈액은 즉시 \( 1.5 \mathrm{ml} \)의 Eppendorf tube에 옮겨 혈중 글루코스와 젖산을 생화학자동분석기(YSI 2300 plus, YSI institute, USA)를 사용하여 분석하였다. 또한 혈액의 수소이온농도를 분석하기 위하여 \( \mathrm{pH} \) meter (SP701, Suntex, USA)를 사용하였다. 나머지 혈액은 Serum separation tube에 옮겼으며, 초고속원심분리기(비전과학, 대한민국)을 이용하여 \( 2,000 \times \mathrm{g} \) 에서 15분간 원심분리하여 상청액을 분리 후 분석시까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고(Sanyo, Japan)에서 보관하였다. 유리지방산은 효소법을 이용하여 분석하였다. 우선 혈청 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 NEFAzyme (Shinyang, Korea) 용액 I \( 400 \mu \mathrm{l} \)과 잘 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응시킨 후 용액 II \( 200 \mu \mathrm{l}\)를 넣고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시켰다. 그 후 분광광도계(UV-1201,Shimadzu, Japan) 맹검을 대조로 파장 \( 555 \mathrm{~nm} \) 에서 검체의 흡광도를 읽은 후 표준액의 흡광도 및 농도를 이용하여 검체의 농도를 구하였다. 암모니아는 분석용 킷(Sigma, USA)를 사용하여 분석하였다. 요약하면, 제단백시약 \( 40 \mathrm{ml} \)와 혈액샘플 \( 1.0 \mathrm{ml} \)를 잘 혼합한 후 \( 2,500 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심분리기(비젼과학, 대한민국)를 이용하여 원심분리한 후 발색시약을 넣고 혼합하였다. 그 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20 분간 방치 후 파장 \( 630 \mathrm{~nm} \)에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 계산하였다. 코티졸은 원심분리 후 상청액을 cortisol \( \mathrm{Ab} \) 가 코팅된 검사 튜브에 검체를 \( 25 \mu \mathrm{l} \) 첨가한 후, \( { }^{125} \mathrm{I} \) cortisol (DPC, USA)을 \( 1.0 \mathrm{ml} \)씩 다시 첨가하고 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도로 45분간 반응시켰으며, 이러한 과정이 종료되면 튜브에 있는 내용물을 완전히 흡입한 후 \( \gamma \)-counter (Cobra 5010 II, Quantum, USA)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>자료처리</h2><p>피험자의 신체적 특징은 평균과 표준편차로 표기하였으며, 그 이외의 자료는 평균과 표준오차로 표기하였다. 통계는 윈도우즈용 통계프로그램인 SPSS 14.0K 를 사용하였다. 심폐기능과 혈중 에너지 기질의 변화를 살펴보기 위하여 \( 2 \times 5 \) (집단\( 2 \times \) 시기 5[0, 3, 30, 60, 120분])의 검정을 위하여 이원반복분산 분석을 실시하였고, 유의차가 있을 경우에 일원분산분석을 실시한 후 사후검정으로서 Tukey법을 사용하였다. 윙게이트 테스트의 집단 내 회복율을 알아보기 위하여 3차시기와 4차시기의 students' paired \( t \)-test를 실시하였으며, 집단 간 회복율의 차이분석을 위해 students' unpaired \( t \)-test를 수행하였다. 모든 차의 유의성은 \( \mathrm{p}<0.05 \) 이하로 설정하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>심폐기능의 변화</h2><p>3회의 반복적인 윙게이트 테스트 전후와 2시간 동안의 회복시에 나타난 심폐기능의 변화는 Table 2 와 같다. 호흡수는 윙게이트 테스트 전에 비하여 직후에 유의하게 증가하였으며 \( (\mathrm{p}<0.05) \), 이후 회복기 동안에 점차 감소하여 2시간이 경과하기까지 점차 회복하였다. 그러나 집단 간 유의차는 없었다. 산소포화도는 집단 및 시기간 모두 유의한 차이가 나타나지 않았다. 심박수는 운동 직후에 유의하게 증가하였다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 또한 두 집단 모두 운동 직후에 비하여 회복기에 유의하게 낮았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 그러나 집단간 유의차는 없었다.</p><h2>혈중 에너지 기질의 변화</h2><p>윙게이트 테스트 전후와 회복기의 혈중 에너지 기질의 변화는 Fig. 1과 같다. 혈중 글루코스(A)의 집단 간 차이는 운동 후 회복기 120분에 CON이 BRV에 비하여 유의하게 낮았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 혈중 유리지방산(B)의 집단 간 차이는 운동 후 회복기 60분과 120분에 BRV 가 CON에 비하여 유의하게 높았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 혈중 암모니아 \( (\mathrm{C}) \) 와 젖산(D)은 운동 후 회복기 60분과 120분에 BRV가 CON에 비하여 유의하게 낮았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 혈중 \( \mathrm{pH}\)(E)와 코티졸(F)는 운동 후 회복기 전기간에 걸쳐 집단간 유의한 차이가 없었다.</p><h2>윙게이트 파워의 변화</h2><p>3회의 반복적인 윙게이트 테스트와 2시간의 휴식 후 실시한 4회째의 윙게이트 파워의 변화는 Table 3과 같다. 전체 조사항목 모두 3회의 반복적인 윙게이트 테스트에 의해 점차 감소하였다. 평균파워의 회복 량은 CON과 BRV 모두 유의하게 증가하는 것으로 나타났으나 \( (\mathrm{p}<0.05) \), 집단 간 회복 량과 회복율은 유의한 차이가 없었다. 최대파워의 회복 량은 CON과 BRV 모두 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며\((\mathrm{p}<0.05)\), 집단 간 차이가 나타났다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 체중 당 평균파워의 회복 량은 CON과 BRV 모두 유의하게 증가하는 것으로 나타났으나( \( (\mathrm{p}<0.05) \), 회복 량과 회복 율의 집단 간 유의한 차이가 없었다. 체중당 최대파워의 회복 량은 CON과 BRV 모두 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며 \( (\mathrm{p}<0.05) \), 회복율은 CON에 비하여 BRV가 유의하게 높았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 총일량의 회복 량은 CON과 BRV 모두 유의하게 증가하는 것으로 나타났으나\((\mathrm{p}<0.05)\), 회복량과 회복율의 집단 간 유의차가 없었다.</p>	생명
Real-time PCR을 이용한 스트레스에 따른 벼의 Receptor like kinase (RLK) 유전자의 발현 변화 분석	<h2>상처 처리 후 Recptor like kinase genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>식물의 상처는 자연적인 바람, 재배를 위한 인간의 행동 그리고 곤충에 의해서 입게 되며, 이러한 상처는 식물의 생산성에 영향을 주는 요인으로 작용한다 (Kreps et al. 2002). 따라서 상처에 따른 receptor like kinase genes (RLGs) 발현 변화를 확인 하기 위해, 벼에 인위적인 상처를 줌으로써 RLGs발현 변화를 확인하였다.</p> <p>파종 후 14일 배양된 낙농벼에 멸균된 바늘을 사용하여 잎에 상처를 주고 이전 실험과 같이 각 4 시간과 24 시간 배양한 후 RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA를 사용하여 역전사 반응을 통해 cDNA 를 제작하였으며, 이 cDNA 를 주형으로 낙농벼의 염기서열을 바탕으로 설계된 Q-primer쌍을 사용하여 quantitative real-time PCR (QRT-PCR)을 수행하였다.</p> <p>본 과정에서도 QRT-PCR 에서 얻어진 각 RLGs의 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{T}\right) \) 의 수치를 상온에서 배양된 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값과 비교하고, 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값에서 각 RLG 의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값을 빼어(대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) - 상처 처리 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) ) 발현 변화를 확인하였다 (Fig. 7).</p> <p>상처에 대한 발현 변화는 몇 몇의 RLGs에서 확인 가능하였다. RLG 1, #6, 18, 20 의 경우 4 시간 후에는 뚜렷한 변화를 보이지 않았으나, 24시간 후에 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 4개의 RLGs를 제외한 유전자에서는 4시간과 24시간 후에는 대조군과 같은 수준의 발현을 보였다. 이는 상처에 대한 기준이 확실 하지 않아 얻어진 결과로 판단되었으며, 따라서 이에 따른 추가적인 실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.</p> <p>식물의 Receptor like kinase (RLK) 단백질들은 signal sequence, single transmembrane region, cytoplasmic kinase 도메인으로 구성되어 있으며, RLK genes (RLGs)은 호르몬 반응 경로, 세포 분열, 식물의 성장과 발달, 자가 불수분 그리고 공생과 병원균 인식과 연관 되어 있다는 가능성은 이전 연구들에 의해서 보고되고 있으나, 주요 작물의 하나인 벼의 RLK에 대한 연구는 미비한 실정이다.</p> <p>본 연구에서는 RLKs의 단백질 서열을 기반으로한 분석을 수행하여, 단백질간의 차이를 확인하였으며, 또한 RLKs를 암호화하는 RLGs의 발현 변화 mRNA 수준에서 확인하였다. 실험을 통해 확보된 RLGs (RLG1, RLG5, RLG6, RLG#6, RLG8, RLG10, RLG17, RLG18, RLG20)의 발현 변화를 real-time PCR을 사용하여 분석하였으며, threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{T}\right) \) 수치의 비교를 통해 발현 변화를 비교하였다. RLGs의 발현 변화는 벼의 기관을 나누어 확인하였으며, 식물의 생장 및 생산성에 영향을 주는 주요 스트레스 (저온, 염분, 미생물 감염, 상처)에 의한 변화를 확인함으로써 그 기능에 대한 정보를 분석하였다.</p> <p>벼의 receptor like kinase (RLK)의 아미노산 서열 분석 결과에서 일부 도메인으로 판단되는 위치를 제외한 부분에서 상당히 낮은 유사성을 보였으며 (Fig. 1), 유전자 분석 프로그램을 통해 제작된 phylogenetic tree에서도 3 개의 그룹으로 분리되는 성향을 보여 (Fig. 2), 단백질 간의 차이 확인이 가능하였다. 이러한 결과에서 각각의 RLGs가 상당히 다양한 신호를 인지 할 것으로 예상되었으며, 이를 통해 단백질 서열 상에서도 큰 차이를 보이는 벼 유래 RLKs에 대해 그 각각의 기능을 분석하기 위한 연구가 분자수준에서 연구되어야 할 것으로 판단되었다.</p> <p>Real-time PCR 을 적용한 RLGs의 발현 분석 결과에서 각 유전자는 잎에서 가장 많이 발현되는 것으로 확인 되었으며, 다음으로는 뿌리에서 발현 되는 것을 확인하였다 (잎>뿌리>줄기, Fig. 3). 실험의 결과를 통해 이 후 스트레스에 따른 RLK 유전자 발현 변화 실험은 잎을 사용하여 수행하였다.</p> <p>식물체가 성장하면서 받는 스트레스는 식물의 성장에 큰 영향을 미치며, 특히 주요작물의 수확량의 \( 50 \% \) 를 감소시킨다고 보고 되었다. 따라서 현재 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물체를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 벼에 존재하는 RLK 유전자가 외부 스트레스에 대하여 어떠한 분자적인 특징을 갖는지 알아보고자 하였다. 스트레스로는 물리적 스트레스인 저온 (low temperature), 화학적 스트레스에 해당되는 염 (salts, NaCl ) 그리고 병원체의 침입에 따른 스트레스에 관여되는 호르몬 처리 (salicylic acid, SA), 인위적 상처 (artificial wound)를 선정하였으며, real-time PCR을 사용하여 각 유전자의 발현을 측정하여 결과를 확인하였다.</p> <p>저온의 환경에서 RLG5를 제외한 모든 유전자가 4 시간과 24 시간에서의 발현 변화에는 차이가 있지만, 시간이 지날수록 발현이 증가하였다 (Fig. 4). 이 결과로 저온에서 벼의 항상성을 유지하기 위해 RLGs가 과발현 된다는 사실을 확인하였으며, RLGs가 과발현된 벼는 저온에 대한 저항성을 갖게 될 수 있을 것이라 예상되었다. 다음으로 염에 대한 반응은 NaCl 을 처리함으로써 확인하였으며, 처리에 따라 RLGs 모두 발현이 감소되었으나 4시간 후와 비교하여 24시간 후에는 어느 정도의 발현양이 회복되는 것을 확인하였다 (Fig. 5). 저온에서 RLGs발현이 증가한 것은 온도 저항성을 갖는다는 가능성 보여 주었으나, 염에 대해서는 반대로 발현이 감소하는 것으로 보아 이는 RLGs가 염에 대해서 저항성을 갖지 않는 다는 것으로 해석 되었다.</p> <p>병원균 감염에 대한 반응을 나타내는 호르몬인 SA 와 인위적인 상처에 대해서는 각 RLGs에 따라 발현 변화가 다르게 나타났다. 두 스트레스에 대해 먼저 4시간 후 각 RLGs의 발현은 감소하였으나, 24 시간 후에 SA에 대해서는 감소됐던 발현이 회복되는 것을 확인 할 수 있었으나 (Fig. 6) 상처에 대해서는 더 억제되는 양상을 보이는 유전자가 많았다 (Fig. 7).</p> <p>따라서 본 실험 결과 RLGs중에서도 외부 영향에 따라 발현이 증가 또는 감소에 대한 반응이 다르게 나타냈으며, 이는 RLGs에 따라 인식하고 반응하는 것이 다르다는 것을 나타낸다는 것을 의미한다 하겠다.</p> <p>본 연구 결과 스트레스에 의한 RLGs는 다양한 스트레스 중 저온에 대한 저항성을 가진다는 가능성을 제시하며, 냉해 등에 대한 저항성을 갖는 신 품종 개발을 위한 분자생물학적 자료로서 본 연구의 결과가 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>유전자 분석과 계통발생학적 분석</h2> <p>PCR 증폭 및 일반적인 molecular cloning을 통해 확보된 모든 receptor like kinase genes (RLGs)의 염기서열은 NCBI의 Basic Local Alignment and Search Tool (BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)를 통해 GenBank에 등재된 RLGs의 염기서열과 비교하여 상동성을 확인하였다. 분석에 적용된 염기서열의 GenBank accession number는 table 1에 나타내었다. 염기서열이 확인된 RLGs의 단백질 서열은 ClustalX(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)에서 아미노산 서열을 정렬하고, Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA 3, http://www.megasoftware.net) 프로그램에서 Neighbour-Joining 방법으로 계통발생학적으로 분석하였으며, TreeView 프로그램 (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)를 통해 확보한 계통발생학 (Phylogenetic) tree를 확인하였다.</p> <h2>식물재료 및 스트레스 처리</h2> <p>본 실험에서는 국내 재배용 벼인 낙동벼 (Oryza sativa L.cv. Nakdong)를 농촌진흥청 유전체실험실에서 제공받아 사용하였으며, 볍씨 파종 후 14일이 지난 식물체에 각각의 stress를 처리하였다. 환경적인 stress로는 상처와 저온의 온도를 처리하며, 화학적인 stress로는 Salicylic acid (Duchefa, Netherlands) 처리와 Sodium chloride (Daejung, Korea)를 처리함으로써 염에 따른 stress를 처리하였다.</p> <p>상처에 대한 단백질 발현 효과를 위해 멸균된 바늘을 사용하여 잎에 상처를 낸 후 1 시간과 24 시간 후 두 번에 걸쳐 수확하였으며, 대조군은 상처를 내지 않은 잎을 수확하였다. 저온의 처리는 배지를 포함한 식물체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간과 24시간 후 수확하고, 대조군은 상온에서 배양하였다. 화학적 처리를 위해 \( 25 \mathrm{mM} \mathrm{SA} \) (Salicylic acid)와 \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) (Sodium chloride)을 처리하였다.</p> <h2>Total RNA의 추출</h2> <p>식물의 잎 조직을 절단하여 \( 500 \sim 600 \mathrm{mg} \) 씩으로 나눈 후, 조각 낸 시료 절편을 미리 액체 질소로 냉각된 막자 사발에 넣고 시료가 해동되지 않도록 액체 질소를 부어가며 완전한 분말형태가 될 때까지 분쇄하였다. 분쇄된 잎 조직을 멸균된 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) tube에 담고 RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 실험법은 제조사의 지시를 그대로 따르며, 순수 분리한 total RNA 시료는 spectrophotometer (Eppendorf, Germany)를 이용하여 정량 한 후 RT-PCR에 사용하였다.</p> <h2>First-Strand CDNA 합성</h2> <p>순수 분리한 식물체의 total RNA를 사용하여 cDNA를 합성하기 위해 역전사반응을 수행하였다. 과정은 \( 2 \mu \mathrm{g} \) 의 total RNA 를 oligo \( \mathrm{dT} \) (100 pmole)와 섞어 준 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 가열하여, 바로 ice에 정치한 후 \( 10 \times \) Reaction buffer, \( 100 \mathrm{mM} \) DTT, dNTP (각 \( 2.5 \mathrm{mM} \) ), 200unit MMLV 역전사 효소 (Bioneer, korea), 10 unit RNase (Invitrogen, USA)를 이용하여 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 의 최종 부피로 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다. 반응이 종료된 cDNA mix는 RNaseH (Fermantas, USA)를 처리한 후 바로 quantitative real-time PCR에 사용하였다. 효소를 이용한 실험은 모두 제조사의 지시를 따랐다.</p> <h2>Quantitative real-time PCR 용 primer의 제작</h2> <p>본 연구에서 발현 분석에 대상이 되는 벼의 receptor like kinase 유전자들은 (RLGs; RLG1, RLG5, RLG6, RLG\#6, RLG8, RLG10, RLG17, RLG18, RLG20) 선행 연구를 통해 유전자 염기서열이 규명되었으며, 그 염기서열을 바탕으로 Real-Time PCR에 사용된 primer (Q-primer)의 염기서열을 결정하였다. 염기서열이 결정된 Q-primer은 internet-based primer 제작 프로그램인 Primer3 v0.2을 이용하여 제작하였으며, NCBI 의 BLAST search를 통해 primer 염기서열의 유일성을 검증하였으며, primer 제작 회사를 통한 주문 (Bionics, korea)에 의해 제작되었다 (Table 1).</p> <h2>Quantitative real-time PCR</h2> <p>먼저 table 1 의 선별된 Q-primer의 최적 annealing 온도를 알아보기 위해 Exicycler Quantitative Thermal Block (Bioneer, Korea)의 gradient 기능을 이용하여 gradient PCR 을 수행하였다. 재조합 pBX-RLG plasmid DNA \( 1 \mathrm{ng} \), 각 RLG-F/R Q-primer 10 pmole에 2x GreenStar PCR premix (Genetbio, Korea) 를 첨가하여 최종 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 반응용액을 사용하였다. 여기서 선정된 annealing 온도는 역전사효소 반응으로 합성된 cDNA 를 주형으로 수행한 Quantitative real-time PCR에 적용되었다. 전사효소 반응액 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 중 \( 1 \mu \mathrm{L} \) 와 10 pmole의 각 RLG-F/RQ-primer로 총 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 반응액으로 하여, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 로 10 분간 전해리를 수행한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 20 초간 해리, 각 annealing 온도에서 20 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 초간 중합의 과정을 35 cycle 수행하였으며, 용응온도분석 (Melting point analysis)은 \( 50-94{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 구간을 측정하여 \( \mathrm{Tm} \) 값을 결정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Receptor like kinase genes (RLGs)의 유전자 분석 및 계통발생학적 분석</h2> <p>Receptor like kinase genes (RLGs)의 분석을 통해 유전자 간의 특징을 확인하고자 하였다. 유전자 분석을 위해 molecular cloning을 통해 전체 ORF를 포함하는 유전자를 확보하였으며, 유전자 분석 프로그램을 적용하여 유전자의 정확성을 확인하였다. 확인된 각 RLGs를 이용하여 단백질의 기능을 결정하는 요소인 아미노산 서열을 기준으로 하여 각 단백질 간의 차이를 확인하였다.</p> <p>벼의 receptor like kinase (RLK)의 아미노산 서열 분석 결과에서 kinase 도메인으로 해석되는 약 390 아미노산 잔기부터 610 아미노산 잔기까지 비교적 높은 유사성을 보였으나, 신호 분자와 접촉이 예상되는 N-terminal 도메인을 포함한 부분은 그 유사성이 매우 낮은 것으로 확인되었다 (Fig. 1). 이 결과는 RLK의 구조상 다양한 신호를 인지 할 것으로 예상되는 N-terminal 도메인의 아미노산 서열상의 다양성을 보여준 것이라 하겠다.</p> <p>RLKs 의 단백질 서열들에서 그 다양성을 확인하였고, 이들을 자료로 유전자 분석 프로그램을 통해 계통발생학적 분석을 수행하였다. 이 분석에서는 단백질 전체 서열에 대한 분석과 상동성이 높은 부분 즉, kinase 도메인을 중심으로 하는 부분만을 선정하여 분석하였으며 두 실험에 대한 결과로 계통발생학 (Phylogenetic) 연관성을 살펴보았다 (Fig. 2).</p> <p>결과적으로, 형성된 두 종류의 phylogenetic tree에서 각기 세부적이 차이는 보였으나, 공통적으로 3 개의 그룹이 형성됨을 확인할 수 있었다. RLG6, RLG18, RLG20, RLG8이 한 그룹으로 지정 되었고, RLG10, RLG5, RLG1, RLG17등이 또 하나의 그룹으로 지정되었으며, RLG\# (sharp로 대체 표기함)6은 이들과는 별도의 각각의 그륩임을 보여 주었다(Fig. 2).</p> <h2>기관별 Receptor like kinase genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>식물은 각 기관에 따라 특정 유전자 발현에 차이를 나타낸다고 보고된 연구 결과 (Jinn et al. 2000)에 의거하여 약 14일간 성장시킨 벼를 임의로 잎 (leaf), 줄기 (stem), 뿌리 (root)의 세 부분으로 구분하였으며, RNA 추출 kit를 사용하여 벼의 각 기관에서 추출된 total RNA각 기관에 따른 receptor like kinase gene (RLGs)의 발현 차이를 확인 하였다. quantitative real-time PCR (QRT-PCR)에 사용되기 위해 제작된 Q-primer들의 annealing 온도를 결정하기 위한 gradient PCR에 주형으로 사용되었다. Q-primer의 annealing 온도는 RLG1, RLG5, RLG8가 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 이며, RLG6, RLG\#6, RLG17, RLG18, RLG20는 \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 로 결정되었다. 결정된 annealing 온도를 기반으로 QRT-PCR을 수행하였다.</p> <p>Receptor like kinase gene 1 (RLG1)을 포함한 RLGs의 줄기에서 나타난 발현은 잎과 뿌리에 비교하여 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{\mathrm{T}}\right) \) 값이 최대 2.0 cycle에서 0.83 cycle까지 증가하는 것으로 확인되었다. \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값이 증가하는 것은 유전자의 발현이 작은 것을 의미하므로, 모든 RLGs의 발현이 줄기에 비교하여 잎과 뿌리에서 상대적으로 많은 것으로 해석되었다. 이러한 결과는 대조군인 actin 유전자가 줄기에서 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값이 약 3 cycle 정도 앞당겨지는 것과 비교됨을 보여 주었다 (Fig. 3). Actin 의 경우 줄기에서 가장 많은 발현을 확인 하였고 (줄기>뿌리>잎), RLGs들은 잎에서 가장 많이 발현되었으며, 다음으로는 뿌리에서 발현 되는 것을 확인하였다 (잎>뿌리>줄기).</p> <p>식물의 RLK는 다양한 기능에 연관되어 있으며, 동물과 비교하여 거대한 그릅을 갖고 있기 때문에 (Morris and Walker 2003) 각 RLGs를 독립적으로 분석해야 할 것으로 판단되었다. 본 연구에는 모든 기관에서 RLG6의 발현이 가장 많았으며, 다음으로 RLG20, RLG18, RLG#6, RLG17, RLG8, RLG5, RLG10 순으로 발현의 차이를 보였다. RLG1의 경우 다른 RLGs와 비교하여 특히 뿌리에서 발현이 더 낮아지는 결과를 보여주었다. RLG1을 제외한 RLGs는 뿌리의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값을 기준으로 잎보다는 약 0.4 cycle이 큰 것을 보여주었으며, 줄기보다는 약 2.5 cycle이 작은 것으로 확인되었다. 결과적으로 잎과 줄기에서의 RLG 발현은 거의 차이를 나타내지 않았다. 그에 비교하여 RLG1의 발현은 줄기와 잎에 비교하여 각각에서 1 cycle이상의 차이를 보였다. 즉 다른 뿌리에서 RLG1 의 발현이 작아졌다는 것을 의미하며, 이러한 결과는 식물체의 각 기관에서 RLGs의 기능이 다르게 작용한다는 것을 간접적으로 제시하는 것이라 하겠다.</p> <p>본 실험의 결과를 바탕으로 이후 스트레스에 따른 벼의 RLK 유전자의 발현 변화를 확인하기 위한 실험에서는 모든 RLGs의 발현 형식이 같은 잎과 줄기를 사용하여 실험을 수행하였다.</p> <h2>저온에서의 Receptor Like Kinase Genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>저온의 처리를 통해 receptor like kinase gene (RLGs)의 발현 변화를 확인 하기 위해서 파종 후 14 일 배양된 낙농벼를 저온 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 각 4 시간과 24 시간 배양한 후에 RNA 를 추출하였다. 역전사 반응을 통해 cDNA 를 제작하였으며, 이 DNA를 주형으로 사용하여 낙농벼의 염기서열을 바탕으로 설계된 primer 쌍을 quantitative real-time PCR (QRT-PCR)에 적용하였다.</p> <p>QRT-PCR 에서 얻어진 각 RLGs 의 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{\mathrm{T}}\right) \) 의 수치를 상온에서 배양된 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값과 비교하였으며, 대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값에 비교하여 수치가 모두 증가 한 것을 확인하였다. 정확한 비교를 위해 대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값에서 저온 처리를 한 벼의 각 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값을 빼고 그 차 (대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) - 저온처리 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) )를 확인하였다 (Fig. 4).</p> <p>각 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값의 차가 양수를 나타내므로 대조군과 비교하여 각 RLK 유전자의 발현이 증가하였다. RLG5를 제외한 모든 유전자에서 4 시간과 24 시간에서의 발현 변화에는 차이가 있지만, 시간이 지날수록 발현이 증가하는 것을 확인하였다. RLG5의 경우 4시간 후와 24 시간 후에서 발현의 차이가 없었으나 대조군에 비교하여 발현이 증가한 것은 확인 하였다. 이는 저온의 환경에서 RLGs의 발현이 증가하는 것을 말한다. 즉 저온의 환경에서는 RLGs 발현이 증가되어야 식물체가 유지될 수 있다는 것으로 해석 할 수 있었다. 따라서 식물이 저온의 환경에서 적응할 수 있도록 하는 RLGs기능에 대한 가능성을 의미한다고 하겠다.</p> <h2>NaCl 처리에 따른 Receptor like kinase genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>염은 식물의 발아 및 성장 등에 복합적으로 영향을 주는 스트레스 요인으로 보고되어 있으며, 특히 벼를 포함하는 주요 작물에서 염 스트레스에 대해 저항성을 갖는 유전자의 탐색과 분석이 활발히 진행되고 있다 (Diedhiou et al. 2008; Hu et al. 2008). 파종 후 14 일 자란 벼에 \( 100 \mathrm{mM} \) NaCl 을 처리한 후 각 4 시간과 24 시간 후에 RNA 를 추출하여 Receptor like kinase genes (RLGs) 유전자의 발현 변화를 확인하였다.</p> <p>RLGs 발현을 나타내는 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{\mathrm{T}}\right) \) 값과 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값의 차를 통해 NaCl 처리 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) - 대조군 \( \left.\mathrm{C}_{\mathrm{T}}\right) \) 유전자 발현 변화를 확인하였다 (Fig. 5).</p> <p>NaCl 이 처리된 벼에서 대조군에 비교하여 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값이 커졌으며, 스트레스를 처리한 시점에서 4시간 후에는 2 3 cycle이 24시간 후에는 \( 1.3 \sim 2 \) cycle의 차이를 보여주었다. NaCl 처리에 의해서 RLGs 의 발현이 감소했다는 것을 확인하였으며, 전체적으로 NaCl 을 처리한 벼는 저온의 환경에서 배양된 벼에서 보여진 결과와 비교하여 모든 RLGs 가 감소되는 변화를 보였다.</p> <p>그러나 저온의 벼에서 RLG5를 제외한 모든 RLGs의 발현이 시간이 지날수록 증가한 반면 NaCl 을 처리한 벼에서는 24시간 후에 대조군에 비해서는 그 발현양이 감소 하였으나, 4 시간에서 보여진 RLGs 발현의 감소보다는 증가한 것을 확인 하였다. 이 결과에서 또한 RLG5는 4 시간에서와 24 시간에서 그 차이를 보이지 않았으며, 저온에서는 발현 증가를 보였고, NaCl 처리에서는 발현감소를 보였다.</p> <p>이 결과로써 염분에 의해서 RLGs의 발현이 억제된 다는 것을 확인 할 수 있었으며, 이러한 억제는 24 시간 후에 RLGs의 발현이 증가하는 것으로 보아 염에 대한 적응이 형성되어 유전자 발현이 회복되는 것으로 판단되었다.</p> <h2>Salicylic acid처리에 따른 Receptor like kinase genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>Salicylic acid (SA)는 식물체에서 미생물 침입에 반응하는 기능을 갖는 식물 호르몬으로 보고되었으며 (Loake and Grant 2007), 미생물 침입에 있어 RLGs의 발현 변화를 확인하기 위해 실험을 수행하였다. SA 를 최종 농도 \( 25 \mathrm{mM} \) 로 파종 후 14 일 배양된 낙농벼에 처리하였다. 처리 후 각 4시간과 24시간 배양한 후에 RNA를 추출하였으며, 역전사 반응을 통해 cDNA를 제작하였다. cDNA를 주형으로 하여 Receptor like kinase gene의 발현 변화를 확인하기 위해 quantitative real-time PCR (QRT-PCR)을 수행하였다.</p> <p>발현 변화의 확인은 QRT-PCR에서 얻어진 각 RLGs의 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{T}\right) \) 의 수치를 상온에서 배양된 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값과 비교하였으며, 대조군의 \( \mathrm{C}_{T} \) 값에서 각 RLK 유전자의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값을 빼고 (대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}}-\) SA 처리 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) ), 그 차이를 통해서 유전자 발현 변화를 확인하였다 (Fig. 6).</p> <p>전체적인 결과에서 SA에 처리에 따른 RLGs의 발현은 시간이 지남에 있어 같은 현상을 보였다. 먼저 4 시간 후 각 RLK 유전자의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값은 대조군과 비교하여 약 1 cycle 감소하였으며, 24시간 후에는 감소됐던 발현이 중가하여 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값의 차가 회복 되는 것을 확인 할 수 있었다. 결과를 통해 RLGs는 두 개의 그룹으로 나누어 그 양상을 구분 할 수 있었다. RLG1, 5, 8, #6, 20을 포함하는 그룹은 24시간 후에도 대조군에 비해 발현이 감소된 상태를 보였으며, RLG 10, 6, 17, 18 를 포함하는 그룹은 24 시간 후에 발현이 대조군에 비해 증가된 양상을 보여주었다.</p> <p>따라서 RLGs는 미생물 침입에 있어서 짧은 시간 발현이 급속하게 감소 되었지만 시간이 지남에 따라 발현이 회복되는 것은 RLGs이 미생물 침입에 직접적인 신호 전달에 의해서 그 발현이 억제 되었으나 이 후, 발현이 회복되면서 이차적인 신호 전달 기능을 갖고 있을 것이라는 가능성을 보여주는 것이라 해석하였다.</p> <h1>서론</h1> <p>작물은 생장하는 전 기간 동안 하나 또는 그 이상의 복합적인 환경요인이나 생물학적 요인에 의하여 비정상적인 생리적 과정을 수반하게 됨으로써 잠재적 생산손실을 내포하게 된다. 이러한 요인들을 작물의 스트레스라 하며, 작물이 가지는 높은 적응력 (Kreps et al. 2002)에도 불구하고, 스트레스는 전 세계적으로 벼 (Oliza sativa)를 비롯한 대부분의 주요 농작물 생산의 \( 50 \% \) 이상을 감소시키는 작물 생산 감소의 원인이 된다 (Boyer 1982).</p> <p>이러한 스트레스는 식물에 존재하는 다양한 수용체 (receptor)를 통해 외부 신호로 인지되며, 수용체로 분류되는 Receptor-like kinases (RLKs)는 17년 전에 옥수수 (Zea mays)에서 처음으로 발견되었으며 (Wlker and Zhang 1990), 세포 외 영역(extracellular domain), transmembrane 단백질, kinase 영역이 보존되어있는 세포질 영역 (cytoplasmic domain)으로 구성되어있음이 밝혀졌다.</p> <p>식물의 RLK는 동물의 receptor kinases (RKs)와 유사한 구조를 가지며, 많은 연구를 통해 식물의 RLK 활성 메커니즘이 동물의 Receptor tyrosine kinases (RTKs)의 활성 메커니즘과 유사할 것이라 보고되었으나 (ven der Geer et al. 1994; Shiu and Bleecker 2001; Castells and Casacuberta 2007), 동물이 6개의 RLK/Pelle 그룹을 갖는데 비해 식물의 RLKs는 거대한 유전자 그룹으로 되어있어 (Arabidopsis) 600 개 이상의 그룹을 갖는 것으로 알려져 있으며 (Shiu and Bleecker 2003), 그 기능에 대해 아직 많이 알려져 있지 않고 있다.</p> <p>현재까지 많은 식물 종에서 RLKs가 확인되었고, 식물의 생활사에서 RLKs의 다양한 역할이 보고되고 있다 (Becraft 2002; Dievert and Clark 2003). 식물의 RLK는 transmenbrane 단백질로서 세포로 하여금 외부로부터의 신호를 인지하며 그로부터 세포 내 kinase 영역을 통하여 신호를 증폭함으로써 (Ohtake et al. 2000) 식물의 세포의 신호 전달에 주요한 역할을 한다.</p> <p>식물의 RLKs는 세 개의 그룹으로 분류되며, 첫 번째 그룹은 Brassica에서 발견된 세포 외 S-도메인을 포함하는 S-locus receptor kinases (SRKs)와 S-locus glycoproteins (SLGs)이다. SRK 와 SLG 는 암술머리에서 발현되며 자가수분 억제와 관련된다 (Nasrallah and Nasrallah 1993; Takasaki et al. 2000).</p> <p>두 번째 그룹은 독특한 세포 외 도메인으로 분류되는 CrRLK1과 Wak1이며, Catharanthus roseus에서 발견된 CrRLK1은 다른 RLKs와 비교하여 세포 안과 밖의 중간이 아닌 세포 내부의 인산화 메커니즘에 사용된다고 알려져 있다. Wakl은 Arabidopsis thaliana에서 발견되었으며, 병원체와 salicylic acid에 의해서 발현이 유도된다.</p> <p>세 번째 leucine-rich repeat (LRR) 단백질 그룹은 식물의 세포의 분화 및 증식, 형태 형성의 성장과 발달을 조절하는 가능을 하며 (Torii et al. 1996; Li and Chory 1997; Becraft 2002; Mstsubayashi et al. 2002), 또 다른 기능은 병원성 미생물의 저항성을 갖는 벼의 Xa21과 같이 식물과 미생물의 상호 작용 및 식물의 방어 작용에 관련 되는 (Song et al. 1995; Gomez and Boller 2000; Endre et al. 2002; Nishimura et al. 2002; Stracke et al. 2002) 세포적 기능에서 주요한 역할을 한다고 보고되어 있다.</p> <p>본 연구에서 RLK의 발현을 분석하기 위해 사용된 Real-time PCR은 thermal cycle와 spectrophotometer를 함께 구동하여, 실시간으로 PCR 산물의 변화를 형광시약을 통해 측정할 수 있는 정량방법으로 (Wilhelm and Pingoud 2003), 다양한 질병 진단 (Baczynska et al. 2004; Ratti et al. 2004), 유전자 변형 작물의 선별 (Paradigol et al. 2003; Ronning et al. 2003; Han et al. 2007), 특정한 유용 유전자의 발현 (Lee et al. 2004; Wang and Levin 2006) 등에 널리 응용되고 있다(Klein 2002).</p> <p>따라서 본 연구에서는 주요 작물 중에 하나인 벼에 대하여 그 생산성에 영향을 주는 스트레스 중, 물리적 스트레스인 온도 (temperature), 화학적 스트레스에 해당되는 염 (salts) 그리고 생물학적 스트레스로 병원체의 침입에 관여하는 호르몬의 처리 (salicylic acid), 인위적 상처 (artificial wound)를 벼에 처리한 후 Real-time PCR 정량법을 적용하여 RLK 유전자의 발현 변화를 mRNA 수준에서 분석함으로써 그 RLKs 유전자의 특성을 분자생물학적 수준에서 밝히고자 하였다.</p>	생명
형질전환된 Escherichia coli변이주에서 Sodium citrate를 이용한 고농도 L-Threonine 생산	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>E. coli MT201과 재조합 균주인 E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산량 비교</h2> <p>L-Threonine 생산균주인 E. coli MT201의 생육 및 L-threonine 생산량을 확인하기 위해 탄소원이 포도당으로 구성된 발효배지에서 유가식 배양을 실시하였다. 5 liter 발효조를 이용하여 유가식 배양을 실시한 결과 E. coli MT201의 경우에 총 배양 112 시간 동안에 균체량은 흡광도(OD660)을 기준으로 약 52까지 증가하였고, 배양 중 L-threonine은 최고 \( 57 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 가 생산되었다.</p> <p>L-Threonine의 대량생산을 위해서는 전구물질인 oxalo-acetate의 과량생성이 필요하다. 이를 위하여 해당과정의 py-ruvate로부터 직접 oxaloacetate를 생성하는 pyruvate car-boxylase의 과량생산을 위한 발현용 plasmid, pPYC를 제작하였다. Koffas 등과 Peters-Wendisch 등의 논문을 참조하여 양 말단에 HindIII 제한효소부위를 지니는 primer를 각각 제작하였다. 이들 primer로 Corynebacterium glutamicum으로부터 정제·회수된 염색체 DNA로부터 Takara LA Taq kit (Takara, Japan)를 이용하여 Delta Cycler II system (Ericomp, USA)으로 Takara사의 실험법에 따라 실시하여 pyc 유전자를 포함하며 HindIII의 제한효소부위를 양 말단에 지니는 약 \( 3.4 \mathrm{~kb} \) 의 DNA단편을 획득하였다. 이들 PCR 산물의 확인은 plasmid pUC19의 HindIII부위에 cloning하여 DNA sequencing을 통하여 pyc 유전자의 ORF 임를 확인하였다(결과 미제시). 한편 \( 4.2 \mathrm{~kb} \)의 E. coli에서 발현하는 plasmid \(\mathrm{pTrc} 99 \mathrm{~A} \)를 먼저 제한효소 NcoI 으로 절단하여 평활화시킨 후에 reading frame을 맞추기 위하여 HindIII 링커(Takara, Japan)를 부착하여 최종적으로 제한효소 HindIII로 절단한 후에 이 부위에 상기의 pyruvate carboxylase 유전자를 포함하는 \( 3.4 \mathrm{~kb} \)의 DNA 단편을 연결하여 \( 7.5 \mathrm{~kb} \)의 expression plasmid pPYC를 제작하여 agarose gel상에서 확인하였다(결과 미제시)</p> <p>상기의 방법으로 제작된 plasmid를 E. coli MT201에 도입하여 형질전환된 균주인 E. coli MT / pPYC를 획득하였다. E. coli MT / pPYC의 L-threonine 생산성을 확인하기 위해 모균주인 E. coli MT201의 배양 조건과 동일한 조건으로 유가식 배양을 실시하였다. 유가식 배양 결과 균체의 증식(OD660)은 총 배양 122시간에 약 41까지 증가하였고 L-threonine은 최고 \( 36.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 까지 생산되었다</p> <p>형질전환균주 E. coli MT/pPYC는 glucose하에서 E. coli MT201보다 균체 증식 및 L-threonine 생산량 모두가 감소되었다. 이는 포도당이 해당과정을 거쳐 TCA 회로를 회전하면서 생육에 필요한 전구체인 중간대사 산물을 공급해 주어야 하는데 pyruvate carboxylase에 의해서 oxaloacetate로의 공급은 원활하였으나 상대적으로 TCA 회로의 중간 대사산물의 공급이 원활하지 않아 균체의 생육이 억제 받았으며 이로 인하여 일차대사산물인 L-threonine 생산량이 감소한 것으로 추측된다.</p> <h2>플라스크 배양에서 균체 생육 및 L-threonine 생산에 대한 sodium citrate의 영향</h2> <p>TCA 회로 상의 중간대사 산물을 공급함으로써 E. coli MT / pPYC의 생육 및 L-threonine 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 citric acid를 포도당과 함께 공급하였다. 배양액 중의 pH를 고려하여 sodium citrate와 ammonium citrate의 영향을 각각 조사한 결과로부터 sodium 염이 ammonium 염보다 균체 증식 및 생산에 효율적임을 알 수 있었다(결과 미제시).</p> <p>E. coli MT201과 E. coli MT / pPYC 의 생육 및 L-threonine 생산에 필요한 탄소원으로 포도당만을 첨가한 경우와 포도당과 sodium citrate를 함께 첨가한 경우를 각각 플라스크 상에서 비교하였다. 플라스크 배양에 사용된 탄소원은 각각 포도당\((5\%)\), 그리고 포도당 \( (3 \%)\) + sodium citrate \( (2 \%) \) 으로 하였다.</p> <p>플라스크 배양 결과 모균주인 E. coli MT201에서 탄소원으로 포도당만을 사용한 배양에서는 \( 0.99 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 L-threonine이 생산된 반면 \( 2 \% \)의 sodium citrate를 같이 첨가한 배양에서는 탄소원으로 포도당만을 첨가한 경우보다 훨씬 높은 \( 4.18 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 L-threonine이 생산되었다. L-Threonine 생산량의 증가뿐만 아니라 균체의 증식(OD 660) 역시 3.02에서 8.76으로 증가하였다(Table 2).</p> <p>재조합 균주인 E. coli MT / pPYC에서의 플라스크 배양 결과도 E. coli MT201을 이용한 배양의 경우와 유사한 결과를 보였다. 따라서 L-threonine 생산량 증대를 목적으로 형질전환된 E. coli MT / pPYC 균주에 대해서 sodium citrate의 첨가가 L-threonine 생산량뿐만 아니라 균체 증식(OD660)에 대해서도 포도당만을 탄소원으로 사용한 경우에 비해 더 좋은 효과가 있음을 확인할 수 있었다.</p> <h2>L-Threonine 생산을 위한 포도당 및 sodium citrate의 최적 농도</h2> <p>플라스크 배양에서 E. coli MT / pPYC 에 대한 탄소원으로 포도당과 sodium citrate를 혼합한 배양이 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 있어 효과적임을 확인하였다. 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 영향을 주는 탄소원의 최적 농도를 결정하기 위해 포도당과 sodium citrate를 \( 5 \% \) 이내에서 다양한 농도비로 첨가하였다.</p> <p>플라스크 상에서 포도당과 sodium citrate의 농도비 (4:1, 3.5: 1.5,3: 2,2.5: 2.5,2: 3)를 다르게 하여 배양을 실시한 결과 균주의 생육은 배양 전반에 걸쳐 유사한 증식형태를 보였다. L-Threonine 생산성을 검토하면 sodium citrate의 농도가 높을수록 초기 L-threonine 생산량은 증가되었으나 특히 포도당과 sodium citrate의 농도비가 3.5:1.5의 비율로 첨가되었을 때 가장 높은 생산량\( (5.14 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \) 을 보였다(Table 3).</p> <p>L-Threonine 생산량과 마찬가지로 균체의 생육 역시 포도당과 sodium citrate의 농도비 3.5:1.5의 비율로 첨가되었을 때 L-threonine 생산 균주의 생육이 가장 좋았다(Table 4). 그렇지만 포도당과 sodium citrate의 농도비가 2:3의 비율로 첨가되었을 때에는 배양 32시간 이후부터 생육이 감소하는 경향을 보였는데 이는 포도당의 고갈에 의한 것으로 추측된다(Table 4).</p> <h2>유가식 배양에서 E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산</h2> <p>상기 실험에서 확인된 최적의 포도당과 sodium citrate의 첨가비(3.5:1.5)를 이용하여 5 liter 발효조에서 유가식 배양에 의한 재조합 균주 E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산량을 확인하였다. 첨가배지는 탄소원인 포도당의 농도가 발효조 내에서 \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 이하로 되었을 때 간헐적으로 공급하였다.</p> <p>유가식 배양의 결과 Fig. 3에서 보는바와 같이 배양 21시간부터 첨가배지를 공급하였다. L-Threonine 생산 균주의 생육은 배양 60시간동안에 홉광도(OD660)를 기준으로 약 48까지 증가하였다. 또, L-threonine 생산은 배양 75시간동안 약 \( 76 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 까지 증가되어 최고의 생산량을 보였다. 이때 L-threonine 생산성은 \( 1.25 \mathrm{~g} / \mathrm{l} / \mathrm{h} \) 로 최고의 값을 나타내었다.</p> <p>Threonine은 인간이나 가축의 성장에 부족하기 쉬운 아미노산의 하나로서 가축의 사료, 식품 및 의약품 원료로도 널리 사용되어지는 필수 아미노산이다. 화학적 합성에 의해 생산된 threonine은 4개의 이성질체가 존재하기 때문에 순수한 L-형만을 선택적으로 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 미생물의 발효법에 의해 생산된 threonine은 모두 L-형으로 화학적 합성에 의해 생산된 threonine보다 효과적이다. 또한 특정아미노산을 값싼 원료로부터 단순한 공정에 의해서 높은 수율로 생산할 수 있으므로 공업적인 아미노산 생산에 널리 이용되고 있다.</p> <p>아미노산 생합성 경로의 조절은 일반적으로 아미노산 analog 물질들에 의해 연구되었다. \( \alpha \)-Amino- \( \beta \)-hydroxyvaleric acid AHV는 세균의 성장을 억제하는 L-threonine analog 물질이며, 과잉 축적된 L-threonine에 의해 feedback inhibition을 받는 효소들은 AHV에 의해서도 활성이 저해된다. AHV에 대한 내성 변이주는 Escherichia coli, Brevibacterium sp., 그리고 Corynebacterium sp. 같은 미생물들로부터 분리되어졌으며 이들 미생물의 특징은 L-threonine의 축적에 의한 feedback inhibition이 해제되는 점에 있다. 따라서 AHV 내성 변이주의 분리는 L-threonine 대량 생산을 위한 방법으로 이용되고 있으며 이와 더불어 유전자 재조합법을 이용한 L-threonine 생산성 향상에 대한 연구는 주로 생합성에 직접 관여하는 효소군의 구조유전자(thr operon)를 대량으로 발현시켜 L-threonine의 생산을 유도하고 있다. 하지만 이러한 방법들은 L-threonine의 대량생산을 위하여 제작된 plasmid들의 배양 중 안정성이 문제점으로 지적된다. 이를 해결하기 위하여 thr operon을 함유한 plasmid의 안정성을 높이기 위해 여러 방법이 보고되어 있다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 L-threonine 생산량을 증가시키기 위해 같은 aspartate 계열의 아미노산인 L-lysine에서 생산량 증가를 위해 시도된 바 있는 pyruvate carboxylase 유전자를 plasmid 형태 pPYC로 L-threonine 생산균주인 E. coli MT201에 도입하여 재조합 균주인 E. coli MT/pPYC를 획득하였다. 그렇지만 재조합 균주인 E. coli MT/pPYC는 포도당을 첨가한 배지에서 모균주인 E. coli MT201보다 더 낮은 성장과 L-threonine 생산량을 보였다. 이를 해결하기 위해 새로운 기질로 sodium citrate를 선정하여 sodium citrate의 배지 중 적정농도 및 이를 이용한 배양 조건과 L-threonine 생산량에 관하여 연구하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 plasmid</h2> <p>L-Threonine 생산을 위한 실험에 사용된 균주 및 plasmid는 Table 1과 같다.</p> <h2>배지</h2> <p>E. coli 배양을 위한 일반배지는 Luria-Bertani 배지를 약간 변형한 배지 ( \(1 \% \) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl}) \)와 M9 최소배지 ( \( 6 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \), \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{NaCl} \), \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}, 0.002 \mathrm{~M~} \mathrm{MgSO}_{4}, 0.4 \% \) 포도당, \( 0.0001 \mathrm{~M~} \mathrm{CaCl}_{2} \) )를 사용하였으며, 필요에 따라 ampicillin을 \( 50 \mathrm{mg / l} \) 첨가하여 사용하였다. 형질전환용 배지는 SOC 배지( \( 2 \% \) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 10 \mathrm{~mM~} \mathrm{NaCl} \), \( 2.5 \mathrm{~mM~} \mathrm{KCl} \), \( 10 \mathrm{~mM~} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \), \( 20 \mathrm{~mM} \) 포도당)를 사용하였다.</p> <p>L-Threonine의 생산을 위한 플라스크용 배지는 liter당 \( 70\mathrm{~g} \) 포도당, \( 2 \mathrm{~g~} \) yeast extract, \( 20 \mathrm{~g}\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \), \( \mathrm{SO}_{4}, 1 \mathrm{~g~} \mathrm{MgSO}_{4} \), \( 1.5 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) , \( 10 \mathrm{~mg~} \mathrm{FeSO} 4\), \( 30 \mathrm{~g~} \mathrm{CaCO}_{3} \) , \( 10 \mathrm{~mg~} \mathrm{MnSO} 4 \)를 첨가한 배지를 사용하였고, 발효조 배양을 위한 종균 배지는 liter당 \( 10 \mathrm{~g~} \) 포도당, \( 10 \mathrm{~g~} \) tryptone, \( 7 \mathrm{~g} \) yeast extract, \( 1 \mathrm{~g} \) \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\) , \( 10 \mathrm{~g~} \mathrm{NaCl} \), \( 2 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}{ }_{2} \mathrm{PO}_{4} \)의 조성으로 된 배지를 사용하였다. 발효조에서 L-threonine 생산에 사용된 배지는 liter당 \( 50 \mathrm{~g~} \) 포도당, \( 2.5 \mathrm{~g~} \) yeast extract, \( 10 \mathrm{~g~}\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}, \) \( 1 \mathrm{~g~} \mathrm{MgSO}_{4} \), \( 2 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 10 \mathrm{~mg~} \mathrm{FeSO} 4\), \( 5 \mathrm{~mg~} \mathrm{MnSO}_{4} \)를 첨가한 배지를 사용하였고 유가식 배양을 위한 첨가배지의 조성은 liter 당 \( 40 \mathrm{~g~} \) 포도당, \( 0.2 \mathrm{~g~} \) methionine, \( 0.25 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \)이었다. 필요에 따라 ampicillin은 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)의 농도로 첨가하였다.</p> <h2>배양 조건</h2> <p>LB 한천 배지에서 18시간동안 배양한 균주를 \( 50 \mathrm{ml} \) 최소 배지를 함유한 \( 500 \mathrm{ml} \) baffle 플라스크에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕 배양기(KSI-200L, Korea Science Co., Ltd.)에서 \( 160 \mathrm{rpm} \)의 조건으로 진탕 배양하였다. 24시간 배양 후 \( 20 \mathrm{ml} \)의 배양액을 \( 200 \mathrm{ml} \)의 종균배지가 들어있는 1 liter baffle 플라스크에 접종하여 최소배지의 배양 조건과 동일하게 유지하였다. 18시간 배양 후 \( 200 \mathrm{ml} \)의 배양액은 \( 1.8 \) liter의 발효배지가 들어있는 5 liter 발효조(KFC LA-150, Kobiotech Co., Ltd.)에 첨가하였다. 배양 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), pH는 \( 25 \%\) \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{OH} \)를 사용하여 6.0으로 일정하게 조절하였고 교반속도와 통기속도는 용존 산소의 농도가 \( 20 \% \) 이상 유지되도록 적절하게 조절하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>균체 농도는 배양액을 증류수로 적당히 희석한 후 spec-trophotometer (JASCO V-530, JASCO Corporation, Japan)를 사용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 포도당 농도는 YSI Glucose & Lactate Analyzer (YSI 2700 SELECT, Yellow Springs Instruments Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, L-threonine 농도는 Kase의 ninhydrin 방법[3]을 변형하여 사용하였다.</p>	생명
골수 미세환경에서 조혈줄기세포의 기능조절에 대한 고찰- 현재 및 새로운 개념	<h2>백혈병</h2> <p>백혈병은 백혈구의 기능 장애 및 비 정상적인 증식을 특징으로 하는 혈액 질환으로, 세포 분화 정도에 따라 급성 또는 만성으로 분류될 수 있으며, 골수구(Myeloid) 또는 림프구(Lymphoid)로 분류될 수 있다.</p> <p>● 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia(ALL)): ALL은 림프성 기원의 백혈구가 정상적인 B세포, T세포로 발달하지 않고 증식할 때 발생한다. 소아에서 가장 흔한 백혈병으로 소아의 최대 \( 80 \% \), 성인의 경우 \( 20 \% \)를 차지한다. ALL의 특징은 림프 전구 세포의 분화 및 증식과 관련된 염색체 이상 및 유전적 변화이다. 성인의 경우 \( 75 \% \)의 사례가 B세포 계통의 전구체에서 발생하며, 나머지 사례는 악성 T세포 전구체로 구성된다.</p> <p>● 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia (AML)): 급성 골수성 백혈병은 골수성 세포 기원의 모세포의 증식을 특징으로 하며, 성인에게서 발생하는 백혈병 중 \( 80 \% \)를 차지하는 가장 흔한 백혈병이다. 이것은 골수에서 미성숙한 모세포의 클론이 확장되어 비 정상적인 골수 계통의 줄기세포 전구체(적혈구, 혈소판, 백혈구, B cell, T cell)의 형성 및 골수 부전을 초래한다. 급성 골수성 백혈병은 조혈과 관련된 유전자의 돌연변이가 특징이다. 이러한 돌연변이는 말초 혈액과 골수에서 미분화 골수 전구체의 클론 확장을 초래하여 비정상적인 적혈구가 생성되고 골수 부전을 초래한다. 최근 연구에 따르면 나이가 들면서 축적되는 일련의 반복적인 조혈 줄기 세포 유전적 변화에서 발생할 수 있다.</p> <p>● 만성 림프구성 백혈병(Chronic lymphoblastic leukemia(CLL)): 만성 림프구성 백혈병은 서서히 진행하는 질병으로 성숙한 것으로 보이는 비정상 적인 림프구가 림프절에서 정상 세포를 침범하는 질병이다. 혈액, 골수, 림프절에서 림프구 수가 증가하고 간, 비장에 퍼지고 비대해 진다. 림프구의 종류에 따라 B세포성과 T세포성으로 구분된다. 대부분의 경우는 60-70세 사이에 발생한다.</p> <p>만성 골수성 백혈병(Chronic myeloid leukemia (CML)): 만성 골수성 백혈병은 골수에서 myeloid cell의 비정상적인 증식과 이러한 세포들이 혈액에 축적되는 백혈병의 한 형태로 mature granulocyte를 증식시키는 조혈줄기세포의 장애이다. 특히 9번 염색체의 ABL gene과 22번 염색체의 BCR gene 부분이 translocation되면서 BCR-ABL gene이 탄생하게 된다. BCR-ABL은 세포주기를 제어하여 세포 분열을 가속화하고, DNA repair를 억제하므로 BCR-ABL 단백질의 작용은 만성 골수성 백혈병의 원인이 된다. BCR-ABL도 Tyrosine kinase activity을 가지고 있어 CML의 치료제로 TK inhibitor인 Imatinib을 사용하고 있고, 25-60세 사이의 사람들에게서 발생한다.</p> <h2>림포마</h2> <p>Lymphoma는 lymphocyte가 비 정상적으로 발달할 때 lymphoma 세포가 된다. 이러한 세포들은 lymph node 혹은 다른 조직에서 뭉친다. 림프종은 림프구 계에서 발생하는 머리와 목 부위에서 나타나는 종양이다. 악성 림프종은 호지킨림프종과 비호지킨 림프종(NHL)으로 나뉜다. NHL은 두경부에서 발생하는 악성 종양의 약 \( 5 \% \)를 차지한다</p> <h2>다발성 골수종</h2> <p>형질세포(Plasma cell)는 항원을 공격하는 항체를 생산한다. 다발성 골수종은 형질세포가 비정상적으로 분화, 증식되어 나타나는 혈액암이다. 이 골수종세포가 종양을 형성하고 골수를 침범하며 적혈구, 백혈구 등을 감소시킨다. 정확한 원인은 알려져 있지 않지만 CMYC, NRAS, KRAS 와 같은 종양 유전자의 유전적 이상이 형질 세포 증식에 영향을 미칠 수 있다.</p> <h2>골수증식종양(Myeloproliferative neoplasm)</h2> <p>골수의 활동이 병적으로 활발해져 적혈구, 백혈구, 혈소판이 현저하게 증가하고, 골수의 섬유화로 인해 조혈작용이 정상적으로 이루어지지 않는 질환이다. 질환의 원인은 JAK2, CALR, MPL와 같은 특정 유전자 변이이다</p> <h2>골수형성이상증후군(Myelodysplastic syndrome)</h2> <p>골수에서 형성이상(Dysplasia)과 말초혈액에서 정상 백혈구, 적혈구, 혈소판의 감소를 특징으로 하는 질환이다. 말초 혈액 세포 감소증이 나타나고 급성 골수성 백혈병으로 발전할 수 있다. MDS에서 mutation된 유전자에는 SF3B1, TET2, RUNX1, JAK2 등이 있다.</p> <h2>혈액암에서의 신호전달체계</h2> <h3>mTOR-AKT pathway</h3> <p>mTOR-AKT pathwaymTOR 신호전달계는 다양한 세포 외부의 자극에 의해서 활성화되며, mTOR의 활성은 mTORC1과 mTORC2 complex에 의해 조절된다. mTOR1 complex는 mTOR, RAPTOR, mLST8, DEPTOR, PRAS40로 구성되어 있으며, mTORC2 complex는 mTOR, RICTOR, mLST8, PROTOR로 이루어져 있다. 대부분의 AML 환자에게 AKT 인산화가 발견된 관찰 결과이며, 여러 연구에서 전체 생존율의 저하와 관련이 있다.</p> <h2>JAK-STAT pathway</h2> <p>JAK-STAT 신호전달 경로는 세포의 증식, 자연사, 분화와 면역적 반응에 생리학적으로 중요한 조절자이다. STAT 단백질은 6 가지가 있는데 그 중 STAT5가 조혈작용에서 중요한 역할을 하고, STAT5 활성은 혈액 암을 발생시키는 데에 중요한 부분이다. 특히 STAT5는 BCR-ABL로 유발되는 CML, FLT3 ligand 돌연변이로 유발되는 AML 등에서 관련 있다고 알려져 있다.</p> <h2>조혈줄기/전구세포 노화의 heterogeneity</h2> <p>마우스에서 노화된 조혈줄기세포 기능 저하에 대해서는 많이 보고되었으나, 이러한 줄기세포 노화에 기여하는 분자 메커니즘은 명확히 밝혀진 바가 없다. 그동안 조혈줄기세포 노화에 대한 연구는 필연적으로 조혈줄기세포의 heterogenous한 population의 한계로 진행이 되는데, 유세포분석기를 통해 조혈줄기세포 분리에도 purity가 낮으며, 이는 heterogenous한 population이 연령에 따라 증가한다고 입증되었기에 노화 분야에서 특히 주목하는 부분이다. 연령에 따른 heterogenous한 조혈줄기세포 pool 분석에 단일세포 골수이식, 유세포분석기, 단일세포 전사체 시퀀싱 등을 통해 노화 표현형에 기여하는 조혈줄기세포 subset을 식별하고자 하는 연구가 진행 중에 있다. 특히 노화에 따라 골수성 분화를 지향하는 조혈줄기세포 클론이 노화에 따라 조혈줄기세포 pool을 점차적으로 채우는 현상을 보인다. 노화가 조혈줄기세포 pool의 클론 구성에 어떤 영향을 미치는지에 대한 여부는 아직 밝혀지지 않아 더 많은 연구가 요구된다.</p> <h2>노화된 조혈줄기/전구세포의 회복</h2> <p>노화 조혈줄기세포의 기능 변화에 대한 연구를 미토콘드리아의 대사적 환경에서 최근 진행이 되고 있다. 특히 조혈줄기세포 내의 미토콘드리아 막 전위에 따라 각각 젊은 조혈줄기세포과 노화된 조혈줄기세포의 특징 및 기능을 시사하였으며, 항산화제인 Mito-Q로 노령 마우스의 노화된 조혈줄기세포의 미토콘드리아 막 전위를 조절함으로서 회춘하는 효과를 보여, 노화에 따른 혈액 질병의 예방 및 치료 목적으로 Mito-Q의 임상학적 적용이 기대된다.</p> <h2>골수 내 미세환경</h2> <p>조혈줄기세포가 존재하는 골수 미세환경은 니쉬라 불리우며 조혈줄기세포가 미분화 상태를 유지하도록 보호하며, 조혈줄기세포와 상호작용하여 다양한 신호 전달 단계를 통해 조혈줄기세포의 증식과 분화를 조절하여 정상적인 조혈을 유지한다. 뼈를 형성하는 조골세포에 인접한 니쉬는 Angiopoietin1을 분비하여 조혈줄기세포의 휴지기 상태를 유지하고, 조혈줄기세포의 분화를 억제한다. 또한 골수 혈관 내피세포에 인접한 CXCL12-abun-dant reticular (CAR) 세포에서 발현되는 CXCL12 역시 조혈줄기세포의 휴지기 상태를 유지하는데 필수 요소이다. 조혈줄기세포 니쉬는 세가지 부분으로 나누어 볼 수 있다. 조골세포 니쉬(Osteoblastic niche), 혈관 니쉬(Vascular niche), 조혈줄기세포의 이웃 세포이다.</p> <h2>조골세포 미세환경</h2> <p>조골세포는 골수에서 조혈줄기세포 니쉬의 중요한 구성성분 중의 하나이다 \( [6,33] \). 조골세포는 성숙한 세포와 미성숙한 세포가 섞여있으며, 뼈를 형성하는 세포로 중간엽 줄기세포로부터 만들어진다. 5-Bromodexyuridine (BrdU)를 장기간 in vivo 표지를 하여 대부분의 조혈줄기세포가 분열한다는 것을 알아냈다. 그럼에도 불구하고 표지가 유지되는 세포들은 휴지기 상태의 세포이며, 이들은 몇 달 동안 남아있게 된다. 이를 통해 골수 세포는 휴지기의 조혈줄기세포와 분열하는 조혈줄기세포로 나누어 볼 수 있다. 휴지기 상태의 조혈줄기세포는 조골세포와 근접한 곳에 위치한다. Bmprla KO 마우스를 이용하여 Zhang 연구팀은 N-Cadherin \( { }^{+} \)spindle-shaped osteoblasts (SNO cells)가 느린 세포주기의 조혈줄기세포와 비슷한 것을 보였다. 그들의 연구는 골수에서 N-Cadherin을 발현하는 조골세포 세포가 조혈줄기세포의 니쉬로 작용하는 세포이며, N-Cadherin \( { }^{+} \)세포의 수의 증가는 조혈줄기세포의 증가와 연관이 있는 것을 밝혔다. 또한 다른 그룹인 Visnjic 연구팀은 조골세포 결핍 마우스에서 조혈작용이 억제된다는 것을 보였다. 이를 통해 조혈줄기세포에서 조골 세포의 결함은 조혈작용을 억제한다는 것을 확인하였다.</p> <p>케모카인(Chemokine) 또는 Chemo-attractive protein은 조혈줄기세포의 이동성과 연관이 있으며, 조혈줄기세포와 기질세포(Stromal cell)와의 상호작용과도 연관이 있다. 케모카인 중 SDF1으로도 알려진 CXCL12는 homing과 관련이 있다고 보고가 되어 있다. SDF1 또는 그 수용체인 CXCR4의 유전자를 deletion 했을 때 정상 태아 심장 조혈 작용은 일어났지만, 조혈세포에 의한 골수 engraftment는 나타나지 않았다. 사람의 조혈전구세포에서 CXCR4의 과발현은 누드마우스에서 Engraftment를 증가시키며, CXCR4 중화항체는 Engraftment를 억제시키는 효과를 보였다. 그러나 CXCR4는 휴지기 상태의 조혈줄기세포에서는 발현되지 않는다고 알려져 있기 때문에, 조혈줄기세포 Engraftment와 연관 있는 인자와 조골세포 니쉬에서의 adhesion molecule과는 다르다. Adhesion molecule인 ALCAM과 OSTEOPONTIN은 조골세포에 의해 발현되어지고, 조혈줄기세포-조골세포 상호작용에서 연관이 있을 것으로 보인다. 또한 골수 니쉬에서 BMP, NOTCH li-gand, Angiopoietins와 같은 extrinsic factor는 조혈줄기세포-조골세포 상호작용에 관여할 것으로 여겨진다.</p> <h1>본 론</h1> <h2>조혈줄기/전구세포</h2> <p>조혈줄기세포는 자가재생(Self-renewal)이 가능하며, 혈액세포와 면역세포로의 분화(Differentiation)가 가능하다. 조혈줄기세포는 분화 과정을 통해 조혈전구세포(Hematopoietic progenitor cell (HPC))를 생성하고, 조혈전구세포는 혈액세포와 면역세포로 분화한다. 조혈전구세포는 모든 종류의 혈액세포로 분화할 수 있지만, 조혈 줄기세포처럼 자가재생의 능력은 없다. 또한 조혈줄기세포의 이러한 능력 때문에 혈액암 환자 치료를 위한 방사선 조사 후 이식 치료에 사용된다. 이러한 조혈 줄기 세포 이식 치료 방법은 아직까지 혈액암에 대한 유일한 치료 요법으로 사용된다.</p> <p>조혈줄기세포는 주로 골 내막(Endosteum)에 존재하는 골수에서 니쉬(Niche)라는 특정 미세환경에 존재하며, 니쉬에 존재하는 조혈줄기세포는 안정 상태(Steady state)에서 휴지기 상태(Quiescent state)를 유지한다. 하지만 출혈, 감염, 방사선 조사 등과 같은 자극으로 인하여 혈액세포가 감소하게 되면 조혈줄기세포는 정지 상태에서 빠져나와 증식 및 분화를 통해 조혈 시스템을 재구성한다. 조혈줄기세포의 휴지기 상태와 증식 사이의 균형은 정상적인 조혈작용에 아주 중요하며, 이러한 작용 사이의 균형이 제대로 조절되지 않을 경우 조혈줄기세포가 고갈되거나 백혈병과 같은 혈액암을 유발할 수 있다. 그렇기에 조혈줄기세포의 정지 상태와 증식 상태의 균형은 내재적, 외재적 메커니즘을 통해 엄격히 조절된다.</p> <p>조혈줄기세포의 자가재생과 분화는 세포 내재적 메커니즘과 니쉬 세포로부터 받은 세포 외재적 신호를 통해 조절된다. 조혈줄기세포는 전사인자인 SATB1과 세포주기 조절자인 CDKN1A, GFI1, 또는 전사 조절자인 MSI2와 같은 세포 내재적 신호에 의해 조절되며, 니쉬 세포로부터 분비되는 줄기세포 인자 Thrombopoietin과 같은 신호에 의해 자가 재생과 분화가 조절된다고 보고가 되고 있다.</p> <h2>조혈줄기/전구세포와 노화</h2> <h3>조혈줄기/전구세포 노화에 따른 수와 기능</h3> <p>혈액은 신체의 결정적인 자가 재생 조직이지만 노화에 의한 변형을 피해가지는 못한다. 노화는 조혈 계에서 발생하는 여러 임상 적으로 중요한 상태를 동반하며 적응 면역 체계의 감소 및 능력 저하, 특정 자가 면역 질환 발생률 증가, 혈액 악성 종양 증가, 연령 관련 빈혈 발생 증가 등이 포함된다. 연령에 따른 조혈줄기세포의 기능적 잠재력의 감소는 마우스 모델을 통해 잘 알려져 있다. 노화된 조혈줄기세포는 젊은 조혈줄기세포에 비해 골수성 계통 편향을 보이며 이식 시 더 낮은 재구성 잠재력을 나타낸다. 또한 대부분의 조직과 마찬가지로 조혈 계의 노화는 만성 및 급성 백혈병의 발생률 증가를 포함하여 악성 변형의 빈도 증가와 관련이 있다. 골수성 백혈병은 고령의 환자가 지배적이면서, 소아 백혈병은 림프 계통을 동반하는 경우가 많은 것을 보아, 조혈줄기세포의 연령 관련 변화가 직접적으로 조혈작용 관련 노화 질병에 영향을 줄 가능성이 제기되었다. 흥미롭게도 조혈줄기세포 노화는 AML, PML, ETO와 같은 골수성 백혈병 발병에 관여하는 유전자의 발현 증가를 보인다.</p> <h2>혈관 미세환경</h2> <p>혈관 니쉬는 발생단계 중 Embryonic stage 및 Adult stage로 나누어 볼 수 있다. Embryonic stage는 조혈줄기세포와 내피세포(endothelial cells)의 상호작용이 긴밀하게 이루어져 있으며, 광범위한 연구가 이어져 오고 있다. 하지만 Adult stage에 대해서는 정확히 알려지지 않았다. Embryonic stage에서 조혈세포와 내피세포는 일반적인 전구세포인 혈관모세포(hemangioblast)로부터 형성된다. Runx1 \( 1^{+} \)내피세포는 Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) 과 태반(Placenta)에서 조혈줄기세포를 생성할 수 있다. 내피세포와 조혈줄기세포는 CD31, CD34, CD133, FLK1, TIE2를 함께 발현하고 있다. 조혈줄기세포는 그들 스스로 혈관형성을 유도하는 Ang1을 분비 하며, 혈관형성 인자인 FGF를 생성하는 해마에서 내피세포는 신경줄기세포와 함께 위치한다. 더불어 혈관 내피 전구세포(Vascular endothelial progenitor cells)는 심장과 췌장의 기관 형성에 필수적이다.</p> <p>Adult stage에서의 내피세포와 골수 조혈줄기세포 간의 연관성은 아직 잘 알려지지 않았다. 골수에서 유도된 내피전구세포(BM-derived endothelial progenitor cells, EPCs)는 출생 후의 혈관생성 과정에 관여한다. 골수에서의 혈관 니쉬에 대한 모델이 제시되었는데, 조골세포 지역 내에서 발현되는 MMP9의 활성화가 골수의 기질세포로부터 세포막의 Kit ligand가 쪼개지게 된다. 이후 수용성 Kit ligand는 세포주기 시작과 조혈줄기세포의 활동성을 촉진한다. 따라서, 골수에서 혈관 니쉬는 조혈줄기세포의 활동성 또는 증식과 분화가 이루어지는 장소임을 알 수 있다. VEGF와 Ang1와 같은 혈관생성인자들은 조혈줄기세포의 유지에 중요한 역할을 한다. VEGF는 혈관 형성과 조혈작용에 중요한 조절자로서, Geber 연구팀은 내부 자가분비 메커니즘(Internal autocrine loop mechanism)을 통해 VEGF가 조혈줄기세포를 조절한다는 것을 밝혔다. 조골세포 니쉬에서 조혈줄기세포는 휴지기 상태로 스스로를 유지하는 반면에 혈관 니쉬에서는 조혈줄기세포와 조혈전구세포들은 분열한다. 조혈세포들의 이동은 조골세포 니쉬에서 줄기세포와 함께 시작되고, 증식과 분화를 통해 진행되며, 마지막에는 성숙의 단계가 된다. 이러한 세포 이동을 통해 세포들은 혈관 니쉬를 향해 이동하게 된다.</p> <h2>이웃세포</h2> <p>골수의 대식세포(Macrophage)는 조혈줄기세포의 니쉬를 형성하는데 필수적이라고 보고되었다. \( \mathrm{CD} 169^{+} \)대식세포는 조혈줄기세포의 휴지기 상태에 필요하지만, 대식세포의 역할은 명확하지 않아 조혈줄기세포 니쉬의 중요한 인자가 될 수 있을 것이라 여겨지며 계속적인 연구가 이루어지고 있다. 거대핵세포(Megakaryocyte) 또한 조혈줄기세포의 니쉬를 조절한다. 골수에서 거대핵세포가 제거되면 조혈줄기세포의 수가 증가한다. 출혈이 있는 마우스에서 조혈줄기세포가 보상적으로 증가하게 만들고, 혈액에 RBC를 주입하면 보상적인 증가는 제한된다는 결과를 얻었다. 거대핵세포는 조혈줄기세포의 증식을 두가지 메커니즘으로 제한한다는 것이 제안되었는데, 첫번째 메커니즘은 거대핵세포가 CXCL4을 생성하여, 조혈줄기세포의 증식을 억제한다는 것이고, 두번째 메커니즘은 TGF \( \beta \)를 통해 조혈줄기세포의 휴지상태를 조절한다는 것이다.</p> <h2>혈액암</h2> <p>혈액암은 혈액이 생성되는 골수에서 시작되며, 골수에서 조혈줄기세포는 백혈구, 적혈구, 혈소판으로 발달하는데 비정상적인 혈액 세포가 생성되면 통제되지 않는 성장으로 인해 정상 혈액 세포의 발달과 기능조절을 방해한다. 혈액암은 장기에 종양이 생기는 고형암과 다르게 암세포가 혈액을 타고 우리 몸 구석구석을 돌아다닌다. 혈액암은 백혈병(Leukemia), 림프종(Lymphoma), 다발성골수종(Multiple myeloma)로 분류할 수 있다. 백혈병은 혈액암으로 몇몇 백혈병 세포들은 다른 세포의 느린 발달에 비해서 아주 빨리 성장한다. 대부분의 백혈병은 55세 이상부터 진단되지만, 15세 이하의 청소년, 어린이들에게도 자주 관찰된다. 림프종은 림프구가 비정상적으로 발달해 림프종 세포가 되어 발생한다. 이것들은 림프절과 다른 조직에서 빠르게 증가한다. 일반적인 림프종 중에는 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, AIDS 관련 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종이 있다. 다발성 골수종은 형질 세포(Plasma cell)에서 발생하는 암이다. 정상적인 형질 세포들은 항체들을 생성한다. 하지만 비정상적인 골수종이 발달하면 항체 생성을 방해하고 면역반응을 감소시킨다.</p> <h1>서 론</h1> <p>혈액은 체내의 세포에 산소와 영양소를 공급하고 세포의 대사에 의해 발생하는 이산화탄소와 노폐물을 회수하여 운반하는 체액이다. 혈액은 액체성분인 혈장과 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 혈구로 이루어져 있다. 조혈작용은 유기체의 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 모든 혈액세포와 면역세포를 생성하는 과정이다. 혈액세포와 면역세포는 수명이 짧아 평생 이를 보충해줘야 하며 이는 조혈세포 계층의 최상위에 있는 골수 내 조혈줄기세포(Hemato-poietic stem cell (HSC))에서 파생된다. 골수 내 조혈줄기세포 니쉬(niche)는 특이적인 미세환경으로 조혈줄기세포의 유지 및 기능을 조절하는 역할을 한다. 니쉬는 조혈줄기세포의 자가재생(Self-renewal)와 분화(Differentiation)를 조절하여 혈액세포와 면역세포를 형성하는데 필수적인 조혈작용(Hematopoiesis)을 지속적으로 유지시킨다. 1970년대에 골수 미세환경이 조혈줄기세포의 니쉬 개념으로 제시되었고, 니쉬는 조혈줄기세포의 자가복제 및 분화에 필수적인 요소들을 제공하는 역할을 한다. 또한 니쉬가 줄기세포의 휴지기(Quiescence)와 세포주기(Cell cy-cle)를 조절하고, 줄기세포에 조직의 정보를 제공하며, 줄기세포의 딸세포의 운명을 조절할 뿐만 아니라 줄기세포의 돌연변이 생성을 억제한다는 것이 밝혀졌다. 이후 많은 연구들을 통하여 조혈줄기세포와 관련한 니쉬의 중요성이 알려지게 되었고, 조혈줄기세포와 니쉬 간의 상호작용을 이해할 수 있게 되었다.</p> <p>지난 150년 간 평균수명이 지속적으로 증가하고 세계적으로 고령화가 진행됨에 따라, 노화에 따른 유기체 내 변화에 대한 연구는 계속 발전되어 왔다. 노화는 다양한 장기와 조직의 지속적인 기능 저하를 동반하며, 암 발병의 가장 높은 위험요인이기도 하다. 조혈시스템 역시 노화에 따라 조혈줄기세포의 기능, 수 및 혈액세포의 구성이 변경되며 빈혈, 적응 면역 감소, 혈액 악성 종양 같은 나이와 밀접한 혈액학적 질환들의 발병의 위험이 증가된다.</p> <p>혈구세포는 분화 및 성숙 과정을 통해 일정 생존기간 후 파괴, 소실되어 평형 상태를 유지한다. 혈액질환은 이러한 평형 상태에 불균형이 일어난 경우이다. 혈액/조혈 조직의 암은 혈액이 만들어지는 골수에서 생기는 암이다. 혈액암은 비정상적인 혈구의 성장이 조절되지 않아 발생하는데, 크게 세 종류의 혈액암이 있는데, 백혈병, 림프종, 다발성골수종이 있다. 따라서 본론에서는 조혈줄기 세포, 조혈줄기세포의 노화 연구, 골수 니쉬 및 혈액암에 대해 소개하고자 한다.</p>	생명
	<h1>서 론</h1> <p>비만은 면역체계 이상을 초래하여 염증반응으로 이어지는 원인이 된다. 이러한 염증반응은 산화적 스트레스와 관련있으며, 산화적 스트레스를 유발시키는 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 세포의 손상과 신경변성 (neurodegenerative) 및 세포사를 유발하는 것으로 알려져 있다.</p> <p>신경세포의 손상과 조절을 담당하는 neurotrophin (NT)는 nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), NT-3, 그리고 NT-4로 분류된다. NGF는 뉴런의 목표에 의해 분비되는 단백질이며, 교감 및 감각뉴런 유지와 더불어 세포성장을 포함하는 생물학적 활동에 중요한 역할을 담당한다. 그리고 최근 염증반응과 면역계통 질환의 진행에도 관여하는 것으로 보고되고 있다. 선행연구에 의하면 혈장 NGF 수준은 고도 비만인 경우 낮게 나타나며, 또한 염증요인, BMI, 체지방율 그리고 허리둘레와 높은 상관을 가지고 있다. NGF는 갈색 지방세포에서 합성되어 분비되므로 유전적으로 마른 동물모델보다는 비만 동물모델에서 높게 나타난다고 최초로 밝혔지만, 연령에 따라 차이가 존재한다고 하였으며, 인간을 대상으로 한 연구에서 성인의 경우 정상체중보다는 비만인의 NGF가 높고, 고도비만보다는 과체중인 피험자의 NGF가 더 높게 나타났다고 하여, 비만 수준과 연령에 따라 차이를 보이고 있어 조직수준에서의 연구가 절실히 필요하다.</p> <p>한편, BDNF는 뇌뿐만 아니라 말초에서도 발견되는 단백질로서 중추신경계와 말초신경계의 특정 뉴런에서 활성 되어 뉴런이 생존하는데 지원해주는 역할을 한다. 또한, 신생 뉴런과 시냅스의 성장과 분화를 도와주어 학습, 기억, 그리고 사고력 활성을 위한 역할을 수행하는 것으로 운동으로 neurogenesis를 자극하고 뇌손상을 예방하며, 학습과 정신적 기능 강화는 물론, 세포 성장의 주요한 조절자로서 긍정적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. NT에 의한 신경 세포 성장 기전을 살펴보면, 4 개의 NT (NGF, BDNF, NT-3, NT-4)는 그들과 상응하는 Trk-A, Trk-B와 Trk-C에 의해서 발현되며 MEK1/2, SEK와 MKK3/6에 의하여 MAPK가 활성화되고, 이러한 MAPK는 신호 기전의 활성으로 초기발현 유전자(immediately early gene, IEG)를 발현 시킨다. 초기발현 유전자는 세포외부의 자극에 가장 먼저 반응하는 전사(transcription)이며, c-fos, fosB, fosBdel, fra-2, c-jun, junB, junD 등으로 분류된다. 이들은 전사조절인자로서 세포의 증식, 분화, 세포사, 종양형성과 유전자의 발현 등 다양한 세포 과정을 조절하는데 관여한다.</p> <p>운동과 관련된 연구를 살펴보면, Toldy 등은 쥐를 대상으로 6 주간의 수영 운동 후 c-jun 발현이 활성화되었다고 하였으며, Iemitsu 등은 48 시간의 트레드밀 운동이 그렇지 않은 그룹보다 c-jun과 c-fos의 단백질 발현이 증가함을 보고하였다. 또한 Sim 등은 알코올을 통한 산화스트레스를 증가시킨 결과 c-fos의 발현이 감소하며, 가벼운 강도와 적정 강도의 운동 이후 c-fos발현이 증가함을 보고하여 규칙적인 운동이 유기체의 세포 성장에 긍정적인 영향을 준다고 하였다.</p> <p>이처럼 규칙적인 운동이 비만을 개선시킴으로써 산화적 스트레스와 neurogensis 과정에 긍정적인 영향을 줄 수 있다고 가정해 볼 때, 산화적 스트레스는 비만과 관련이 있으며, 이는 NGF 및 BDNF 발현과 이들을 조절하는 전사인자들 발현의 변화를 유도함으로써 나타난다. 그러나 운동에 의한 항비만 효과에 이러한 기전들이 어떻게 작용하는지에 대해서는 아직 알려진 바 없다. 또한 비만으로 인한 산화적 스트레스 증가가 규칙적인 운동으로 산화적 스트레스 감소를 통하여 뇌 조직의 IEGs (c-fos, c-jun)에 어떠한 영향을 주는지 규명하는 연구가 절실히 필요하다. 따라서 본 연구는 고지방식이 비만유도 rat을 대상으로 조직의 산화적 손상이 neurogenesis 과정에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고, 규칙적인 유산소성 운동으로 인한 개선 효과를 분자 생물학적 차원에서 규명하고자 한다.</p> <h2>공간적 인지학습 능력</h2> <p>두 그룹 내 운동과 비운동군 뇌 인지기능의 효과를 검증하기 위해 Morris water maze (MWM)를 사용하였다. 실험 절차는 미로학습 검사를 시작하기 하루 전에 도피대가 없는 상태에서 수영풀 안을 60초 동안 자유롭게 수영하도록 하여 물에 대한 적응을 유도하였으며, 훈련이 시작되면 동물은 4 사분면 중 한쪽에서 동물의 머리가 벽면을 향하도록 하여 살며시 물 안으로 놓아주어, 2그룹 모두 3일 동안 총 6회 실시하여 platform을 찾아 올라갈 때까지의 잠재기를 측정하였다.</p> <h2>채혈 및 조직 샘플링</h2> <p>트레드밀 훈련 전과 후에 꼬리 정맥에서 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 혈액을 채혈하였으며, 혈청지질성분과 8-OHdG를 분석하였다. 트레드밀 훈련 후 채혈과 조직샘플링은 일시적인 운동 효과를 배제하기 위해, 훈련종료 48 시간 경과 후에 실시하였으며, 사료는 12 시간 전에 공급을 중단하였지만, 음수는 계속 제공하였다. 실험동물들은 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르 (ethyl ether)를 이용하여 마취 시켰다. 마취된 실험동물은 해부판 위에 사지를 고정시키고, \( 70 \% \) 알코올 분무기로 분무한 후, 복부를 절개하여 복부 정맥에서 \( 10 \mathrm{ml} \) 의 정맥혈을 채혈하였으며, 이후 약 \( 3 \mathrm{~g} \) 의 해마와 \( 5 \mathrm{~g} \) 의 간을 샘플링 하였다. 두 조직은 deepfreezer (MVE Co., USA)에 넣어 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 상태로 보관한 뒤 분석하였다.</p> <h2>생화학적 분자생물학적 분석</h2> <h3>Lipid profiles</h3> <p>TC, TG 및 HDL-C 함량은 효소법에 의한 정량용 kit (각각 AM201-K, AM202-K, AM157S-K, AM203-K, Asan Co., Korea)로 측정하였다. 혈청 \( 0.002 \mathrm{ml} \) 에 효소용액 \( 0.3 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 교반하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 수조에서 5 분간 반응시켜 발색시킨 후 blank를 대조로 하여 분광광도계(UVmini-1240, Shimadzu Co., Japan)로 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)</h3> <p>산화적 DNA 손상의 지표로 이용되는 8-OHdG는 DNA damage ELISA kit (Assay Designs, USA)로 측정하였다. Sample diluent에서 8-OHdG standard와 sample을 준비한 다음, 8-OHdG immunoassay plate의 각 well에 standard와 sample을 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하였으며, 각 well에 anti-8-OHdG를 \( 50 \mathrm{\mu l} \) 첨가하였다. 그 후 1 시간 실온에서 incubate하고, wash buffer \( 300 \mu \mathrm{l} \) 6 번 씻어낸 다음, 각 well에 anti-Mouse IgG: HRP cohjugate를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가하였다. 그 후 다시 1 시간 동안 실온에서 incubate 한 후, 각 well에 TMB substrate \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하였다. 다시 실온에서 15 분 동안 incubate 한 후, \( 450 \mathrm{~nm} \)흡광도를 통해 측정하였다.</p> <h3>Western blot</h3> <p>인지기능의 주요 담당과 초기 발현 단백질의 발현이 가장 두드러진 Hippocampus (c-fos, c-jun, Erk, BDNF, NGF)와 산화적 스트레스를 조절하는 liver (MDA)의 protein을 분리하기 위해서 radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer [\(50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \(\mathrm{pH} 8.0\), with \( 150 \mathrm{mM} \) sodium chloride, \( 1.0 \% \) Igepal CA-630 (NP-40), \(0.5\%\) sodium deoxycholate, \( 0.1 \%\) so-dium dodecyl sulfate, Protease Inhibitor Cocktail and Phosphatase Inhibitor Cocktails] \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 homogenazer로 조직을 균질화한 다음, 30분간 ice incubation하여 hippocampus를 융해시키고, \( 13,000 \mathrm{rpm}\), 30분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리하여 상층액만을 깨끗한 e-tube에 옮기고 사용하기 전 까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. Western blot 실험을 시작하기 전 \( \mathrm{BCA}^{\mathrm{TM}} \) protein assay kit (PIERCE, IL)로 단백질을 정량한 다음 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 로딩하여 전기영동을 하고 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 membrane에 옮긴 후 \( 5 \% \) SKIM MILK로 blocking하였다. 1차 antibody NGF (sc-548)와 BDNF (sc-546), b-actin (sc-1616) (Santa Cruz biotechnology, Santa, CA, USA), Erk (AF 1576), c-fos, c-jun (R&D system, Minneapolis, MN, USA, MDA 를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight 반응하였으며, 2차 antibody를 실온에서 1시간 반응한 뒤 ECL solution (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)으로 발색한 뒤 LAS-3000으로 단백질 발현을 확인하였다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS Windows Ver 14.0 통계 package를 이용하여, 모든 측정항목에 대해 평균과 표준 편차를 산출하였다. 집단 간의 트레이닝에 따른 혈액성분에 대한 차이검증을 위해 이원분산 분석(two-way ANOVA)을 이용하였으며, 시기 간 차이가 있을 시 대응표본 t-test를 실시하였고, 집단 간 차이가 있을 시 독립표본 t-test를 실시하였다. 조직분석은 독립표본 t-test를 실시하였으며, 모든 통계적 유의 수준 은 \( a=0.05 \) 로 설정하였다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>고지방식이 비만 유도 쥐를 대상으로 8주간의 트레드밀 훈련은 고지방 식이로 인한 혈청 지질성분의 불균형을 완화해주었으며, 동시에 산화적 스트레스의 감소를 가져왔다. 그리고 규칙적인 유산소성 운동이 비만으로 발생된 뇌 성장 인자의 감소를 막아, NT와 초기발현 단백질 농도를 개선함으로써 뇌기능 향상에 긍정적인 결과를 얻을 수 있었다.</p> <p>운동의 긍정적 기능에도 불구하고 운동부족 현상은 증가하고 있으며, 비만으로 인한 문제가 심각하다. 하지만 비만은 규칙적인 운동을 통해 HDL-c 의 증가와 TC, TG의 감소를 유도하여 혈중지질 농도를 개선시키고, 합병증을 줄여준다. 한 편, 비만에 따른 이상지질현상은 산화적 DNA 손상을 유발하게 되며, 이러한 DNA 손상의 지표로써 8-OHdG와 MDA가 대표적이다. 고지방식이 rat을 대상으로 규칙적인 운동을 시킨 결과 운동 후 rat의 혈중 8-OHdG 농도의 유의한 감소가 나타나 운동의 긍정적 영향을 보고하고 있으며, 또한 흰 쥐를 대상으로 12 주간 규칙적인 운동으로 산화적 스트레스의 지표인 혈중 MDA농도가 감소됨을 발견하여 운동을 통한 산화적 스트레스의 개선을 보고하고 있다. 본 연구는 장기간 고지방식이 유도를 통하여 비만을 유발한 뒤 운동트레이닝의 효과를 분석하였다. 그 결과 TG 와 TC 모두 지속적인 고지방식 이를 실시한 HDS 그룹에서 유의한 증가가 나타난 반면, HDT 그룹은 변화가 나타나지 않았다. 그리고 HDL-c는 HDT그룹에서 유의한 증가가 나타났다. 이러한 결과는 고지방식이에 따른 혈청지질의 불균형 현상이 규칙적인 운동으로 TG와 TC가 악화되는 것을 막아주며, HDL-c는 개선시키는 것으로 고지방식이에 대한 지질성분의 불균형을 운동트레이닝으로 막을 수 있었다. 한편, 혈중 8-OHdG 농도와 간에서의 MDA 발현은 트레드밀 훈련 후 HDS 보다 HDT 그룹에서 유의하게 감소하였다. 이러한 결과로 볼 때 지속적인 고지방 식이에도 불구하고 규칙적인 운동은 체중 감소를 유도하고 산화적 스트레스에 의한 간에서의 조직 손상 악화를 효과적으로 방어해 준다고 볼 수 있다.</p> <p>규칙적인 운동은 뇌 기능에 효과적이며, 최근 BDNF를 향상시킴으로써 산화적 손상을 막아주는 긍정적 영향을 보고하고 있다. 또한 운동중단(detraining) 후에 BDNF와 NGF 의 유의한 감소를 보고하여 지속적 운동을 강조하고 있다. 운동은 비만 rat 과 다발성 경화증 환자의 NGF를 증가시켜 기억력을 향상시키는 것으로 알려져 있으며, Yu등은 고지방식이로 인한 쥐의 해마에서 BDNF의 감소를 보고하였으며, 이러한 현상은 학습능력과 기억력 퇴화를 유발시키는 원인으로 보고 있다. 그리고 손상된 해마세포는 칼로리 섭취 조절 능력 기억과 관련하여 악영향이 나타남으로써 과체중을 야기 시키는 것으로 보고하고 있다. 한편 단 기간 (3일) 트레드밀 훈련은 BDNF 발현이 증가하여 인지기능을 향상시키는 것으로 보고 되고 있으며, 트레드밀 훈련을 통하여 BDNF 의 발현 증가와 공간학습 능력의 향상을 보고하였다. 하지만 인간을 대상으로 실시한 10 주간 웨이트 훈련은 근력과 제지방(LBM) 체중은 증가하였으나 혈중 BDNF의 변화는 나타나지 않아 건강한 대상자의 경우 영향을 미치지 않는 것으로 보고되고 있다. 운동 이후 NT의 증가가 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 free radical의 감소를 유발하며, ROS의 수준을 긍정적으로 조절하기 위한 NT의 적응력 향상으로 뇌기능 향상의 저해 요소인 산화적 손상을 완화하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서 트레드밀 운동은 해마에서 고지방식이 유도 비만 쥐의 감소된 BDNF를 증가시켜 주는 것으로 나타났다. 한편, BDNF 의 downstream인 MAPK cascades중 Erk는 뇌의 학습과 기억, 그리고 synaptic plasticity와 같은 기능 조절을 담당하며, 3개의 주요한 cascade인 extracellular signal-regulated kinase (Erk), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 그리고 p38 MAPK (p38)로 분류할 수 있다. 운동과 관련된 선행연구를 보면, Chae 등은 6 주간의 트레드밀 훈련이 Erk의 발현을 증가 시킨다고 하였으며, Iemitsu 등은 12주간의 트레드밀 훈련후 Erk의 발현이 증가한다고 보고하였다. 본 연구 결과 고지방 식이는 규칙적인 운동으로 산화적 스트레스 감소뿐만 아니라, 특히 선행연구와 같은 시상하부가 아니 뇌의 해마에서 MAPK cascades의 Erk 발현 증가현상을 가져왔으며, 또한 NTs의 긍정적 변화를 통해 감소된 BDNF 발현 증가를 가져온 것으로 사료된다.</p> <p>IEG는 c-fos, fosB, fra-1, c-jun, junB, junD 등으로 구분되고, 신경활동의 지표로서 면역변화, 뇌출혈, 소음, 운동과 같은 다양한 자극이 주어지면 매우 빠르고 정확하게 발현되는 것으로 알려져 있다. 그리고 세포의 증식, 분화, 세포사, 종양형 성과 유전자의 발현 등 다양한 세포과정을 조절한다. 운동은 NGF의 생성을 촉진하며, 그 하위 신호체계인 c-jun의 발현을 통해 학습능력과 기억에 관하여 신경세포의 활성과 관련이 있는 것으로 보고 되고 있으며, 신경 표지자로 알려져 있는 c-jun은 신경의 재생과 관련되어 많은 연구가 수행 되어 오고 있다. 특히 Sim 등은 해마에서 비만쥐와 마른쥐의 비교를 통해 비만쥐보다 마른쥐에서 c-jun의 발현이 증가한다고 하여 정상체중을 유지하는 것이 필수적임을 제시하였으며, Yanagita 등은 시상하부에서 강제적인 wheel running 운동 그룹이 그렇지 않은 그룹보다 c-jun 발현이 증가한다고 하여 규칙적인 운동의 필요성을 제시하였다. 또한 Toldy 등은 전두엽과 소뇌에서 규칙적인 운동으로 c-jun이 증가한다고 보고하였으며, Iemitsu 등은 심장에서 rats을 대상으로 48 시간의 트레드밀 운동이 그렇지 않은 그룹보다 c-jun의 발현이 증가 한다고 보고하였다. 본 연구 결과 해마에서 트레드밀 훈련 후의 NGF의 단백질 발현이 증가되었으며, 또한 c-jun의 발현이 HDT 그룹에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 인지기능 검사의 직접적인 효과로서 Water maze time을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 선행연구에서 시상하부에 국한된 것과는 달리 운동의 긍정적 효과가 인지기능과 학습능력에 직접적으로 관여하는 뇌의 해마에서 나타남으로써 그 의미가 크다고 할 수 있다. 따라서 규칙적인 운동이 해마에서 NGF의 발현은 물론 c-jun의 발현을 증가 시켜 학습능력과 기억력의 향상을 유발하였으며, 유기체의 신경세포성장에 긍정적인 영향을 주게 되어 공간인지 능력의 향상을 가져온 것으로 판단된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물과 환경조건</h2> <p>본 연구에 사용된 동물은 국가공인 동물 취급 업체로부터 분양 받은 Sprague-Dawley 수컷 흰쥐(4주령) 30 마리로서 D대학교 의과대학 동물 실험실에서 한 cage에 2마리씩 넣어 사육하였다. 동물 사육실은 high efficiency particulate arrestant (HEPA) 항시 무균 청정 공기를 공급시키는 필터와 외부의 오염 공기가 차단되는 양압 설비를 갖추고 있으며, 사육실 내의 온도는 \( 22-24{ }^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \( 60 \% \), 조명 등이 자동 제어되어 일정한 조건의 사육 환경이 제공될 수 있는 시설을 갖추었다. 모든 실험은 D대학교 의학연구소와 동물 실험 위원회 지침에 따라 시행하였다.</p> <h2>식이섭취 및 체중변화</h2> <p>1주일간의 환경 적응(일반식이: Dong-a SF, Korea)을 시킨 후, 15주간 모든 필수 영양소, vitamin과 mineral, 그리고 fat \( 40 \% \) 가 함유된 AIN-76A (Jung-ang Lab. Animal, Inc. Korea)을 물과 함께 공급하여 비만을 유도 하였다. 15주간 비만 유도 후, 비만식이 비훈련군 (high fat diet sedentary, HDS, \( n=15 \) ), 비만식이 훈련군 (high fat diet training, HDT, \(\mathrm{n}=15) \) 으로 분류하여 사육하였다. 실험 기간 동안 식이 섭취량은 매일 같은 시각(18:00)에 측정하였으며, 체중은 매주 1 회(18:30) 일정한 시간에 computingscale 체중계(CAS, Korea)를 이용하여 측정 하였고, 식이섭취에 의한 일시적인 체중 변화를 막기 위해 측정 2 시간 전에 식이 그릇을 제거한 후 실시 하였다.</p> <h2>운동프로그램</h2> <p>운동 프로그램은 15 주간 고지방 식이를 통해 비만을 유도한 후, Sim 등의 연구에서 사용된 방법과 동일하게, 주 5일, 1일 40분씩 8 주간 실시하였다. 트레드밀 운동은 1~4주는 경사도 \( 0^{\circ} \) 고정된 조건에서 처음 5 분간은 \( 2 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \) 의 속도로, 다음5 분간은 \( 5 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \) 의 속도로, 그리고 남은 30 분 동안은 8\( \mathrm{m} / \mathrm{min} \) 의 속도로 실시하였다. 5 주에서 8 주는 경사도 \( 0^{\circ} \) 고정된 조건에서 처음 10 분간은 \( 8 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \) 의 속도로, 다음 10 분간은 \( 11 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \) 의 속도로, 그리고 나머지 40 분 동안은 \(14 \mathrm{m} / \mathrm{min} \) 의 속도로 실시하였다.</p>	생명
임상검체에서 분리된 Methicillin Resistant Staphylococcus aureus의다제내성양과 내성 관련 유전자의 검색	<h1>서 론</h1><p>메티실린 내성 포도상구균(MRSA)은 1961년이 최초로 보고된 이후 대부분의 항균제에 다제내성(multiple antibiotics resistance)을 보이면서 강력한 항균제가 꾸준히 개발됨에도 불구하고 전 세계적으로 병원 내 원인균으로 문제가 되고 있다. MRSA에 의한 감염증의 치료는 비베타락탐계 항생제를 필요로 하며, 또한 이들은 여러 종류의 항생제에 대해서 내성을 나타내므로, 치료에 많은 어려움이 뒤따른다. MRSA의 메티실린에 대한 내성은 내인성기전(Instrinsic resistance)에 의한 것으로서, 포도상구균의 염색체 상에 존재하는 mec이라는 메티실린 내성결정인자에 의해 매개된다. 즉 mec은 페니실린에 대한 친화성이 매우 적은 penicillin binding protein인 PBP2'또는 PBP2a 라고도 불리는 단백질에 대한 구조 유전자인 mecA를 포함하고 있는데, 이 PBP2a는 기존의 PBP들을 불활성화 시킬 수 있는 \(\beta\)-lactam계 항생제의 농도에서도 세포벽의 주요성분인 peptidoglycan의 합성을 지속적으로 수행할수 있는 능력을 갖는다. 메티실린 내성에 대해서는 처음부터 유전적 내성은 플라스미드에 있지 않는 내성기전의 존재가 추측되고 있다. PBP2'는 약제와의 친화성이 낮고\(\beta\)-lactamase의 존재에서도 PBP에 대해서 세포벽을 합성하는 것이 가능하다. Song 등은 결정된 염기서열의 특성으로부터 PBP2'을 코드한 유전자인 mecA의 페니실린에 유전자와 상동성이 높은 부분의 mecA 유전자의 억제 유전자로 생가되는 mecB 유전자의 존재를 보고하였고, 이 mecA 유전자의 상유역을 없애면 PBP2'의 생성이 증가하고 동시에 메티실린 내성이 상승하는 것으로부터 이 mecB 유전자가 억제 조절 인자인 mecR 인 것이 밝혀졌다. Hiramatsu 등은 이 mecR이 유도 유전자인 mecR1과 억제 유전자인 mecI로 구성됨을 밝혔는데, mecA gene의 조절 유전자로서 mecR1과 mecl는 \(\beta\)-lactam의 존재 하에서 아주 서서히 mecA의 전사를 조절하는 강한 억제인자이다. mecA 유전자의 전사를 조절하는 유전자인 mecR1과 mecl가 염색체상에서 mecA유전자의 바로 윗부분에 존재하여, mecA의 발현을 조절한다. 즉 이들은 mecR1과 mecI가 각각 coinducer와 repressor로서 작용하여 mecA gene의 전사를 억제하므로, mecA가 염색체상에 존재함에도 불구하고 PBP2a가 발현되지 않으므로 메티실린에 대한 내성을 나타내지 읺는다. 유도 유전자 mecR1에 의하여 code 되는 단백질은 585개의 아미노산으로 구성되며, \(\beta\)-lactam 제제에 의하여 활성화되면 mecA의 촉진 부위(promotor region)에 결합함으로서 mecI에 의한 전사(transcription) 억제가 해제되고 PBP2'가 생성되면서 내성 표현이 좌우되는 것으로 알려져 있다.</p><p>한편, Berger-Bachi 등은 mecA가 메티실린에 대한 내성의 발현에 반드시 필요한 요건이기는 하지만 MRSA의 내성 의존도와 mecA 유전자 발현의 결과인 PBP2a의 양과는 서로 직접적인 상관성이 없다고 주장하였다. 즉 이들은 transposon Tn551을 methicillin 내성균주에 삽입하여 얻은 균주가 메티실린에 감수성을 나타냈으나, 여전히 PBP2a를 생성하는 것을 발견하고 PBP2a의 존재만으로는 메티실린에 대한 내성을 모두 설명할 수 없으며, mec 결정인자 이외에 MRSA의 methicillin에 대한 내성에 관계되는 또 다른 유전자인 fem(factors essential for the expression of methicillin resistance)의 존재를 보고하였다. mecA로부터 \(1,000\mathrm{~kb}\) 떨어진 위치에 있는 femA가 메티실린 내성을 조절하는 유전자로 존재하는 것으로 생각되고 있다. 1980년이래 급속도로 증가하는 다제내성균에 대해서는 복수의 내성유전자가 염색체 DNA상에 존재하고 있음이 확인됨에 따라 내성 기전의 범위는 점차 복잡해지고 있다. 상세한 기전에 관해서는 아직 밝혀져 있지 않은 부분이 많지만, 포도상구균에 대한 메티실린 내성의 본능이 PBP'와 PBP2의 유도에 따른다는 것은 널리 알려진 사실이다. 본 연구에서는 일반 검체에서 세균검사로 확인된 MRSA를 대상으로 항생제 내성 검사를 실시하여 다재내성양상을 관찰하였고, MRSA의 내성관련 유전자인 mecA, mecR1, mecI 및 femA를 검색하여 유전자들과 다제내성간의 상관관계를 검토하였다.</p>	생명
Tussue microarray를 이용한 사이모신 베타4(Thymosin β4)와 vascular endothelial cell growth factor (VEGF)의	<h1>고 찰</h1><p>본 연구에서는 사이모신 베타 4의 단백질 발현을 여러 인간 장기를 대상으로 tissue microarray를 사용하여 조사하였다. 또한 VEGF 단백질 발현을 동일 슬라이드를 대상으로 조사함으로써 VEGF와 사이모신 베타 4의 발현 양상을 비교하고 함께 위치하여 관련된 작용을 하는지를 조사하였다. 조직 전반적으로 사이모신 베타 4는 섬유성 기질 조직, 혈관 내피세포, 림프구들에서 발현되다. 조직 별로는 간, 이자, 침샘의 관상피, 심장에서 강한 발현을 보였고 피부, 폐, 이자, 림프절, 갑상선, 요관에서 중간 정도의 발현을 보였다. VEGF는 혈관 내피세포에서 발현되었고 대체적으로 사이모신 베타 4와 동일한 위치에서 동일한 양상의 발현을 보였지만 반드시 일치하지는 않았다. 기관별로는 이자, 요관, 유선, 간, 식도, 폐와 부신(adrenal gland)등 혈관이 밀집되어 분포하는 곳에서 강한 발현을 보였다.</p><p>사이모신 베타 4는 정상 조직 혹은 발생과정에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고 되고 있다. 혈관형성을 유도하고 상처치유와 모발성장을 촉진하며 세포 사멸과 항염증 작용을 하는 것이 보고 되었으며 심장 세포의 이동, 생존, 심장 손상 회복에 관여하는 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 발생과정에서도 사이모신 베타 4의 여러가지 중요한 역할이 보고되었는데 신경계와 심혈관계 (cardiovascular system), 치아 형성에 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다. 본 연구에서는 사이모신 베타 4의 발현양상을 인간의 여러가지 정상 조직에서 tissue microarray를 사용하여 조사하였다. 또한 사이모신 베타 4에 의해 유도되며 혈관 형성에 중요한 역할을 담당하는 VEGF의 발현 양상을 함께 조사하여 그 상호 관련 여부를 조사하였다. 본 연구결과에 따르면 사이모신 베타 4의 발현 양상과 VEGF는 대체적으로 유사하며 같은 위치에서 발현되지만 그 발현양상이 다른 경우도 관찰되었다. 따라서 대체적으로 사이모신 베타 4와 VEGF는 상호 연관되어 작용하며 동일한 발현 양상을 보이지만 모든 기관에서 사이모신 베타 4와 VEGF의 발현이 관련된 것은 아니라는 것을 보여 주었다. 본 연구에 의해 강한 사이모신 베타 4의 발현양상을 보이는 몇몇 기관이 확인되었는데 이러한 발현 양상을 통해 특정 기관에서의 사이모신 베타 4의 역할이 중요하고 필요하다는 것을 유추할 수 있다. 사이모신베타 4는 간, 이자, 침샘 및 심장에서 강한 발현을 보였는데 이중 심장에서의 사이모신 베타 4는 이미 보고된 바 있으며 다른 기관인 간, 이자, 침샘에 대해서는 아직 연구된 바가 없으므로 추가 연구를 통해 이러한 기관에서의 사이모신 베타 4의 구체적인 역할이 밝혀져야 할 것이다.</p><p>사이모신 베타4는 암전이 현상과 악성화에 관여한다. 많은 연구들을 통해 사이모신 베타 4가 악성암에서 증가되는 것이 보고되었지만 아직 암조직 사이의 기질 조직에 관해서는 발현 양상이 조사되지 않고 있다. 최근 암의 성장에 암조직 사이의 기질조직의 중요성이 부각되고 널리 연구되고 있다. 사이모신 베타는 대체적으로 정상적인 조직에서도 섬유성 기질 조직에 많이 발현된다. 이러한 점을 볼 때 사이모신 베타 4가 실제 암의 성장에 있어서 기질에서 많이 발현되어 암의 성장 및 확산에 관여할 가능성에 대해서도 검토되고 연구될 필요가 있다고 생각된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>Tissue microarray</h2><p>Tissue microarray는 Super Bio Chip (SuperBioChips Laboratories, Seoul, Korea)사로부터 구입하여 사용하였다. 나이와 성별을 제외한 환자의 정보는 제공되지 않았다. 조직에 관한 정보와 조직의 종류는 Table 1에 요약되어 있다.</p><h2>면역조직화학검사(Immunohistochemistry)</h2><p>면역조직화학검사를 위해 tissue microarray 슬라이드를 탈파라핀화와 수화를 거친다음 citrate buffer \( (0.01 \mathrm{M}, \mathrm{pH} \) 6.0)상에서 전자레인지로 최고출력으로(\( 700 \mathrm{W} \) 이상) 5분간 두번 antigen retrieval을 실시하였다. PBS하에서 슬라이드를 충분히 식힌 후 3% hydrogen peroxide 용액에서 5분간 반응하여 endogenous peroxidase를 제거하였다. 이후 PBS로 5분간 3번 씻어 준 다음 PBS에 희석된 rabbit polyclonal thymosin \( \beta 4 \) (\( 1: 1,000 \) dilution; ALPCO Diagnostics, Windham, NH, USA) 혹은 rabbit polyclonal VEGF (\( 1: 2,000 \) dilution, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) 항체로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 배양하였다. 다음날 PBS로 5분씩 3번 씻어 준 후 2차 항체를 처리하여 1시간 동안 반응한다. PBS로 5분 동안 3번 씻어 준 후 Dako's EnVision Kit (DAKO, Carpinteria, CA, USA)를 사용하여 DAB 발색반응을 유도하였다. 슬라이드는 이후 대조 염색을 Meyer's hematoxylin (DAKO, Carpinteria, CA, USA)로 10초간 염색 후 탈수반응을 거친 다음 Permount (Fishier Scientific, Pittsburgh, PA, USA)로 고정하였다.</p><h2>정량적 분석(Semiquantitative Assessment)</h2><p>단백질 발현양상의 정도를 측정하기 위해 면역화학염색의 정도를 4가지로 나누어 판단하였다. 발현이 되지 않고 염색이 되지 않은 경우를 negative\( (-) \), 약하게 발현되는 경우를 weak\( (+) \), 중간 정도의 발현양상을 보이는 경우를 moderate \( (++) \), 강한 발현양상을 보이는 경우를 strong \( (+++) \)으로 분류하였다. 발현 양상이 국소적인 경우는 focal positive \(( \left.{ }^{*}\right) \)로 표시하였다.</p><h1>결 과</h1><p>Tissue microarray 슬라이드 상의 59가지의 인간 정상조직을 대상으로 사이모신 베타 4와 VEGF에 대한 면역조직화학검사를 실시하였다. 사이모신 베타 4는 조직에 관계 없이 주로 섬유성 기질 조직(stromal fibrous tissue), 혈관내피세포(blood endothelial cells) 및 림프구(lymphocytes)에서 발현되는 것이 관찰되었으며 VEGF는 주로 혈관 내피세포에서 관찰되었다. 사이모신 베타 4와 VEGF의 자세한 조직별 발현양상은 Table 2에 요약되어 있다.</p><p>기관별로 사이모신 베타 4와 VEGF의 발현 양상을 살펴보면 림프계통의 기관인 이자, 림프절, 갑상선에서는 사이모신 베타 4와 VEGF 모두 중간 정도의 발현 양상을 보였다. 사이모신 베타 4와 VEGF 모두 폐의 폐포 사이막 세포 (alveolar septal cells)와 혈관 내피세포에서도 증간 정도의 유사한 발현양상을 보였다. 비뇨계통(urinary system)에서 사이모신 베타 4는 신장의 신장 관(renal tubes), 요관상피(ureter epithelium) 및 기질 조직에서 중간 정도의 발현양상을 보였으며 VEGF는 발현 양상은 사이모신 베타 4와 유사하지만 요관 상피(ureter epithelium)에서 강하게 발현되는 것이 관찰되었다. 내분비계(endocrine system)에서는 혈관내피세포를 제외한 부신 피질(adrenal cortex)과 수질 (medullar)에서는 사이모신 베타 4의 발현이 관찰되지 않았으며 VEGF 역시 혈관내피세포 이외에는 발현 되지 않았다. 소화기계(digestive system)에서는 침샘(salivary gland)의 관 상피(ductal epithelium)에서 사이모신 베타 4가 강하게 발현되는 것이 관찰되었고 간, 체관(pancreatic ducts)에서도 강하게 발현되었으며 침샘의 세엽(acini), 이자의 외분비 세엽(exocrine acini), 위(stomach)의 기저관(fundic gland), 맹장(appendix)의 선상피(gland epithelium) 및 기질 조직에서 중간 정도의 발현양상을 보였다. VEGF는 대체로 사이모신 베타 4와 유사한 발현 양상을 보였으며 이자에서 강한 발현을 보였다. 생식계통(reproductive system)에서는 사이모신 베타 4의 발현이 대체로 낮거나 중간 정도였으며 VEGF 역시 약하거나 발현 되지 않았다. 신경계통(nerve system)에서는 뇌의 백색질(white matter)이나 척수(spinal cord)의 신경세포(neurons)에서는 사이모신 베타 4가 발현되지 않았으나 뇌의 회색질(gray matter) 및 척수의 아교세포(glial cells)에서는 약하게 발현되는 것이 관찰 되었다. VEGF 역시 신경계통에서는 발현되지 않거나 매우 약하였다. 피부 상피(skin epidermis) 에서는 중간 정도의 발현양상을 보였으나 바닥층(basal layer)에서는 발현이 되지 않았으며 진피(dermis)에서는 부분적으로 약하게 발현되었다. VEGF는 혈관 내피세포를 제외하고는 피부에서는 발현되지 않았다. 유방의 기질 조직에서는 사이모신 베타4가 강하게 발현되었으나 유선(mammary gland)에서는 발현되지 않는 양상을 보였으며 VEGF는 유선에서 강하게 발현되었다. 골격근(skeletal muscle)에서는 사이모신 베타 4가 중간 정도로 발현되었으나 심장근(cardiac muscle)에서는 아주 강하게 발현되었다. VEGF는 골격근에서는 약한 발현을 보였으며 심장근에서는 중간 수준의 발현을 보였다.</p> <h1>서 론</h1><p>사이모신 베타4(thymosin \( \beta 4) \)는 43개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질이다. 우리 몸의 일반적인 세포의 베타 사이모신 계통 전체 단백질 중 70-80%가 사이모신 베타 4로써 가장 많은 부분을 차지하고 있으며 거의 모든 세포에서 \(0.4 \mathrm{mM} \)이상의 사이모신 베타4가 존재한다고 보고되고 있다. 사이모신 베타 4가 처음 발견될 때는 갑상선에서 분리되었으며 갑상선 증식 인자 중의 하나인 것으로 보고되었다. 사이모신 베타 4는 G-actin과 결합하여 F-actin과 G-actin의 변환을 조절하여 세포의 이동을 촉진하는 단백질로 처음 알려지면서 활발히 연구되어 여러가지 기능들이 보고되었다. 사이모신 베타 4의 대표적 기능으로는 혈관신생 유도, 상처치유 촉진, 모발성장 촉진, 세포사멸, 면역억제 반응, 그리고 고형암 성장 및 전이촉진 등을 들 수 있다. 이러한 기능 외에도 사이모신 베타 4는 발생학적으로도 여러가지 기능을 담당한다. 계배의 신경형성, 심장형성 및 깃털형성에 사이모신 베타 4가 관여하는 것이 보고 되었으며 쥐의 뇌에서 신경이 형성되는 과정, 심장의 형성과정 등에 사이모신 베타 4가 관여하는 것이 보고되었다. 또 사이모신 베타 4는 발생 초기단계의 치아 주변에 발현되어 치아 형성 과정에도 중요한 영향을 미치는 것으로 알려졌다. 최근 사이모신 베타 4는 혈관형성의 주요한 인자인 vascular endothelial cell growth factor(VEGF)의 발현을 유도하는 것이 밝혀졌다. 사이모신 베타4의 VEGF 유도 현상은 혈관 형성 촉진과 암전이 촉진 현상을 밝혀 줄 수 있으며 여러 장기에서 VEGF와 함께 혈관 형성작용에 관여할 가능성을 제시해 준다.</p><p>그러나 사이모신 베타4의 발생 단계의 기관 형성 및 여러 장기에서의 중요한 역할에도 불구하고 아직까지 정상 조직에서의 발현 양상이 모든 장기를 대상으로 구체적으로 조사되지 않고 있으며 특히 생체 내에서 실질적인 기능을 수행하는 단백질 수준에서의 발현 양상에 대한 조사는 거의 이루어지지않고 있다. 사이모신 베타 4의 발현 양상에 대한 보고를 살펴보면 이자(spleen) 및 면역 관계 세포들에서 사이모신 베타4가 발현되고 있음이 RNA 단계의 분석을 통해 보고된 바 있으며 혈중 사이모신 베타 4의 농도가 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay)에 의해 조사되었고 이자, 갑상선, 폐등의 장기에서 RNA 수준의 발현양상이 보고된 바 있다. 쥐, 생쥐, 계배 및 인간 배아의 뇌에서 사이모신 베타 4의 발현 양상이 관찰 되었으며 폐 소세포암종(small cell lung carcinoma), 유방암 등의 여러 암조직에서 사이모신 베타 4의 발현 양상이 보고된 바 있다. 하지만 정상 조직 및 각 장기에서 단백질 수준의 사이모신 베타 4의 발현양상이 관찰된 보고는 아직 없으며 구체적인 발현 위치에 대해서도 조사되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 tissue mi-croarray를 이용하여 여러 인간 장기에서 사이모신 베타 4의 발현양상을 관찰하고 사이모신 베타 4에 의해 발현이 유도될 것으로 예상되는 VEGF의 발현을 조사함으로써 사이모신 베타 4의 기능을 조사하고 각 조직에서 사이모신 베타4와 VEGF의 관련성을 조사하고자 하였다.</p>	생명
호두의 화장품 기능성	<h1>서 론</h1> <p>성인병 및 만성질환 등에 심각하게 노출되어있는 현대인들은 과도한 업무와 불규칙적인 식습관으로 인하여 체내에 prooxidant와 antioxidant의 불균형으로 초래되는 산화적 스트레스(oxidative stress)에 의해 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환에 노출되어있다 할 수 있다. 특히 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성산소(reactive oxygen)는 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 되며, 향장분야에서는 피부 노화나 여러 가지 피부 트러블을 야기하게 된다. 이러한 활성산소를 조절하기 위하여 합성항산화제가 널리 쓰여 왔지만, 웰빙이라는 문화적 이슈로 인하여 인공 합성물에 대한 인식의 변화와 안전성의 논란이 지속되고 있어, 안전한 천연물로 이를 대처하고자 천연물을 이용한 기능성 식품과 기능성 화장품의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히 지금까지 피부노화를 억제하는 천연 항산화제의 경우 주로 식물에서 유래된 폴리페놀성 물질이 보고 되어있는데, flavonoid, tannin, carotenoid 등이 노화억제 및 염증 그리고 각종 암등을 예방하는데 효과적이라고 알려져 있다.</p> <p>호두(Juglans regia)는 가래나무과 호두나무(Juglans sinensis)속에 속하는 소교목의 열매로 전 세계적으로 널리 분포, 재배되고 있는 작물로서 페르시아 호두(Juglans regia)를 비롯하여 10여 종이 주종을 이루고 있다. 호두는 지질 및 단백질뿐만 아니라 무기질까지 풍부한 영양원으로 특유의 향미가 있어서 아이스크림, 호두기름 향유, 호두기름 화장품, 그림물감용 등으로 널리 사용되고 있으며, 예로부터 우리나라에서는 두뇌작용은 물론 머리카락을 검게 한다고 하여 한방의 약재로도 사용되고 있다. 이러한 호두를 이용하여 매우 효력이 있고 안전하면서 기능성을 활용하고자 하는 연구가 계속되고 있으며, 생리활성 및 화합물 분리 정제에 대한 논문들이 발표되고 있으나 피부미용에 적용 하기위한 화장품 기능성에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 한국에서 자생하는 호두추출물로부터 항산화, 항염증효과와 미백 및 수렴효과 등의 화장품 생리활성을 검토하여 기능성 화장품에 적용하기위한 자료로 활용하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물의 제조</h2> <p>호두추출물의 제조는 충북 영동지방에서 구매한 호두시료를 에탄올, 메탄올, 아세톤, 물 등을 추출용매로 하여 100 mesh로 걸러진 호두과육과 껍질 혼합시료 \(1 \mathrm{g}\)에 추출용매 \(100 \mathrm{ml}\)를 가하여 24시간 동안 진탕 추출하였으며, 추출액은 Whatman No. 1 filter paper로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator (Eyela NE, Japan)에서 농축하여 사용하였다</p> <h2>총 phenol성 화합물 정량</h2> <p>총 phenol성 화합물은 Folin-Denis 방법으로 측정하였으며, 시료 \(1 \mathrm{ml}\)에 \(95 \% \) ethanol \(1 \mathrm{ml}\)와 증류수 \(5 \mathrm{ml}\)를 첨가하고 \( 1 \mathrm{~N} \) Folin-ciocalteu reagent \(0.5 \mathrm{ml}\)를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) \(1 \mathrm{ml}\)를 가한 후, 흡광도 \(725 \mathrm{nm}\)에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>호두 추출물의 추출조건 및 페놀성 화합물 함량</h2> <p>호두시료로 부터 다양한 추출용매를 이용하여 phenolic compounds를 추출한 결과 Fig. 1과 같이 ethanol 추출물에서 \(31.9\mathrm{mg}/\mathrm{g} \)의 가장 높은 phenolic compounds의 함량을 나타내었으며, 인체에 무해한 추출용매인 물과 ethanol을 가지고 농도별로 추출한 결과 Fig. 2와 같이 phenolic compounds가 ethanol \(60\%\)의 농도에서 \(33.1\mathrm{mg}/\mathrm{g} \)으로 추출수율이 가장 높았으며, 열수추출에서는 \(24.6 \mathrm{mg}/\mathrm{g} \)로 Moon 등이 보고한 녹차(\(10.9\mathrm{mg}/\mathrm{g} \)), 상황버섯(\(17.9 \mathrm{mg}/\mathrm{g} \)), 인지( \(6.7\mathrm{mg}/\mathrm{g} \))의 추출물의 phenolic compounds 함량 보다 높은 함량을 나타내었다. 페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 분자구조와 분자량을 가지며, 구조적으로 phenolic hydroxyl(\( \mathrm{OH} \))기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하여, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 시료의 \(60\%\) ethanol 추출물에서 약 \(33\mathrm{mg} / \mathrm{g} \)의 phenolic compounds 함량을 나타내어 생리활성도 우수할 것이라 판단되었다.</p> <h2>항산화 효과</h2> <p>전자공여능은 phenolic acid와 flavonoids 및 기타 phenol성 물질에 대한 항산화 작용의 지표라 할 수 있으며, 이러한 물질들이 free radical을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크면 높은 항산화 활성 및 활성산소에 대한 소거활성을 기대할 수 있다. DPPH 라디칼 소거능을 알아본 결과 Table 1과 같이 대조구인 vitamin C를 \(200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 처리하였을 때의 \(87\%\)에 비해 열수추출물과 \(60\%\) ethanol 추출물을 \(200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)씩 처리하였을 때에서 각각 \(78.1\%\)와 \(80.6\%\)를 나타내어 두 추출물 모두 높은 전자공여능을 가지고 있다고 판단되었다. DPPH 라디칼 소거능이 높다는 결과로 본 시료에 함유된 페놀성 화합물들이 자유라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력을 수행하여 화장품에 적용하였을 때 피부에서 자유 라디칼에 의한 노화를 억제하는 역할을 수행할 수 있을 것이라 판단하였다. 수용성 물질에 대한 항산화력을 측정하기 위하여 \(200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 동일한 처리 농도에서 ABTS radical cation decolorization을 측정한 결과, Table 1과 같이 열수 추출물에서 \(98.1\%\) 그리고 \(60\%\) ethanol 추출물에서 \(98.3\%\)로 높은 저해율을 나타내어 대조구인 vitamin C의 \(98\%\)와 유사하게 측정되어 우수한 항산화력을 가진 것으로 확인되었다. 이는 윤 등이 보고한 추출용매 비에 따른 백부자(Aconiti koreani Rhizoma) 추출물의 항산화 실험에서 에탄올 추출물 및 열수추출물의 항산화력보다 우수한 결과를 나타내었다. 지용성 물질에 대한 항산화력을 알아보기 위하여 PF를 측정한 결과 Table 1과 같이 열수추출물과 \(60\%\) ethanol 추출물 모두에서 vitamin C의 1.2보다 다소 낮은 1.1 정도의 PF 값을 나타내었으나, Duval과 Shetty가 완두에 함유되어있는 phenol성 물질의 PF가 \(1.1\sim1.3\) 정도였다고 보고한 결과와 유사한 경향을 보였다. 지질의 산화 억제효과를 측정하는 지표로 TBARs 생성의 감소정도를 측정한 결과 Table 1과 같이 열수 추출물에서 \(60\%\) 그리고 \(60\%\) ethanol 추출물에서 \(75\%\)의 억제효과를 나타내어 vitamin C보다 지용성 물질에 대한 항산화력은 더 높게 측정되어 비교적 높은 항산화력을 가졌음을 알 수 있었다.</p> <h2>염증 억제 효과</h2> <p>염증은 외부자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로서 활성화된 면역세포에 의해 일어나는 일련의 면역반응이다. 면역세포가 세균, 바이러스 등을 포함한 미생물 및 생체의 이물질 등을 인식하면 면역세포가 활성화되고, 활성화된 면역세포에서 염증반응의 원인이 되는 많은 인자를 분비하여 염증반응을 유발시킨다. Nitric oxide (NO)는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로서, NO synthase (NOS)에 의해 L-argine으로부터 생성되는데, NO는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하며, 특히 대식세포가 LPS로 자극될 때 in-ducible NOS(iNOS)가 발현되어 NO을 생성하게 되는데, 이렇게 생성된 NO는 염증반응을 매개하는 역할을 하게 된다. 따라서 호두의 항염증활성을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포에 \(10\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 LPS를 1시간 동안 처리한 후 호두 에탄올추출물을 \( 5, 10, 50, 100\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도별로 처리하여 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig. 3과 같이 호두 에탄올추출물의 농도가 증가함에 따라 NO의 생성량이 감소하는 경향을 나타내었다. LPS만 처리한 군에 비해 \( 5\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)처리군에서는 \(2\%\), \(10 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 처리군에서는 \(10\%\), \(10 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 처리군에서는 \(35\%\), \(100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) l 처리군에서는 \(50\%\) 정도 감소시키는 것으로 확인되었다. LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이때 염증반응 및 종양발생 등에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응과 관련된 조직에서 NO와 iNOS의 발현이 증가되는 현상이 일어나게 된다. 본 실험에서 LPS만 처리한 군에 비해 \(100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 호두 에탄올 처리군에서는 \(50\%\) 정도 NO의 양이 감소되는 것으로 보아 피부의 염증 억제에도 효과적으로 작용할 것이라 판단되었다. NO의 생성에는 NOS라는 효소가 작용하는데, NOS에는 constitutive NOS (cNOS)와 inducible NOS (iNOS) 두 종류가 있다. 특히, 자극에 유도된 iNOS인 경우 오랜 기간 동안 다량의 NO를 생성하게 되고, 생성된 NO는 guanyl cyclase의 활성과 동시에 주위 조직에 세포독성을 나타내는 것이 특징이다. 즉 LPS로 유도되어진 RAW 264.7 cell에서 iNOS의 protein level의 감소에 의해 항염증 효과를 기대할 수 있으며, 또한 세포와 같은 macrophage 또한 monocyte에서 tumor necrosis fzctor-alpha (TNF-\(\alpha\)), Interleukin-6 (IL-6)와 같은 proinflam matory cytokine을 증가시키는 요인 중 하나인 COX-2의 protein level을 측정함으로써 항염증 효과를 기대할 수 있다. 호두추출물에 의한 NO생성 저해 기전을 확인하기 위해 western blot으로 iNOS의 단백질 생성을 측정한 결과 Fig. 4와 같이 호두추출물의 경우 대조군에 비해 \(100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \(10\%\)의 억제효과를 나타내어 대식세포에서 호두추출물에 의해 iNOS 발현이 억제되는 결과를 나타내었으나 그 효과는 높지 않았다. 또 다른 염증인자인 COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과 호두추출물의 경우 \(100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 \(5\%\)의 저해 효과만을 나타내었다. iNOS와 COX-2의 발현은 둘 다 염증반응에 관련된 분자이지만 처리하는 약물에 의한 결과는 서로 다른 기전을 가지고 있는 것으로 판단되며, 앞에서 언급한 NO 생성 억제 결과에 비하여 낮은 결과를 나타낸 것은 macrophage에서 inducible NOS의 발현에 의한 NO 생성 이외의 다른 mechanism에 의한 NO 생성이 이루어지는지에 대한 연구와 TNF-\(\alpha\), IL-1, IL-6, IL-8 등 cytokine에 대한 연구를 병행하여 차후 지속적인 연구가 이루어져야 한다고 판단되었다.</p> <h2>미백 활성</h2> <p>피부의 색조를 결정하는 주요한 인자인 melanin은 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소세포 내의 melanosome에서 생합성 된다. 멜라닌을 합성하는데 있어서의 출발물질은 아미노산의 일종인 tyrosine이다. Tyrosinase는 피부의 표피 기저층에 존재하는 멜라조사이트에서 tyrosine을 산화시켜 멜라닌의 생성을 촉진시키는 효소로서, 이들의 활성 억제는 피부 미백에 매우 효과적이다. 그리하여 호두추출물의 ty-rosinase 활성저해를 측정해 본 결과 Table 2와 같이 \(200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 열수 추출물에서는 저해효과가 나타나지 않았으나, \(200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 \(60\%\) ethanol 추출물의 경우 \(43\%\)의 저해율을 나타나, 대조구인 \(200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) vitamin C보다는 낮게 나타나났으나, Shin의 연구 결과인 홍경천, 인삼, 갈근, 오미자, 연교, 홍화씨, 창출 추출물을 이용한 실험결과보다 높은 tyrosinase 활성억제를 보여 주었으며, 이는 호두추출물이 멜라닌 색소의 억제를 통한 미백화장품의 원료 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.</p> <h2>수렴 효과</h2> <p>수렴작용이란 피부 단백질이 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 일반적으로 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 헤모글로빈 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴성의 효과 정도를 판단 할 수 있다. 따라서 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하고 그 결과 구조를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 할 수 있다. 그러므로 수렴성이 존재함은 피부를 수축시키므로 주름 개선 효과가 있다고 할 수 있다. 본 실험 결과 \(200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 동일한 처리 농도에서 열수추출물의 경우에는 수렴작용이 나타나지 않았으나, \(60\%\) ethanol 추출물의 경우 Table 3과 같이 \(55\%\)의 억제효과를 나타내어 수렴활성이 우수한 것으로 판단되었으며, 대조구인 vitamin C의 \(34\%\)보다는 높았고, tannic acid의 \(58\%\)와 비슷한 수준으로 측정되었다. 이러한 결과로 보아 호두추출물은 피부 단백질의 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하고 피부가 수축되는 현상이 발생하여, 외용화장품에 적용함으로써 피부와 점막 표면에 난용성의 피막을 형성하여 국소를 보호하거나, 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시킴으로 인해 주름개선효과를 기대할 수 있어, 주름개선용 화장품의 소재로서 개발이 가능하다고 판단되었으며, 향후 이러한 생리활성물질의 정제 및 동정을 통하여 기능성 화장품소재로서의 추가 연구개발이 진행되어야한다고 판단된다.</p> <h2>전자공여능 측정</h2> <p>호두추출물의 전자공여능(electron donating abilities, EDA)은 Blois의 방법에 준하여 측정하였다. 각 시료용액 \(1.0 \mathrm{ml}\)에 \(60 \mathrm{\mu M}\)의 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) \(3.0 \mathrm{ml}\)를 넣고 교반한 후, 15분간 방치한 다음 \(517 \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음 식에 의해 나타내었다.</p> <p>\( \begin{array}{c}\text { DPPH radical } \\ \text { 소거능(\%) }\end{array}=\frac{\text { 대조구의 흡광도-반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }} \times 100 \)</p> <h2>ABTS radical cation decolorization의 측정</h2> <p>ABTS radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법에 의해 측정하였다. 즉, \(7\mathrm{mM}\) ABTS \(5\mathrm{ml}\)와 \(140 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{S}_{2} \mathrm{O}_{8} \) \(88\mathrm{\mu l}\)의 비율로 섞어 어두운 곳에 \(14\sim16\)시간 방치시킨 후, 이를 absolute ethanol과 \( 1: 88 \)의 비율로 섞어 \(734\mathrm{nm}\)에서 대조구의 흡광도 값이 \( 0.7 \pm 0.002 \)가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료용액 \(50\mathrm{\mu l}\)와 ABTS solution \(1\mathrm{ml}\)를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 incubation하여 \(734\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하여 아래의 식에 의해 저해율을 계산하였다.</p> <p>ABTS radical 저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Antioxidant protection factor (PF) 측정</h2> <p>PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법으로 측정하였다. \(10\mathrm{mg}\)의 \(\beta\)-carotene을 \(50\mathrm{ml}\)의 chloroform에 녹인 용액 \(1\mathrm{ml}\)를 evaporator용 수기에 넣고 \(40\mathrm{^\circ C}\) water bath에서 chloroform을 증류시킨 후 \(20\mathrm{\mu l}\) linoleic acid, \(184\mathrm{\mu l}\) Tween \(40\)과 \(50\mathrm{ml}\) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 가하여 emulsion을 만들고, \(5\mathrm{ml}\)의 emulsion에 시료 용액 \(100\mathrm{\mu l}\)를 혼합하여 vortex로 잘 섞어준 뒤 \(50\mathrm{^\circ C}\)에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, \(470\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>\( \mathrm{PF}=\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }} \)</p> <h2>Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 측정</h2> <p>TBARS는 Burge와 Aust의 방법에 따라 측정하였다. \(1\%\) linoleic acid와 \(1\%\) Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion \(0.8\mathrm{ml}\)와 시료 \(0.2\mathrm{ml}\)를 섞은 후 \(50 \mathrm{^\circ C}\) water bath에서 10시간 반응시켰다. 반응 후 반응액 \(1\mathrm{ml}\)에 TBA regent \(2\mathrm{ml}\)를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉각시킨 후 15분간 \(1,000\mathrm{rpm}\) (vision, VS-5500N)으로 원심분리하여 실온에서 10분간 방치 후 상징액을 \(532\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였으며, TBARS 값은 흡광도 수치\( \times 0.0154 \)로 \(1\mathrm{ml}\) 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP)의 \( \mu \mathrm{M} \)로 표시하였다.</p> <p>저해율(\%)= \( \left(1-\frac{\text { 반응구의 TBARs } \mu \mathrm{M}}{\text { 대조구의 TBARs } \mu \mathrm{M}}\right) \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide 저해활성</h2> <p>Nitric oxide (\( \mathrm{NO} \))측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide (\( \mathrm{NO} \))의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 \(2 \times 10^6\)개의 cell을 confluence가 \(80\%\)일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysacchride (LPS) \( 10\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)를 control군을 뺀 모든 well에다 넣어서 자극시켰다. 1시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였으며, (\( \mathrm{NO} \)) 생성량은 시간별로 supernatant를 모아 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 \(540\mathrm{nm}\)에서 흡광도로 측정하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Western blot을 이용한 iNOS 및 COX-2 활성 측정</h2> <p>iNOS protein 활성측정을 확인하기 위하여 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 suspension을 \(100 \pi \) tissue culture dish에 각 well당 \(2 \times10^4\) cell로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 아세톤 추출물, 발효 상징액, 발효 후 아세톤 추출물을 농도별(\(10\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml} \), \( 100\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \))로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 또 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 후 Lysis buffer (RIPA buffer \(10\mathrm{ml}\)에 complete mini \( 1 \mathrm{tab} \)을 가함) \(100\mathrm{ul}\)로 용해해서 \(4\mathrm{^\circ C}\) \(12,000\mathrm{rpm}\)에서 20분간 원심분리하였다. 상징액만을 모아 새 튜브로 옮긴 후 단백질 정량을 하거나 또는 차후 사용하기 위해 \(-20\mathrm{^\circ C}\)에 보관하였다. 원심 분리하여 얻은 상징액은 Bradford assay로 정량하여 \(20\mathrm{\mu l}\)의 단백질을 \(10\%\)의 SDS-PAGE사에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semidry transfer cell 기기(Bio Rad)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (\(5\%\) skim milk in TBST)에서 in-cubation 시켰다. 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 iNOS (BD Biosience \(1:1,000 \)), COX-2 (cayman \(1:1,000 \)), GAPDH (Santacruz \(1:1,000 \)) 1차 항체를 희석하여 \(4\mathrm{^\circ C}\)에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP (santacruz \(1:1,000 \))의 각각의 2차 항체를 \(1:1,000 \)으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 3회 washing한 뒤 암실에서 ECL (Millipore)용액으로 반응시키고 X-ray film에 노출시켜 각각의 band를 Molecular Imager (Bio-Rad)를 이용하여 band를 정량화하였다.</p> <h2>Tyrosinase 저해(미백) 활성 측정</h2> <p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 \(0.175\mathrm{M}\) sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH}\) \(6.8\)) \(0.5\mathrm{ml}\)에 \(10\mathrm{mM}\) L-DOPA를 녹인 기질액 \(0.2\mathrm{ml}\) 및 시료용액 \(0.1\mathrm{ml}\)의 혼합액에 mushroom tyrosinase (\(110\mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)) \(0.2\mathrm{ml}\)를 첨가하여 \(25\mathrm{^\circ C}\)에서 2분간 반응시킨 후 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \(475\mathrm{nm}\)에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 다음의 식에 의해 계산하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Astringent activity (수렴성) 측정</h2> <p>원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액을 \(1:1\)의 비율로 넣어 진탕 혼합한 다음 \(1,500 \mathrm{rpm}\)에서 3분간 원심분리 후 \(576\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하여 흡광도 감소율로 수렴성을 측정하였다.</p>	생명
Bacillus sp. Sh-517에 의한 keratinase의 생성 최적 배양 조건	<h3>초기 \( \mathrm { pH } \) 의 영향</h3> <p>본 균주의 초기 \( \mathrm { pH } \) 에 따른 균체증식과 효소활성을 조사하기 위하여 기본배지에 \( \mathrm { pH } 3.5 \) 에서 \( \mathrm { pH } 10 \) 까지 조절 한 후 48 시간 배양하여 \( \mathrm { pH } \) 에 따른 균체량과 효소활성을 즉정하였다. 결과는 Fig. 6과 같이 \( \mathrm { pH } 8.5 \) 에서 가장 호소활성이 우수 하였으며, \( \mathrm { pH } 8.0 \) 에서 균체생산이 가장 많았다. 또한 \( \mathrm { pH } 6.5 \)에서부터 \( \mathrm { pH } \) 9.0까지의 넓은 범위에 걸쳐 균체생산과 효소 활성이 우수하였다. 이는 \( \mathrm { pH } 9.0 \) 에서 가장 높은 효소 활성을 보였다는 Suntornsuk 등[18], Kim [9] 및 Giongo 등[5]과 유사하였으나 \( \mathrm { pH } 7.5 \) 에서 최고 활성을 나타냈다는 Lee 등[11] 과는 약간 상이하였다.</p> <h3>배양 시간의 영향</h3> <p>본 균주의 배양 시간에 따른 keratinase 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 지금까지 조사된 효소 생산 최적 조건인 탄소원으로 chicken feather \( 2 \% \), 질소원으로 beef extrac \( 0.5 \%, \mathrm { KNO } _ { 3 } 0.5 \% \), 금속염으로 \( \mathrm { KCl } 0.06 \%, \mathrm { NaCl } 0.05 \% \), \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } 0.04 \%, \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 0.03 \% \) 및 생육인자인 yeast extract \( 0.01 \% \) 를 첨가한 효소생산 배지에 전배양한 종균을 \( 1 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 되게 접종한 후 \( \mathrm { pH } 8.5,40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하여 6 시간 간격으로 균주의 생장과 효소활성을 조사하였다. 결과는 Fig. 7과 같이 접종 후 18 시간 후부터 효소활성이 급격하게 증가하여 42시간에서 가장 높은 효소활성을 보였으며 균체증식은 24시간부터 일정하게 나타났다. 이는 Williams 등[21], Yu 등[23] 및 Kang 둥[8]의 5일보다 효소생산 시간이 매우 빠름을 알 수 있었다. 현재 산업직으로 미생물이 생산하는 keratinase의 실</p> <h1>서 론</h1> <p>깃털은 보통 조류가 가지는 총 중량의 5-7%를 차지하며 keratin 형태의 즌단백질이 약 \( 90 \% \) 이상 차지하고 있다[10]. 현재 전 세계적으로 많은 수의 가금류를 사육하고 있으며 동시에 도죽도 하고 있다. 이 도축 과정에서 나오는 막대한 양의 깃털은 쓰레기로 축적된다. 이와 같이 버려지는 폐깃털은 단백질을 다량 함유하고 있어 폐깃털을 이용할 경우 환경오염은 물론 동물사료 등으로 유용하게 사용될 것이다. 그런데, 폐깃털의 주된 구조를 이루는 keratin의 물리적, 화학적 안정성으로 인하여 페깃털의 처리가 큰 환겅 문제를 야기하고 있으며 또한 수화가 불가능하여 동불사료로서의 이용도 제한을 받고 있다. 그리고 최근 환겅오염에 대한 관심이 높아져서 폐기물의 환경 친화적이고 생물학적인 처리기술이 각광을 받고 있다. 그러한 이유로 가금류의 폐깃털 처리에 대한 연구가 진행되고 있으나 아직까지 완전한 폐깃털 처려 공정 개발이 미비한 실정이다[11].</p> <p>Keratin 단백질은 polypeptide chain이 supercoiling된 상태에서 단백질 사슬이 매우 단단하게 쌓여 있으며, cysteine 함량이 높아 polypeptide chain 사이에 disulfide결합이 특히 많아서 구조적으로 매우 단단하고 안정하다[7,20]. 그러나 깃털이 자연계에서 무한히 축직되지 않는 것은 이들을 분해하는 효소인 keratinase른 분비하는 미생물이 즌재하기 때문이다. Keratinase를 생산하는 미생물로는 세균, 곰팡이, 방선균 등이 많이 연구되었으며, Bacillus licheniformis [2,12], Bacillus sp. [18,19], Pseudomonas sp. [17] Trichophyton mentagrophytes [23,24], Aspergillus sp. [4], Streptomyces sp. [1,22] 등의 미생물 균주가 발견되어 효소의 생산조건, 특성규명, 폐깃털의 사료제조 등에 관해서 연구되도 있지만 분해력이 떨어저 신용화에 큰 장애가 되고 있는 실정이다.</p> <p>본 연구에서는 가금류의 깃털을 강력하게 분해하는 kera-tinase를 생산하는 미생물 Bacillus sp. SH-517를 분리하였으며 이 균이 생성하는 최적 생성 조건을 검토한 걸과를 보고하는 바이다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시힘 균주 분리와 배양</h2> <p>Keratinase를 분리하기 위하여 경기도와 충청도 일대의 가금류 처리공장과 폐기물 처리장 부근의 토양에서 시료를 채취하여 그 균원 시료로 사용하였다. Keratinase를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 균원 시료를 \( 5.0 \% \) skim milk,agar \( 1.7 \%( \mathrm { pH } 6.5) \) 로 하는 1 차 선변배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 36시간 배양하여 clear zone이 크고 생육이 우수한 균주를 1 차 분리하고 분리된 각 균주를 \( 0.5 \% \) chicken feather, \( 0.05 \% \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } , 0.05 \% \mathrm { NaCl } , 0.04 \% \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.03 \% \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \), \( 0.01 \% \mathrm { MgCl } _ { 2 } \cdot 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.01 \% \) yeast extract \( ( \mathrm { pH } 6.5) \) 로 하는 2 차 선별배지[16]에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 180 \mathrm { rpm } \) 으로 48 시간</p> <h3>탄소원의 영향</h3> <p>분리된 균주의 균체 증식과 효소활성에 미치는 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 chicken feather \( 0.5 \% \) 를 첨가한 탄소원을 배제한 2차 선별배지에 각종 탄소원을 \( 0.5 \% \) 되도록 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 진탕배양 \( (180 \mathrm { rpm } ) \) 한 후 균체량과 효소 활성을 조사한 결과는 Table 1과 같다. 결과에서 D-raffinose, D-sorbose, fructose, a-cellulose 등이 깃털만을 유일 탄소원으로 하였을 때보다 높은 효소활성을 나타내었다. Kim [9]은 \( 1 \% \) 의 포도당 첨가 시 효소활성 및 균체생성을 촉진하였다는 보고와는 상반된 결과로, 이는 균주의 차이에 의한 것으로 사료된다. Chon과 Kwon [3] 그리고 Page와</p> <p>Stock [14]은 raffinose가 효소생성을 촉진시켰다는 보고와 일치하였다. 그리고 본 연구에서는 D-raffinose 등이 효소생성을 촉진시켰으나 산업적으로 사용되기에 비용이 많이 들어가는 탄소원이므로 깃털만을 유일한 탄소원으로 다음 실험을 계속하였다. Fig. 1 의 결과와 같이 깃털이 \( 2 \% \) 첨가되었을 때에 가장 높은 효소 활성을 나타내었다. 이는 깃털의 농도가 \( 1 \sim 3 \% \) 에 처 호소 활성에는 큰 차이가 없다는 Suntornsuk 등[18]의 결과와는 약간의 차이가 있었고 \( 1 \% \) 깃털에서 가장 활성이 좋았다는 Cheng 등[2]의 결과와도 차이가 있었다 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 의 변화는 초기의 \( \mathrm { pH } \) 6.5에서 최고의 활성을 나타낸 \( 2.0 \% \) 깃털의 농도에서 \( 7.1 \) 로 약간 증가하다가 활성과 더불어 다시 떨어지기 시작하여 \( 4.0 \% \) 에서 초기 \( \mathrm { pH } \) 인 \( 6.5 \) 로 낮아졌다.</p> <h3>질소원의 영향</h3> <p>본 균주의 균체 증식과 효소 활성에 영향을 미치는 질소 원의 영향을 조사하기 위하여 유일 탄소원으로 깃털을 \( 2 \% \)첨가한 배지에 각 질소원을 \( 0.1 \% \) 가 되도록 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 진탕배양하여 균체량과 효소활성을 조사한 결과는 Table 2와 같았다. 유기질소원으로는 beef extract를 첨가하였을 때 가장 효소활성 및 균체 증식이 우수하였으며 yeast extract와 pep-tone을 참가하였을 때에도 좋은 결과가 나타났다. 무기질소 원으로는 \( \mathrm { KNO } _ { 3 } \) 를 침가하였을 때 가장 효소활성과 균체 증식이 뛰어났으며 \( \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } \) 을 사용하였을 때에는 깃털을 유일 질소원으로 사용하였을 때보다 활성과 균체증식이 낮게 측 정되었다. 이는 \( \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } \) 이 질소원으로서 양호하였다는 Williams 등[21]의 결과와 상반되었다. 깃털과 함께 다른 질소원을 침가하였을 때 대부분의 질소원에서 깃털을 유일 질소원으로 사용하였을 때에 비하여 효소활성과 균체증식이 우수하였음을 알 수 있었다. 또한 Rosa 등[17]의 keratin을 유일한 질소원으로 사용하였다는 보고와는 상이하였다.</p> <p>용화가 활발하지 않은 것 중에 가장 큰 이유는 chicken feather의 분해를 위하여 많은 시간을 요구하기 때문인데 Bacillus sp. SH-517의 경우 산업적 이용의 가능성이 매우 높은 것으로 사료된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>경기도와 충청도 일대의 가금류 처리공장과 폐기물 처리 장 부근 토양으로부터 protease 활성이 높은 균주를 분리한 후 그 중 keratinase 활성이 높은 1균주를 최종 선별하여 동정하고 효소생산을 위한 최적 배양조건을 검토한 결과는 다음과 같다. 선별된 간주는 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus 속으로 판명되었으며, 편의상 Bacillus sp. \( \mathrm { SH } -517 \) 로 명명하여 사용하였다. Bacillus sp. \( \mathrm { SH } -517 \) 에 의한 keratinase 생성 최적 조건을 검토하였는데, 최적 배지 조성은 탄소원으로 chicken feather \( 2.0 \% \), 유기질소원으로 beef extract \( 0.5 \% \), 무기질소원으로 \( \mathrm { KNO } _ { 3 } 0.5 \% \), 무기염으로 \( \mathrm { KCl } \) \( 0.06 \%, \mathrm { NaCl } 0.05 \%, \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } 0.04 \%, \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 0.03 \% \) 이었고 그리고 생육인자로 yeast extract \( 0.01 \% \) 이였다. 진탕배양 시 \( (180 \mathrm { rpm } / \mathrm { min } ) \), 최적 온도와 배지의 \( \mathrm { pH } \) 는 각각 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } , 8.5 \) 로 나타났으며, 위와 같은 최적 조건 하에서 keratinase의 최대 활성은 42 시간 만에 125 units \( / \mathrm { ml } / \mathrm { min } \) 이었다.</p> <p>동안 액체 배양하여 원심분리한 상등액을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 애서 keratin azure를 이용하여 keratinase activity를 측정하였다. 이 중 활성이 가장 높은 균주를 최종 선별하여 \( \mathrm { SH } -517 \) 이라 명명하고 이후의 실험에 사용하였다. 최종 선별된 균주는 Nutrient Broth (NB) \( 100 \mathrm { ml } \) 을 \( 300 \mathrm { ml } \) Erlenmeyer flask에 넣어 배양 한 후 \( 30 \% \) glycerol 현타액과 \( 1: 1 \) 로 흔합하여 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) deep freezer에서 보관하였다. 그리고 효소 생산 조건을 검토하기 위한 배양은 2차 선별배지를 \( 300 \mathrm { ml } \) Erlenmeyer flask에 100 \( \mathrm { ml } \) 을 분주하여 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 20 \mathrm { ~min } \) 동안 가압살균 한 후 전배 양한 배양액(2차 선별배지에서 활성화시킨) \( 1 \mathrm { ml } \) 을 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 진탕배양하였다.</p> <h2>우모 분해균의 동정</h2> <p>분리된 균주를 동정하기 위하여 Bergey's manual of sys-tematic bacteriology [15]에 기술된 방법에 따라 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성을 조사하였다.</p> <h2>기질의 조제</h2> <h3>깃털의 전처리</h3> <p>도계장에서 수집한 깃털에서 다른 이물질들을 분리해낸 후, 증류수를 이용하여 10회 세척하였다. 세척한 chicken feather롤 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) dry oven에서 완전 건조가 되도록 3 일 동안 건조하고, 약 \( 5 \mathrm { ~mm } \) 의 길이로 절단하여 배지 성분 및 activity test를 위한 기진로서 사용하였다.</p> <h3>Keratin azure의 전처리</h3> <p>Keratin azure를 기실로 사용하기 위하여 다음과 같이 전처리하였다. Keratin azure를 1~2 mm로 절단한 후 막자사발에 넣고 액체질소를 가하여 급랭시킨 후 미세하게 분쇄하여 분말화하였다.</p> <h3>사용 기기 및 시약</h3> <p>본 실험에 사용한 spectrophotometer는 Hitachi model 2000 을 사용하였으며, 시약은 Sigma 사의 kcratin azure를 사용하였으며, 그 외의 시약은 특급 내지 1 급 시약을 사용하였다.</p> <h3>효소 활성 측정</h3> <p>Keratin azure를 이용한 Assay배양조건 검토를 위하여 효소의 활성은 Suntornsuk 등 [18]의 방법을 변형하여 조사하였다. 즉, 조효소액(원심분리액) \( 1 \mathrm { ml } \) 을 Keratin azure 현탁액(0.01M Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer \( \mathrm { pH } \) \( 7.5,4 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) ) \( 1 \mathrm { ml } \) 에 첨가하여 water bath에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 150 \) \( \mathrm { rpm } \) 으로 1 시간 반응 시킨 후 반응액을 10 분간 끓여서 반응을 정지시키고 \( 8,000 \mathrm { rpm } \) 에서 원심분리하여 기질에서 유리 된 발색단을 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. 대조군은 조효소액과 Keratin azure 현탁액의 혼합액을 반응 전에 10 분간 끓인 것으로 하였다. 그리고 효소의 units는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분동안 기질과 반응한 반응액의 흡광도를 \( 0.01 \) 중가시키는 효소량을 1 unit라 하였다.</p> <h3>깃털을 이용한 assay</h3> <p>깃털을 이용한 효소활성의 측정은 Farag 등[4]의 keratin을 이용한 호소활성 측정 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 조효소액 \( 5 \mathrm { ml } \) 을 \( 0.1 \mathrm { ~g } \) 의 절단된 깃털에 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 동안 반응 시킨 후 \( 8,000 \mathrm { rpm } \) 으로 원심 분리하여 잔여 깃털을 제거한 후 Lowry method [13]를 이용하여 \( 770 \mathrm { ~nm } \) 에서 홉광도롤 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h3>균주의 동정</h3<p>본 실험에 사용한 분리된 균주 SH-517의 형태학적 특성 및 각 종 배지를 이용한 배양상의 특성을 조사한 결과(not shown data), Gram 양성의 호기성 간균이며 내생포자를 형성하고 운동성이 있었으며 catalasc는 양성, oxidase는 음성이었다. Glucosc를 이용하여 산을 형성하였으며 가스 발생은 음성이었다. Gclatin, cascin, starch의 가수분해능이 있었으며 indol 생성능에서는 음성이었다. Citrate utilization 및 ni-trate reduction 등을 하는 것으로 조사되었으며 Bergey's manual of systematic bacteriology [15]와 비교한 결과를 종합하여 볼 때 SH-517 strain은 Bacillus licheniformis와 가장 가까운 특성을 보였으나 정화한 균종을 밝힐 수는 없었다. 따라서 여기서는 Bacillus sp. SH-517로 명명하고, 차후에 \( 16 \mathrm { ~S } \) rRNA를 이용하여 보다 정확한 동정을 실시하기자 한다.</p> <p>Table 2의 결과를 바탕으로 유기질소원으로는 beef ex-tract를 사용하여 실험 하였고 무기질소원으로는 \( \mathrm { KNO } _ { 3 } \) 블 사용하여 각각의 최적 농도를 측정한 결과, Fig. 2과 Fig. 3과 같이 각각 \( 0.5 \% \) 에서 최적의 효소활성과 균체 증식을 보였다. 그리고 Fig. 2와 Fig. 3 의 배양액의 초기 \( \mathrm { pH } \) 는 7.0으로 조정하여 사용했는데, 효소의 생성 최대 농도에서 \( \mathrm { pH } \) 가 7.1로 증가하다가 다시 효소활성과 더불어 \( 6.9 \) 로 약간 낮아졌다.</p> <h3>금속염의 영향</h3> <p>본 균주의 균체 증식과 효소활성에 미치는 금속염의 영향을 조사하기 위하어 금속염을 제외한 기본배지에 각 금속염을 각각 \( 0.05 \% \) 되게 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 진탕배양 후 균체량과 효소활성은 조사한 결과는 Table 3과 같았다. \( \mathrm { KCl } \) 은 첨가하였을 때 효소생산이 가장 우수하였다. 이는 \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \) 와 \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \) 를 첨가하였은 때 활성이 우수했다는 Page 등]14]의 보.기와는 상이하였는데, 아마 이것은 균주의 차이로 나타난 결과로 생각된다. 그리고 \( \mathrm { KCl } \) 의 농도에 대한 영향은 Fig. 4 와 같이 \( \mathrm { KCl } \) 을 \( 0.06 \% \) 첨가하였을 때 효소활성이 가장 우수하였다. 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 변화는 초기 \( \mathrm { pH } \) 7.0에서부터 시작하여 \( \mathrm { KCl } \) 모든 농도에 이르기까지 \( 7.0 \) 은 유지하였다.</p> <h3>배양 온도의 영향</h3> <p>본 균주의 배양 온도에 따른 균체증식과 효소활성을 조사하기 위하여 각 온도에서 48 시간 배양하여 각각의 균체량과 효소활성을 측정한 결과는 Fig. 5 와 같이 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 균체증식 및 enzyme activity가 가장 우수하였고 \( 3545 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 \( 90 \% \) 이상의 효소활성을 보였다. 이는 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 효소활성이 가장 우수했다는 Streptomyces 속 균 을 사용한 Brigitle 등[1]과 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 Young과 \( 5 \mathrm { mith } [22] \) 의 보고와는 상이하였으며 같은 Streptomyces 속을 이용한 Kim [9]과의 보고와는 잘 일치하였다. 그리고 같은 Bacillus 속을 이용한 Kang 등[8]의 결과와도 잘 일치하였다.</p>	생명
갈파래(Ulva lactuca) 추출분획의 암세포주에 대한 세포독성 및 면역활성 효과	<h2>Nitric oxide (NO) 분석법을 통한 면역활성 측정</h2> <p>생쥐 대식세포주 RAW 264.7을 96-well plate (Roche Inc.)에 분주하고 24 시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 배양세포를 PBS로 세정한 후 갈파래 분획물들을 PBS에 희석하여 20 \( \mu \ell \) 씩 첨가하였다 (최종농도: \( 0.5,0.1,0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \). 대조군은 갈파래 분획물 대신 동량의 \( \mathrm { PBS } \) 를 가하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 에서 24시간 배양한 후 배양액 \( 100 \mu \mathrm { l } \)에 reaction diluent \( 400 \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 희석을 행하였다. Total NO assay는 Total NO/Nitrite/NitrateAssay Kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 manual을 토대로 행하였으며, Synergy HTMulti-detection microplate reader (Biotek Instruments, Inc.)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 \( \mathrm { OD } \) 값을 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>갈파래의 에탄올 추출 및 각 용매별 분획물의 제조</h2> <p>갈파래 시료 \( 800 \mathrm { ~g } \) 에 대한 에탄올 추출을 행하고 이를 Rotary evaporator (EYELA Inc., Tokyo, Japan)로 농축을 행하여 최종적으로 \( 3 \mathrm { ~L } \) 의 에탄올 추출시료를 얻었다. 이를 butanol, ethyl ether, hexane, methanol, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 등을 이용하여 분획을 행하고, 얻어진 분획물을 Centrifugal evaporator (Sovall RC 5C + , Ashevrlle, NC, USA)를 이용하여 용매 제 거 및 농축을 행한 결과 각각의 갈파래 분획물 시료들을 10 \( \mathrm { mg } \) 전후의 비슷한 양으로 얻을 수 있었다.</p> <h2>갈파래분획물의 암세포에 대한 세포독성</h2> <p>MTT 분석법은 살아있는 세포내 미토콘드리아의 dehydrogenase에 의해서 MTT가 formazan으로 변화하는 것을 이용하며, 생성된 formazan의 농도를 spectrophotometer로 측정함으로써 세포에 대한 독성을 조사하는 방법으로서, 각종 항암제에 대한 in vivo 세포독성에 관한 연구에 사용되어 온 dye exclusion test나 \( \left [ { } ^ { 3 } \mathrm { H } \right ] \)-thymidine uptake assay와 비교 시 실험 조작이 매우 간편하고 재현성이 우수하여 세포독성여부 대량검색이나 초기 검색단계에 적당한 방법으로 많이 이용되고 있다. 이 방법은 방사선 동위원소를 사용하지 않고 세포의 증식 및 생존율을 정확히 측정할 수 있는 방법으로서, 육안으로도 발색정도를 관찰할 수 있다.</p> <p>인체 간암세포주(HepG2)에 대한 갈파래의 각 용매 분획물의 생육저해 활성을 측정한 결과를 Fig. 4에 나타냈다. 간 암세포주에 갈파래의 각 분획물을 첨가하여 생육저해 활성을 측정한 결과 전반적으로 높은 활성을 나타냈고 특히 Ethyl ether층 분획물의 경우 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 미처리 대조군에 비해 \( 75 \% \) 의 생육저해 활성으로 다른 분획물에 비해 월등히 높은 활성을 나타냈다. 분획물의 농도를 \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 로 처리하였을 때, Ethyl ether층과 수층에서 약간 높은 활성을 나타냈다. 분획물의 농도를 \( 0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의로 처리하였을 때는 \( 0.5,0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도보다 낮은 활성을 보여, 갈파래 추출물의 농도가 증가함에 따라 암세포 성육저해 효과도 증가한 것으로 나타났다 .</p> <p>큰쥐 신경교세포주(C6)에 대한 갈파래의 각 용매 분획물의 생육저해 활성을 측정한 결과를 Fig. 5 에 나타냈다. 분획물들은 전반적으로 높은 생육저해 활성을 보였으며 특히 Ethyl ether층 분획물의 경우 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 미처리 대조군에 비해 \( 95 \% \) 의 생육저해 활성을 나타냈고 다음으로 수층 분획물의 생육저해 활성이 높았다. 갈파래의 Ethyl ether충 및 수층의 분획물들은 신경교 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다.</p> <p>우리나라의 암에 의한 사망자수 1 위가 간암이며 평균발병 연령은 약 55 세이다. 대부분 40-60세 사이에 이 질환에 걸리게 되는데 가장 활발히 일하는 한 가정의 대들보를 엄습하는 질환으로서 사회적, 가정적으로도 절실한 문제가 되고 있다. 또한 신경교종은 뇌종양의 \( 50 \% \) 를 차지하는 가장 흔한 종양이다. 일반적으로 이 종양은 주변의 뇌로 퍼져나가기 때문에 정상적인 뇌와의 경계가 명확하지 않아 수술로 전부 적출하는 것은 어렵기 때문에 약물치료제의 연구가 시급한 실정이다. 본 연구 결과로 갈파래로부터 추출한 생리활성 물질을 이용하여 암세포들에 대해 세포독성을 나타내는 성분을 밝혀내고 연구를 계속해 나간다면 새로운 항암활성 소재의 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.</p> <h2>갈파래 분획물의 면역활성</h2> <p>생쥐 대식세포주에 대한 갈파래의 각 용매 분획물의 면역활성 측정결과를 Fig. 6에 나타냈다. 갈파래의 Ethyl ether충 추출분획의 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도의 시료에서 가장 높은 활성이 나타났지만 분획 전반에 걸쳐 대체로 유사한 활성을 보였다. 분획물 \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도의 경우는 분획 전반에 걸쳐 유사한 정도의 활성을 보였으나 Ethyl ether층에서 약간 낮은 활성을 보였다. 분획물 \( 0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도의 경우는 \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도의 시료와 비교하였을 때 그다지 큰 활성차이를 보이지 않았다. 하지만 미처리 대조군에 비하여 시료 전반에 걸쳐 탁월한 면역활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.</p> <p>본 연구의 결과로 현재 식용으로 사용되고 있지 않아 버려져 있는 해조류인 갈파래(Ulva lactuca)를 이용하여 암 예방 및 면역활성 강화를 위한 기능성 소재의 개발이 가능할 것으로 사료된다.</p> <h1>요약</h1> <p>본 연구는 갈파래(Ulva lactuca) 추출분획의 암세포주에 대한 세포독성 및 면역활성 효과를 조사하였다. 갈파래의 에탄올 추출물로부터 분획물의 제조는 hexane, ethyl ether, methanol, butanol, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 의 용매를 이용하여 행하였다. 인간 백혈암세포주(U937), 생쥐 신경아종세포주(NB41A3), 인체 간암세포주(HepG2), 큰쥐 신경교세포주(C6) 등에 대한 갈파래 분획물의 세포독성을 축정하였다. 갈파래의 Ethyl ether 층은 4종류의 세포 모두에서 가장 높은 세포독성을 나타냈다. 또한 수층 역시 비교적 높은 세포독성을 나타냈다. 4종류의 세포 모두에서 농도의존적 경향을 나타냈다. 갈파래 분획물의 큰쥐 대식세포주(RAW 264.7)에 대한 면역활성 효과도 조사하였다. 갈파래 추출물의 5 가지 분획물 모두에서 농도의존적으로 \( \mathrm { NO } \) 생산을 활성화시켰다. 이러한 결과들로 갈파래가 항암 및 면역활성을 나타내는 천연 소재개발에 있어 유용한 후보가 될 수 있을 것으로 사료된다.</p> <p>인체 혈구암세포주(U937)에 대한 갈파래의 각 용매 분획물의 생육저해 활성을 측정한 결과를 Fig. 2에 나타냈다. Ethyl ether층 분획물의 경우 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 미처리 대조군에 비해 \( 92 \% \) 의 탁월한 생육저해 활성을 보였고 수층분획물의 경우 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 \( 80 \% \) 의 생육저해 활성을 나타냈다. 이는 다른 분획물인 Hexane층, \( \mathrm { BuOH } \)층, \( \mathrm { MeOH } \) 층에 비해 높은 활성을 나타내는 것이었다. 가장 높은 생육저해 활성을 보이는 Ethyl ether층 분획물을 각각 \( 0.1,0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 로 처리했을 때 대조구에 비해 \( 70 \% \) 와 \( 50 \% \) 의 생육저해 활성을 보였고, 수층분획물은 \( 0.1,0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도에서 각각 \( 50 \% \) 와 \( 28 \% \) 의 생육저해 활성을 보였다. 즉, 갈파래 추출물은 농도의존적으로 혈구암 세포에 대한 생육저해 효과를 보이는 것으로 나타넜다.</p> <p>생쥐 신경아종세 포주(NB41A3)에 대한 갈파래의 각 용매 분획물의 생육저해 활성을 축정한 결과를 Fig. 3에 나타냈다. Ethyl ether층 분획물의 경우 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 미처리 대조군에 비해 \( 70 \% \) 의 탁월한 생육저해 활성을 보였고 수층 분획물의 경우 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 농도에서 \( 45 \% \) 의 생육저해 활성을 나타냈다. 이는 다른 분획물인 Hexane층, \( \mathrm { BuOH } \) 층, \( \mathrm { MeOH } \) 층에 비해 높은 활성을 나타내는 것이었다. 가장 높은 생육저해 활성을 보이는 Ethyl ether층 분획물을 각각 0.1, \( 0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 로 처리했을 때 대조구에 비해 \( 50 \% \) 와 \( 20 \% \) 의 생육저해 활성이 나타났으며, 수층분획물은 \( 0.1,0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도에서 각각 \( 40 \% \) 와 \( 17 \% \) 의 생육저해 활성을 보였다. 갈파래 분획물은 혈구암 세포의 경우와 비슷하게 신경아종 세포에서도 전반적으로 농도에 의존하는 생육저해 효과를 보였고 그 중에서도 Ethyl ether층과 수층에서 높은 활성을 나타냈다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포주, 배지 및 배양</h2> <p>인체 헐구암세포주 U937과 생쥐 대식세포주 RAW 264.7은 \( 10 \% \) feal bovine serum (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA)과 penicillin-streptomycin (100 units/ml, Bio Whittaker)을 포함하는 RPMI 1640 (Bio Whittaker)배지를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 에서 배양하였다. 생쥐 신경아종세포주 NB41A3, 인체 간암세포주 HepG2, 큰쥐 신경교세포주 C6는 \( 10 \% \) feal bovine serum (Bio Whittaker)과 penicillin-streptomycin (100 units/ml)을 포함하는 Delbecco's modified eagle medium (DMEM) 배지를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 에서 배양하였다.</p> <h2>분획물의 제조</h2> <p>갈파래(Ulva lactuca)는 부산 광안동 수변공원에서 채취하여 증류수로 수세, 정선 및 탈수과정을 거쳐서 건조시킨 후 분쇄한 시료 무게의 10 배량 \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 의 \( 80 \% \) ethanol로 약 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 8 시간 동안 추출을 행하였으며, 추출액은 Whatman NO.3 여과지(Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 2회 여과하였다. 이를 butanol, ethyl ether, hexane, methanol, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 등을 이용하여 Fig. 1에 나타낸 방법 으로 분획을 행한 후, 농축하여 분획물을 제조하였다.</p> <h2>MTT 분석법을 통한 암세포에 대한 세포독성 측정</h2> <p>MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA) 제품을 이용하였다. 배양된 인체 혈구암세포주 U937, 생쥐 신경 아종세포주 NB41A3, 인체 간암세포주 HepG2, 큰쥐 신경교세포주 C6를 96-well plate (Roche Inc., Indianapolis, IN, USA)에 \( 180 \mu \) 씩 분주하고, 갈파래 분획물들을 phosphate-buffered saline (PBS, Bio Whittaker)에 희석하여 \( 20 \mu \) 씩 첨가하였다 (최종농도: 0.5, \( 0.1,0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) ). 대조군은 갈파래 분획물 대신 동량의 \( \mathrm { PBS } \) 를 가하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 에서 48시간 추가 배양한 후 배양액을 제거하고 MTT \( (5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) in \( \mathrm { PBS } ) \) 용액을 \( 100 . \mu \mathrm { l } \) 씩 가하고 \( ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 에서 4 시간 동안 배양하였다. 이 후 DMSO \( 100 \mu \ell \) 를 넣고 \( 37 ^ {\circ } mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 에서 \( 10 \sim 15 \) 분 동안 반응시킨 후 발색정도를 Synergy HT Multi-detection microplate reader (Biotek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 OD값 으로 측정하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>최근 의학의 계속적인 발전에 의해 질병에 대한 많은 치료제가 개발되었지만, 그 예방법과 치료법이 분명치 않고 결정적인 결과를 가진 약제를 발견하지 못하고 있는 실정이다. 질병 치료에 개발되어 사용되고 있는 화학 요법제는 그 치료적 체계성 및 구성약의 부작용과 독성으로 이용이 제한적이므로 인체에 무해하면서도 질병을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제를 천연물로부터 탐색하려는 연구가 필요하다. 특히, 항암 및 면역 활성을 나타내는 물질을 찾아내어 이용함으로써 식품의 단순한 영양적, 기호적인 기능 외에 생체방어 또는 질병에 대한 치료효과를 찾아내어 암의 극복에도 획기적인 계기를 제시해주고 있다. 뿐만 아니라, 암의 원인을 규명하고 치료방법을 찾고자 하는 노력이 계속되고 있으며, 특히 천연과 전통식품 및 한약재를 대상으로 새로운 항암성분을 찾으려는 노력이 계속되고 있다.</p> <p>바다에 생육하고 있는 해조류에는 지구상에 알려진 많은 원소들이 축척되어 있다고 알려져 있다. 특히, 해조류는 이들 원소를 표면 전체로부터 흡수하여 수계에 비해 최대 수만 배까지 농축된 미네랄의 보고라 할 수 있다. 또한 비타민, 무기질 등의 미량성분들이 균형있게 분포되어 있어 대사작용의 개선, 저칼로리 다당류인 식이성 섬유에 의한 정장 작용과 유독물질의 제거효과, 저분자 생리활성 물질은 혈압과 콜레스테롤의 정상화 및 암 예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 해조류의 항암성에 관한 연구로는 녹조류, 갈조류, 홍조류에서의 항암 효과, 해조류 추출물의 항돌연변이 효과 등이 보고되어 있다.</p> <p>갈파래(Ulva lactuca)는 파래과에 속하는 녹조식물로서 전세계의 외해의 간조선 부근의 바위에 부착하여 서식한다. 상추잎처럼 생긴 엽상체는 길이 \( 30 \mathrm { ~cm } \) 에 달하며, 2층으로 배열된 세포들이 질기고 끈적끈적한 젤라틴에 의해 둘러싸여 있다. 생활사는 포자를 만드는 이배체 세대와 배우자를 만드는 반수체 세대가 번갈아 가면서 나타나며, 몸의 일부가 떨어지거나, 배우자가 포자처럼 자라 무성생식이 일어난다. 갈파래에는 비타민 A, B, C가 풍부하게 들어 있지만, 현재 우리나라에서는 갈파래를 식용으로 사용하지 않고 가축의 사료로 활용하고 있는 실정이다. 한편 유럽에서는 갈파래를 식용으로 이용하고 있지만 식품학적 및 생리활성에 관한 기초적인 연구가 있을 뿐 in vitro 및 in vivo에서의 생리활성 효능에 관한 연구는 미진한 편이다. 국내에서는 홑파래에서 추출한 당단백질의 항암효과 및 면역 활성이 보고된바 있다.</p> <p>본 연구는 갈파래의 에탄올 추출물에 대한 용매별 분획을 행하여 얻은 각각의 분획물들의 생리활성을 연구하기 위해 다양한 암세포주들에 대한 세포독성 및 면역활성을 검증하였다.</p>	생명
Web-Building Strategy of a Wasp Spider, Argiope bruennichi, under Sensory Information Emitted by a Prey Species	<h2>웹 변인 측정</h2> <p>실험 기간 동안 오전 8시에 대조군과 실험군에서 웹을 건축한 개체와 건축하지 않은 개체가 기록되었다. 흰띠줄의 경우는 웹 중심(hub)에서 상단(upper area)과 하단(lower area) 둘 중 한 지역에서만 흰띠줄이 관찰되어도 흰띠줄을 건축한 것으로 간주하고, 선형(linear)이 아닌 일반 실크의 색깔과 구분이 되지 않는 색이 희미한 안개형 웹 부속물은 흰띠줄을 건축하지 않은 것으로 간주하였다.</p> <p>웹의 높이는 사육장의 바닥으로부터 건축된 웹의 중심까지의 최단 거리로 측정하였다. 웹의 중앙에서 가장 먼 거리에 있는 마지막 원그물(spiral)까지의 거리인 장반경(longer radi-us)과 가장 가까운 마지막 원그물까지의 거리인 단반경(shorter radius)을 측정하고 이를 바탕으로 웹 면적(web area)을 산출하였다. 즉, 장반경과 단반경의 평균값을 반지름(r)으로 하고 계산한 원의 넓이 \( \left ( \pi \mathrm { r } ^ { 2 } \right ) \) 를 웹의 면적으로 간주하였다. 원그물 개수는 장반경의 범위에 포함되는 웹의 중앙에서 가장 먼 거리에 있는 마지막 점착실까지 존재하는 모든 나선실의 개수이다. 상단 흰띠줄 길이(upper stabilimentum length)와 하단 흰띠줄 길이(lower stabilimentum length), 흰띠줄 전체 길이(total stabilimentum length)를 측정하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>대조군과 실험군에서 각 개체의 웹 건축 구조 변화의 통계적 분석을 위해, 동일한 표본에 대한 반복 측정치를 비교하기 위해 SYSTAT version 12에 의해 제공되는 비모수통계검정법(non-parametric statistical hypothesis test)인 Wilcoxon signed-rank test를 사용하였다.</p> <h1>결 과</h1> <p>웹을 건축한 개체의 수를 비교한 결과 대조군과 실험군에서 모두 전반적으로 감소하는 경향을 보였다. 대조군에서 웹을 건축한 개체의 비율이 자극 전일(previous day: 개체가 굶은 지 3일째 되는 날)과 자극 1 일(sensory day1: 실험군의 경우 첫 번째 서양뒤영벌 자극이 주어진 날이며, 대조군의 경우 굶은 지 4일째 되는 날) 사이에 \( 11.8 \% \) 가 감소한 데 비해, 실험군의 경우 자극 전일과 자극 1일에서 웹을 건축한 개체의 비율이 대조군과 비교하여 약 두 배인 \( 21.6 \% \) 가 감소한 것으로 나타났다. 자극 1일과 자극 2일(sensory day2: 실험군에서 두번째 자극이 주어진 날이며, 대조군에서는 개체가 굶은 지 5일째 되는 날) 사이에 대조군의 경우 \( 11.8 \% \) 감소하였고, 실험군의 경우 \( 16.2 \% \)의 감소 경향을 보였다. 자극 2일과 자극 3일에 대조군의 경우 웹을 건축한 개체의 비율이 \( 5.9 \% \) 증가하는 양상을 보였으며, 실험군의 경우 대조군에 비해 약 2 배 증가한 \( 10.8 \% \)의 증가 양상을 보였다.</p> <p>흰띠줄은 웹 건축에 장식처럼 추가되는 부분이다. 어떤 이유로 개체가 웹 건축을 포기하거나 미루었다면 흰띠줄의 건축도 이루어지지 않는다. 흰띠줄 건축 감소를 앞 선 결과인 웹 건축 빈도의 감소와 함께 해석해야 하는 이유이기도 하다. 또한 흰띠줄을 건축하기 위해 개체는 많은 에너지와 단백질을 투자해야 한다. 실험 기간 중 전반부의 굶긴 기간이 개체의 이러한 투자 능력에 영향을 미쳤을 수 있을 것이다. 하지만 대조군에서는 예외 없이 감소한대 반해 실험군에서 자극 3일에 \( 10.8 \% \) 증가하는 양상을 보인 것은 다른 해석이 필요한 부분으로 사료된다.</p> <p>또한 본 연구는 비행성 먹이 정보를 바탕으로 개체는 웹의 높이, 면적, 나선 그물의 수 등에서 차별적인 의사결정을 할 것이라고 예측했었다. 연구 결과는 대조군과 비교했을 때 실험군에서만 나타나는 특별한 차이를 발견하지 못했다. 웹의 높이가 변화 양상을 보이지 않은 것은 사육 상자의 공간적 제약에 의한 것일 수 있다는 예측이 가능하다. 사육 상자의 높이를 대폭 증가시키는 실험 디자인이 필요한 부분으로 사료된다. 웹 넓이의 경우 개체가 사육 상자의 공간을 충분히 활용하지 않고 지은 경우가 대부분이고, 웹 넓이의 증감 양상이 대조군과 실험군 모두에서 뚜렷한 경향성을 가지고 있지 않은 것으로 보여 실험 조건에 크게 영향을 받은 것으로 판단하기 힘든 것으로 사료된다.</p> <p>또한 본 연구는 비행성 먹이 정보를 바탕으로 개체는 웹의 높이, 면적, 나선 그물의 수 등에서 차별적인 의사결정을 할 것이라.고 예측했었다. 연구 결과는 대조군과 비교했을 때 실험군에서만 나타나는 특별한 차이를 발견하지 못했다. 웹의 높이가 변화 양상을 보이지 않은 것은 사육 상자의 공간적 제약에 의한 것일 수 있다는 예측이 가능하다. 사육 상자의 높이를 대폭 증가시키는 실험 디자인이 필요한 부분으로 사료된다. 웹 넓이의 경우 개체가 사육 상자의 공간을 충분히 활용하지 않고 지은 경우가 대부분이고, 웹 넓이의 증감 양상이 대조군과 실험군 모두에서 뚜렷한 경향성을 가지고 있지 않은 것으로 보여 실험 조건에 크게 영향을 받은 것으로 판단하기 힘든 것으로 사료된다.</p> <p>연구 결과에서 나타난 자극 3 일째에 전반적인 건축 활동의 증가는, 각 개체에게 있어서 자극 3 일에 해당하는 날짜가 다르기 때문에 특정일의 기후 조건 따위의 영향을 받은 것으로 보기 어렵다. 두 그릅 모두에서 실험 기간 동안 먹이가 공급되지 않은 조건에서 포식에 대한 욕구가 강화된 시기로 보는 것이 가능하다고 사료된다.</p> <p>포식을 위해 웹을 건축할 것인가 아니면 방어를 위해 웹 건축을 미룰 것인가에 관련된 개체의 의사결정을 연구하는데 긴호랑거미 (A.bruennichi)는 좋은 소재라고 사료된다. 왜냐하면 그들의 웹은 물리적으로 그들의 의사결정을 잘 반영하기 때문에 각각 웹 구조의 변수가 중요하게 해석될 수 있다. 먹이유인 보다는 낮게 비행하는 작은 새와 같은 포식자가 있는 상황에서 개체는 눈에 잘 뜨이는 횐띠줄을 만들지 않을 수도 있을 것이다.</p> <p>또한 Blackledge는 낮은 포식 성공도(low foraging suc-cess)를 가진 상황에서 거미가 자신의 흰띠줄 건축을 포기할 것이라는 제안을 한 바 있다. 그의 주장은 먹이 곤충이 오히려 흰띠줄의 존재를 인식해서 웹을 피할 것이라는 것이라는 것이다. 감각 자극만 제공되고 포식 성공이 없는 경우 개체는 먹이가 피하는 것이라고 생각할 수 있다. 먹이를 유인하기 위해 흰띠줄을 만들 것인가? 아니면 먹이의 눈에 뜨이는 것을 피하기 위해 흰띠줄을 만들지 않을 것인가? 에 관한 긴호랑거미 (A.bruennichi)의 의사결정을 알기 위해서는 더 많은 실험적 접근이 필요하다.</p> <h1>서 론</h1> <p>개체를 둘러싼 환경에서 제공되는 감각 정보(sensory in-formation)를 토대로 동물들은 꾾임없이 그들의 행동을 수정해야 한다. 환경 요인은 예측하기 어렵고 늘 변화하기 때문이다. 정확한 정보의 수신과 이를 바탕으로 한 행동의 수정은 개체의 생존과 번식에 직접적으로 영향을 미치기 때문이다. 먹이를 효율적으로 획득하는 동물은 그렇지 못한 동물에 비해서 생존과 번식의 기회를 늘릴 수 있다. 감각 정보를 제공하는 개체(signaler)와 감각 정보를 수집하는 개체(receiver)가 피식자(prey)와 포식자(predator)의 관계에 놓이는 경우 이 문게는 심각하다. 피식자는 포식자에게 자신의 정보를 노출시키지 않아야 하겠지만 포식자의 입장에서는 피식자, 즉 먹이로부터 오는 감각 정보를 정확하게 해석하고 포식을 위한 전략 수립에 반영해야 할 것이다.</p> <p>거미는 육상의 대표적인 포식 동물로 주어진 환경에서 제공되는 여러 가지 정보를 바탕으로 자신의 포식 전략을 수정한다. 특히 웹 건축 행동은 거미 종의 대표적인 포식 전략으로서 이 중 정주성(sedentary) 거미의 웹 건축 행동은 개체의 적응도(fitness)를 높이기 위한 에너지 투자 전략이다. 비록 거미의 건축 행동은 진화적 구속에 의해 제한적인 양상을 보이지만 주어진 생물, 비생물적 환경 요인에 따라서 가변성을 보일 수 있다. 먹이로부터 오는 감각 정보를 수용하고 웹 변인을 수정하는 행동을 보이는 거미 개체는 그렇지 않은 개체에 비해 생존과 번식에 유리할 것이다. 피식자를 포함해 주변의 생물종으로부터 제공되는 감각 정보를 토대로 웹 건축 전략을 수정하는 행동은 거미가 자신의 이익을 극대화하는 전략이라고 볼 수 있다. 이익 극대화에 근접하기 위한 거미 웹의 물리적 구조를 정량화 할 수 있다면, 웹 변인을 통한 최적 포식자의 포식전략 수립을 예측하는 것이 가능할 것이다.</p> <p>Wise와 Barata의 연구와 Opell의 연구에 따르면, 포식에 성공할 가능성이 많은 조건에서 더 많은 포식을 원하는 개체는 보다 큰 웹을 건축하고자 할 것이다. 또한 공중에 둥근 웹을 건축하는 일부 거미들이 건축 과정 후반부에 웹 위에 장식처럼 추가하는 지그재그. 형태의 흰띠줄('stabili-mentum')이 있다. 이 흰띠줄 건축 행동이 거미가 먹이를 효과적으로 포획하기 위한 투자 행동이라는 가설이 있다. 흰띠줄 기능에 관한 이른바 '먹이유인 가설(prey-attraction hypoth- \( \mathrm { esis } ^ {\prime } \) 에 지지적인 근거를 제시하는 Craig와 Bernard 의 연구와 Tso 의 연구에 따르면, 자외선 반사율(UV re-flectance)이 높은 흰띠줄의 건축은, 곤충이 진화적 적응을 통해 내재적으로 이미 가지고 있는 감각 편향(sensory bias)을 이용한 유인 전략이라는 것이다. 즉, 꽃의 중앙 부위에서 반사되는 자외선을 인식하여 날아오는 꽃꿀 채집 곤충들이 흰띠줄에서 반사되는 자외선에 유인된다는 것이다. 꽃꿀을 채집하는 초식 곤충은 꿀벌의 경우처럼 꽃꿀을 가진 식물의 특성(모양, 색깔, UV 흡수 및 반사, 냄새 등)에 더 잘 반응하는 감각 편향을 가지고 있는 것으로 보인다. 실제로 흰띠줄은 일반 거미실에 비해 높은 자외선 반사율을 나타낸다. 또한 적지않은 연구들이 흰띠줄을 포함한 웹이 흰띠줄이 없는 웹과 비교해 꽃꿀채집자(nectar collector)를 사낭하는 일에 더 성공적이었음을 보여주고 있다.</p> <p>긴호랑거미(Argiope bruennichi)는 논습지와 관목 나대지에 많이 서식하는 종으로 공중에 둥근 형태의 웹을 건축하고 종종 웹 위에 흰띠줄 장식을 추가하는 건축행동을 보인다. 이유는 정확히 밝혀지지 않았지만 때때로 흰띠줄이 없는 웹을 건축하기도 한다. 꽃꿀을 채집하는 서양뒤영벌 (Bombus terrest-ris)은 화분을 매개하는 대표적인 곤충이며, 긴호랑거미 (A. bruennichi)의 웹에 쉽게 걸릴 수 있는 먹이종이다. 비행하는 화분 매개 곤충을 사냥하기 위해 웹을 건축하는 개체는 그에 적합한 건축 전략을 수립해야 할 것이다. 다시 말해, 특정한 먹이종으로부터 제공되는 감각 정보가 있는 환경에서 거미는, 그러한 감각 정보가 전혀 없는 환경에서와는 다른 구조를 가지는 웹을 만드는 것이 자원 투자의 효율성 차원에서 유리할 것이다. 먹이 동물로부터 제공되는 감각 단서(sensory cue)는 먹이 포획이 실제 일어나지 않는다고 하더라도, 거미가 포식 전략을 세우는데 중요한 정보를 줄 것이다. 실제 crab spiders, funnel-weaving spiders, orb-weavers, wolf spi-ders 등의 적지 않은 거미들이 먹이로부터 제공되는 감각 정보를 받아들인다는 가설에 지지적인 연구 성과들이 있다. 따라서 본 연구는 다음과 같은 가설을 제안한다. 먹이종에 대한 감각 정보가 없는 환경에 놓인 개체와 비교해, 비행성이고 자외선(UV) 인식에 민감한 서양뒤영벌 (B. terrestris)의 감각 정보를 제공받은 긴호랑거미(A. bruennicht)는 웹 건축 전략차이를 보일 것이다. 지상에서 보다 높은 위치에 웹을 건축할 것이고, 포식 성공 가능성의 증가에 따른 웹 건축 빈도의 증가와 더불어 웹 넓이가 증가하며, 흰띠줄 건축 빈도 또한 증가할 것이라는 가설을 설정하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <p>긴호랑거미(Argiqpe bruennichi)는 대표적인 논거미로서 다른 Argiope spp.에 비해 상대적으로 쉽게 관찰되는 종이다. 성체뿐만 아니라 미성숙 개체들도 지상에서 쉽게 관찰된다. 또한 개체가 웹의 중심(hub)에 주로 위치하고 있어 채집이 용이하다. 실험실 환경에서도 잘 사육되는 것으로 관찰되었다. 성체 출현 시기는 7월-10월이다. 둥근 모양의 웹(orb web)을 건축하며, 중앙에 특이적 웹 부속물(web decoration)인 UV 반사율이 높은 흰띠줄(stabilimentum)을 건축한다. 성체의 흰띠줄은 웹의 중앙을 가로질러 일자형으로 건축하는 것이 일반적이며, 아성체의 경우 나선형(spiral) 등의 이형적인 형태를 보이기도 한다. 서양뒤영벌(Bombus terrestris)은 한국과 유럽 등지에 분포하며 자외선(UV) 인식이 매우 높은 종으로서 전 세계적으로 화분 매개 곤충(pollinator)로서의 이용 빈도가 매우 높다. 성충은 6-7월부터 나타나며, 꽃의 분포율이 높은 들판 지역에서 긴호랑거미 (A. bruenuichi)와 같은 정주성 거미에게 적합한 먹이종이다.</p> <h2>채집 및 사육</h2> <p>긴호랑거미 (A. bruennicht) 암컷 성체를 채집하였다. 장소는 인천광역시 남동구 논현동에 위치한 소래 습지 생태 공원 일대 \( \left (37 ^ {\circ } 24 ^ {\prime } 29.09 ^ {\prime \prime } \mathrm { N } , 126 ^ {\circ } 44 ^ {\prime } 49.07 ^ {\prime E } \right ) \)이며, 8월 12일, 23일, 29일 3회에 걸쳐 오전 중(09:00-11:30)에 채집하였다. 채집된 개체는 개별적으로 실험을 위해 디자인된 사육 상자에 넣어졌다.<p>사육실은 \( 12 \mathrm { hr } / 12 \mathrm { hr } \) (낮: 08-20시(663-734 lux), 밤: 20-08시)의 일주기를, \( 29.5-31 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 온도를, 69.8-72.2 \%의 습도를 유지하였다. 분무기를 사용하여 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 증류수를 매일 12 시와 17시에 2회, 사육 상자 상단에 3번, 하단에 3 번 분사하였다. 또한 실험기간 중에 먹이 공급과 연구진 외에 타 생물종에 속하는 개체의 출입을 차단하였다.</p> <p>파리목 동애등에(Ptecticus tenebrifer)를 개체 당 4 마리씩 먹이 자극을 차단하는 실험 기간에 들어가기 앞서 24 시간 전에 먹이로 제공하였다. 동애등에는 \( 45-60 \mathrm { mg } \) 의 몸무게(bodymass)를 가진다. 이 과정은 실험 기간 동안 개체의 수명(longevity)을 늘리기 위해서 수행되었다.</p> <h2>실험 설계</h2> <p>대조군(control group) 34개체, 실험군(experimentalgroup) 37개체가 실험에 사용되었다. 대조군과 실험군에 대한 실험은 감각 정보의 차단을 위해 각각 격리된 실험실에서 수행되었다. 대조군 개체에게 실험 기간 동안 먹이를 공급하지 않았으며 먹이에 대한 감각 정보 또한 제공하지 않았다. 먹이 감각 정보가 제공되지 않은 기간은 모든 개체에게 총 6일(144시간)이다.</p> <p>실험군에 속한 개체에게도 실험 기간(6일) 동안 먹이를 공급하지 않았다. 처음 3일(72시간)은 먹이 자극이 주어지지 않는 환경을 제공하였고, 이어지는 3일은 서양뒤영벌 (B. ter-restris) 의 감각 정보(sensory information)만이 제공되는 상황을 만들었다. 정보 제공은 오전 9시를 시작으로 1시간 동안 이루어졌으며 이어지는 1 시간 동안은 아무런 정보를 제공하지 않았다. 정보가 제공되는 시간과 제공되지 않는 시간을 총 4회 반복하였다. 정보 제공이 끝난 16:00로부터 1시간 뒤인 17: 00에 이전에 건축된 웹을 모직 천을 이용하여 제거한 후 다음날 08: 00에 건축된 웹을 영상 촬영하고 변인을 측정하였다.</p> <p>하단 흰띠줄 길이의 변화 양상을 관찰한 결과 대조군과 실험군 모두에서 전반적으로 감소하는 경향이 나타났다. 자극 전일과 자극 1일에 대조군의 경우 평균 길이 \( 0.01 \mathrm { ~cm } \) 감소 경향이 유의미하지 않음을 보였으나(Wilcoxon sign-ed-rank test: \( t=1.56, p>0.05) \) 실험군의 경우 평균 길이 \( 0.27 \) \( \mathrm { cm } \)의 감소 경향을 보였다 \( ( \mathrm { t } =2.43, p=0.015) \).</p> <p>웹의 중앙을 통과하는 흰띠줄 전체 길이를 관찰한 결과 대조군과 실험군 모두 전반적인 감소 경향이 나타났다. 자극 전일과 자극 1일에 대조군의 경우 평균 길이 \( 1.56 \mathrm { ~cm } \) 의 다소 감소하는 경향을 보였으며(Wilcoxon signed-rank test: \( \mathfrak { t } =1.96, p=0.051) \), 실험군의 경우 평균 길이 \( 0.47 \mathrm { ~cm } \) 의 감소 경향을 보였다 \( (t=2.63, p=0.009) \).</p> <h1>고 찰</h1> <p>본 연구는 꽃꿀채집자인 서양뒤영벌(Bombus terrestris)의 감각 정보를 인지한 긴호랑거미(Argiope bruennichi)의 웹 건축 빈도가 감각 정보가 제공되지 않은 대조군과 비교해 증가할 것이라는 가설을 제안한 바 있다. 연구 결과 웹 건축 빈도는 대조군과 실험군에서 모두 전반적인 감소 경향을 나타내었다. 오히려 실험군에서 보인 감소 경향이 대조군에 비해 두드러지게 나타났다. 자극 1일에 실험군의 웹 건축 빈도가 대조군 감소 비율의 2 배 감소한 것은 본 연구에서 제시한 가설과 부합하지 않는 결과를 보이는 것이다.</p> <p>건축을 포기한 개체의 비율이 상대적으로 많은 실험군에 포함된 일부 개체는 서양뒤영벌 (B. terrestris)의 존재에 교란되었을 가능성이 있을지도 모르겠다. 같은 종의 곤충이라도 웹에 완전히 걸려들어 움직임이 제한되었을 때는 쉬운 사냥감이지만 웹에 걸리지 않고 그낭 만났을 때는 때때로 위협적인 존재로서의 역할을 할 수 있기 때문이다.</p> <p>본 연구는 거미의 포식 전략의 하나로 화분 매개자 곤충의 감각 편향을 이용한 유인 기능이 있는 흰띠줄(stabilimentum)의 건축은 먹이의 종류에 영향을 받을 것이라는 가설을 제안하였다. 즉, 자외선 반사에 민감한 서양뒤영벌 (B. tertestris)의 정보가 제공된 상황에서 개체는 먹이를 유인하는 흰띠줄 건축을 시도하는 경향이 증가할 것이라는 것이다. 실험 결과는 당초의 가설과는 달리 대조군과 실험군에서 모두 흰띠줄의 건축 빈도는 전반적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 실험군에서 흰띠줄 건축의 감소는 서론에서 설명한 '먹이유인가설'에 부합하지 않는다.</p> <p>흰띠줄을 건축한 개체 수 비교 결과 대조군과 실험군 모두 전반적으로 감소하는 경향을 보였다. 대조군에서 흰띠줄을 건축한 개체의 비율이 자극 전일에서 자극 1일에 \( 14.7 \% \) 감소 경향을 보였으며, 실험군에서 흰띠줄을 건축한 개체의 비율은 자극 전일에서 자극 1일에 대조군의 약 두 배인 \( 27.0 \% \)의 감소 경향을 보였다. 자극 1일과 자극 2일에 대조군의 경우 \( 14.7 \% \)로 이전의 흰띠줄 건축 비율 감소 양상과 유사한 비율의 감소 양상을 보였으며, 실험군의 경우 \( 21.6 \% \)의 감소 양상을 보였다. 자극 2일과 자극 3일에 대조군의 경우 \( 5.9 \% \)의 적은 흰띠줄 건축 빈도 감소 양상을 보였으나 꾸준한 감소 양상을 보였고, 이와 반대로 실험군의 경우 흰띠줄 건축 빈도가 \( 10.8 \% \)증가 양상을 보였다.</p> <p>웹의 높이는 대조군과 실험군 모두 유의미한 증감 양상이 나타나지 않았다. 전일과 자극 1일의 비교, 자극 1일과 자극 2일의 비교, 자극 2일과 3잍의 비교 모두에서 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다.</p> <p>웹 면적의 경우는 대조군과 실험군에서 모두 뚜렷하게 증가하거나 감소하는 경향을 보이지 않았다. 감각 자극이 제공된 날들 간에 나타난 증가 또는 감소 경향이 통계적으로 유의미하지 않은 것으로 나타났는데, 유일하게 실험군에서 전일과 자극 1일 간에 \( 90.52 \) \( \mathrm { cm } ^ { 2 } \) 다소 감소하는 경향을 보였다( \( \left . \mathrm { t } = 2.516, p=0.016 \right ) \).</p> <p>원그물 개수는 대조군과 실험군에서 모두 뚜렷하게 증가하거나 감소하는 경향을 보이지 않았다. 다만 자극 전일과 자극 1일의 비교에서 두 그룹 모두에서 원그물 개수가 감소하는 경향을 나타냈다. 즉, 자극 전일과 자극 1일에 대조군의 경우 평균 개수 6.86개 감소하는 경향이 나타났으며(Wilcoxon signed-rank test: \( t=2.147, p=0.033 \), 실험군의 경우 평균 개수가 1.71개 감소하는 경향이 나타났다. \( (t=2.431, p=0.015) \).</p> <p>상단 흰띠줄 길이(upper stabilimentum length) 변화 양상을 관찰한 결과 실험군과 대조군 모두에서 전반적으로 감소하는 경향이 나타났다. 자극 전날과 자극 1일에서 대조군의 경우 평균값이 \( 0.49 \mathrm { ~cm } \) 증가하는 경향을 보였으나 (Wilcoxon signed-rank test: \( t=2.46, p=0.010 \)) 실험군의 경우 \( 0.36 \mathrm { cm } \) 감소하는 경향을 보였다(t=2.356, \( p=0.024) \).</p>	생명
쑥, 솔잎 및 두릅 추출물을 첨가한 돈육 Patty의 품질 특성	<p>추출물의 조제는 깨꼿이 수세하거 물기롤 제서한 추출재료 대 물이 \( 1: 10(w: v) \) 이 되도록 조정한 후 \( 95 \mathrm { C } \) 에서 60분간 추출하였다. 추출물은 여과지로 여과하고 \( 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 냉각 시킨 후 저장하면서 돈육 patty 제조에 이용하였다.</p> <h2>일반성분, pH 및 색도</h2> <p>일반성분은 \( \mathrm { AOAC } \) 법으로 측정하였고, \( \mathrm { pH } \) 는 \( \mathrm { pH } \) meter (AT1 Orion Model 370, USA)로 측정하였다. 그리고 색도는 색차계(Chroma meter Model CR-200b, Minolta Camera Co., Japan)를 이용하고 \( L \) a 및 b값으로 표시하였으며, 이때 색 보정을 위해 사용된 표준 백색판의 \( \mathrm { Y } x y \) 는 각각 \( 93.9,0.315 \) 및 \( 0.333 \) 이었다.</p> <h2>수율 및 지방 보유율</h2> <p>수율 및 지방보유율은 다음식에 의하여 구하였다.</p> <p>Cooking yield \( ( \%) = \frac {\text { Cooked weight } (g) } {\text { Raw weight } (g) } \times 100 \)<p>Fat retention \( ( \%)= \frac {\text { Cooked weight } (g) \times \text { Cooked fat } ( \%) } {\text { Raw weight } (g) \times \text { Raw fat } ( \%) } \times 100 \)</p> <h2>보수력 및 단백질 추출성</h2> <p>보수력은 잘게 썬 시료 \( 10 \mathrm { ~g } \) 을 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) water bath에서 35분간 가열하고, 상온에서 10분간 방치한 후 \( 1000 \mathrm { rpm } \) 에서 원심분리하여 분리된 수분과 시료의 총수분량을 측정하여 다음공식에 의하여 구하였다. 그리고 수용성 단백질 및 염용성 단백질의 추출성은 Arganosa와 Marriott의 방법으로 측정하였다.</p> <p>Water holding capacity \( ( \%)=(1 \)-Free water/Total water \( ) \times 100 \)<h2>조직감 측정</h2> <p>돈육 patty의 조직감은 rheometer(Model CR-200D, SUN Scientific Co., Japan)를 이용하여 측정하고 경도(hardness), 탄성(springiness), 응집성(cohesiveness), 뭉침성(gumminess) 및 저작성(chewiness)으로 표시하였다.</p> <h2>관능검사</h2> <p>가열 돈육 patty의 관능검사는 잘 훈련된 7명의 관능원에 의하여 향기, 다즙성, 조직감 및 전체적인 기호성에 대해 가장 좋다(like extremely)를 9점, 가장 나쁘다(dislike extremely)를 1점으로하는 9점 기호척도법으로 실시하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험결과 얻어진 자료에 대한 통계분석은 SAS program을 이용하여 Duncan의 multiple test로 5%로 수준에서 유의성을 검정하엿다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>돈육 patty의 일반성분 조성 및 pH</h2> <p>돈육 patty의 일반성분 및 \( \mathrm { pH } \) 를 분석한 결과는 Table 2 와 같다. 돈육 patty의 수분함량은 대조구가 \( 66.6 \% \) 로 쑥, 솔잎 및 두릅 추출물을 첨가한 것보다 현저하게 높았으며, 지방함량은 대조구가 \( 13.2 \% \) 로 다른 처리구에 비해 비교적 낮게 나타났다. 돈육 patty의 단백질함량은 각 처리구가 \( 17.3 \sim 18.1 \% \) 로 현저한 함량의 차이는 없었으며, 회분함량은 솔잎 추출물 첨가구가 \( 2.1 \% \) 로 다른 돈육 patty에 비해 높았다. 특히 물을 \( 10 \% \) 첨가한 대조구의 수분함량이 식물 추출물을 \( 10 \% \) 첨가한 patty보다 높은 것은 식물 추출물 \( 10 \% \) 에 함유된 고형분 양의 차이에서 오는 결과로 생각된다. 그리고 돈육 patty의 \( \mathrm { pH } \) 는 5.92~5.98로 시료들 사이에 차이가 없었다.</p> <h2>생육 및 가열 돈육 patty의 색도</h2> <p>돈육 patty의 색도를 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다. 생육 patty의 \( \mathrm { L } \) (명도), \( \mathrm { a } \) (적색도) 및 \( \mathrm { b } \) (황색도)값은 대조구가 각각 \( 72.6,6.0 \) 및 \( 16.4 \) 로서 식물 추출물을 첨가한 돈육 patty보다 비교적 높았으며, 쑥, 솔잎 및 두릅 추출물을 첨가한 돈육 patty 사이에는 현저한 차이를 보이지 않았다.</p> <p>가열육 patty의 \( \mathrm { L } \) 및 \( \mathrm { a } \) 값은 시료들 사이에 차이가 없었으나, b값은 대조구가 높게 나타났다. 그리고 가열육 patty의 L값이 생육 patty보다 다소 높았으나, a값은 낮은 경향이었다.</p> <p>육의 색깔은 myoglobin의 농도와 화학적 상태에 의해서 결정되고, 육제품의 색깔은 발색제로 사용된 아질산염이 원료육의 myoglobin과 반응하여 색을 안정화시키게 된다 . 본 실험에서 생육 patty 대조구의 명도, 적색도 및 황색도가 식물 추출물을 첨가한 patty들보다 높은 것은 식물 추출물에 함유된 엽록소가 영향을 미친 것으로 생각된다. 가열육의 색깔은 myoglobin의 변성에 영향을 받게 되고 , myoglobin의 번성을 감소시키는 원인은 높은 \( \mathrm { pH } \), 질산업, 식초, 포도주, 향신료 등이라고 보고되고 있다. 따라서 가열육 patty의 적색도가 생육 patty보다 낮은 것은 가열에 의해 myoglobin이 변성되었을 뿐만 아니라, 제조원료에 myoglobin의 변성을 감소시키는 원인 물질이 함유되지 않았기 때문인 것으로 판단된다.</p> <h2>돈육 patty의 수율, 지방보유율, 보수력, 단백질 추출성 및 gel 강도</h2> <p>Table 4는 돈육 patly의 조리수율, 지방보유율, 보수력, 단백질 추출성 및 gel 강도를 나타낸 것이다. 가열욱 patty 의 수율은 \( 77.0 \sim 78.2 \% \) 로 시로들 사이에 현저한 차이가 없었다. 지방보유율은 두릅 추출물을 쵬가한 palty가 대조구보다 현저하게 높았으며, 쑥 및 솔잎 추출물 첨가구와는 차이가 없었다. 보수력은 \( 88.3 ~ 90.0 \% \) 로 시료들 사이에 차이가 없었으며, 수용성 단백질의 추출성은 대조구가 솔잎 첨가구보다 높았고, 쑥 및 두릅 추출물 처리구와는 차이가 없었다. 그리고 염용성 단백질 추출성 및 gel 강도는 대조구와 식물 추출물 처리구 사이에서 현저한 차이가 없었다.</p> <p>조리수율 및 지방보유율은 첨가된 지방 및 수분량, 가열온도, 조리방법 등에 영향을 받게 되고[5,20], 보수력은 지방함량이 낮고 적육의 함량이 늪으면 결합수의 영향으로 보수력이 높아지는 것으로 알려져 있다[12]. 단백질의 추출성은 단백질의 변성으로 감소하게 되는데 본 실험에서 수용성 및 염용성 단백질의 추출성이 낮은 것은 가열에 의한 단백질 변성의 결과로 생가된다. 이상에서 물리적 성질에 영향을 미칠 수 있는 조리수율, 보수력, 염용성 단백질 추출성 및 gel 강도가 물을 \( 10 \% \) 첨가한 대조구와 식물 추출물을 \( 10 \% \) 첨가한 patty들 사이에 차이가 없는 것은 기능성 육제품을 제조할 수 있는 가능성을 보여주는 것이다.</p> <h2>돈육 patty의 조직적 특성</h2> <p>각 patty의 경도(hardness), 탄성(springiness), 응집성(co-hesiveness), 뭉침성(gumminess) 및 저자성(chewiness)을 rheometer를 이용하여 측정하고 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 물 \( 10 \% \) 첨가한 대조구, 쑥, 술잎 및 두릅 추출물을 침가한 4종류의 patty 사이에 경도, 탄성, 응집성, 뭉침성 및 저작성의 차이는 없었다. Troutt 등 및 Berry는 지방 첨가량에 따라 조직적 특성들이 번화한다고 보고하였는데, 본 실험에서는 지방 침가량을 \(20 \% \)로 단일화하였기 때문에 조직적 특성에는 차이가 없으며, \( 10 \% \) 의 물과 \( 10 \% \) 의 식물 추출물은 기계적 조직감에 영향을 미치지 않는 것으로 나타닜다.</p> <h2>돈육 patty의 관능적 특성</h2> <p>돈육 patty의 관능성을 9점 기호척도법으로 평가하고 그 결과를 Table 6에 나타내었다. 그 결과 물 \( 10 \% \) 첨가한. 대조구, 쑥, 솔잎 및 두릅 추출물을 각각 \( 10 \% \) 씩 첨가한 돈육 patty사이의 가열육 향기, 다즙성 및 전체적인 기호성은 차이가 없었으니, 조직감은 솔잎 추출물 첨가구, 쑥 추출물 첨가 구, 두릅 추출물 첨가구 및 대조구의 순으로 높게 나타났다.</p> <p>관능성은 식품의 가장 중요한 품질 특성인데, 많은 연구자들이 육제품의 관능성에 미치는 영향에 대하여 보고하였다. Hensley와 Hand는 지방과 수분 첨가 비율이 관능성과 물성에 미치는 영향에 대하여 연구하였고, Hand 등은 지방을 \( 10 \% \) 이하로 줄이면 다즙성이 저하된다고 하였으며, Egbert 등은 gum류의 첨가가 육제품의 관능성 과 물리적 성질에 영향을 미친다고 보고하였다. 본 연구에서는 물대신 식물 추출물을 첨가한 것 외에는 다른 돈욱 patty와 원부재료의 배합비율이 비슷하여 물과 식물 추출 뭍의 첨가에 따른 관능성의 차여를 판단하고자 하였으나, 식물 추출물이 관능적 톡성에 영향을 미치지 않거나 다소 우수한 것으로 나타났다.</p> <p>이상의 결과에서 항산화성이나 항균성이 있는 식물 추출물을 육제품 제조시 첨가하는 물 대신에 사용함으로써 종래의 육제품과 이질적인 품질의 차이가 있을 것으로 예측하였으나 쑥, 솥잎 및 두릅 추출물을 첨가하여 제조한 돈육 patty들이 대조구와 물리적 - 관능적 성질들이 비슷하거나 다소 우수하여 이들을 이용한 기능성 육제품의 제조가 가능할 것으로 판단되었고, 이 결과들을 토대로 다른 식물 추출물을 이용한 연구가 계속되어야 하겠다.</p> <h1>요 약</h1> <p>기능성 육제품의 가능성을 검토하기 위해서 물 \( 10 \% \) 첨가한 돈육 patty, 숙, 솔잎 및 두릅 추출물을 가각 \( 10 \% \) 씩 첨가한 돈육 patty 4종류를 제조하고 품질 특성을 조사하였다. 물을 \( 10 \% \) 첨가한 대추구의 수분함량은 식물 추출물 처리구보다 높았으나, 지방함량은 낮았으며, 회분함량은 솔잎 추출물 처리구가 높게 나타났다. \( \mathrm { pH } ^ { 2 } \) 는 5.92 5.98로 시료들 샤이에 차이가 없었다. 생육 patty 대조구의 Hunter's L 및 a값이 식물 추출물 처리구보다 비교적 높았으며, 생욱 patty의 a값이 가열육 patty보다 높았다. 대조구와 식몰 추출물 처리구 사이의 조리수율, 보수력, 염용성 단백질 추출성 및 gel 강도는 차이가 없었다. 그리고 지방보유을은 대조구가 식물 추출물 처리구보다 낮았으나 수용성 단백질의 추출성은 대조구가 솔잎 추출물 처리구보다 높았다. 경도, 탄성, 응집성, 뭉침성 및 저작성은 시료들 사이에 차이가 없었다. 관능검사 결과 가열육의 향기, 다즙성 및 전체적인 기호성은 시료들 사이에 차이가 없었지만, 조직감은 솔잎, 쑥, 두릅 추출물 처리구, 대조구 순으로 높게 나타났다.</p> <h1>서론</h1> <p>외식산업의 발달로 육제품의 소비형태가 다양해지면서 분쇄 육제품인 햄버그 패티 및 스테이크, 돈가스, 너겟 등의 소비량이 급속히 증가하고 있다. 육제품은 다른 식품군과는 다르게 지방과 단백질을 많이 함유하고 있기 때문에 유통, 저장과정에서 지방산화 및 단백질 분해로 인한 독성물질의 축적, 미생물 성장으로 인한 식중독 발생 등의 우려가 많은 식품이다. 이와 깉온 건강장애는 최근의 식중독 사건의 다발로 그 중요성이 더윽 증대되고 있다. 일반적으로 육제품의 부패를 억제하고 식폼의 안진성을 높이기 위해서 합성 항산화제나 합성 보존료를 사용하고 있다. 그러나 최근에 와서 합성첨가물에 대한 안전성의 문제가 심각하게 대두되면서 합성첨가물을 기피하려는 사회적 분위기의 형성과 함께 소비자들은 천연의 식품첨가물에 대한 선호도가 크게 증대되어 가고 있는 실정이다. 따라서 소비자들의 요구에 부응하면서 육체품의 안전성을 높일 수 있는 천연 식품첨가물의 개발은 매우 중요한 과제라 하겠다.</p> <p>현재까지 천연의 항산화 물질이나 향균물질에 대한 연구가 국내외에서 꾸준히 진행되어 온 결과 약용식물로 이용되고 있는 여러 종류의 식물체에서 이러한 작용이 확인된 물질이 분리되었고 또한 그 작용 기적에 대한 연구들이 많이 보고되고 있다. 우리나라 산야에 자생하고 있으며 쉽게 구할 수 있는 쑥은 지혈,위장,신경통,천식,소화,부인병 등 솔잎은 간, 비뇨생식기,위장,신경,순환기,피부질환 등 두릅은 돌연변이 억제효과 등에 효능이 있어 오래전부터 한약제로도 사용되어 왔으며, 연구결과 이들에 함유되어 있는 flavonoid류,alkabid류,ilgan류,유기산류 등이 항산화작용 또는 향균작용이 있는 것으로 알려지고 있다. 그러나 이러한 작용이 있음에도 불구하고 이들을 식품에 첨가하여 항산화성이나 향균성을 연구한 결과는 드물다. 또한 쑥, 솔잎 및 두릅 추출물이 육제품에 항산화 및 향균작용이 있다고 하더라도 제품의 품질에 나쁜 영향을 미친다면 식품첨가물로 사용하기에는 부적절하다. 따라서 이들을 육제품에 첨가하여 제품의 품질에 미치는 영향을 밝히는 것은 무엇보다도 중요하다.</p> <p>본 연구는 항산화작용과 향균작용이 있는 것으로 알려진 쑥,솔잎,및 두릅의 추출물을 첨가한 육제품을 제조하고 이들이 육제품의 품질에 미치는 영향을 파악하여 천연의 식품첨가물을 개발할 수 있는 토대를 마련하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 연구에 사용한 돈육 patty는 Table 1 과 같은 배합비율로 제조하였다. 즉 돈육 \( 69.5 \% \), 지방 \( 20 \% \) 에 물을 \( 10 \% \) 첨가한 대조구와 물대신 쑥(Aretemnsta niontata) 추출물 \( 10 \% \) 처리구, 솝(Pintts densiffora)잎 추출믈 \( 10 \% \) 처리구 깇 두릅 (Aralia elata)익 추출물 \( 10 \% \) 처리구로 제조하였다. 돈육 patty의 가열은 내부온도가 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 가 되도록 \( 200 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 전기오븐을 이용하여 가열하였다.</p>	생명
CpG Island 검색용 윈도우 프로그램 개발	<p>(C-2) 단계 (B)에서 계산한 결과 값들이 CpG island로 판단하는 기준을 충족시키지 못할 경우 분석 윈도우를 스텝크기 만큼씩 진행 방향으로 이동시키면서 기준을 충족시킬 때까지 계속 진행한다. 충족되어지는 영역이 검색되어지면 (C-1)단계의 작업을 수행한다.</p> <p>(D) 분석 윈도우의 끝부분이 입력 서열의 마지막 위치에 도달하면 (B)단계로 이동한다. 그렇지 않으면 분석 윈도우의 끝부분에 새로운 분석 윈도우를 위치시키고 (B)단계에서 (D)단계 과정을 반복 수행한다.</p> <p>(E) 검색 완료된 입력 서열내의 각각의 CpG island에 대해 인접한 것들끼리의 거리가 Gap 값 미만이고 상호 연결했을 경우에 합쳐진 단일 영역이 %GC 및 Obs(CpG)/Exp(CpG) 값들을 충족시키는 것들이 있으면 서로 연결하여 하나의 단일 CpG island로 최종 보고한다.</p> <h2>CpG Island Searcher와 Emboss-CpGPlot 프로그램들과의 검색 성능 비교</h2> <p>CpGi의 검색 성능을 파악하기 위해 기존의 검증된 웹 인터페이스 기반의 CpG island 검색 프로그램인 CpG Island Searcher와 Emboss-CpGPlot 등과 동일하거나 거의 유사한 파라미터 내에서 검색 결과를 비교분석하였다. 실제 각 프로그램마다 사용할 수 있는 파라미터와 내부 검색 알고리즘 등의 미묘한 차이 등으로 말미암아 \( 100 \% \) 완전한 비교분석을 할 수 없지만 나름대로 객관성을 확보하기 위해 파라미터들을 최대한 유사하게 설정하고 비교분석하였다. 각 프로그램의 파라미터들을 살펴보면, 먼저 Takai와 Jones의 기준에 기반을 둔 CpG Island Searcher의 경우 모든 파라미터들은 라디오 버튼 형태로 구성되어 있다. \( \% \text { GC } \)는 \( 50 \% \) 부터 시작해서 \( 60 \% \) 까지 \( 1 \% \) 간격으로 11개의 라디오 버튼으로 이뤄져 있으며 기본 값으로는 \( 55 \% \)로 설정되어 있고, Obs(CpG)/Exp(CpG)는 0.6부터 0.7까지 0.01 간격으로 11개의 라디오 버튼으로 구성되어 있으며 기본 값으로는 0.65로 설정되어 있다. 그리고 분석 원도우 크기는 \( 200 \mathrm { ~bp } \)부터 \(1,200 \mathrm { ~bp } \)까지 \( 100 \mathrm { ~bp } \) 간격으로 선택할 수 있으며 기본 값으로는 \( 500 \mathrm { ~bp } \)로 설정되어 있고, 마지막으로 Gap값은 \( 100 \mathrm { ~bp } \)부터 \( 300 \mathrm { ~bp } \)까지 \( 50 \mathrm { ~bp } \) 간격으로 설정할 수 있으며 기본 값으로는 \( 100 \mathrm { ~bp } \)를 사용하고 있다. Emboss-CpGPlot은 기본적으로 Gardiner-Garden와 Frommer의 기준에 기반을 두고 있으며 분석 윈도우 크기는 \( 100 \mathrm { ~bp } \)부터 \( 400 \mathrm { ~bp } \)까지 \( 100 \mathrm { ~bp } \)씩, Obs(CpG)/Exp(CpG)는 0.6부터 1.0까지 0.1씩, MinPC는 30부터 80까지 10씩(MinPC는 CpG island로 확정짓기 전에 10개의 분석 윈도우 내에서 G와 C가 차지하는 최소 평균 백분율 값을 의미함), CpG island의 최소 길이 값인 Length는 \( 50 \mathrm { ~bp } \), \(100 \mathrm { ~bp } \), \(200 \mathrm { ~bp } \), \(300 \mathrm { ~bp } \), \(400 \mathrm { ~bp } \), \(500 \mathrm { ~bp } \) 등의 값을 선택할 수 있으며 그 외에 스텝크기로는 1, 2, 5, 10 등의 값을 선택할 수 있게 되어 있다. 이렇듯 앞에서 언급한 바대로 CpG island를 검색하기 위해 개발된 프로그램들의 특성과 내부 알고리즘의 기준에 따라 각각의 파라미터들이 다르기 때문에 CpGi가 유효한 결과를 나타내는지 비교분석하기 위해 최대한 유사하거나 동일한 파라미터 값들을 적용하도록 하였다. 그러한 측면에서 Bnboss-CpGPlot의 일부 파라미터들은 선택할 수 있는 값들의 차이가 너무 크기 때문에 Emboss-CpGPIot의 기준에 CpG Island Searcher와 CpGi의 기준을 최대한 맞추어 결과를 분석하였다. 비교 분석시 22번 염색체의 AP00524 Contig와 21번 염색체의 NT_029490.3 Contig를 사용하였고, 설정한 파라미터 값들은 Emboss-CpGPIot의 경우 분석 윈도우 크기는 \(200 \mathrm { ~bp } \), 스텝크기는 \(1 \mathrm { ~bp } \), Obs(CpG)/Exp(CpG)는 0.6, MinPC는 50, Length는 \(200 \mathrm { ~bp } \) 였고, CpG Island Searcher의 경우에는 %GC는 55, Obs(CpG)/Exp (CpG)는 0.6, Length는 \(200 \mathrm { ~bp } \), Gap값은 \(100 \mathrm { ~bp } \)였다. 마지막으로 CpGi의 경우 분석 윈도우 크기는 \(200 \mathrm { ~bp } \), 스텝크기는 \(1 \mathrm { ~bp } \), Obs(CpG)/Exp (CpG)는 0.6, Gap값은 \(100 \mathrm { ~bp } \), %GC는 55, 그리고 #CpG는 10으로 설정하여 실행하였다.</p> <h1>서론</h1> <p>포스트게놈 시대에는 유전자들의 기능 및 조절 메커니즘 규명을 비롯하여, 각 생물체의 게놈 프로젝트를 통해서 얻어진 방대한 DNA 정보와 생명체의 정보 등을 이용한 생명현상 연구가 활발히 이뤄지고 있으며, 특히 DNA가 발현된 단백질의 구조와 기능에 대한 연구, 즉 프로테오믹스(proteomics)가 핵심 분야로 대두되고 있다. 게다가, 지난 수 십년 동안 유전자 발현 및 조절 메커니즘에 대한 연구가 유전학을 바탕으로 진행되어 왔으나 최근 유전자가 발현하는데 DNA 서열과 함께 메틸기가 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀지면서 후성학(epigenetics)이 중요한 분야로 인식되고 있다. 후성학에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 DNA 염기에 메틸기( \( \mathrm { CH } 3- \))가 붙는 메틸화(methylation)이다. 유전체의 염기서열 중 시토신(C)과 구아닌(G) 두 염기가 나란히 존재하는 것을 CpG라 하는데, 여기서 시토신이 메틸화될 수 있다. CpG는 진화과정을 거치면서 진핵생물 유전체에서는 점진적으로 감소되어 온 경향이 있는데 포유동물 유전체에는 여전히 잘 보존되어 있으며 유전체 내 CpG의 메틸화 정도나 양상은 포유동물의 종에 따라 다르고, 조직에 따라서도 특이적인 것으로 밝혀지고 있다. 특히 인간을 포함한 포유동물의 염기서열에는 CpG가 밀집되어 있는 부위가 존재하는데, 이러한 영역을 'CpG island'라고 한다. CpG island는 보통 \(0.5 \)~ \(4~ \mathrm { kbp } \) 정도 크기로, 유전자의 상위 부위, 즉 유전자의 전사를 조절하는 영역인 프로모터 부근에 대부분 위치하고 있어 유전자와 밀접한 연관성을 갖고 있다. 현재 밝혀진 인간 유전체의 전체 염기서열에서 CpG island는 약 29,000개로 추정되는데, 전체 추정 유전자의 \(70 \% \)에 해당하는 유전자가 하나의 CpG island를 보유하고 있는 것으로 여겨 진다. 많은 실험들에 의해 CpG island는 유전자 발현억제, 유전자 각인, X 염색체 불활성화, 발암의 억제 등에 작용하는 등 유전자 발현 및 조절 메커니즘에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.</p> <p>CpG island는 대부분 비 메틸화상태 (methylation-free)로 존재한다. 그러나 메틸화된 예외적인 경우가 존재해 CpG island의 메틸화가 지닌 의미를 밝히는데 도움이 되고 있다. 특히, 인간의 정상세포에서는 암 억제유전자 등이 정상적으로 발현됨으로써 세포분열을 적절하게 조절하고 있다. 그러나 암세포의 경우는 암 억제유전자가 제대로 기능을 발휘하지 못해 세포분열의 조절기능을 잃어버린 상태에 이른다. 이런 암 억제유전자의 기능 소실은 이들 유전자의 CpG island에 나타난 비정상적 메틸화에 원인이 있다는 사실이 다양한 암(대장암, 간 종양, 백혈병, 위암 등) 종에서 연속적으로 밝혀지고 있다. 유전자의 전사과정은 세 가지 조건이 충족되어야 진행이 되는데 첫째, 적절한 전사인자(transcriptional factor)가 있어야 하고, 둘째, 히스톤(histone)들이 아세틸화되어 있으면서 메틸화되지 않아야 하고, 셋째, CpG island에 메칠화가 이뤄지지 않아야 한다. 이러한 측면에서 CpG island가 매우 중요한데, 비록 CpG island의 메칠화가 우선인지 아니면 유전자 발현 억제가 우선인지의 논란은 여전히 남아 있지만, 암세포에서 CpG island 내의 메칠화는 분자진단 및 암의 조기 진단에 활용될 가능성이 매우 높으며, 유전자의 변이보다는 후생학적 변이를 정상화시키는 것이 더 쉬울 것이라는 점에서 암의 치료적 측면에서도 매우 흥미로운 분야이다. 따라서 이런 다양한 연구결과들이 밝혀짐에 따라 암과 관련하여 CpG island 를 연구하는 곳이 늘어나고 있는 실정이다. 게다가, CpG island는 유전자의 유용한 표식자로서의 역할을 할 수 있기 때문에 전산생물학적 측면에서 유전자나 프로모터 예측 프로그램을 개발할 때 중요한 단서로 활용될 수 있다.</p> <h1>결 론</h1> <h2>CpGi 검색 결과의 양식 및 해석 방법</h2> <p>CpGi 검색 결과의 양식과 해석 방법에 대한 이해를 돕기 위해 13번 염색체의 NC_006595 (1-3846) Contig를 사용하여 CpGi를 실행하였다. 검색 결과 화면을 살펴보면 위쪽 라인은 분석대상 입력서열을 의미하고, 검색된 CpG Island은 굵은 청색선으로 표시된다. 그리고 분석대상 입력서열 라인 바로 밑 부분에는 해당 입력서열의 위치별 G + C% 값들을 그래픽하게 도표화해서 보여준다. G + C% 도표는 사용자가 다양한 용도로 참조하거나 활용할 수 있을 것이다. CpG island의 굵은 청색선 부분을 더블클릭하면 해당 CpG island에 대한 세부정보를 보여주는 팝업 창이 뜬다. 즉, 팝업 창을 통해 서 CpG island의 시작위치와 종료위치, CpG island의 전체 길이, G + C% 값 및 CpG island를 구성하고 있는 실제 서열 등을 확인할 수 있다. Fig. 3을 통해서 알 수 있듯이 NC_006595에서는 모두 세 개의 CpG island가 검색되었다.</p> <h2>22번 염색체의 AP00524 Contig에 대한 검색 결과</h2> <p>22번 염색체의 AP00524 (1-4455) Contig를 대상으로 Emboss-CpGPIot, CpG Island Searcher 및 CpGi 등을 구동 시켰을 경우, 모든 프로그램들이 Contig 내에 CpG island가 존재하지 않는 것으로 검색결과를 보고하였다.</p> <h2>21번 염색체의 NT_029490.3 Contig에 대한 검색 결과</h2> <p>21번 염색체의 NT_029490.3 (1-15050) Contig를 대상으로 세 개의 프로그램을 구동시켰을 경우, Emboss-CpGPIot는 하나의 CpG island가 존재하는 것으로, CpG Island Searcher와 CpGi는 각각 2개의 CpG island가 존재하는 것으로 검색결과를 보고하였다. Emboss-CpGPIot에서 찾아낸 CpG island의 길이는 \(225 \mathrm { ~bp } \)이였고, 시작 위치는 입력서열의 13555번째이고 종료 위치는 13779번째이었다. CpG Island Searcher가 검색한 첫 번째 CpG island는 입력서열의 10287번째에서 10440번째 사이에 위치했으며, %GC는 \(55.2 \% \), Obs(CpG)/Exp(CpG)는 0.607, 길이는 \(154 \mathrm { ~bp } \)이었다. CpG Island Searcher가 검색한 두 번째 CpG island의 위치는 13575에서 시작되어 13890에서 끝났다. %GC는 \(55.1 \% \), Obs(CpG)/Exp(CpG)는 0.851 그리고 길이는 \(316 \mathrm { ~bp } \)이었다. 마지막으로 CpGi의 검색 결과를 살펴보면 검색된 첫 번째 CpG island는 10218에서 시작해 10437에서 끝났으며 그 길이는 \(219 \marhrm { ~bp } \), %GC는 \(51 \% \)를 나타냈다. 검색된 두 번째 CpG island는 13464에서 시작해 13869에서 끝났으며 길이는 \(405 \mathrm { ~bp } \), %GC는 \(48 \% \)였다.</p> <p>전산학적 기법을 이용한 CpG island 검색 프로그램은 대규모 유전체 프로젝트의 산물로 쏟아지고 있는 유전체를 대용량 으로 분석할 때 유용한 분석 도구로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, CpG island 관련 연구자들에게도 많은 도움이 될 수 있을 것이다. 대표적으로 널리 활용되고 있는 공개용 웹 기반 검색 프로그램으로는 D. Takai와 P.A. Jones 에 의해서 구현된 CpG Island Searcher (http://cpgislands.usc.edu/)와 Gardiner-Garden와 Frommer가 제안한 기준으로 구현된 EMBOSS의 CpGPlot (http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/#andNewcpgseek) 등이 있다. 국내에는 아직까지 공개된 웹 프로그램이 존재하지 않으며, 게다가 국내외적으로 윈도우 운영체제의 개인용 컴퓨터 상에서 독자적으로 구동될 수 있는 윈도우 기반의 검색 프로그램이 공개되어 있지 않은 실정이다. 이러한 측면에서 쉽게 사용가능하며 분석결과에 대한 해석이 용이한 사용자 친화적인 인터페이스 기반의 CpG island 검색용 윈도우 프로그램인 CpGi를 개발하게 되었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <p>CpGi는 유전체를 대용량으로 분석하고 주석 작업을 수행하는 연구자들이나, CpG island의 메틸화를 바탕으로 프로모터나 각종 암 관련 유전자의 발현 유무를 연구하는 실험 연구자들을 위하여 보다 용이하고 정확하게 CpG island를 예측할 수 있도록 개발된 윈도우 프로그램이다. 현재 일반에 공개되어 널리 사용되고 있는 CpG island 검색용 웹 프로그램들의 경우 텍스트 위주의 분석 환경을 제공하고 있으며, 비록 부분적인 그래픽 환경을 제공하고 있더라도 인터넷 웹상의 분석결과를 효과적으로 말미암아 가시화(visualization)하지 못하는 실정이다. 따라서 이러한 문제점을 극복하고 다양한 파라미터 설정에 의한 효과적인 분석과 분석결과의 가시화를 위해 최대한 사용자 친화적인 윈도우 인터페이스(Interface)로 CpGi 프로그램을 구현하였으며, 윈도우 프로그램이기에 마이크로소프트 윈도우즈 운영 체제의 개별 PC 상에서 독자적인 프로그램으로 구동된다. 프로그램 내부에 사용된 CpG island 검색 기준은 기본적으로는 D. Takai와 P. A. Jones 등이 제안한 기준을 바탕으로 하였고，이 외에도 부가적인 기준을 첨가하여 사용자가 맞춤형 분석을 할 수 있게끔 다양한 파라미터 값들(%GC, Obs (CpG)/Exp (CpG), 윈도우 크기, 스텝크기, Gap 값, #CpG 등)을 사용자가 직접 설정할 수 있도록 구현하였다. 윈도우 크기(window size)는 분석대상 입력 서열을 분석할 때 매회 마다 분석대상으로 삼는 부분 서열(즉, 분석 윈도우)의 크기를 의미하며, 여기서는 CpG island의 최소 크기 값과 동일하다. %GC는 분석 윈도우 내의 염기서열들 중에서 G와 C가 차지하는 백분율 값이며, Obs (CpG)/Exp (CpG)는 임의의 상황 에서 이론적으로 추정되는 CpG의 개수에 대한 실제 관측된 CpG의 개수의 비율을 의미한다. 스텝크기(step size)는 선행 분석 윈도우에 대한 분석이 완료되고 그 다음 분석 윈도우로 이동할 때 건너뛰게 되는 서열의 크기를 의미하며, Gap 값은 입력서열 전체에 대한 분석이 완료된 후 검색된 CpG island 들에 대해 내부적으로 인접한 CpG island들 간의 단일체로의 합체를 위해 사용되는 합체 허용 서열 간격을 의미한다. 마지막으로 #CpG는 분석 윈도우 내에 존재하는 CpG dinucleotide의 최소 개수 값을 의미한다. 게다가, CpGi는 위치별 G + C를 그래프로 보여주는 내부 모듈을 갖고 있으며, 이를 위한 별도의 윈도우 크기와 스텝크기 파라미터 값이 존재한다. 즉, CpG island의 검색결과를 시각적으로 보여줄 때 입력서열 상의 CpG island들의 위치와 더불어 입력 서열상의 위치별 G + C를 그래픽하게 보여주기 위한 옵션이다. 분석대상 입력서열을 편집박스(edit box)에 직접 입력하거나 파일 형태로 업로드 시킬 수 있으며 입력서열은 반드시 FASTA 양식(즉, 첫 번째 줄은 반드시 ' \(>\)' 시작하는 주석문이어야 하고, 두 번째 줄부터 실제 서열데이터가 뒤따르는 양식을 의미함)을 원칙으로 하며, 파일의 확장자는 디폴트로 \(. \text { seq } \)로 설정되어 있다.</p> <p>CpGi를 개발하기 위해 Microsoft Windows XP Professional(5.1, build 2600) 운영체제를 탑재한 Intel Pentium 4 ( \(2.80 \mathrm { GHz } ~ \text { CPU } \), \(512 \mathrm { MB } ~ \text { RAM } \)) 컴퓨터를 사용하였으며, CpGi의 외부 인터페이스와 주요 핵심 알고리즘은 프로그래밍 언어 Viusal C + + 6.0을 이용하여 구현하였다.</p> <h2>내부 알고리즘 구현</h2> <p>현재까지 기존의 검색 프로그램에 의해 널리 통용되는 보편적인 CpG island 검색 기준은 크게 두 가지로 대별된다. 즉, Gardiner-Garden과 Frommer에 의해 제시되었던 기준과 Takai와 Jones에 의해 제안된 기준이다. 전자의 경우는 GaMiner-Garden과 Frommer가 GenBank 서열 데이터를 대량으로 분석한 것을 토대로 1987년에 제시한 기준으로 지금까지 일반적으로 널리 통용되고 있다. 그들이 제시한 기준에 의하면 CpG island는 기본적으로 서열의 길이가 적어도 \(200 \mathrm { bp } \) 이상이어야 하며 해당 길이의 서열 내에서 G + C%가 \(50 \% \) 이상이고, 추정되는 GpG 수에 대한 관측된 GpG의 비율(즉, Obs(CpG)/Exp(CpG))이 0.6 이상이어야 한다. Takai와 Jones에 의해 2002년에 제시된 기준을 살펴보면 CpG island는 기본적으로 서열의 길이가 \(500 \mathrm { bp } \) 이상, 서열 내의 G + C%는 \(55 \% \)이상, 그리고 Obs(CpG)/Exp(CpG)의 비율이 0.65 이상이어야 한다. 따라서 Takai와 Jones에 의해 제시된 기준은 Gardiner-Garden과 Frommer 에 의해 제시된 기준을 다소 보완하고 개선하여 검색 대상 서열내의 CpG island를 보다 엄격한 기준으로 정확하게 찾아낼 수 있도록 제안된 것이라고 볼 수 있다. 이러한 측면을 고려하여 본 논문에서는 Takai와 Jones가 제시한 기준을 토대로 CpG island 예측 프로그램의 내부 검색 알고리즘을 개발하였다. CpG island를 예측하기 위한 검색 알고리즘은 C 언어를 이용하여 개발하였는데 이를 요약하면 다음과 같다.</p> <p>(A) 분석대상 입력서열의 첫 번째 위치를 시작점으로 사용자가 지정한 윈도우 크기만큼 초기 분석 윈도우를 설정한다. 윈도우 크기는 파라메타 설정 파업 창에서 사용자가 임의로 정해줄 수 있으며, 디폴트 값은 \(200 \mathrm { bp } \)이다.</p> <p>(B) 설정된 분석 윈도우 내에 위치하는 해당부분 서열들에 대해 %GC, Obs(CpG)/Exp(CpG) 및 #CpG 값들을 계산한다.</p> <p>(C-1) 만약 분석 윈도우가 CpG island로 판단하는 기준을 충족시키면 분석 윈도우 크기만큼 진행 방향으로 이동시키고, 새로운 분석 윈도우에 대해 (B)에서 계산한 값들을 다시 계산하고 해당 영역이 기준을 충족시키는지 여부를 판단한다. 기준이 충족되어질 경우 반복적으로 분석 윈도우 크기만큼 진행 방향으로 이동하고 새로운 분석 윈도우에 대해 계산하는 반복 작업을 수행하면서 CpG Island 영역을 확장해 나간다. 이러한 반복적 확장과정에서 기준에 부합되지 않는 분석 윈도우가 발생하면 진행방향의 역방향으로 스텝크기 만큼씩 분석 윈도우를 이동시키면서 기준이 부합되는 영역이 나올 때 까지 계속 역방향으로 진행한다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>첫 번째 검증 실험에 해당하는 22번 염색체의 AP00524 Contig에 대한 검색결과를 살펴보면 CpGi가 CpG Island Searcher와 Emboss-CpGPlot 등과 일치하는 검색결과로서 해당 Contig상에 하나의 CpG island도 존재하지 않는다는 검색결과를 도출하였다. 원래 22번 염색체의 AP00524는 CpG island가 존재하지 않은 Contig였기 때문에 False positive한 것들을 예측해 내지 않고 나름대로 정확하게 예측했다고 할 수 있다. 즉, 특이성(specificity) 측면에서 나름대로 정확성을 띄고 있다는 것을 간접적으로 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 하나의 결과를 가지고 CpGi가 기존의 다른 프로그램들만큼 성능이 뛰어나다고 단정하기 힘들 것이다. 특히 False negative한 예측치 측면에서의 정확성, 즉 민감도(sensitivity) 차원에서 다른 두 프로그램들 보다 뛰어나다고 단언하기 곤란할 것이다. 이미 앞에서 언급한 바가 있듯이, 실제 CpG island 검색 프로그램들은 나름대로의 기준에 의해서 자체 고유의 내부 알고리즘으로 검색하기 때문에 상호 우위를 직접적으로 비교하기 매우 힘들며, 특정한 기준을 정하여 검색했을 때 합당한 것들을 모두 검색해 낼 수 있는 것이 보편적이기 때문에 더욱 그러하다. 그래서 그러한 성능평가는 다른 응용 분야의 프로그램들에 비해 그리 중요하지 않다고 볼 수 있다. 그럼에도 불구하고, False negative한 예측치 측면의 성능에 대해 간접적으로 나마 검증하기 위해 21번 염색체의 m_029490.3을 이용하여 검색한 결과들을 비교분석해 보았다. 21번 염색체의 NT_029490.3에 대해서는 Emboss-CpGPlot는 하나의 CpG island를 예측하였고, CpGi와 CpG Island Searcher는 두 개의 CpG island가 존재하는 것으로 예측하였다. 3개의 분석 프로그램들이 예측한 CpG island의 개수에 차이가 있을 뿐만 아니라 예측된 CpG island들의 위치가 검색 프로그램별로 조금씩 상이했다. 프로그램마다 이러한 상이한 위치의 차이가 생기는 것은 아마도 파라미터의 지정문제와 내부 검색 알고리즘의 미묘한 차이에서 기인한다고 볼 수 있을 것이다. 즉, 각 프로그램별로 기본적으로 주어진 파라미터의 종류에 다소 차이가 있고, 동일한 파라미터라고 하더라도 지정할 수 있는 수치의 단위나 간격의 차이가 있었기 때문에 이러한 결과가 나오게 된 것이라 여겨진다. 그렇지만 이러한 결과가 유의하다고 생각되는 것은 CpGi를 통하여 검색된 CpG island의 위치가 동일하게 두 개의 CpG island를 찾아낸 CpG Island Searcher의 결과와 비교해 봤을 때 거의 비슷한 곳에 위치하고 있었고, 한 개의 CpG island를 검색해 낸 Emboss-CpGPlot의 분석 결과의 도표를 잘 분석해 보면 CpG Island Searcher와 CpGi에서 검색된 첫 번째 CpG island의 Obs(CpG)/Exp(CpG) 및 GC% 등의 파라미터 값들과 유사한 값을 갖고 있다는 것을 발견할 수 있었다. 다른 두 프로그램이 검색한 하나의 CpG island를 Emboss-CpGPlot가 제대로 검색하지 못했던 것은 앞서 언급한 바와 같이 사용자가 지정할 수 없는 분석 시스템 내부 파라미터의 적용 방식에 다소 차이가 있었기 때문에 CpG Island Searcher나 CpGi에 서는 유효하다고 여겨진 CpG island 영역이 Emboss-CpGPlot에서는 유효하다고 판단되는 임계값(threshold)에 도달할 수 없었던 것으로 이해할 수 있다.</p> <p>서론에서 언급한 것처럼 CpG island 메틸화는 분자 진단 및 암의 조기 진단에 활용될 가능성이 매우 높으며, 유전자의 변이보다는 후성학적 변이를 정상화시키는 것이 더 쉬울 것이라는 점에서 암의 치료적인 측면에서도 응용 가능성이 높다고 할 수 있다. 특히 메틸화 여부 혹은 그 양상의 차이 등은 같은 암을 가진 환자들에게서 예후를 짐작할 수 있게 하거나 항암제에 대한 반응 등을 예측하는데 사용될 수도 있을 것이다. 즉, 현재로써는 수많은 CpG island와 그와 관련되어 있는 메틸화 중에서 임상적으로 유용한 것들을 탐색하는 단계에 있지만 머지않은 장래에는 DNA 메틸화 표지가 암 위험도 측정, 조기 진단, 암 조직에 대한 분자 진단, 항암 치료 효과 예측, 재발 감시 등에 광범위하게 응용 될 수 있을 것이다. 전산학적 측면에서 볼 때 대규모 유전체 프로젝트로 말미암아 쏟아지는 DNA 서열 데이터에 대한 기본적인 분석 및 주석 작업이 필수적이며, 이러한 작업에는 기본적으로 프로모터 예측 및 유전자 예측이 필수적으로 포함된다. 대부분의 CpG island들은 유전자 발현을 제어하는 프로모터 부위 에 위치하고 있기 때문에 CpG island를 정확히 검색해 낼 수 있다면, 프로모터의 위치나 유전자의 시작지점 등에 대한 중요한 단서를 찾을 수 있을 것이다. 이러한 맥락에서 순수한 CpG island 연구뿐만 아니라 대규모 서열 데이터 분석 차원에서 정확한 CpG island를 검색할 수 있는 프로그램이 요구되고 있는 실정이다. 이에 따라 서버와 클라이언트 환경의 웹기반 프로그램이 아닌 윈도우 운영체제의 개인용 컴퓨터 상에서 구동될 수 있는 CpG island 검색용 윈도우 프로그램을 개발하게 되었다. 프로그램의 개발 도구로는 Visual C + + 6.0을 사용하였고, 검색 알고리즘은 Takai와 Jones가 제시한 기준을 기반으로 개발되었다. CpGi의 검색 결과에 대한 객관적 판단을 위해 22번 염색체의 AP00524와 21번 염색체의 NT_029490.3를 이용하여 CpG Island Searcher와 Emboss-CpGPlot에서 도출된 분석결과와 비교 분석해 보았다 앞에서 보았듯이, CpGi에 의한 검색 결과는 다른 두 프로그램에 비해 같거나 오히려 보다 정확한 검색 결과를 보여주었다. Emboss-CpGPlot와 CpG Island Searcher의 대부분의 파라미터 값들은 사용자들이 이미 고정적으로 제공된 라디오버튼 형태의 파라미터 값을 선택하는 방식으로 되어 있으나, CpGi의 경우 기본 값들은 Takai와 Jones의 기준에 의해 지정되어 있으면서도 편집박스 형태로 사용자가 임의의 값을 마음대로 지정해 줄 수 있어 보다 정교한 맞춤형 분석이 가능하다는 것이 큰 장점 중의 하나이다. 게다가, 기존 웹 기반 분석 프로그램들의 취약점인 그래픽 인터페이스의 강화로 사용자들이 보다 쉽게 이용할 수 있고, 분석 결과에 대한 이 해를 보다 용이하게 할 수 있다는 것도 중요한 의의로 부각 될 수 있다.</p>	생명
당근 펠렛종자의 건조방법 및 저장조건이 발아성에 미치는 영향	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>펠렛 후 건조온도 및 건조시간에 따른 건조율 변화</h2><p>펠렛 종자의 제조는 종자표면에 펠렛 피복재료와 접착제를 연속적으로 분무함으로써 이투어진다. 펠렛 제조 과정중 분무된 접착제를 종자와 파복재료틀이 홉수하여 생체중이 증가하게 되는데, 장기간 저장을 위해서는 펠렛전의 함수율로 수분을 탈수시키는 건조과정이 필요하다.</p><p>펠렛을 제조하기 전 피복재료(talc+ calcium carbonate \( 1: 1 \) \( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 함수율은 \( 4.9 \% \) (FW basis)였으나, 펠렛을 제조하는 과정 중 피복재료들이 접착제를 흡수하여 펠렛종자의 함수율은 \(24\%\)로 증가하였다. 이틀 종자를 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(35^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 통풍 건조시키면 3시간 이내에 수분이 탈수되어 펠렛전의 함수율과 동일한 \( 5 \% \) 수준으로 건조되었다.</p><p>건조속도는 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가장 빨랐으며, 1시간 건조 후에는 처리전의 함수율로 건조되었다. 그러나 건조 3시간 후부터는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 의 두 온도 간 건조율에는 큰 차이가 없었다. 반면 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 펠렛종자를 건조시키면 건조속도가 완만하여 4일 후에도 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 보다 함수율이 \( 2.0 \% \) 높았다.</p><p>산업화를 위한 대량 건조 시에 적용될 수 있는 적정 건조조건은 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 건조였는데, 처리전의 함수율로 건조되었을 뿐 아니라 급속 건조 시에 발생될 수 있는 펠렛층의 균열 현상도 관찰되지 않았다.</p><h2>펠렛 후 건조온도 및 건조기간에 따른 발아율 변화</h2><p>펠렛공정은 종자와 펠렛 피복재료 간 응집력을 높이기 위해서 접착제를 연속적으로 분사하면서 펠렛종자를 생산한다. 이와 같이 분무된 수용성 접착제는 종자와 펠렛 피복물질이 흡수하여 생체중이 증가하게 되는데, 장기간 저장을 하기 위해서는 펠렛 전의 함수율로 탈수시키는 과정이 필요하다. 또한 건조된 펠렛종자는 취급하기가 쉽다. 따라서 펠렛종자가 산업화되기 위해서는 펠렛 후 종자활력을 저하시키기 않으면서 건조효율을 높일 수 있는 경제적인 건조방법이 확립되어야만 한다.</p><p>펠렛종자의 발아율은 펠렛 후 건조시간 및 건조온도에 의해 큰 영향은 받지 않았다. 펠렛하지 않은 무처리 종자는 발아온도에 관계없이 \( 80 \% \) 이상 발아하였고, 펠렛종자도 \( 80 \% \) 전후의 발아율을 보여 펠렛처리를 하더라도 발아율이 감소되지 않았다. 그러나 펠렛종자를 제조한 후 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 96시간 건조시키면 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 나 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 건조에 비해 발아율이 약간 감소되는 경향이나 통계적인 차이는 인정되지 않았다.</p><p>펠렛제조하지 않은 종자는 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( \mathrm{T}_{50} \) (최종발아율에 대한 \( 50 \% \) 발아에 소요되는 일수)이 각각 3.8일 및 3.2일이 소요되었으나, 당근 종자를 펠렛하면 발아속도가 약 3일 정도 지연되었다.</p><p>발아속도는 건조온도와 건조기간의 단독요인 및 이들 요인상호간의 유의성은 인정되지 않았다. 그러나 펠렛종자를 3시간 건조한 후 건조온도 간 발아속도에는 큰 차이가 없었으나, 그 후 건조시간이 경과되면 발아속도가 약간 지연되었다. 이러한 경향은 고온인 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 뚜렷하게 나타났다. 반면 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 건조시킨 펠렛종자는 펠렛 전의 함수율로 건조되었고, 발아율과 발아속도도 펠렛 직후에 비해 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 펠렛 후 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 급속 건조하여도 종자활력이 저하되지 않아 산업화를 위한 대량 처리 시 건조비용을 절감시킬 수 있는 경제적 온도로 판단된다.</p><p>펠렛된 당근종자는 무처리 종자에 비하여 발아속도가 지연되었는데, Kang은 펠렛피복 물질이 종피에 부착되어 산소와 수분 투과성을 제한했기 때문이라고 하였다. 따라서 당근펠렛 종자에서도 무처리 종자와 동일한 발아속도를 보유하기 위해서는 종자활력을 증진시킬 수 있는 종자처리를 가한 후 펠렛하는 것이 좋을 것으로 판단되었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>공시품종 및 펠렛종자 제조</h2><p>본 실험에 사용된 공시된 당근 종자는 '추홍' [노바티스( 주)] 이였다. 펠렛종자의 개조방법은 회전드럼식의 펠렛제조기(대림하이텍사, 수원)에 \( 100 \mathrm{~g} \)의 종자를 넣은 후 접착제를 분무하고 이어서 talc+calcium carbonate\( (1: 1 \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 피복재료를 소량씩 투입하면서 펠렛링하였다. 펠렛종자의 제조 과정 중 접착제 분무는 펠렛 초기단계에는 \( 0.5 \% \) PVA (polyvinyl alcohol) 수용액을 증간단계에는 \( 1.0 \% \) 수용액을 펠렛 완성단계에는 \( 2.0 \% \)\( (\mathrm{W} / \mathrm{V}) \) 수용액을 분무하였다. 펠렛 제조기의 회전 속도는 펠렛제조의 초기에는 \( 60^{\sim} 70 \mathrm{rpm} \), 중간단계에는 \(100 \sim 150 \mathrm{rpm} \), 펠렛 완성단계에는 \( 400^{\sim} 500 \mathrm{rpm} \) 으로 조절하였다. 펠렛종자의 완성단계에는 경도를 강화하기 위하여 열풍기를 이용하여 2분간 건조시켰다.</p><h2>펠렛 후 건조온도와 건조시간에 따른 건조율</h2><p>펠렛 후 건조온도와 건조기간이 펠렛종자의 건조율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 35^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 각각 1 ,1.5,3,6,8,10,12,24,48,72,96시간 건조하여 종자함수율을 측정하였다. 종자함수율 측정은 ISTA rule의 고온항온건조 방법에 따라 \( 130^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 건조시킨 후 측정하였고 단위생 체중으로 산출하였다.</p><h2>펠렛 후 건조온도와 건조시간에 따른 발아율</h2><p>산업화를 위한 대량처리시 건조비용을 절감할 수 있는 적정 건조온도를 확립하기 위하여 펠렛종자를 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 35^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3,6,12,24,48,72 및 96시간 건조하여 발아율과 \( 50.0 \% \) 발아에 소요되는 일수 \( \left(T_{50}\right) \) 를 조사하였다.</p><h2>펠렛종자의 저장성</h2><p>펠렛종자의 저장성 조사는 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 와 상온에서 1,2,3 및 4개월 저장하여 발아력을 비교하였다. 이를 위하여 펠렛 후 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 3시간 음건하여 펠렛종자의 함수율을 \( 5 \% \)로 조절한 후 플라스틱 용기에(내경 \( 40 \mathrm{~mm} \times \) 높이 \( 130 \mathrm{~mm} \) ) 넣고 완전 밀봉하여 각각의 건조온도와 건조기간에서 저장한 종자를 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온기에서 발아력을 비교하였다. 발아시험은 직경 \( 9 \mathrm{~cm} \)의 petridish에 흡습지(Whattman No. 2) 2장을 깔고 100립의 종자를 3반복으로 치상한 후 \( 5 \mathrm{ml} \) 의 증류수를 가하여 \( 20 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기의 암조건에서 실시하였다. 발아조사는 종자를 치상한 후 18일까지 12시간 간격으로 조사하였다.</p><h2>펠렛 저장종자의 묘출현율과 초기생율</h2><p>펠렛 후 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 음건하여 펠렛종자의 함수율을 \( 5 \% \)로 조절한 후 플라스틱 용기에(내경 \( 40 \mathrm{~mm} \times \) 높이 \( 130 \mathrm{~mm} \) ) 넣고 완전 밀봉하여 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)와 상온에서 1,2,3 및 4개월 저장된 펠렛종자의 묘출현율과 초기생욱을 비교하였다. 이를 위해 50공의 플러그 트레이에 상토를 충진(식물세계, 농우그런텍)한 후 펠렛종자를 파종하였다. 파종 후 20일까지 1일 간격으로 묘출현율 조사하였으며, 자엽이 지상으로 전개한 것을 출현한 것으로 간주하였다. 생육조사는 파종 후 35일간 생육시킨 당근유표를 반복 당 10개체씩 채취하여 건물중을 조사하였다. 건물중은 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 72시간 건조시킨 후 측정하였다.</p> <h2>펠렛종자의 저장성</h2><p>펠렛종자는 건조와 과습상태 등 다양한 발아환경에서도 높은 발아력을 유지하여야만 실용화가 가능하다. 그러나 펠렛종자의 발아력은 저장방법과 저장온도에 따라 달라질 수 있다.</p><p>펠렛종자의 발아율은 저장기간과 저장온도에 따라 큰 영향을 받았다. 펠렛종자는 펠렛되지 않은 무처리 종자보다 대체적으로 발아율이 낮았다. 그러나 저장온도에 따라서도 저장수명이 달랐는데, 실온저장은 종자활력이 급격하게 상실되었으나, \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 저장이 실온저장보다 퇴화속도가 완만하였다. 저장기간이 경과할수톡 펠렛종자와 무처리 종자 모두 발아율이 감소하였는데, 실온에서 4개월 저장된 펠렛종자는 저장직전에 비해 \( 10.9 \% \), 무처리는 종자에서는 \( 16.7 \% \) 발아율이 감소되는 결과를 보였다.</p><p>\( \mathrm{T}_{50} \) 과 MDG(평균발아소요일수)도 저장기간, 저장온도 종자처리의 각각의 요인간 유의성을 보였다. 무처리 종자는 4개월 저장하여도 발아율이 감소할 뿐 발아속도에는 큰 차이가 없었으나, 펠렛종자는 저장기간이 경과하면 발아속도가 지연되었는데, 이러한 현상은 실온 저장한 펠렛종자에서 뚜렷하였다. 또한 \( \mathrm{T}_{50} \) 은 동일 저장기간의 무처리 종자에 비하여 \( 2 \sim 4 \)일 정도 지연되었으며, MDG도 \( 1.5^{\sim} 4.2 \)일 지연되었다.</p><p>저장온도는 저장기간과 더불어 펠렛 종자의 활력을 결정하는 중요한 요인이다. 펠렛종자는 적정 저장조건에서는 종자활력이 4개월까지 유지되지만, 불량저장조건에서 저장기간이 길어지면 무처리에 비해 퇴화가 급속하게 진행되어 발아율은 감소되었고, 발아속도는 지연되었다.</p><p>저장기간별 발아율과 발아속도는 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 저장이 실온저장보다 높은 발아율을 보였고, 조기 발아하였다. 따라서 펠렛종자의 활력을 유지시킬 수 있는 적정 저장온도는 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 였다.</p><p>실온저장에서 종자퇴화가 급속하게 상실된 원인은 과다한 호흡에 의해 발아 에너지원으로 이용될 수 있는 저장양분의 소모에 의한 것으로 집약된다.</p><h2>펠렛 저장종자의 묘출현율과 초기생육에 미치는 영향</h2><p>펠렛종자를 이용하면 기계화 파종이 가능하여 파종노력과 모솎음 작업을 절감할 수 있다. 펠렛제조 후 저장온도와 저장 간을 달리하여 포장조건하에서 묘출현을 조사하였다. 저장전의 펠렛종자의 묘출현은 \( 80 \% \)였고, 무처리 종자의 묘출현율은 \( 85 \% \)였다. 또한 묘출현속도 개념인 \( \mathrm{E}_{50} \) 은 펠렛종자는 8.2일 이었고, 펠렛제조하지 않은 무처리 종자는 6.1일로 펠렛종자는 무처리에 비해 \( E_{50} \) 이 2일 정도 지연되었다. 펠렛종자를 저장하면 묘출현이 약간씩 저하되었는데, 특히 실온에서 4개월 저장된 펠렛종자는 출현율이 \( 66 \% \)로 저장전의 펠렛종자에 비해 \( 14 \% \)의 묘출현율이 감소되었다. 그러나 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)에 저장된 펠렛종자는 저장전에 비해 묘출현율이 \( 6 \% \)정도 저하되었다.</p><p>무처리 종자는 4개월 저장하여도 묘출현울이 감소하고 묘출현 속도는 지연되는 경향이지만 펠렛종자에 비해서는 그 차이가 크지 않았다. 저장온도와 저장기간에 따라 약간의 차이는 있으나 펠렛종자는 동일한 저장조건의 무처리 종자에 비해 묘출현속도가 약 2일 정도 늦었다.</p><p>일반적으로 포장상태의 발아환경은 수분상태, 온도 등이 불량조건에 노출되는 경우가 많다. 따라서 불량환경조건에서도 높은 발아력을 지닌 펠렛종자의 생산은 필연적이다.</p><p>\( 5^{\circ} \mathrm{C} \)에 4개월간 저장된 펠렛종자는 묘출현속도가 무처리에 비해 약 2일 정도 지연될 뿐 나종자와 묘출현율 차이가 크지 않았다.</p><p>당근 종자를 펠렛하여 저장기간을 달리한 당근종자를 파종하여 35일간 생육시킨 후 초기 생육을 조사하였다. 펠렛종자는 무처리에 비해 건물중에는 큰 차이가 없었다. 그러나 실온에서 4개월 저장된 펠렛종자를 파종하여 35일간 생육시킨 묘들은 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 저장된 것에 비해 유묘의 건물중이 낮았다.</p><p>따라서 실온에서 저장된 펠렛종자는 실내의 발아뿐만 아니라 포장조건에도 묘출현 감소와 초기생육의 약화로 나타났다. 이에 반해 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 에 저장된 펠렛종자는 무처리와 동등한 초기생육을 보였다.</p><p>펠렛종자의 유용성은 크기와 형태가 불균일한 당근종자를 기계화 파종에 용이하도록 가공처리한 것이므로 묘출현과 초기 생육이 약화될 수 있는 단점이 나타날 수 있으나, 본 연구에서 는 이러한 결함이 크게 나타나지 않아 노력절감형 당근재배법 확립에 유용하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>당근은 이식을 꺼리는 특수성으로 인하여 육묘를 거치지 않고 직파되는 것이 대부분이다. 그리고 현행종자를 손으로 하는 파종은 정밀파종이 어렵고, 종자량이 과다하게 소요되어 종자비 지출 및 육묘관리비 상승 등 농가소특의 저해요인으로 되고 있다. 이는 곧 외국의 코팅종자의 수입을 초래하는 원인으로 지적되고 있다.</p><p>농산물의 수입개방화에 대응하여 국제 경쟁력을 갖춘 고품질, 고부가가치 농산물을 생산하기 위해서는 작물재배 환경을 적극적으로 조절할 수 있는 기술집약적, 자본집약적 및 노동 절약형 재배법 확립이 절실히 요구된다. 경제성이 있는 원예 작물은 적절한 유묘관리가 필요하며, 특히 미세종자틈은 크기가 불균일하여 기계화 파종이 어협다. 이러한 문게점을 해결 하기 위한 방편으로 미국이나 유럽에서는 발아 장해를 유발하지 않는 피복재료를 종자표면에 부가하여 종자 크기를 인위적 으로 증가시킨 펠렛종자가 산업화되고 있다.</p><p>펠렛종자는 그 용도에 따라 정밀파종, 불량환경 경감, 묘출현 및 생장 촉진 등으로 구별된다.</p><p>이러한 유용한 장점을 지닌 펠렛종자는 토양의 발아 미세환경을 개선시킬 수 있는 경게적인 처리법으로 인식되어 선진 외국에서는 많은 연구가 있어 왔다. 우리나라에서도 산업화가 진행됨에 따라 농촌의 노동력이 부즉하게 되었고, 노동 임금이 상승하고 있어 파종의 생력화가 절실하다.</p><p>당근종자는 크기가 작고 형태가 균일하지 읺아 기계화 파종이 어협다. 따라서 펠텟종자를 이용하여 파종작업을 기계화한다면 육묘단가를 현저하게 절감할 수 있을 것이다.</p><p>지금까지의 종자펠렛에 관한 연구는 피복재료와 접착제의 탐색 등에 국한되어 왔고 펠렛 후 건조방법을 구명한 연구는 없었다 펠렛 후 건조조건은 펠렛종자의 활력에도 관여하며 고온건조는 건조효율은 높일 수 있으나 펠렛층이 균열될 수 있다 반면 저온건조는 건조속도가 느려 산업화를 위한 대량처리 시 건조비용을 가중시키는 요인이다 따라서 펠렛종자의 활력을 저하시키지 않으면서 건조효율을 높일 수 있는 건조방법을 확립하는 것이 중요하다.</p><p>펠렛종자를 제조한 후 즉시 파종하는 경우도 있으나 산업화로 연결되기 위해서는 일정기간의 저장이 필요하다 펠렛종자의 저장수명은 저장기간과 저장온도 종자함수율 및 펠렛과정중의 기계적인 손상 등에 의해 영향을 받는다 펠렛종자는 종자를 피복하고 있는 펠렛물질에 의해 호흡율이 낮아 저장수명이 향상될 수 있으나 발아율 감소와 발아지연 등의 불리한 면도 나타날 수 있다 따라서 펠렛종자의 활력을 장기간 지속시킬 수 있는 저장조건이 확립되어야 할 것이다.</p><p>따라서 본 연구는 산업화를 위한 대량 처리 시 당근 펠렛종자의 물리성을 유지시킬 수 있는 적정 건조조건을 확립하며, 아울러 펠렛종자의 종자의 활력을 유지시킬 수 있는 적정 저장조건을 구명하기 위해 수행되었다.</p>	생명
홍국발효홍삼의 이화학적 특성 및 생리활성	<h2>홍삼 및 흥국발효홍삼 분말의 총 당도</h2> <p>홍삼 및 홍국발효홍삼 분말의 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))수용액 중의 총 당도는 각각 \( 0.23 \% \)및 \( 0.17 \% \)로 홍삼에서 약간 높았다. 이를 \( 100 \% \)로 환산하면 각각 \( 23 \% \)및 \( 17 \% \)로 Kim 이 보고한 건삼의 총당 함량이 \( 18.9 \% \)라고 한 결과와 비슷하며, \( \mathrm { Kim } \)등이 건삼의 전분 함량이 5년근에서 \( 18.3 \% \)라고 하여본 실험 결과와도 비슷하였다. 총 당 함량은 수삼에는 \( 5.7 \), \( 6.5 \% \), 유리당 함량은 건삼에 \( 2.2 \% \)및 수삼에 \( 0.52 \% \), 환원당은 건삼에 \( 3.9 \% \)및 수삼에 \( 1.28 \% \)를 나타내었고, \( 70 \% \)에탄올로 추출할 때에 환원당은 수삼에 \( 7.8 \% \), 건삼에 \( 12.8 \% \), 미삼에 \( 9.1 \% \)를 함유하고 있었다. 또한 \( 80 \% \)에탄올 추출물에서 총 당은 \( 11.5 \% \)로 starch \( 3.9 \% \), sucrose \( 3.8 \% \), maltose \( 3.5 \% \), fructose \( 0.1 \% \), glucose \( 0.04 \% \)로 분석되었다.</p> <h2>홍삼 및 흥국발효홍삼 분말 추출물의 pH 및 산도</h2> <p>홍삼 및 홍국발효홍삼의 분말을 \( 1 \% \)(w/v)농도로 증류수에 넣은 다음 균질화 시켜 \( \mathrm { pH } \)값을 측정한 결과, 흥삼 추출물은 \( \mathrm { pH } 5.7 \)및 홍국발효홍삼 추출물의 \( \mathrm { pH } \)는 5.6으로 두 시료간에 큰 차이는 없는 것으로 나타났다. Cho 등 도 인삼추출물의 \( \mathrm { pH } \)를 측정한 결과에서 미삼 \( \mathrm { pH } 5.9 \), 백삼 \( \mathrm { pH } 6.0 \), 수삼 \( \mathrm { pH } 5.9 \)의 약산성을 띄는 암갈색의 액체로 본 실험 결과와 비슷하였다. Lee 등도 홍삼근(30지)와 홍삼미를 \( 2: 1 \)비율로 혼합하여 생수로 원물중량 대비 18.6배를 가하여 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24,48 , 및 72시간 추출 한 후 \( \mathrm { pH } \)를 측정한 값이 각각 5.0,4.9 및 4.7로 본 실험 결과와는 약간 낮지만 약산성으로 나타났다.</p> <p>Lee 등은 우리나라 홍삼 제품의 \( \mathrm { Ca } \)함량은 \(3,787-4,651 \mathrm { ppm } \)이였고, 일본 제품의 경우는 \(4,020-4,790 \mathrm { ppm } \) 함유되었다 고 하였다. Ko 등이 보고한 분석결과를 보면 한국홍삼 제품에서 \( \mathrm { Ca } \)은 \( 0.31 \% \), 중국 홍삼 \( 0.37 \% \), 일본 홍삼 \( 0.29 \% \)및 한국 백삼 \( 0.34 \% \)로 재배국가에 따라 큰 차이가 나지 않았으며, 본 실험 결과와 대체로 일치하는 경향을 보였다. \( \mathrm { Zn } \)성분의 경우 국내산 홍삼에서 \( 15.37-19.15 \mathrm { ppm } \), 북한산은 \( 13.52-19.88 \mathrm { ppm } \), 중국 제품은 \(13.66-19.08 \mathrm { ppm } \), 일본 제품은 \( 18.60-24.57 \mathrm { ppm } \)이 함유되었다고 Lee 등이 보고하였고, Ko 등도 국내산 홍삼 \( 18.96 \mathrm { ppm } \), 중국산 홍삼 \( 20.19 \mathrm { ppm } \), 일본산 홍삼 \( 18.10 \) \( \mathrm { ppm } \)및 국내산 백삼 \( 19.61 \mathrm { ppm } \)으로 \( 18.1-20.2 \mathrm { ppm } \)범위 내에서 함유되었다고 하였고, Cho 등은 미삼에서 \( 47.5 \mathrm { ppm } \)함유되었다고 보고하였다. Fe의 경우 Ko 등은 국내산 홍삼 \( 89.02 \mathrm { ppm } \), 중국산 홍삼 \( 45.14 \mathrm { ppm } \), 일본산 홍삼 \( 35.70 \mathrm { ppm } \ 및 국내산 백삼 \( 98.04 \mathrm { ppm } \)으로 국가간 함량 차이가 나는 것으로 보고하였으며, Lee 등은 102.4-142.9 ppm이라고 하였고, Cho 등은 미삼에 \( 125 \mathrm { ppm } \)이 함유되어 있어 다소 차이가 있었으나 본 실험 결과도 이들 범위에 들어가는 것으로 나타났다. 홍삼에 함유된 미네랄 성분은 \( \mathrm { P } \), \( \mathrm { K } \), \( \mathrm { Ca } \), \( \mathrm { Mg } \), \( \mathrm { Si } \), \( \mathrm { Mn } \), \( \mathrm { Na } \), \( \mathrm { Fe } \), \( \mathrm { Cu } \), \( \mathrm { Zn } \)등 일반적으로 식물체에 함유된 미네랄 성분들이 함유된 것으로 보고 되었으며, 본 실험에서도 홍삼과 홍국 발호홍삼의 경우도 이들과 비슷하였으며, 홍국발효홍삼 보다는 대체로 홍삼분말에서 미네랄 성분이 많이 함유된 것으로 나타났다. 이러한 이유는 홍삼을 발효함으로 인해 홍국균의 생육에 미네랄 성분이 어느 정도 소비되었을 것으로 추측되며, 또한 홍국균이 생육하여 함유된 것만큼 홍삼이 적은 비율로 포함되어 있어 홍삼에 함유된 미네랄 성분이 적은 것으로 사료되어 진다. 이처럼 홍삼에서 미네랄 성분 중 \( \mathrm { Ca } \)함량이 높은 것은 인슐린 분비와 작용에 필수적인 역할을 하는 점을 감안하면 홍삼의 주요 효능으로 알려진 당뇨병 치료와 무관하지 않으며, \( \mathrm { K } \)함량이 높은 것 또한 식염의 과다섭취로 인한 피해를 막아주어 혈압을 강하시키는 고혈압 치료제로 알려진 것과 무관하지 않는 것으로 사료되어 진다.</p> <h2>홍삼 및 흥국발효홍삼 분말의 색도(Color)</h2> <p>홍삼 및 홍국발효홍삼 추출물의 색도를 Hunter's value \( L ^ { * } \) (명도), \( \mathrm { a } ^ { * } \left ( \right . \) 적색도), \( \mathrm { b } ^ { * } \) (황색도) 값으로 나타낸 결과는 Table 3과 같다. 이러한 색도의 차이는 붉은 색소를 만들어내는 홍국에 의한 것으로 보여지며, 홍국을 첨가한 고추장이나 된장의 경우도 붉은색을 많이 나타내어 본 실험결과와 동일한 결과를 나타내었다.</p> <h2>홍삼, 흥국발효홍삼 분말 추출물의 총 폴리페놀 화합물 함량</h2> <p>폴리페놀 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사 산물로서 flavonoid, catechin, tannin 류로 크게 구분된다. 특히, 페놀성 화합물들은 전자공여능이 있어 높은 항산화 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 페놀성 물질은 식물의 고유한 색을 부여하고, 떫은맛과 쓴맛의 주체로 식물성 식품의 고유한 맛에도 깊이 관여한다.</p> <p>본 실험에서 사용한 홍삼 및 홍국발효홍삼 추출물의 총 폴리페놀 화합물 함량을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 총 폴리페늘 화합물 함량은 홍삼보다 홍국발효홍삼 추출물에서 높았으며, \( 70 \% \)에탄을 추출물에서 가장 높았고 물 추출물에서 가장 낮은 값을 보였다. 두릅순의 경우도 총 폴리페놀 화합물이 물 추출물 보다는 \( 70 \% \)에탄올 및 \( 70 \% \)메탄올 추출물에서 높은 함량을 보여 본 실험 결과와 일치하는 경향을 보였다. 특히 8월에 채취한 함초의 폴리페놀 화합물 함량도 수용성 추출물보다는 에탄올 추출물에서 높은 것으로 보고 되었다.</p> <p>국내산 식물성 천연물 중의 총 폴리페놀 화합물 함량을 분석한 결과를 보면 솔잎 \( 1.6 \%-1.8 \% \), 뽕잎 \( 1.3 \% \)및 꾸지뽕잎 \( 1.3 \% \), 칡뿌리 \( 2.0 \% \), 호두 \( 2.1 \% \), 해바라기씨 \( 2.0 \% \), 상추 \( 1.1 \% \), 쑥 \( 1.1 \% \), 생강 \( 1.7 \% \), 모과 \( 4.6 \% \), 밤 속껍질 및 감잎 \( 5.8 \% \)등 에서 비교적 높은 농도로 조사 되었으나 나머지 분석대상에서는 낮은 농도로 조사되었다. Kim 등은 미국 백삼으로부터 30, 60, 90 및 120 분의 열처리 시간을 달리하면서 제조한 홍삼의 총 phenolics의 농도는 각각 489.6,518.5,532.1및 574.2 \( \mathrm { mg } / 100 \mathrm { ~g } \)으로 얼처리 시간 증가와 함께 phenolics의 증가가 있었으며, 120분 열처리의 경우 백삼의 \( 445.5 \mathrm { mg } / 100 \mathrm { ~g } \)보다 약 \( 30 \% \)증가하는 것으로 보고 되었다. 그러나 상대적인 총 폴리페놀 함량은 미국산 홍삼보다 본 실험에 사용한 홍삼에서 더 많이 함유된 것으로 나타났다. Wang 등은 Korean red ginseng에서 total antioxidant capacity과 radical scavenging activity가 비슷한 수준인 것으로 보고되었으며, 미국산 홍삼에서 항산화 활성 증가는 Maillard 반응 생성물 인 것으로 여겨지는데, 인삼의 열처리 과정 중에 이러한 물질 중의 하나인 maltol이 생성되는 phenolic compounds가 풍부하면서 강한 free radical scavenging 활성을 가진 것으로 보고 된 적이 있다.</p> <h2>홍삼 및 홍국발효홍삼 분말 추출물의 불포화 지방산 Linoleic acid 산화 실험계를 이용한 항산화 활성</h2> <p>불포화 지방산인 linoleic acid를 이용한 thiocyanate 방법으로 홍삼 및 홍국발효홍삼 추출물의 항산화 활성을 측정한 결과를 Fig. 2와 3에 각각 나타내었다. 반응 최종일 대조군에 대한 생대 활성으로 나타낸 결과는 홍삼의 70% 메탄올 추출물에 서 가장 저해 활성이 높았고, 홍국발효홍삼에서는 \( 70 \% \)에탄올 추출물에서 가장 높았으나 두 시료간에 큰 차이는 없었고 약 \( 40 \% \) 이하의 활성을 보였다. 이들에 비해 대조구로 사용된 시판 합성 항산화제인 BHT는 \( 63 \% \)정도의 비교적 높은 항산화 활성을 보였다. Choi 등 및 Chang 등도 식품으로 사용 되어 그 안전성이 확인된 각종 식물 및 약재를 에탄올과 물로 추출하여 항산화력을 검색한 결과, 에탄을 추출물이 물 추출물 보다 항산화 효과가 강하고 추출 수율도 높았다고 하였다.</p> <p>불포화 지방산인 linoleic acid를 이용한 TBA법으로 항산화 활성을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. TBA법으로 불포화 지방산인 linoleic acid의 산화 반응을 측정한 결과에서는 thiocyanate 방법으로 측정한 결과와 상당히 유사한 결과를 보였으나, 단지 홍국발효홍삼 메탄올 추출물에서 에탄을 추출물 보다 약간 낮은 값을 보였을 뿐이다. 이때 대조구로 사용된 시판 합성 항산화제인 BHT는 \( 70 \% \)정도의 높은 항산화 활성을 보였다.</p> <h1>요 약</h1> <p>홍국발효홍삼의 알코올성 간 질환 개선용 건강기능식품 개발을 위한 기초 자료를 얻기 위하여 일반 이화학적 특성과 항산화 활성 정도를 측정 하였다. 홍삼 및 홍국발효흥삼의 추출물 수율은 각각 수용성 \( 5.83 \% \)및 \( 6.58 \% \), \(70 \% \)에탄올 \( 0.98 \% \)및 \( 0.62 \% \), \(70 \% \)메탄올 \( 3.04 \% \)및 \( 1.27 \% \)로 수용성 추출에서 가장 높았다. 홍삼 및 홍국발효홍삼 \( 1 \% \)추출물 중의 총 당도는 각각 \( 0.23 \% \)및 \( 0.17 \% \)로 홍삼에서 약간 높았으며, 가용성 고형분도 각각 \( 0.6 \)및 \( 0.5 \)Brix로 홍삼에서 약간 높았다. 총 폴리페놀 화합물 함량은 홍삼보다 홍국발효홍삼 추출물에서 높았으 며, \( 70 \% \)에탄올 추출물에서 가장 높았다. 미네랄 함량은 K가 22,386 및 \( 16,936 \mathrm { ppm } \)으로 가장 많이 함유되어 있었고, 다음으로 \( \mathrm { Ca } \)이 각각 3,693 및 \( 2,310 \mathrm { ppm } \)으로 함유되어 있었고, \( \mathrm { Mg } \)는 각각 2,647 및 \( 2,703 \mathrm { ppm } \), \( \mathrm { Na } \)는 각각 103 및 \( 109 \mathrm { ppm } , \mathrm { Fe } \)는 각각 115 및 \( 42 \mathrm { ppm } , \mathrm { Zn } \)은 각각 57 및 \( 62.3 \mathrm { ppm } \)이 함유되어 있었다. 항산화 실험에서 총 폴리페놀 함량, DPPH radical 소거능 및 불포화 지방산 linoleic acid를 이용한 TBA법에 의한 항산화 활성은 홍삼 추출물보다는 홍국발효홍삼에서 높은 것으로 나타났다.</p> <h2>TBA (2-thiobarbituric acid)에 의한 항산화 활성 측정</h2> <p>시료용액 \( 1.0 \mathrm { ml } \), linoleic acid ( \( 25 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \), EtOH 용해) \( 1.0 \) \( \mathrm { ml } \)을 시험관에 넣고 혼합한 후 \( 0.2 \mathrm { M } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 7.0) \( 2 \mathrm { ml } \)와 증류수 \( 1.0 \mathrm { ml } \)를 가하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 반응시키면서 일정간격으로 측정하였다. 즉 시료액 \( 0.5 \mathrm { ml } \)를 centrifuge tube에 넣고 35 \% trichloroacetic acid \( 0.25 \mathrm { ml } \)와 \( 0.75 \% \)aqueous TBA \( 0.5 \mathrm { ml } \)를 가하여 혼합한 후, 열탕수조에서 가끔 진탕하면서 15분간 처리하여 흐르는 물에 냉각시킨 후, \( 70 \% \)trichloroacetic acid \( 0.5 \mathrm { ml } \)를 가한 다음 20분 후, \( 3,000 \mathrm { rpm } \)에서 15분간 원심분리하고, 그 상징액을 \( 532 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정 하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean \( \pm \mathrm { SE } ) \)로 표시하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>홍삼 및 흥국발효홍삼 분말의 추출 수율 및 가용성 고형분</h2> <p>천연물로부터 생리활성물질과 같은 유효성분을 가장 효율적으로 추출하기 위하여 사용량, 추출 용매의 종류, 추출 온도와 시간 등이 검토되고 있다. 천연물 중에는 catechins, pectin, caffein, flavonoids 등의 식물성 polyphenolic 화합물들은 수용성 또는 지용성으로 구분되어 있어 추출되는 용매에 따라 그 성분들이 달라지기 때문에 추출 수율에 있어서도 많은 차이를 보이고 있다.</p> <p>본 실험에서 홍삼 및 홍국발효훙삼의 수용성 추출물의 수율은 각각 \( 5.83 \% \)및 \( 6.58 \% \)였으며, \( 70 \% \)에탄올 추출물 수율은 각각 \( 0.98 \% \)및 \( 0.62 \% \)였고, \( 70 \% \)메탄을 추출 수율은 각각 \( 3.04 \% \)및 \( 1.27 \% \)로 용매 중에서는 수용성 추출에서 수율이 가장 높았다. Lee 등도 인삼의 추출 용매에 따른 추출수율은 물 추출물이 가장 많고 에탄올은 농도가 높을수록 수율은 낮아지는 경향을 나타내는데, 이는 에탄올의 농도가 높을수록 성분의 추출량이 적어지며 주로 다당류의 추출량이 적어지므로 수율이 감소한다고 하였다. 홍삼 및 홍국발효홍삼의 가용성 고형분은 각각 \( 0.6 \)및 \( 0.5 \)Brix로 홍삼에서 약간 높았다.</p> <h2>홍삼 및 흥국발효홍삼 분말 추출물의 DPPH free radical에 의한 전자공여 활성</h2> <p>DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성 을 측정하는데, 이러한 DPPH법은 식물 추출물의 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 실제 항산화 활성과도 연관 성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있다.</P><P>홍삼 및 홍국발효홍삼 추출물의 DPPH radical 소거정도에 의한 항산화 활성은 Fig 에 나타내었다. 양성 대조구로 사용된 시판 합성 항산화제인 BHT \(0.1 \% \)처리에 의해서 \( 95.3 \% \)로 높은 활성을 보였다. 홍삼 및 홍국발효홍삼 추출물의 항산화 활성은 수용성, \( 70 \% \)에탄올, \( 70 \% \)메탄올 추출물 모두 홍삼 추출물 보다는 홍국발효홍삼 추출물에서 약간씩 항산화 활성 이 높은 것으로 나타났으나, 전체적으로 볼 때 \( 19.2 \% \sim 29.5 \% \)로 높은 항산화 활성은 아닌 것으로 보여 진다. 홍국발효홍삼 추출물에서 항산화 활성이 높은 것은 홍삼을 발효시킨 홍국의 영향에 의한 것으로 판단되며, 실제로 홍국 추출물에서 항산 화 활성이 보고 되고 있어 이를 뒷받침하고 있다.</p> <p>홍국을 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15일간 발효시킨 발효콩의 \( 70 \% \) 에탄올 추출물은 \( 3 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)농도에서 DPPH radical scavenging effect가 비 발효콩보다 5.2 7.4배 높다고 하였으며, 이러한 항산화 톡성은 Monascus-fermentation 동안 콩으로부터 유래된 mevinolins 및 isoflavone aglycones에 기인한다고 하였다. 그러나 Kim 등은 홍삼 수용성 추출물의 \( 0.05 \%(0.5 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \sim 20 \)농도까지 처리에 의한 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가하였으며, \( 0.05 \% \)처리에 의해 약 \( 30 \% \)정도로 본 실험결과와 유사하였으나, 이보다 높은 농도인 \( 0.1 \% \)처 에 의해서는 약 \( 60 \% \)정도의 활성을 보여 본 실험 결과와는 약간 다른 경향을 보였다.</p> <p>미국 백삼으로부터 30, 60, 90및 120분의 열처리 시간을 달리하면서 제조한 홍삼의 \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)농도 처리에서 DPPH radical scavenging activity \( \% \)는 백삼 \(59.9 \% \)에 비해 각각 \( 65.2 \%, 76.1 \%, 79.9 \% \)및 \( 88.5 \% \)로 모두 증가하였데, 이 때 총 phenolics의 농도도 백삼 \( 445.5 \mathrm { mg } / 100 \mathrm { ~g } \)에 비해 홍삼은 489.6,518.5,532.1 및 \( 574.2 \mathrm { mg } / 100 \mathrm { ~g } \)으로 열처리 시간 증가와 함께 phenolic 화합물이 증가하고, 따라서 DPPH radical scavenging activity 사이에 높은 정의 상관관계 \( \left ( \mathrm { r } ^ { 2 } =0.9991 \right ) \)가 성립되었다고 하였다. 백삼에 비해 홍삼에서 항산화 활성이 증가하는 원인으로 열처리 과정 중에 생성되는 Maillard 반응 생성물인 maltol이 지적되어 있으며, 이 maltol에는 phenolic compounds가 풍부하여 강한 free radical scavenging 활성을 가진 것으로 보고 된 바 있다. Maltol과 같은 Maillard 반응 생성물은 열처리 시간이 길어지면 그만큼 항산화 활성이 증가하는데, 한국산 홍삼, 버섯, 커피 및 과 일도 DPPH free radical scavenging 활성 증가와 함께 항산화 활성이 증가되었다고 하였다. 인삼 수용성 추출물 2 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)을 첨가하여 DPPH법으로 in vitro 항산화 활성을 측정 한 실험에서 radical scavenging 활성은 거의 없는 것으로 나타나 항산화 효과가 거의 없는 것으로 보고된 바 있다. Kim 등도 약용식물의 수용성 추출물에서 전자공여능에 의한 항산화 활성을 측정한 결과 \( 1.0 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } (0.1 \%) \)농도에서 당귀 \( 15.8 \% \), 감초 \( 13.3 \% \), 옥죽 \( 5.4 \% \)로 보고되어 시료에 따라 항산화 활성을 다르게 나타내는 경우도 있다. 이상의 결과에서 홍삼 및 홍국발효홍삼 추출물의 DPPH free radical 소거능은 추출 용매의 차이에 의해 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며, 홍국균의 발효에 의해서도 크게 항산화 활성이 증가되지는 않는 것으로 나타났다.</p> <p>본 연구에서는 이러한 홍국균을 흥삼에 접종하여 발효시킴으로서 얻어지는 홍국발효홍삼을 이용하여 간 기능 개선 등 건강보조식품을 개발할 목적으로 그 기초 자료를 얻기 위하여 홍국발효홍삼의 일반 이화학적 특성조사와 함께 생리활성작 용에 대하여 검토하였다.</p>\( \mathrm { w/v } \)<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>실험 재료인 홍삼은 6년근 수삼으로부터 증숙과 건조 과정을 거쳐 제조한 홍삼을 분쇄(MICRO-JET MILL HKJM-300, Hankook Powder System, Seoul, Korea)한 후 얻어진 홍삼분말에 전배양 시킨 홍국균(Monascus purpureus KCCM 12002)을 \( 5 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))접종시켜 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30일간 고체배양 한 후 건조시킨 분말(200 mesh)을 (주)일한인삼(금산, 충남)에서 제공 받아 사용하였다.</p> <h2>시료의 추출 및 수율 측정</h2> <p>수용성 추출물을 얻기 위하여 각각 건조된 횽삼 및 홍국발효홍삼 분말 시료 \( 100 \mathrm { ~g } \)에 10배 양의 3차 증류수를 가한 후 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)항온수조에서 3시간씩 교반하면서 3회 반복 추출하였으며, \(70 \% \)에탄올 및 \(70 \% \)메탄올 용매를 수용성 추출물과 동일한 방법으로 추출한 후 추출액을 모아 여과지(Whatman No.2, Whatman International Ltd., England)로 여과시켜 여액을 ro-tatory vacuum evaporator (Rotavapor R215, BUCHI, Switzeland)로 감압 농축하여 각각의 용매를 제거시킨 후 freeze dryer (삼원냉열 SF-DSF 12, 부산, 한국)로 동결건조하여 추출 수율을 구하였다.</p> <h2>총 당 측정</h2> <p>총 당은 phenol-sulfuric acid법으로 측정하였다. 즉, 시험관에 홍삼 및 홍국발효홍삼 분말을 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))로 증류수에 녹인 시료용액을 각각 \( 0.5 \mathrm { ml } \)씩 취하고, 동시에 표준용액을 \( 0.5 \mathrm { ml } \)씩 각각 취하여 \( 5 \% \)정제페놀수를 \( 0.5 \mathrm { ml } \)가해 잘 혼합시켰다. 여기에 농황산 \( 2.5 \mathrm { ml } \)를 가하여 발색시켜 20분 경과 후 \( 490 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 포도당의 비율로 총당 함량을 계산하였다.</p> <h2>총 폴리페놀 화합물의 함량 측정</h2> <p>총 폴리페놀 화합물의 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 것을 이용한 FolinDenis법을 약간 변형시켜 측정하였다. 즉, 홍삼 및 홍국발효홍삼 분말을 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))로 증류수에 녹인 시료용액 \( 0.5 \mathrm { ml } \)에 Folin-Ciocalteu's phenol reagent \( 2.5 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 잘 흔합하고 5분간 실온에서 방치하였다. 정확히 5분 반응시킨 후 \( 7.5 \% \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 2 \mathrm { ml } \)를 가하여 흔합하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 발색시킨 후 \( 760 \mathrm { ~nm } \)에서 홉광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물은 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 부터 함량을 구하였다. Tannic acid를 이용한 표준곡선은 tannic acid \( 1 \mathrm { mg } \)을 \( 50 \% \)메탄올 용액 \( 1 \mathrm { ml } \)에 녹이고 최종 농도가 0,50,100,150,200,300 및 \( 500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)용액이 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 \( 760 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>식생활의 서구화, 환경오염 및 일상생활 속의 스트레스로 인한 음주의 빈도가 잦아짐에 따라 지방간, 간경화, 간암, 고지혈증, 고혈압, 당뇨병, 심장병, 동맥경화증 등의 만성적 질환이 사회적인 문제로 대두되고 있다. 한편, 체내에 유입된 이질성물질(xenobiotics)로 인한 세포 내 유리기(free radical) 생성이나 산화 스트레스에 의해 생성된 생체막 과산화지질의 증가는 조직 세포에 산화적 손상을 주어 조직의 정상적인 생리적 기능을 저하시킴으로서 각종 질병의 발병 원인이 되거나 노화가 진행된다고 하는 확설이 설득력을 얻어가고 있다.<p> <p>우리가 섭취하고 있는 알코올 역시 다른 식품과는 달리 체내에 축적되지 못하는 xenobiotics의 한 종류이며, 과량의 알코올을 섭취하면 간 조직 내에서 알코올 분해산물로 생성된 아세트알데히드와 NADH가 간 세포 손상은 물른 뇌로 전해져 많은 유해화합물로 변화되어 안면홍조, 맥박증가, 오심, 구토 등의 숙취증상을 초래할 수 있다. 간 조직에서 알코올 대사는 주로 ADH와 ALDH활성에 영향을 주는 요인들에 의해 영향을 받게 된다.</p> <p>현대인의 알코올 섭취는 과음 내지는 폭음으로 인해 음주 후 숙취 해소를 위한 숙취 음료나 야물의 섭취로 이어져 이에 대한 관심 증가와 함께 관련 연구도 많이 수행되어져 왔으나 그 효과가 두드러지게 나타나는 경우는 드물다. 대부분 음주자들의 과음 또는 폭음에 따른 숙취해소는 꿀물, 복어국, 한약재 추출물 등 민간요법에 의존하고 있는데, 특히 숙취해소와 함께 예방의학적 효과를 기대할 수 있는 재료로 한약 재가 각광을 받고 있는 추세이다.인삼은 예로부터 생 약재 중에서 가장 진귀한 약제로 사용되어 왔고, 최근까지 인삼의 다양한 한방적 효능이 현대 과학적 연구를 통하여 점차 밝혀지면서 신진대사 촉진작용, 독성물질 해독작용, 간 보호 작용, 간 재생 촉진 작용, 알코올 해독 촉진작용, 고지혈증 개 선효과, 당뇨병 개선효과, 고혈압 개선효과 등이 보고되고 있다. 수삼의 증숙 및 건조로 제조된 홍삼에도 가용성 사포닌 성분과 phenolic acids에 속하는 caffeic acid, saicylic acid, ferulic acid, vanillic acid, maltol, panaxynol, diol 및 triol saponin, ginsenoside Rb1 및 Rb2, matol (2-methy-3,3-hydroxypyrone), cephaloridine, panaxadiol, panaxatriol 등이 간 조직에서 항산화 활성과 항산화 물질의 활성을 증진시키는 효과도 있음이 밝혀졌다.</p> <p>홍국(Monascus purpureus-fermented rice, Red yeast rice, Red koji)은 중국, 대만, 일본, 필리핀 등을 중심으로 동아시아 여러 지역에서 소화불량, 타박상, 이질 등의 민간약재로 사용되어 왔으며, 동시에 홍주, 홍두부 등 천연식품 착색제나 가공품의 소재로 활용되어져 홍국색소가 일본에서는 식품첨가물 로 사용되고 있다. 최근 들어 홍국균이 생산하는 monacolin K, mevinolin, lovastatin, \( \gamma \)-aminobutyric acid (GABA), acethylcholine 등에 의해 콜레스테를 저하 작용, 혈압상승 억제 작용이 밝혀져 있어 홍국의 경제적 효용가치를 시사 하는 중요한 단서가 되고 있다. 최근 mevinolin과 isoflavon 등 특정의 유효 활성성분을 증강시켜 부가가치를 높이기 위하여 홍국 발효콩을 개발하여 잠재된 복합기능성을 평가한 결과가 보고 되었다. 현재 홍국의 우수한 생리활성 효능 때문에 이를 새로운 건강기능식품 개발에 활용하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있는 가운데 홍국을 소재로 한 된장, 고추장, 발효메밀, 발효콩 등 건강지향 관련 식품이 상품화 되고 있으며, 또한 식품의약품안 전청은 높은 콜레스테롤 수치의 개선에 도움이 되는 흥국제품을 건강기능식품의 신규품목으로 지정 하게 됨으로서 시장의 활성화가 기대되고 있다.</p> <h2>DPPH법에 의한 항산화 활성 측정</h2> <p>DPPH \( \left ( \alpha, \alpha ^ {\prime } \right . \)-diphenyl- \( \beta \)-picrylhydrazyl)를 이용한 전자공여능(electron donating ability; EDA) 측정에 의한 항산화 활성은 Blois 방법에 따랐다. 즉, DPPH 용액은 \( 100 \mathrm { ml } \) 에탄올에 DPPH 16 \( \mathrm { mg } \)을 녹인 후 증류수 \( 100 \mathrm { ml } \)를 혼합하여 Whatman filter paper No. 2에 여과시켜 만들었다. 이 용액 \( 5 \mathrm { ml } \)에 일정농도 \( (0.1 \%) \)의 시료용액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 혼합한 후 실온에서 30분간 반응시킨 후 \( 528 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 이때 대조구인 BHT도 \(0.1 \% \)농도로 첨가하여 위에서와 동일한 방법으로 흡광도 감소를 측정하였다. DPPH를 이용한 전자공여능 (electron donating ability; EDA)(Blois MS. 1958)은 시료 첨가구와 무첨가구의 홉광도차를 백분율(%)로 표시하였다.</p> <p>EDA \( ( \%)= \{ 1-( \mathrm { Abs } / \mathrm { Abc } )] \times 100 \)</p> <p>Abc: Absorbance of control treatment at \( 528 \mathrm { ~nm } \)</p> <p>Abs: Absorbance of sample treatment at \( 528 \mathrm { ~nm } \)</p> <h2>Thiocyanate에 의한 항산화 활성 측정</h2> <p>Ohkawa의 방법에 따라 먼저 linoleic acid \( (25 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)in EtOH), ferrous chloride \( (2.45 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \ in \( 3.5 \% \)hydrochloric acid), ammonium thiocyanate \( \left (0.3 \mathrm { ~g } / \mathrm { ml } \right . \)in \( \left . \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ), 0.2 \mathrm { M } \) phosphate buffer( \( \mathrm { pH } \)7.0)를 조제하여 이들을 stock solution으로 사용하였다. 혼합용액은 시료용액 \( 0.2 \mathrm { ml } \), linoleic acid \( 0.2 \mathrm { ml } \)을 시험관에 넣고 흔합한 후 phosphate buffer \( 0.4 \mathrm { ml } \)와 증류수 \( 0.2 \mathrm { ml } \)를 가하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 incubation하면서 일정간경으로 측정하였다. 측정방법은 혼합용액에서 \( 0.1 \mathrm { ml } \)을 취하여 시험관에 넣고 \(70 \% \)ethanol \( 3 \mathrm { ml } \)과 ammonium thiocyanate 용액 \( 0.1 \mathrm { ml } \), ferrous chloride 용액 \( 0.1 \mathrm { ml } \)를 혼합한 후 정확히 3분 후에 \( 500 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성의 비교를 위하여 BHT를 \( 0.05 \% \)농도로 사용하여 BHT 첨가구로 하였다.</p> <h2>가용성 고형분</h2> <p>홍삼 및 홍국발효홍삼 분말을 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))로 증류수에 녹인 각 추출물 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))용액의 가용성 고형분을 디지털 당도계(Refractometer PR-101a, Atago Co., Ltd. Japan)로 3회 반복 측정하여 \( { } ^ {\circ } \)Brix로 표시하였다.</p> <h2>pH 및 적정산도 측정</h2> <p>홍삼 및 홍국발효훙삼 분말을 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))로 증류수에 녹인 각 추출물 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))용액의 \( \mathrm { pH } \)는 \( \mathrm { pH } \)meter (Methrohm 691, Swiss)로 직접 측정하였고, 적정 산도는 시료액 \( 10 \mathrm { ml } \)에 각각 중류수 \( 50 \mathrm { ml } \)를 가한 후 잘 흔들어 \( 1 \% \)phenolphthalein 용액 \( 4 \sim 5 \)방울 떨어트리고 \( 0.1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \)로 적정한 후 그 소모량을 측정하여 총 산도로 환산하였다.</p> <p>Total acidity (acetic acid, \( \% \), ( \( \mathrm { w/v } \))</p> <p>\( = [( \)titrated \( 0.1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \mathrm { ml } \times 0.0006)/ \)sample \( \mathrm { ml } ] \times 100 \)</p> <h2>색도 (Color) 측정</h2> <p>홍삼 및 홍국발효홍삼 분말을 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))로 증류수에 녹인 각 추출물 \( 1 \% \)( \( \mathrm { w/v } \))용액의 색도는 colorimeter (Handy colorimeter NR-3000, Nippon enshoku, Japan)를 이용하여 Hunter's value \( L ^ { * } \)(명도), a* (적색도), \( \mathrm { b } ^ { * } \)(황색도)값을 3회 반복 측정하였다.</p> <h2>Mineral 함량 측정</h2> <p>홍삼 및 홍국발효홍삼 분말의 미네랄 함량은 AOAC분석 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 홍삼 및 홍국발효홍삼 분말 \( 1 \mathrm { ~g } \)을 각 \( 550 ^ {\circ } \mathrm { C } \)회화로에서 3시간 회화 시킨 후 \( 6 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \)에 용해시켜 완전히 산분해시켜 수욕조 상에서 산을 완전히 제거하고, 이 건고물에 \( 3 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \)를 가하여 Whatman No. 4 여과지로 여과하여 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석하여 원자흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하여 측정하였다.</p>	생명
Elicitor 처리에 의한 삼백초 추출물(Saururus chinensis )의 미용식품활성 및 피부상재균 억제효과	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Elicitor 처리에 의한 삼백초 추출물의 항산화 효과 변화</h2> <p>Elicitor 처리한 삼백초와 비처리 삼백초 추출물의 oxidative free radical 반응을 이용한 환원성 물질의 분석인 DPPH법으로 비교 측정한 결과, Figs. 1A-C에서와 같이 elicitor 처리한 삼백초 추출물의 DPPH 소거능이 비처리군에 비해 우수한 항산화 효과를 나타내었으며, \( 1.5 \mathrm{mg} \) elicitor/leaf \( 1 \mathrm{~g} \) (group A)에서 \( 3.0 \) \( \mathrm{mg} \) elicitor/leaf \( 1 \mathrm{~g} \) (group B)으로 처리 농도가 높아질수록 항산화 효과는 높아지는 것으로 확인되었으며, elicitor 처리에 의해 물 추출물보다 \( 70 \% \) ethanol 추출물의 항산화 효과가 더 우수한 효능을 나타내었다. 지용성 비타민 A인 \( \beta \)-carotene이 가지고 있는 황색을 이용하여 황색의 변화 정도에 따른 지용성 물질에 대한 항산화력을 측정하는 실험법인 PF를 측정한 결과 elicitor 처리한 삼백초 추출물의 경우 Figs. 1D-F에서와 같이 group A에서는 ethanol 추출물에서 대조구인 비처리군에 비해 상대적으로 높은 지용성 물질에 대한 항산화력의 증대가 관찰되었고, group B에서는 물 추출물에서 대조구와 group A를 능가하는 우수한 항산화력이 확인되었으며, elicitor 처리군의 경우 positive control로 사용한 합성항산화제인 BHA보다 우수한 효능을 나타내어 천연항산화제로서의 개발 가치와 가능성을 보여 주었다. 또한 위의 결과와 같이 elicitor 처리 농도별에 따른 효능의 차이는 삼백초의 성장과정에서 방어기작으로 만들어지는 phenolic compounds의 profile 차이에 의한 것으로 추정이 되었으며, 향후 이에 대한 후속연구도 병행이 되어야 할 것으로 판단되었다.</p> <h2>Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 미백 효과</h2> <p>사람의 피부색은 멜라닌(melanin)이나 카로틴(carotene)과 같은 색소 성분과 혈관의 분포, 각질층의 두께 등에 의해서 결정되는데, 이는 멜라닌이 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소로 자외선을 차단하는 기능도 갖고 있지만 국소적으로 과도하게 합성되거나, 멜라닌 생성에 이상이 생기면 melasma, freckle 및 hyperpigmentation을 유발하게 된다. 따라서 멜라닌 합성의 기질인 tyrosine을 분해하는 tyrosinase를 저해함으로써 멜라닌의 합성을 억제하여 피부의 미백효과를 볼 수 있다. Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 tyrosinase 억제 효과는 Figs. 2A-C에서와 같이 비처리군인 대조구와 유사한 효소 억제 효과를 나타내어 elicitor 처리가 삼백초 추출물의 미백효과 증대에는 영항을 미치지 않는 것으로 확인되었다.</p> <h2>Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 수렴 효과</h2> <p>수렴작용의 원리는 피부 단백질이 tannic acid, epigallocatechin gallate와 같은 phytochemical compound 또는 phenolic compound와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있다. 수렴제는 식품에서는 혀 점막에 작용하여 떫은 맛을 느끼게 하는 작용을 나타내므로 불호 성분의 대명사라 할 수 있다. 그러나 피부에 작용 시 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있으며, 모공을 축소하여 피부를 조이게 만들어 피부가 팽팽하게 느끼게 하는 작용을 하고, 모공축소로 인하여 모발의 이탈을 방지하는 효과도 있다. 이러한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴성 효과 정도를 측정할 수 있다. Wunsch과 Heidrich[21]은 이러한 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피박을 형성하고 그 결과 구조를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 하였다. Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 수렴효과는 Figs.3A-C에서와 같이 비처리군인 대조구에 비하여 오히려 수렴효과가 낮아지는 현상을 나타내어 삼백초를 식품에 적용시킬 때에는 떫은 맛을 덜 느끼게 하는 positive의 효과를 나타낼 수 있을 것이라 판단되었으며, 미용기능성을 고려한다면 모공축소 효과 등은 기대할 수 없을 것으로 판단되었다.</p> <h2>Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 주름개선(elastase 억제) 효과</h2> <p>인체의 중성구 과립구 내에 존재하는 elastase는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 주요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서 elastase 저해제는 피부 주름개선을 하는 작용을 나타내며, ursolic acid 등이 elastase 저해제로 이용되고 있다. 또한 Giacomoni과 Rein[25]과 Cannell 등은 체내의 엘라스틴을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 그 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부주름 및 탄력성 소실을 유발한다고 하였다. 따라서 elastase 저해활성을 측정함으로써 주름개선의 효과와 상관 있음을 알 수 있다. Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 elastase 억제 효과는 Figs. 4A-C에서와 같이 비처리군인 대조구보다 우수한 효소 억제 효과를 나타내었으며, group B의 경우에는 물과 ethanol 추출물 모두 효능의 증가를 나타내어 elicitor 처리한 삼백초 추출물이 주름개선 효과의 증대에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 또한 positive control로 사용한 ursolic acid보다 elicitor 비처리군, 처리군 모두 우수한 효능을 나타내어 삼백초 소재와 elicitor 처리의 우수성을 확인할 수 있었으며, 주름개선에 영향을 미치는 기능성 소재로서의 개발 가능성이 있다고 판단되었다.</p> <h2>피부상재균에 대한 항균활성 검색</h2> <p>실험에 사용한 균주는 페부상재균으로써 여드름의 발생에 관여하는 Propionebacterium acnes와 세균각막염, 안검결막염 등의 원인균인 Staphylococcus epidermidis 표준균주인 KCTC 1917와 Candida albicans 표준균주인 KCTC 7965와 피부상재균으로써 페부표면에서 쉅게 발견되고, 공기 및 토양 등의 자연계에 광범위하게 분포하고 있어 식품에 쉽게 오염되기 때문에 식중독의 원인균이 되기도 하는 Staphylococcus aureus 표준균주인 KCTC 1039 및 병원성 대장균인 Escherichia coli 표준균주 \( \mathrm { KCTC } 1039 \)를 사용하였다. 균주의 배양은 \( S \) epidermidis의 배양에는 Nutrient Medium을 사용하였고, C. albicans의 배양에는 YM Medium을, S. aureus 및 E. coli의 배양에는 Nutrient Medium을 사용하여 배양은 agar plate상으로 37의 BOD incubator에서 24-48시간 동안 실시하였다.</p> <p>항균력 측정은 paper disc법을 이용하여 생육 저해환(Clear zone)을 측정하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이 취해서 액체배지 \( 10 \mathrm { ~mL } \) 에서 18-24시간 배양하여 활성화시킨후 다시 액체배지 \( 10 \mathrm { ~mL } \) 에 균액을 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 접종하여 36시간 본 배양한 후 평팬배지 1 개당 균수가 약 \( 1 \times 10 ^ { 7 } \) cells되게 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. Disc method에 의한 항균활성 검색은 최적배지 agar plate에 준비한 균 배양액 \( 100 \mu \mathrm { L } \)를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 지름 \( 8 \mathrm { ~mm } \) 크기의 disc paper를 올려놓고 \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) membrane filter로 제균한 시료용액 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 에 phenolics 농도가 \( 50,100,150 \) 및 \( 200 \mu \mathrm { g } \) \( 100 \mu \mathrm { L } \) 가 되도록 각각 분주하였다. 대조구로는 멸균수 \( 100 \mu \mathrm { L } \)를 흡수시켜 24시간 동안 배양하여, disc 주위의 clear zone 생성 유무와 직경을 측정함으로써 항균활성을 계산하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 6회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리는 SPSS 23 for windows (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균 \( \pm \) 표준편차(mean \( \pm \) standard deviation)로 표시하였고 분산분석 Duncan's multiple range test, one-way ANOVA를 실시하여 시료 간의 유의차를 \( p<0.05 \) 수준으로 비교 분석하였다.</p> <h2>Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 염중 억제 효과</h2> <p>히아루론산(hyaluronic acid, HA)은 고분자 다당으로 진피층의 섬유아세포에서 산출되어, 표푀, 진푀에 주요한 세포외 매트릭스로 glucuronic acid와 glucosamine이 반복해서 연결된 점액성 moucopolysaccharide이다. 그리고, 염증 형성의 중요 요소인 macrophage의 phagocytic ability를 저해하는 한편, HA 분해 산물 혹은 저분자 HA는 상처 치유과정에서 inflammation, fibrosism, collagen deposition을 증가시키는 것으로 고분자 \( \mathrm{HA} \)의 분해효 소인 HAase의 저해에 의해 \( \mathrm{HA} \)의 고분자 형태를 유지하게 함으로써 항염증 효과를 기대할 수 있다. Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 염증 억제 효과는 Figs. \( 5 \mathrm{~A}-\mathrm{C} \) 에서와 같이 비처리군인 대조구에 비해 우수한 염증 억제 효과를 나타내었으며, group \( \mathrm{A} \) 와 group B 모두저농도와 고농도에서 대조구에 비해 억제율 이 큰 폭으로 상승하는 효과를 나타내었으며, 특히 고농도에서는 \( 100 \% \) 에 가까운 효능을 나타내어 HAase 효소에 대한 억제율이 매우 높은 것을 확인하였다. 따라서 elicitor 처리가 유용 물질의 산업화라는 전제를 충족시키기 위한 biomass 기법으로 매우 적당하다는 것을 시사해주었다.</p> <h2>Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 피부상재균 억제 효과</h2> <p>Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 항균 효과는 Table 1에서와 같이 group A, B ethanol 추출물에서 \( 150 \mu \mathrm{g} / 0.1 \mathrm{~mL} \) 이상의 농도 처리군에서 E. coli와 S. epidermidis에 대한 항균효과가 높아지는 현상을 나타내었다. 이는 elicitor의 농도별 차이에 의해 삼백초에서 방어기작으로 만들어지는 phenolic compounds의 profile과 함량의 차이에 의한 것으로 추정이 되었다. 이상의 결과를 종합하면, 삼백초 재배시에 본 연구에서 사용한 elicitor 를 처리하면 수확되는 삼백초의 단위 무게당 생리활성물질인 phenolic compounds의 생산량을 높일 수 있고, 항산화 활성을 나타내는 DPPH, PF와 생리활성에 관여하는 효소인 elastase, HAase의 저해효과를 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 또한 퍼부상재균에 대한 억제 효과도 증대시킬 수가 있어 산업화를 위한 원료생산에 효율적인 재배기법에 활용할 수 있을 것이라 판단되었다.</p> <h1>초 록</h1> <p>Elicitor를 처리한 삼백초의 물과 ethanol 추출물들의 기능성화장품활성을 살펴보았다. Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 항산화 효과는 \( 1.5 \mathrm{mg} \) elicitor/leaf \( 1 \mathrm{~g} \) (group \( \mathrm{A} \) )에서 \( 3.0 \mathrm{mg} \) elicitor/leaf \( 1 \mathrm{~g} \) (group B)으로 처리 농도가 노아질수록 항산화 효과는 높아지는 것으로 확인되었으며, elicitor 처리에 의해 물 추출물보다 \( 70 \% \) ethanol 추줄물의 항산화 효과가 더 우수한 효과를 나타내었다. Elicitor 처리한 삼백초 추출물의 미용식품활성은 elastase 억제 효과와 미백효과가 비처리군인 대조구와 유사한 효소 억제 효과를 나타내어 elicitor 처리가 삼백초 추출물의 미백 및 주름개선 효과의 증대에는 영항을 미치지 않는 것으로 확인되었으나, 염증 억제 효과가 비처리군인 대조구에 비해 우수한 염증 억제 효과를 나타내었으며, grpoup \( \mathrm{A} \) 와 group \( \mathrm{B} \) 모두에서 대조구에 비해 억제율이 큰 폭으로 상숭하는 호과를 나타내어 elicitor 처리가 유용물질의 산업화라는 전제를 충족시키기 위한 biomass 기법으로 매우 적당하다는 것을 시사해주었다. 따라서 삼백초 재배시에 본 연구에서 사용한 elicitor를 처리하 면 수확되는 삼백초의 단위 무게 당 생산량을 높일 수 있고, 생 리활성도 증대시킬 수가 있어 산업화를 위한 원료생산에 효율적인 재배기법에 활용할 수 있을 것이라 판단되었다.</p> <h1>실험 재료 및 방법</h1> <h2>Elicitor의 제조 및 적용</h2> <p>본 실험에서 사용된 elicitor는 Cho 등의 방법에 따라 이스트 추출물 수용액에 단백질 분해효소(Aspergillus fumigatus 배양액에서 분리한 단백질 분해효소)를 처리하고, ethanol을 첨가로 유도된 불용성 성분인 침전물을 회수하고 건조하여 이스트 효소 분해물을 제조하였다. 제조된 이스트 효소 분해물 분말 \( \mathrm{kg} \)당 \( 5 \mathrm{~g} \)의 \( \mathrm{CuCl}_{2} \)를 균질하게 혼합하여 elicitor 분말을 제조하여 삼백초의 어린잎이 자라기 시작하는 4월 하순경(4월 30일)부터 잎이 다 자라는 5 월 중순경(5월 14일)까지 생잎 \( \mathrm{g} \) 당 \( 1.5 \mathrm{mg} \)(group A)과 \( 3 \mathrm{mg} \) (group B)의 농도로 3회에 걸쳐 용액으로 제조하여 분무기를 사용하여 직접 잎에 분무하였다.</p> <h2>추출물의 제조</h2> <p>삼백초 잎을 수확하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 건조시킨 후 \( 40 \mathrm{mesh} \)로 분쇄하여 시료로 사용하였다. 물 추출물의 경우 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)에 증류수\( 200 \mathrm{~mL} \)을 넣고 액이 \( 100 \mathrm{~mL} \)이 될 때까지 가열한 후 냉각하였으며, ethanol 추출물은 시료에 \( 100 \mathrm{~mL} \) 의 \( 70 \% \) ethanol을 가하고 homogenizer로 \( 20,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 균질화 시킨 후 12시간동안 교반 추출하였다. 물과 ethanol 추출액은 whatman No.1 filter paper로 여과한 후 ethanol 추출물은 rotary vacuum evaporator (BUCHI R-200, Flawil, Switzerland)를 사용하여 추출에 사용한 ethanol을 모두 휘발시킨 후 total volume을 DW로 조절하였으며, 필요에 따라 추출물 모두 농축하여 농도(50-\( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g}) \)를 조절한 후 시료로 사용하였다.</p> <h2>Total phenolic 정량</h2> <p>Total phenolic 정량은 추출물 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 95\% ethanol \( 1 \mathrm{~mL} \)와 증류수 \( 5 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하고 \( 1 \mathrm{~N} \) Folin-ciocalteu reagent \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 잘 섞어 5 분간 방치한 후 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} 1 \mathrm{~mL} \)를 가하여 흡광도 725 \( \mathrm{nm} \)에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선 (Total phenolic compounds content in gallic acid (10-200 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) was calculated using the following equation based on the calibration curve: \( y=0.0083 x-0.027, R^{2}=0.9963 \), where \( \mathrm{y} \) was the absorbance, and \( \mathrm{x} \) was the gallic acid equivalent \( (\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL})) \)으로부터 양을 환산하였다.</p> <h2>항산화 효과 측정</h2> <p>1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 소거활성은 Lee 등의 방법에 준하여 측정하였으며, 전자공여능(\%)은 \( 1-( \) 반응구의 흅광도/대조구의 흅광도) \( \times 100 \)으로 나타내었다. Antioxidant protection factor (PF)는 Andarwulan과 Shetty의 방법에 준하여 측정하였으며, \( \mathrm{PF} \)는 반응구의 흅광도/대조구의 비로 나타내었다.</p> <h2>미백효과(Tyrosinase 억제) 측정</h2> <p>Tyrosinase 저해효과 측정은 Vincent와 Hearing의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer\( (\mathrm{pH} \) 6.8) \( 2.3 \mathrm{~mL} \)와 기질액 \( 1.5 \mathrm{mM} \) L-tyrosine 용액 \( 0.4 \mathrm{~mL} \)의 혼합액에 mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich Co, Louis,\( \mathrm{MO} \), USA, \( 250 \mathrm{U} / \mathrm{mL}) 0.1 \mathrm{~mL} \) 와 시료 \( 0.2 \mathrm{~mL} \) 를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수를 \( 0.2 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시켜 흡광도 \( 475 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하여, 저해율(\%)은 (1-시료의 absorbance/대조구의 absorbance) \( \times 100 \)으로 계산하였다.</p> <h2>수렴효과(astringent) 측정</h2> <p>Astringent 활성 측정은 Wunsch과 Heidrich의 방법에 따라 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용하여, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리 후 \( 576 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Astringent 활성 \( (\%) \)은 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도 \( ) \times 100 \)으로 계산하였다.</p> <h2>주름개선 효과(elastase 저해) 측정</h2> <p>Elastase 저해효과 측정은 Kraunsoe 등의 방법 에 준하여 측정하였다. 반응구는 \( 0.2 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 8.0 \) ) \( 1 \mathrm{~mL} \)에 기질액 \( 0.8 \mathrm{mM} \mathrm{N} \)-succinyl-(Ala) \( { }^{3}-\gamma \)-nitroanilide 용액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 의 혼합액에 \( 1.0 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) porcine pancreatice elastase (PPE) (Sigma-Aldrich Co.) 효소용액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 와 시료 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반 응시켜 \( \gamma \)-nitroaniline 생성량을 흡광도 \( 410 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 저해율(\%)은 (1-시료의 absorbance/대조구의 absorbance) \( \times 100 \)으로 계산하였다.</p> <h2>염증억제 작용(Hyaluronidase, HAase 억제) 측정</h2> <p>HAase 저해효과는 Lee 등의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 시료 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)에 \( 20 \mathrm{mM} \) Sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \)6.9)에 녹인 HAase \( (1,000 \mathrm{U} / \mathrm{mL}) \quad 0.5 \mathrm{~mL} \) 을 혼합하여 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 5 분간 반응시키고 \( 0.3 \mathrm{M} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 5.3)^{\text {에 녹인 }} \) 기질( \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) 0.5 \mathrm{~mL} \) 을 넝어 다시 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45분간 반응시킨 후 \( 0.04 \mathrm{M} \) acetate buffer \( (\mathrm{pH} 3.75) \)에 녹인 알부민용액 5\( \mathrm{mL} \)을 첨가한 후 5분간 방치하고 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 투과율을 측정하 였다. 대조구는 시료 대신 증류수 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 넣어 반응시켰다. 저해율(\%)은 (1-시료의 부과율/대조구의 부과율 \( ) \times 100 \) 으로 계산 하였다.</p>	생명
Lipogenesis와 adipose expansion의 전사조절	<h2>LXRs</h2><p>Oxysterol에 의해 활성화되는 nuclear receptor LXRs는 이름에서 알 수 있듯이 간에서 발견이 되었고, 콜레스테롤과 lip-id 대사에 중요한 것으로 알려져 왔다. LXRß의 경우 조직 전반적으로 발현되며, LXRa는 간과 adipose tissue, macrophage (대식세포)에서 많이 발현된다. 마우스 간조직 및 간세포에서 LXRs은 DNL 유전자인 Srebf1c와 Fasn 유전자 promoter에 결합하고 lipogenesis 최종 산물인 TG 합성을 유발하여 지방간 현상을 야기한다. 또한 whole body Lxrs double KO 마우스의 경우 비만 모델인 ob/ob 에서 지방간 형성이 잘 되지 않기 때문에, 결론적으로 간에서 핵심 lipogenic TFs로 작용한다고 볼 수 있다. 그러나 간의 형질과는 다르게 whole body Lxrs double KO 마우스의 adipose tissue 양은 오히려 증가하고 DNL 유전자 발현도 증가하는 것으로 보고되었다. 또한 Adipoq-Cre를 이용한 Lxra KO 마우스에서도 adipose tissue 양이 오히려 증가하였다. 따라서 adipocyte와 lipogenesis에서 LXRs 역할은 모호하며 향후 추가적인 연구가 필요한 실정이다.</p><h2>Mediator coactivator complex</h2><p>진핵세포(eukaryotes)에서 mRNA 전사에는 RNA poly-merase II (Pol II)가 작용하는데, RNA Pol II에 의한 전사과정의 조절 인자로 chromatin remodelers, histone modifiers와 더불어 Mediator coactivator complex가 중요한 역할을 한다. 포유동물에서 대략 30개의 subunits로 구성되어 있는 Mediator complex는 일반적으로 enhancer에 결합하는 TFs와 promoter쪽의 basal transcriptional machinery 연계 RNA Pol II와의 다리역할을 하는 것으로 알려졌다. 특별히 enhancer 의 마커로 사용되는 Mediator subunit 1 (MED1)의 경우 in vitro 세포배양 모델에서 PPAR \( \gamma \) 에 의한 adipocyte로 형질전환 되는데 중요한 것으로 보고되었으나, in vivo 마우스 모델을 이용한 최근 연구결과에 의하면 adipose expansion에서 lipogenesis coactivator로 작용하는 것으로 알려졌다. 흥미롭게도 기존의 일반적인 전사조절에 Mediator complex가 핵심적으로 작용하기 때문에 MED1이 당연히 early phase of adipogenesis에 중요할 것이라는 기대와는 달리, MED1은 adipose development에는 중요한 역할을 하지 않고 lipo-genesis와 adipose tissue expansion에 핵심적으로 작용하였다. 흥미롭게도 adipocyte 특이적인 Med1 KO 마우스는 심각한 lipodystrophy 병변을 보였다. 분자기전 측면에서 MED1 매개 DNL 유전자 발현에는 lipogenic TF ChREBP와 SREBP1a의 enhancer 결합에 따른 Mediator recruitment가 중요하다는 것이 밝혀졌다. 한편 다른 Mediator subunit인 MED15는 SREBPla와 in vitro 상에서 결합하고 인간세포주에서 Fasn 유전자 발현에 중요한 것도 알려졌다. Cyclin-de-pendent kinase 8(CDK8) 과 Cyclin C는 Mediator complex를 억제하여 DNL을 감소시키며, 마우스의 nutrients 식이 조절에 따라 Mediator와 결합력이 달라지는 것이 보고되었다. 그러므로 Adipocyte에서 DNL 유전자 전사조절의 분자기전에서 lipogeneis coactivator 역할 규명을 위해, 추가적인 Mediator subunit을 타겟으로 하는 in vivo 모델 연구가 중요하다고 할 수 있다.</p><h2>Adipose expansion과 lipogenesis</h2><p>대부분의 동물의 조직과 기관이 그러하듯, adipose tissue 역시 postnatal development 과정을 거친다. 태어나기 전 발생과정인 embryonic development 이후 adipose tissue는 계속해서 양적인 성장을 하는데 이러한 현상을 adipose expansion 이라고 하며 특히 WAT에서 두드러지게 일어난다. Adipose tissue는 식이에 따라 adipogenesis와 lipogenesis가 영향을 받고 이에 따라 adipocyte turnover가 일어나는 급격한 변화를 보인다. 특히 실험실의 마우스의 경우 눈을 뜨는 시점인 태어난지 2주 후부터 고단백질 및 고지방 maternal breast milk feed period에서 실험실 환경에서 제공되는 carbohydrate rich-diet인 사료로 식이가 전환되고 nutrients 관점에서 급격한 변화가 일어난다. 따라서 태어난 지 한달 후 weaning (젖떼기) 시기가 되면 nutrients에 가장 민감한 조직과 기관인 adi-pose tissue와 간을 중심으로 fatty acid synthesis와 lipogenic enzyme 활성화가 증가한다. 최근 연구결과에 의하면, 마우스의 adipocyte 특이적 RNA-Seq (전사체 분석)에서 post-natal adipose expansion 과정동안 lipogenesis enzyme의 발현이 특이적으로 증가하는 것이 보고 되었다. 이것은 adi-pose expansion에 있어, 탄수화물 유래 포도당 대사산물에 의해 활성화되는 lipogenic TF ChREBP와 인슐린 분비에 의해 활성화되는 lipogenic TF SREBP1매개 DNL 유전자 발현의 영향으로 생각된다. 비단 마우스 postnatal adipose expansion 과정 외에도, 인간의 저탄고지(ketogenic) 식이(low carbohy-drate - high fat diet 또는 ketogenic diet)가 살을 빼는 식단으로 최근 각광받는 분자적 원인이 되지 않을까 생각해 볼 수 있다. 향후 이러한 특이적인 식이에 따른 adipose expansion의 생리현상 및 분자기전연구가 필요할 것으로 생각된다.</p> <h1>향후 연구 방향</h1> <p>Adipogenesis는 early phase의 초기 분화과정과 late phase의 후기 분화과정으로 나누어 볼 수 있는데, 초기 분화는 pre-adipocytes 상태에서 adipocytes로 분화가 일어나기 위한 commitment 단계로 PPAR \( \gamma \) 와 C/EBP \( \alpha \)가 핵심적인 전사 조절을 이끈다. 이 과정은 in vivo 모델에서는 adipose tissue devel-opment과정의 핵심이라고 할 수 있다. 반면 후기 분화는 fatty acid가 합성되고 lipid droplet의 형성을 위한 TG 합성 과정을 포함하는 lipogenesis과정이라고 할 수 있다. Adipocyte에서 lipogenesis는 결국 in vivo 모델에서 adipose expansion의 핵심 과정이 된다. 전세계적으로 사회적인 문제가 되는 현대인의 당뇨와 비만을 포함하는 대사성 질환에 대한 관심으로 adi-pose tissue 연구에 학계가 주목하고 있다. 특히 최근 에너지 소비(energy expenditure)와 thermogenesis를 담당하는 BAT 과 면역세포를 포함하는 내분비 기관으로 WAT의 많은 연구가 이루어지고 있다. 그러나 nutrients와 대사에 의해 변화하는 adipose expansion에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다. 따라서 기존의 세포배양을 중심으로 하는 in vitro adipo-genesis 연구에서 탈피하여, CRISPR-Cas9을 이용한 유전자 적중 마우스 모델과 단일세포 전사체 분석(scRNA-seq; single cell RNA-seq)을 포함하는 다양한 차세대염기서열분석법 (NGS; Next Generation Sequencing)의 적극적인 도입이 필요하다. 이를 통해 in vivo adipose expansion 및 adipocyte 생리와 비만의 분자 기전에 대한 깊이 있는 기초 생물학의 학문적 이해를 기대할 수 있으며, 나아가 비만 및 대사성 질환 치료제 개발에 큰 도움이 될 수도 있을 것으로 기대해본다.</p> <h1>초록 : Lipogenesis와 adipose expansion의 전사조절</h1> <p>PPAR \( \gamma \)와 C/EBP \( \alpha \)는 adipose tissue 발생에 필요한 핵심 adipogenic TFs이다. 두 TFs는 adipose tissue의 배아 발생에 있어 초기 adipogenesis와 adipocytes 유전자 발현을 조절한다. Adipose expansion은 adipose tissue가 태어난 뒤에도 계속 팽창이 지속되는 것을 말한다. 이러한 adipose expansion은 후기 adipogenesis의 과정인 lipo-genesis가 요구된다. 특히 간과 adipose tissue은 탄수화물이 기본적으로 fatty acids으로 전환되는 de novo lipo-genesis (DNL)의 주요 장기이다. Fatty acids는 이어서 glycerol-3-phosphate에 에스테르화되어 adipocytes의 lipiddroplets 생성을 위해 triglycerides로 전환된다. 간의 DNL이 활발하게 연구가 된 반면, in vivo에서 adipocytes의 DNL은 아직 잘 알려져 있지 않다. 그러므로, adipose expansion과 DNL에 대한 이해는 비만, 2형 당뇨 그리고 대사성 질환을 위한 치료제 개발에 도움을 줄 수 있다. Adipocytes에서 DNL 유전자 발현은 ChREBP나 SREBP1a와 같은 lipogenic TFs 뿐 아니라, lipogenesis coactivator에 의해 전사 수준에서 조절된다. 최근 in vivo 연구에 의해 lipogenesis 유전자 발현과 adipose expansion의 새로운 측면이 밝혀졌다. 향후 구체적인 분자기전 연구는 어떻게 영양분이 DNL과 adipose expansion을 조절하는 지를 규명해 줄 것이다. 본 리뷰논문은 전사조절 관점에서 adipocytes와 adipose expansion에 있어 DNL에 대한 최신 연구결과를 요약정리 할 것이다.</p> <h1>본 론</h1><h2>Adipogenesis와 lipogenesis</h2><p>Adipogenesis (지방세포분화)에 대한 연구는 주로 사람이나 마우스의 지방조직으로부터 분리된 일차배양세포(primary cells)를 immortalization (불멸화)한다든가, 많은 adipocytes 연구자들이 사용한 3T3L1 및 3T3-F442A 세포주를 통해 adi-pogenesis에 대해 많은 사실들이 알려졌다. 이러한 in vitro 세포배양 연구를 통해 adipogenesis에 핵심적으로 작용하는 많은 transcription factors (TFs)가 규명되었고, TFs 간에 순차적인 상호 유전자 발현조절이 알려졌다. 그 중에 adipo-genesis의 핵심 TFs로 peroxisome proliferator-activated re-ceptor \( \gamma \) (PPAR \( \gamma \) 와 CCAAT-enhancer-binding protein a (C/EBP\( \alpha \)) 가 결국 상호간 피드백 조절을 통해 수 천개 이상의 adipocyte 특이적인 유전자의 발현을 유도하고 adipogenesis를 이끈다고 할 수 있다. Adipogenesis를 유도하는 in vitro 모델에서 사용하는 몇가지 중요한 세포배양 구성 물질로 fetal bovine serum (FBS), isobutylmethylxanthine (IBMX), dex-amethasone (DEX), 인슐린(insulin)을 들 수 있다. 이러한 물질이 작용하는 기전은 IBMX에 의한 cAMP dependent protein kinas A-cAMP response element-binding protein (PKA-CREB) 신호전달 활성화와 DEX를 통한 glucocorticoid re-ceptor (GR) 활성화, 그리고 kruppel-like factor 4 (KLF4) 및 EGR2 (early growth response 2 또는 KROX20) TFs 유도가 중요할 것이라고 알려졌다. 그러나 세포배양의 실험적인 한계로 인해 기존의 많은 in vitro 연구방법이 실제 in vivo 상에서 이루어지는 adipogenesis 생리현상에서 중요하지 않을 수 있다. 사실상 PPAR \( \gamma \) 와 C/EBP\( \alpha \) 를 제외하고 여러가지 중요하다고 여겨졌던 adipogenesis 관련 TFs (KLF4, EGR2, GR)가 adi-pogenesis에 반드시 필요한 근원적인 역할은 하지 않는다는 것이 알려졌다. 최근 in vivo adipogenesis의 연구는 주로 마우스 모델인 conditional knockout mice (조직 특이적 유전자 결핍 마우스)을 확립하는데 초점을 맞추며, 이를 위해 여러가지 Cre-recombinase (Cre) 마우스 모델이 이용된다. BAT와 interscapular 근육의 adipogenesis와 myogensis (근육세포분화)에 중요한 Myogenic factor 5 (MYF5) TF를 이용한 Cre 마우스 모델을 통해 GR, KLF4, EGR2가 실제로 in vivo adipo-genesis에 중요하지 않다는 것이 최근 밝혀졌다. 현재까지는 early phase of adipogenesis의 핵심 유전자 발현조절에 PPAR \( \gamma \) 와 C/EBP\( \alpha \) 가 가장 중요하다고 할 수 있고, 향후 adipogenesis 연구는 in vivo 모델을 통해 late phase of adipo-genesis의 nutrients 와 대사신호전달을 규명하는 것이 adipo-cyte 기능과 역할을 이해하는데 중요하다고 할 수 있다.</p><p>Adipogenesis의 과정은 단순히 preadipocytes가 adipo-cytes로 갑자기 분화하는 것이 아니다. 모든 세포분화과정이 그러하듯 점차적으로 분화가 이루어지는데, late phase of adi-pogenesis의 과정을 통해 보다 mature adipocyte로 분화가 된다. 이때 late phase of adipogenesis의 핵심과정은 lipid가 축적되는 lipogenesis라고 할 수 있으며, 서론에서 언급한 lipo-genesis 핵심 효소인 ACLY, ACCs, FASN, SCDs의 유전자 발현이 전사 수준에서 조절되는 과정이라고 할 수 있다. Lipo-genic TF로 알려진 중요한 인자로 carbohydrate-responsive element-binding protein (ChREBP, 또는 MLXIPL), sterol reg-ulatory element-binding proteins (SREBPs) 그리고 liver X re-ceptors (LXRs)가 알려져 있다. ChREBP는 탄수화물 유래 포도당 대사산물에 의해 활성화되며 같은 유전자상에서 발현되는 두가지 isoforms인 ChREBP\( \alpha \)와 ChREBP \( \beta \)가 알려져 있다. SREBPs은 주로 인슐린 신호전달에 의해 활성화되고 SREBP1a, SREBP1c, SREBP2 세가지로 발현된다. LXRs의 경우 LXRa (또는 NR1H3)와 LXRß (또는 NR1H2)로 존재하며 콜레스테롤 대사산물인 oxysterol에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다. 세가지 TFs 모두 간과 adipose tissue를 중심으로 lipogenic 효소인 DNL 유전자 발현에 중요하다고 보고 되었다. Late phase of adipogenesis라 할 수 있는 lipo-genesis는 근원적인 세포분화 운명 단계가 아닌, 여러가지 영양분과 호르몬에 의해 민감하게 조절되는 adipocyte 생리현상으로 그 분자기전 규명을 위해 in vivo 모델을 이용한 깊이 있는 후속 연구가 필요하다고 볼 수 있다.</p><p>DNL에 의해 합성되는 fatty acid는 결국 adipocyte의 lipid droplet의 발달을 위해 TG synthesis 과정을 거친다. 서론에서 언급한 TG synthesis 유전자와 lipid droplet 형성에 중요한 유전자들은 흥미롭게도 인간에서 돌연변이가 많이 일어나고, 이것은 adipose tissue 유래 질환인 lipodystrophy (지방이영양증)의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. Lipodystrophy은 허벅지나 복부, 팔다리에서 피하지방이 과도하게 소실되는 유전 질환으로 지방간(fatty liver)과 심각한 인슐린 저항성(insulin resistance)를 보인다. AGPAT2는 TG 합성에 핵심 효소로 adipose tissue에서 높은 발현을 보이며 돌연변이를 통한 con-genital generalized lipodystrophy 병변이 나타난다. 또한 Agpat2 KO 마우스의 경우도 lipodystrophy 형질이 뚜렷이 나타난다. 한편 PLIN1의 돌연변이 역시 인간의 familial parti-al lipodystrophy 병변이 나타나며, Plin1 KO 마우스는 db/db 당뇨모델에서 adipose tissue의 양이 감소한다고 보고되었다. 그러나 lipogenic TFS에 의해 조절되는 DNL 유전자 발현 조절과는 달리, lipodystrophy 질환에 중요한 adipo-cyte TG 합성 유전자 발현 조절은 전사 수준의 분자기전이 잘 알려지지 않았다.</p> <h1>서 론</h1><p>포유동물의 Adipose tissue (지방조직)는 에너지의 저장고 역할을 하는 white adipose tissue (WAT)와, 에너지를 소비하는 역할을 하는 brown adipose tissue (BAT)로 나눈다. BAT은 상대적으로 매우 작은 지질을 많이 가지고 이를 통한 지방분해(lipolysis)과정과, 또한 많은 수의 미토콘드리아를 통해 열을 발생시킨다. Adipose tissue development (지방조직 발생)은 어미의 뱃속에서 이미 진행이 되지만, 태어난 직후부터 성체가 될 때까지 크게 확장되는 adipose expansion (지방팽창)의 과정을 거친다. Adipose expansion은 특히 WAT을 중심으로 이루어지고 adipose tissue 양과 지질(lipid)이 크게 늘어나는 현상을 보인다. Embryonic development 과정에서 뿐만 아니라, WAT은 주로 triglyceride (TG) 형태를 식이를 통해 에너지를 저장하고 운동과 섭식제한(caloric restriction) 등의 여러가지 환경적인 영향에 의해 급격하게 달라지게 된다. 특히 선진국을 중심으로 전세계적인 의료 및 사회문제가 되고 있는 비만과 2형 당뇨 및 대사성 질환(metabolic diseases)에 핵심 기관으로 adipose tissue의 중요성이 부각되고 있다. 여기에 WAT은 adipose expansion과정을 거치면서 혈관과 다양한 면역세포를 불러오고 이를 통해 염증반응(inflammation) 및 cytokine 분비를 매개하는 면역기관으로 역할을 한다. BAT은 많은 설치류의 interscapular (등쪽)에 있으며, 사람의 경우 유아 시절 등 부위에 분포하다가 성인이 되어 beige/browning adipose tissue (베이지색 지방조직) 형태로 존재한다. 미토콘드리아의 단백질인 uncoupling protein 1 (UCP1)은 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)를 통해 ATP를 만드는 대신 proton \( \left(\mathrm{H}^{+}\right) \)방출을 통한 열발생 (thermogenesis)이 이루어지고 결국 에너지를 소비하게 된다. 그러나, 현재까지 대부분의 adipocytes (지방세포) 연구는 세포배양 수준에서 연구되고 있고, 인간이나 마우스 동물 모델 등이 중심이 되는 in vivo 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서 비만, 당뇨 및 대사성 질환 치료제 개발을 위해 adipose tissue의 생리학적, 분자생물학적 관점에서 adipocyte 연구가 필수적이라 할 수 있다.</p><p>Adipose tissue는 간(liver)과 함께 포유동물에서 lipid가 아닌 탄수화물(carbohydrate)을 비롯한 다른 nutrients (영양소)로부터 fatty acid를 합성하는 새로운 lipogenesis (지방합성)인 de novo lipogenesis (DNL)의 핵심 장기이다. 중간엽줄기세포(MSCs; mesenchymal stem cells)에서 preadipocytes (지방전구세포)로 분화 후 DNL과정을 거치면서 mature adipo-cytes로 최종 분화가 된다. DNL은 결국 지방축적에 중요한 fatty acid synthesis (지질합성)과정이며, 실험 쥐의 경우 태어난 뒤(postnatal) 어미의 젖을 먹는 시기(maternal breast milk feed period) 이후, 탄수화물 위주 식이(carbohydrate-rich diet) 사료를 본격적으로 먹기 시작하면서 급격하게 adi-pose expansion이 일어나고, 이는 adipose tissue의 DNL 때문일 것이다. 탄수화물 식이가 adipocytes로 공급이 되면, 기본적으로 glycolysis (해당과정)와 tricarboxylic acid (TCA) cycle 을 통해 glucose가 citrate로 전환된다. 미토콘드리아 TCA cy-cle에서 세포질로 나온 citrate는 fatty acid synthesis 역할을 하는 DNL 핵심 효소인 ATP citrate lyase (ACLY), acetyl-CoA carboxylase \( \alpha / \beta \) (ACACA/ACACB, 또는 ACC1/ACC2), fat-ty acid synthase (FASN), 및 stearoyl-CoA desaturase-1/2/3/4 (SCD1/2/3/4)를 통해 순차적으로 대사과정(metabolic process)을 거치면서 fatty acid로 전환된다. 이후 fatty acid는 TG로 전환되어 adipocyte에 lipid droplet (지질 방울) 형태로 저장이 된다. 이 대사(metabolism)는 TG synthesis 효소인 glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAM 또는 GPAT1), 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase-1/2 (AGPAT1/ 2), LIPIN1, 그리고 diacylglycerol O-acyltransferase 1 (DGAT1) 효소가 순차적으로 작용하여 fatty acid의 glycer-ol-3-phosphate 에스테르 반응을 통해 최종적으로 TG가 합성되는 과정이다. 본 리뷰논문에서는 adipocyte lipo-genesis 과정과 in vivo adipose expansion에서 중요한 DNL 유전자 발현(gene expression) 조절 기전에 대해 논의하고자 한다.</p> <h2>Adipocyte에서 lipogenesis 전사조절인자</h2><p>일반적으로 통용되는 용어인 adipogenesis, 즉 early phase of adipogenesis가 adipocyte 분화과정의 운명을 결정짓고 근원적인 adipose tissue development 과정에 초점이 맞추어져 연구되어 왔다. 한편 lipogenesis 과정은 adipocyte 생리 기능에 중요하고 나아가 비만으로 가는 과정 및 대사질환이 유발되는 질병학적인 측면에 있어 중요하다고 볼 수 있다. 이에 lipogenesis 전사조절인자로 중요한 lipogenic TFs와 coactiva-tor로 역할을 하는 Mediator coativator complex에 대해 초점을 맞추어 알아보고자 한다.</p><h2>ChREBP</h2><p>탄수화물 유래 포도당 대사산물에 의해 활성화되는 것으로 알려진 ChREBP는 basic helix-loop-helix/leucine zipper TF이고 같은 유전자에서 발현되지만 다른 promoter에 조절을 받는 형태인 alternative splicing isoform으로 ChREBP\( \alpha \)가 먼저 발현이 되고 피드백 조절을 통해 ChREBP \( \beta \)가 발현이 된다. ChREBP\( \alpha \)는 세포질에서 포도당에 의해 활성화되어 핵 내로 이동하여, N-terminal 부분이 짧은 ChREBP \( \beta \)의 전사를 촉진한다. ChREBP \( \beta \)는 ChREBP\( \alpha \)보다 전사활성이 20 배 이상 높고 DNL 유전자 발현에 핵심 lipogenic TF로 작용한다. ChREBP \( \beta \) 형태와 유사한 constitutively active 형태인 CA-ChREBP를 마우스의 WAT에 과발현하면 DNL 효소 ACLY, ACC1, FASN, SCD1의 유전자 발현이 증가되는 것이 보고되었다. 또한 chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) 기법을 이용하여 ChREBP의 유전체 결합부위를 마우스 WAT 에서 알아본 결과 Acc, Fasn, Chrebp 유전자에 타겟이 된다는 것이 보고되었다. 실제로 Adipose tissue 특이적인 \( \mathrm{Cre} \) 마우스 모델인 Adipoq-Cre를 이용한 Chrebp KO 마우스에서 Acc1, Elovl6, Fasn, Scd1 유전자 발현이 감소하는 것이 보고되었다. 그러나 Chrebp KO 마우스에서 전반적으로 WAT와 BAT의 양적인 변화는 적으며, 이는 SREBP1과의 compensatory (보상) 효과로 여겨진다. 신호전달 및 분자기전 측면에서, ChREBP 는 DNL 유전자 발현을 유도할 때 PPAR \( \gamma \) 전사활성을 조절하며, 인슐린에 의해 활성화되는 serine/threonine kinase 인 AKT2에 의해 ChREBPß 전사활성이 조절되는 것이 보고되었다.</p><h2>SREBP 1</h2><p>Basic helix-loop-helix/leucine zipper 계열인 SREBP1 역시 adipocyte에서 중요한 DNL 유전자 발현 조절 TF 이다. SREBPs는 membrane-bound TF로 fatty acid 및 콜레스테롤 대사에 중요한 것으로 알려졌다. 신호전달 및 분자기전 측면에서, endoplasmic reticulum membrane에 존재하고 인슐린에 의해 활성화되는 두개의 단백질 분해효소인 S1P와 S2P에 의해 잘려지고 N-terminal fragment가 핵 내로 이동하여 TF로 작용한다. SREBP2는 Srebf2 유전자로부터 발현되고 SREBP1 과는 다르게 콜레스테롤 대사에 보다 중요한 역할을 한다. SREBP1은 Srebf1 유전자에서 첫번째 exon이 alternative splic-ing을 통해 transactivation domain이 조금 더 긴 SREBP1a와 짧은 SREBP1c로 발현이 되며, SREBP1c의 경우 주로 간에서 DNL 유전자 발현에 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Adipose tissue에서는 SREBP1c를 과발현하면 adipo-genesis가 억제가 되는 반면 SREBP1a를 과발현한 경우 lipo-genesis 효소의 발현이 증가하고 lipid가 축적되는 것이 보고되었다. 이러한 결과는 adipocyte에서 DNL 유전자 발현에는 SREBP1c보다는 SREBPla가 중요할 수 있다는 것을 시사한다. 그러나 SREBP1 whole body KO 마우스의 경우 WAT의 양이나 DNL 유전자 발현에 큰 영향이 없는 것으로 보고되어, 아마도 SREBP2나 ChREBP와의 compensatory 효과가 adipose tissue에서 작용한다고 생각해 볼 수 있다.</p>	생명

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