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금앵자 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1 지방세포의 분화억제 효과와 그 메커니즘 규명	<h2>RLE에 의한 분화초기세포 증식 억제(Clonal expansion 억제)</h2> <p>지방세포로의 분화 초기단계에서 contact inhibition에 의해 증식이 정지되어 있던 세포는 지방세포 유도 복합체에 의해 다시 세포 증식을 시작하는데, 이 과정에서 핵심적인 역할을 하는 인자가 바로 \( \mathrm { C } / \mathrm { EBP } \beta \)이다. Fig.4A에서 \( \mathrm { C } / \mathrm { EBP } \beta \)의 발현이 RLE에 의해 저해됨을 확인하였기에, RLE가 지방세포 유도 복합체에 의한 세포 증식, 즉 clonal expansion 단계를 저해시킬 것이라 판단하고, 이를 확인하기 위해 trypan blue exclusion assay를 통해 생세포수를 확인하였다. 그 결과 대조군의 세포 증식은 0시간일 때 \( 100 \% \)라고 봤을 때 24,48 시간에는 \( 154.77, 225.1 \% \)의 증식을 보였지만 RLE \( 900 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리군은 \( 119.6,158.03 \%, \mathrm { RLE } 1000 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리군은 \( 101.59,127.85 \% \)로 증식이 억제됨을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 증식 억제 효과는 RLE를 처리하기 전 confluent 상태, 즉 Day 0에서의 세포수와 비교하였을 때 RLE 처리 이후 생세포수의 감소는 유도되지 않는 것으로 보아 세포 독성에 의한 효과는 아닌 것으로 사료된다. 따라서, RLE는 3T3-L1 세포의 분화초기 clonal expansion 단계에서 세포증식 억제를 통해 지방세포로의 분화를 억제하는 것으로 사료된다.</p> <h2>RLE에의한 3T3-L1 지방전구세포의 G1기에서의 세포주기 정지 효과</h2> <p>위의 결과에 의하면, RLE는 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 초기 단계에서 세포 분열을 억제시킨다. 즉, 정지된 세포주기가 MDI로 인해 다시 진행될 때, RLE의 작용에 의해 세포주기 진행의 변화가 있을 것으로 생각되어 Muse \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Cell Analyzer를 이용하여 세포주기 분포도를 확인하였다.</p> <p>Fig. 6 에서와 같이 RLE를 처리하지 않고 MDI와 \( 0.5 \% \) \( \mathrm { DMSO } \)를 처리한 대조군의 G1기의 세포 비율은 \( 42.9 \% \)로 나타났으나, RLE를 처리한 군들의 G1기 세포 비율은 RLE 처리 농도가 높아질수록 점점 증가하여 최고농도인 \( 1000 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } \)에서는 \( 82.1 \% \)로 나타났다. 이러한 결과는, RLE가 clonal expansion 단계에 있는 지방세포의 세포주기를 G1기에서 정지시킴으로써, 지방세포로의 분화를 억제시킨다는 것을 나타낸다.</p> <h2>세포 독성</h2> <p>RLE의 독성을 알아보기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate \( \left(5 \times 10^{3}\right. \)cells/well)에 seeding 하고 24 간 배양하였다. 이후, 대조군으로 \(0.5\%\) DMSO(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 처리하였으며, RLE를 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하고 48시간 배양하였다. WST-1 reagent를 각 well에 \( 20 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 30분 반응시킨 다음 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>분화초기와 분화후기에 발현되는 전사인자들의 발현양상 확인</h2> <p>RLE에 의한 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 과정동안 발현되는 전사인자들의 발현변화를 확인하기 위해, 지방전구세포에 MDI와 함께 RLE를 처리하고 2일 후 세포를 회수하여 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \) 발현 양상을 확인하였다(Day 2). 또한 지방세포 분화 후기에 발현되는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)와 \(\mathrm{PPAR} \gamma \)의 발현양상을 확인하기 위해 MDI와 RLE를 함께 처리하여 2일간 반응 시킨 다음, FBS가 첨가된 DMEM 배지에 insulin만 처리할 때 RLE를 함께 처리하여 4일간 반응시킨 다음 세포를 회수하였다(Day 6).</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>RLE를 처리한 3T3-L1 세포를 회수하여 PBS로 washing한 후, lysis buffer(Cell signaling technology, Danvers, MA, USA)를 세포에 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 용해시킨 후 \( 14,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액의 단백질 농도는 BCA법을 이용하여 정량 한 후 동량의 단백질을 (SDS)-polyacrylamide gel에서 전기영동하였다. 전기영동 후 gel 내의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 전사시키고 Blocking solution[0.15 M NaCl, \( 1 \mathrm{M} \) Tris-\( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 7.5), 0.1\% Tween- \( 20,5 \% \mathrm{BSA}] \)을 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 blocking 시켰다. 1차 항체는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 반응시켰으며, TBS[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}] \)에 \( 0.1 \% \) Tween-20이 첨가된 buffer를 사용하여 membrane을 washing 한 다음 2차 항체를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 반응시켰다. 면역반응 단백질은 화학발광시스템(Chemi-luminescence system; Super Signal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다. 본 실험에 사용한 1차항체는 Cell signaling technology(Danvers, MA, USA)에서 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta, \mathrm{Rb} \), phospho-Rb를 구입하였으며, Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 p21, Cyclin E, Cdk2, Actin를 구입하여 사용하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP, anti-mouse IgG-HRP는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>비만이란 섭취한 에너지와 소비하는 에너지 사이의 심각한 불균형으로 인하여 신체 내 지방이 축적되는 현상으로, 고지혈증, 간기능 이상, 당뇨병, 고혈압, 심혈관계 질환 등의 성인병이나 각종 암 발병의 직·간접적 원인이 되고 있어 비만의 치료 및 예방이 시급한 실정이며, 이를 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 체내 지방은 지방전구세포가 지방세포로 분화한 후 지방세포의 증식과정에서 지방이 축적되는 현상이다. 지방전구세포가 과다 분화하거나 분화된 지방세포가 과다 증식하면 지방세포의 수가 많아지고, 지방세포 내 지방 축적량이 증가할수록 지방세포의 크기가 커져 비만으로 이어질 수 있다. 따라서, 지방세포의 증식 및 분화 억제, 지방세포 내 지방축적 억제 및 축적된 지방의 분해를 통해 비만을 억제할 수 있다.</p> <p>지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정은 세포의 형태나 호르몬 감수성, 다양한 유전자들 상호작용 등이 동반되는 복합한 과정이다. 이러한 반응은 여러 가지 전사인자들의 단계적 작용에 의해 일어나는데, 그 중 CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBP) family와 peroxisome proliferator activated receptor \( \gamma \)가 가장 대표적인 전사인자로 알려져 있다. 지방전구세포인 3T3-L1은 confluence 상태 즉, 세포 배양용 dish에 세포들이 가득 차면 contact inhibition으로 인하여 세포 주기가 정지되어 세포의 성장이 멈추게 된다. 이 상태에서 지방세포 유도 복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine)를 처리하면 정지된 세포주기가 다시 진행되어 세포의 수가 2-3배 늘어나게 되는데, 이 과정을 clonal expansion 단계라 부르고, 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화 될 때 매우 중요한 과정이며, 이 과정이 진행되지 않으면 분화가 일어나지 않는다고 보고되어 있다. 지방세포의 clonal expansion 단계에서 핵심적인 역할을 하는 인자는 바로 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)이다. 지방세포 유도 복합체 처리에 의해 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \delta \)의 발현이 유도되고 세포주기의 진행이 시작된다. 또한 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)와 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)의 promoter에 결합하여 발현을 유도한다. 지방세포의 분화를 조절하는 핵심 인자인 \( \mathrm{C} / \) \( \mathrm{EBP} \alpha \) 와 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)가 발현이 되면 지방세포 유도 복합체에 의해 진행되던 세포 주기가 다시 정지되며, \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)와 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)가 서로 상호 작용을 하면서 다양한 지방세포의 분화 및 지방합성과 저장에 관여하는 유전자들의 발현을 유도하여 세포 내 지방이 축적되고 분화가 완료된다.</p> <p>금앵자(Rosae laevigata fructus)는 열대지방에서 자라는 상록성 관목의 장미과 식물이며 그 열매와 뿌리를 약용으로 이용한다. 금앵자는 가시가 있고 마치 적갈색의 작은 석류와 흡사한 모양을 하고 있으며 열매 속에 30-40개의 황갈색 종자가 들어 있다. 금앵자의 성미는 평(平)하고, 시고 떫은 맛이 난다. 성분으로는 꽃받침과 열매에 유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌이 있다. 한방에서는 금앵자의 꽃받침과 열매를 강장, 수렴, 지사, 유정, 유뇨, 빈뇨, 만성장염, 설사 등에 사용되어 왔다. 금앵자의 항산화효능, 혈액성 상에 관한 연구, 항염증 효능에 관한 연구가 보고되어 있으나, 항비만 효능에 관한 연구는 아직 보고되어 있지 않다.</p> <p>본 연구에서는 금앵자가 항비만 효능을 가지고 있는지 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포를 인위적으로 분화시킬때 금앵자 추출물을 처리하여 나타나는 변화를 확인하였고, 지방세포 분화에 관련된 인자들인 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta, \mathrm{PPAR} \gamma \) 등의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 분화 초기 지방세포 유도 복합체에 의해 세포가 증식하는 과정에서 금앵자가 미치는 영향을 확인하였다.</p> <h2>G1 arrest 관련 단백질의 발현변화</h2> <p>RLE가 분화 초기 지방세포 유도 복합체인 MDI 처리에 의한 세포의 증식 유도 단계에서, G1기에서 세포 주기를 정지시킴으로써 세포의 증식을 억제함을 확인하였다. RLE에 의한 G1기로의 세포주기 정지에 대한 분자기전을 확인하기 위해 세포주기 조절에 관여하는 단백질들의 발현 변화를 western blot analysis를 통해 확인하였다. 세포주기는 Cyclin에 의한 cyclin-dependent kinase(Cdk)의 활성화 및 Cdk inhibitor의 발현에 의해 조절된다. 그 중 G1기에서 S기로 진입하는 단계에서는 Cyclin E가 발현되어 Cdk2를 활성화시켜 세포주기가 진행된다. 그러나 어떠한 요인에 의해 Cyclin과 Cdk 발현이 정상적으로 유도되지 않으면, 필요한 단백질의 합성이 충분히 진행될 때까지 세포주기가 정지된다고 알려져 있다. 또한 Cyclin E와 Cdk2가 활성화 되면 \( \mathrm{Rb} \)를 인산화시키게 되는데, \( \mathrm{Rb} \)가 인산화되면 DNA 복제를 진행시키는 전사인자가 발현되어 S기가 시작된다.Cdk는 다양한 증식 억제 신호들에 의해 발현되는 Cdk inhibitor인 p21에 의해 그 활성이 억제된다고 알려져 있다. 3T3-L1 지방전구세포에 MDI와 다양한 농도의 RLE를 동시에 처리하여 배양한 후, 회수하여 G1기에서 S기로의 전이에 관여하는 단백질들인 Cdk2, Cyclin E, Rb, phosphor-Rb 및 p21의 발현변화를 검토하였다. 그 결과 RLE의 농도 의존적으로 Cdk inhibitor인 p21의 발현이 증가하였고, Cyclin E와 Cdk2, phosphor-Rb의 발현은 감소됨을 확인하였다(Fig. 7). 이는 RLE에 의해 증가된 Cdk inhibitor인 p21이 CyclinE/Cdk2 complex에 결합하여 CyclinE/Cdk2 complex의 활성이 저해되고 따라서, 이후 단계의 \( \mathrm{Rb} \)의 인산화가 억제되어 S기로의 진행이 저해되고 G1기에서 세포주기 정지가 유도되었을 것으로 사료된다.</p> <p>본 연구에 사용된 금앵자는 장미과의 금앵자 나무 열매를 건조한 것으로, 유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌 등의 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 금앵자가 속해있는 장미과 식물 중 비파엽, 용아초, 복분자, 산사 등에 의한 지방세포 분화억제 효능에 대한 보고가 있다. 그 중 비파엽은 3T3-L1 cell에서 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현 억제를 통해 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로, 금앵자 추출물의 효능 및 작용 메커니즘이 유사한 것으로 사료된다. 또한 용아초 \( \mathrm{EtOH} \) 추출물은 지방축적이 유도된 HepG2 세포내에서 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)의 발현 억제를 통해 지방 축적을 억제시키고, 그 외 복분자 열매 추출물이나 산사 약침은 지방세포의 분화 억제 효능은 확인되었으나 메커니즘에 대한 연구는 아직 진행되지 않은 상태이다. 또한 비타민 C, 탄닌, 사포닌 등 금앵자에 포함된 성분에 대한 항비만 효능도 다수 보고되어 있다. 그러나 본 연구에 사용된 금앵자는 항염증, 항산화 등에 대한 보고 외에 항비만 효능에 대한 보고는 본 연구팀이 최초이며, 금앵자 추출물이 지방세포의 분화에 관련된 핵심 전사인자들의 발현을 저해하는 것은 비파엽 추출물의 메커니즘과 유사하다고 할 수 있다. 그러나 금앵자 추출물은 지방세포의 분화에 중요한 단계인 clonal expansion에서 세포의 주기를 G1기에서 정지시킴으로써, 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 보다 효과적으로 억제시킬 것으로 사료된다. 따라서 금앵자는 지방세포의 분화 억제활성을 나타내는 성분의 규명 및 실험 동물 내에서의 지방 억제 효능에 대한 연구 등 항비만 활성과 관련된 기초연구를 위한 소재로 활용이 가능할 뿐만 아니라 기능성 식품 등의 소재로도 활용이 가능할 것으로 사료된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>금앵자 추출</h2> <p>금앵자(Rosae laevigatae fructus) \( 100 \mathrm{~g} \)을 분말화 한 다음, \( 30 \% \mathrm{EtOH} 1 \mathrm{~L} \)를 넣고 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 3회 반복하여 추출하였다. 추출액은 ADVANTEC filter paper 2(ADVANTEC, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고 감압 농축하여 추출물 \( 29.75 \mathrm{~g} \)을 얻었다. 이후 금앵자 \( 30 \% \) EtOH 추출물을 RLE(Rosae laevigatae fructus \( 30 \% \mathrm{EtOH} \) extracts)로 표기하고자 한다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양</h2> <p>3T3-L1(mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구세포는 ATCC(American type culture collection)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea)에 \( 10 \% \) bovine calf serum(BCS, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea), antibiotics(penicillin/streptomycin 100 units/ml, Bioshop, Burlington, Ontario, Canada)를 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>지방세포로의 분화</h2> <p>지방전구세포인 3T3-L1을 지방세포로 분화시키기 위하여 35-mm dish(SPL Life Sciences, Seoul, Korea)에 \( 5 \times 10^{4} \)cells/dish의 농도로 세포를 seeding한 후, \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin solution(100 units/ \( \mathrm{ml} \))이 첨가된 DMEM 배지로 confluence 상태가 될 때까지 배양하였다(Fig. 1, Day 0). 그 후, 지방세포 분화 유도제인 MDI \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), \( 0.25 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), \( 0.5 \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)]를 첨가한 DMEM 배지를 세포에 처리하여 2일간 배양하였다(Day 2). 이후, 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하여 4일간 배양하였고(Day 6), 완전 분화를 위해 DMEM에 \( 10 \% \) FBS, antibiotics를 첨가하여 2일간 더 배양하였다(Day 8). RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향은 MDI나 insulin 처리시, RLE를 함께 처리하여 확인하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색</h2> <p>RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 MDI와 insulin 처리 및 완전분화를 위한 배지에 RLE를 함께 처리하였다. \( 0.5 \% \mathrm{DMSO} \)를 처리한 대조군이 \( 100 \% \) 분화가 되었을 때, 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline(PBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 cell을 washing 한 후, \( 10 \% \) formalin(Junsei Chemical, Tokyo, Japan)을 처리하여 실온에서 1시간 고정시켰다. Formalin을 완전히 제거한 다음 \( 60 \% \) isopropanol(Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA)로 헹군 뒤 Oil Red O working solution 을 넣고 실온에서 10 분간 염색을 하였다. 이 때 Oil Red O working solution은 \( 0.35 \mathrm{~g} \) Oil Red O powder(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 \( 100 \mathrm{ml} \) isopropanol에 녹인 뒤 증류수에 \( 6: 4 \)의 비율로 희석한 다음 여과하여 사용하였다. 염색 후 Oil Red O working solution을 완전히 제거하고 증류수로 4 번 washing한 뒤 현미경으로 세포의 염색 상태를 확인하였으며, 흡광도 측정을 위하여 \( 100 \% \) isopropanol에 용출시켜 spectrophotometer를 이용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>RLE의 지방세포 내 triglyceride 축적억제 효과 확인</h2> <p>RLE가 지방세포 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포가 confluent 상태가 된 이후 전체 분화 과정 동안 \( 100-1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 RLE를 함께 처리하여 지방세포 내 triglyceride 축적 정도를 확인하였다. 그 결과 RLE를 처리하지 않고 \( 0.5 \% \mathrm{DMSO} \)를 처리한 대조군의 분화 정도를 \( 100 \% \)로 하였을 때, RLE를 농도별로 처리한 실험군들의 triglyceride의 축적율이 RLE의 농도가 증가할수록 감소하였다(Fig. 2). 그러나, RLE의 농도 100-500 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 효과가 미미하였고, \( 600 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)부터 triglyceride 축적억제 효과가 뚜렷하게 나타나, 최고 농도인 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 대조군에 비해 약 \( 84 \% \)의 triglyceride 축적억제 효능을 나타내었다. 따라서 RLE는 지방전구세포에서 지방세로로의 분화를 억제하는 효능이 높은 것으로 사료되며, 이후 실험은 triglyceride 축적 억제 효능이 뚜렷하게 나타나는 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도의 RLE를 사용하였다.</p> <h2>RLE의 3T3-L1 세포에서의 독성확인</h2> <p>앞서 확인한 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효능이 세포 독성에 의한 효능인지 확인하기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System을 사용하여 세포생존율을 확인하였다. Triglyceride 축적억제 효과가 있는 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 RLE 농도로 세포 생존율을 확인한 결과, RLE 농도 \( 600,700,800,900 \) 그리고 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 각각 \( 99.5 \pm \)\( 4.74,95.6 \pm 4.64,90.35 \pm 6.63,94.06 \pm 2.97,85.59 \pm 4.03 \% \)로 측정되었다(Fig. 3). 따라서 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효과는 3T3-L1에 대한 독성 효과는 아닌 것으로 사료된다.</p> <h2>RLE에 의한 지방세포 분화관련 전사인자의 발현 변화</h2> <p>지방세포의 분화는 peroxisome proliferation activated receptor gamma(\( \mathrm{PPAR} \gamma \)), CCAAT enhancer binding protein \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \) family라고 불리는 전사인자들이 중추적인 역할을 담당하며 다양한 상호작용을 통해 조절된다. 지방세포 유도 복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine)는 이러한 전사인자의 발현을 촉진함으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면 지방세포 분화 관련 전사인자들의 발현 저해를 통하여 지방 세포로의 분화를 억제하고 지방 축적 감소 등을 야기시킬 수 있으므로, 이는 항 비만 물질 탐색의 기작 연구에 가장 많이 쓰이는 방법 중 하나이다. 따라서, RLE에 의한 지방축적 억제 효과가 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자들의 발현 변화와 관련되는지 알아보았다.</p> <p>\( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)는 지방세포의 분화초기에 MDI에 의해 발현되는 단백질로 지방전구세포에 MDI와 RLE를 2일간 복합처리 한 후(Day 2) 세포를 회수하여 단백질 발현 양상을 확인한 결과 RLE를 처리한 실험군의 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 발현량이 대조군 보다 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 또한 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 자극을 받아 발현하는 단백질들로, adipogenesis에서 중요한 transcription factor로 널리 알려져 있고, 지방세포 완전분화의 지표로 사용된다. RLE에 의한 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현량의 변화를 확인하기 위해, MDI와 RLE를 복합 처리하여 2일간 반응시키고, insulin과 RLE를 4일간 복합처리 한 후 단백질 발현 양상을 확인한 결과(Day 6), RLE의 농도 의존적으로 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현이 감소하였다(Fig. 4B). 따라서, RLE는 지방세포의 분화 초기에 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 발현을 저해시킬 뿐 아니라, 이후 분화 전체 단계에서 중요한 역할을 하는 \( \mathrm{PPAR} \gamma \) 및 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현 또한 저해시켜 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로 사료된다. 즉, RLE는 지방세포의 분화를 유도하는 핵심 전사인자들의 발현을 저해하여 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 사료된다.</p>	생명
	<h1>서 론</h1><p>쌀은 동남북아시아 국가에서 주식으로 사용되는 주요 곡물로서 전 세계적으로 5,670만톤이 생산되며, 이중 약 \( 91 \% \)가 아시아에서 생산된다. 쌀의 생산량은 매년 증가하는 추세지만 서구화된 식습관에 의해 밀의 소비량은 증가하는 반면 상대적으로 쌀의 소비량은 낮아지고 이로 인해 잉여쌀로 쌀 가공식품을 개발하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 또한 가공식품 제조 후 생성되는 쌀 가공부산물의 양도 쌀 가공식품의 증가와 함께 늘어나고 있다. Rhee 등은 쌀 부산물을 이용하여 가식성 필름을 제조하였고 Gnanasambandam 등은 쌀 도정 중 부산물로 생성되는 미강으로부터 단백질 농축물을 제조하였으며 Cho 등은 도정 부산물로부터 색소를 분리하거나 떡 고물 및 소를 제작하였다. 과거에는 쌀 단백질을 미강으로부터 알칼리 추출하여 등전점 침지법으로 제조하거나 쌀을 분쇄하여 효소를 사용한 다음 전분질을 제거하는것이 주요 방법이었으나 기능성과 비용적인 문제가 있어서 다른 단백질들에 비해 식품산업에 널리 이용되지 못하고 있다. 쌀 단백질의 새로운 활용방법으로서 Shih는 쌀 가루를 효소 처리하여 전분을 제거함으로써 쌀 단백질 농축물을 제조하여 pullulan과의 혼합 가식성필름을 제조하였다. Park 등은 쌀 부산물을 초미세분쇄/공기분급을 이용하여 특성을 연구하였고, Gnanasambandam 등은 쌀 도정 중 부산물로 생성되는 미강으로부터 가식성 필름을 제조하였으며, Jang 등은 쌀 부산물을 파운드 케이크에 첨가하여 품질특성을 연구하였다.</p><p>이러한 쌀을 효소처리 하여 물엿이나, 엿, 조청 등을 제조하고 부산물이 남게 되는데, 그 양은 하루에 \(25~30 \mathrm{ton} \)으로 아주 많으며 영양적 가치 또한 높아서 폐기처분하지 않고 이들 대부분을 가축사료로 사용하고 있다. 하지만 쌀 부산물을 가축사료로 사용하는 방법 외에도 단백질 등을 추출하여 식품첨가물로써 활용하는 방안이 연구되고 있으며, 특히 쌀로부터 분리한 쌀 단백질은 식물성 단백질의 급원으로서 가장 많이 사용되고 있는 분리대두단백(Soy Protein Isolates, SPI)이나 우유단백(Whey Protein)과 달리 오랫동안 아시아에서 주식으로 사용된 쌀로부터 유래된 단백질로써 알레르기 작용이 거의 없고 필수아미노산이 풍부한 것으로 알려져 있다.</p><p>쌀 시럽박은 당, 지방 등을 소량 함유하고 있지만 단백질과 식이섬유가 주성분을 이루고 있으며 단백질의 함량은 쌀이나 밀, 보리보다 높다. 따라서 쌀 부산물의 식품소재로서의 이용을 위해 Sharif 등은 쌀 부산물을 쿠키에 첨가하여 특성을 연구하였으며, Ghosh 등은 쌀 부산물로부터 산, 알칼리 분해방법을 이용하여 단백질 가수분해물을 추출하여 특성을 연구하였다. 그러나 건물기준 \( 70 \% \) 이상의 단백질 성분을 protease로 단일 혹은 혼합 가수분해하고 그 특성을 조사한 연구는 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 상업적으로 쓰이는 단백질 분해 효소들을 단일 혹은 혼합으로 쌀시럽박에 처리하여 불용성 쌀 단백질을 수용성 단백질로 수용화하고 이렇게 얻어진 가수분해물의 특성과 효소의 혼합에 의한 시너지효과를 연구하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>일반성분 분석</h2><p>시료의 수용성 분획을 제거하기 위해 증류수로 수세를 하였고 수용성 분획의 제거는 수세 횟수에 따른 무게변화를 통해 알 수 있었다. 수세 횟수에 따른 무게 변화는 Fig. 2에 나타내었는데, 쌀시럽박을 4회 이상 수세하여 건조하였을 때 처음무게기준 건물량 \( 68.5 \% \)로써 그 무게 변화가 없는 것을 알 수 있었으며 3회 수세한 쌀 시럽박을 취합하여 건조한 후 이후 실험의 시료로 사용하였다.</p><p>쌀 시럽박의 일반성분을 Table 1에 나타내었다. 쌀 시럽박 내의 수분, 조단백질 및 조지방 함량은 각각 \( 0.62 \% \), \( 71.16 \%\), \(8.13 \% \)이었고 조회분 함량은 \( 0.94 \% \)이었다. 쌀 시럽박의 경우 쌀에 비해 단백질함량이 매우 높은 것을 알 수 있었는데, 이는 효소를 이용하여 쌀의 주성분인 전분을 당화시키는 과정에서 대부분의 전분이 제거되었기 때문에 상대적으로 단백질 함량이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.</p><h2>단일효소 처리</h2><p>단일효소 처리를 하였을 때 세가지 방법으로 측정한 단백질 함량의 변화를 Fig. 3에 나타내었다. Lowry protein assay, Kjeldahl protein assay 및 Gravimetric method를 이용하여 수용성 단백질 생성량의 경향을 비교분석 하였다. 이때 Lowry, Kjeldahl 그리고 Gravimetric method의 경우 Protease N을 처리한 시료는 각각 \( 59.02 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 70.43 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 85.36 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM을 나타내었고 Protease A의 경우는 각각 \( 27.17 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 62.73 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 58.31 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM을 나타내었으며 Protease M의 경우는 각각 \( 57.46 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 53.32 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, \( 80.00 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM을 나타냄으로써 같은 샘플 에서도 측정 방법에 따라 수용성 단백질 함량에 약간의 차이가 있는 것으로 나타났다.</p><p>Lowry protein assay의 경우 Protease N이 가장 큰 분해 정도를 나타내었고 Protease M과 Protease A의 순으로 분해 정도가 큰 것으로 나타났으며, Protease M과 Protease N은 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. Gravimetric method의 경우 Lowry protein assay와 마찬가지로 Protease N이 가장 큰 분해 정도를 나타내었고 Protease M 그리고 Protease A의 순으로 분해 정도가 나타났다. Kjeldahl method의 경우 Protease N이 가장 큰 분해 정도를 나타내었고, Protease A가 두 번째로 큰 분해 정도를 나타내었으며, 다음으로는 Protamex가 높은 분해율을 나타냄으로써 앞의 두 방법의 결과와는 다른 결과를 나타내었다. 3가지 방법에서 모두 효과가 좋았던 Protease N과 Protease A, 그리고 Kjeldahl method에서는 비록 분해율이 떨어졌지만 Lowry와 Gravimetric method에서 분해율이 좋았던 Protease M 이렇게 3가지 단백질 분해 효소의 효과가 좋음을 알 수 있었으며 3가지 효소 중 수용성 단백질 함량이 가장 높았던 Protease N의 경우 Gravimetric method로 측정하였을 때 전체 단백질 중 \( 12 \% \)의 분해율을 나타내었다.</p><p>쌀 시럽박과 유사한 보리 부산물인 맥주박에 protease 처리를 한 Faulds 등의 연구에서는 맥주박에 protease를 사용했을 경우 단백질의 \( 26 \% \)가 분해되어 식품에 상업적으로 쓰이는 protease가 곡물에 있어서는 쌀 시럽박과 마찬가지로 높은 분해율을 나타내지 못하는 것을 보여주었다. 이러한 낮은 분해율은 곡물에 존재하는 다량의 섬유질 중 hemicellulose나 lignin과 같은 물질이 단백질과 complex를 형성하여 효소의 가수분해를 방해하는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 현상의 주요 원인은 섬유질이 효소와 단백질의 binding site에 존재하거나 binding site를 둘러쌈으로써 가수분해를 방해하는 것으로 생각된다. Faulds 등은 이런 단점을 보안하기 위해 맥주박에 carbohydrase와 protease를 혼합하여 처리하였지만 분해율이 크게 증가하지 않는다고 보고하였는데 이는 효소에 의해 분해가 잘 되지 않고 잔존하는 lignin이 다당류와 세포벽에 결합되어 있는 단백질과 지속적으로 결합하여 단백질의 가수분해가 방해를 받기 때문이라고 하였다.</p> <h2>SDS-PAGE analysis</h2><p>Protein sample은 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel을 이용한 Laemmli의 방법에 따라서 전기영동을 하였다. Separating gel은 \( 10 \% \) acrylamide gel을 준비하였고, Running gel은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 1.9 \mathrm{ml}\), \(30 \% \) acrylamidemix \( 1.7 \mathrm{ml}\), 1.5M Tris \((\mathrm {pH} 8.8 \)) \( 1.3 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) SDS \( 0.05 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) ammonium persulfate \( 0.05 \mathrm{ml}\), N, N, N', N'-tetramethylethylenedi-amine (TEMED) \( 0.002 \mathrm{ml} \)의 조성으로 제조하였으며, Stacking gel은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 0.68 \mathrm{ml}, 30 \% \) acrylamidemix \( 0.17 \mathrm{ml} \), \( 1.0 \mathrm{M} \) Tris \( (\mathrm{pH} 6.8\)) \( 0.13 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) SDS \( 0.01 \mathrm{ml}, 10 \% \) ammonium persulfate \( 0.01 \mathrm{ml}\), N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) \( 0.001 \mathrm{ml} \)의 조성으로 제조하였다. Sample은 \(5 \times\) sample buffer [\(60 \mathrm{mM}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer \( (\mathrm{pH} 6.8\)), \(14.4\mathrm{mM}\) \(\beta\)-mercaptoethanol, \(2\%\) (w/v) SDS, \(25\%\) (v/v) glycerol, \(0.1\%\) (w/v) bromophenol blue]와 섞어서 10분간 끓인 다음 \( 12,000 \times \mathrm{g} \)으로 1분간 원심분리 시켜서 충분리를 시킨 후 아래층을 gel에 loading하였다. 전기영동은 \( 150 \mathrm{~mA} \)로 분리했으며, staining buffer (coomassie blue R-250 \( 1.0 \mathrm{~g} \), methanol \( 450 \mathrm{ml}, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \ 450 \mathrm{ml} \), glacial acetic acid \( 100 \mathrm{ml} \) )와 destaining buffer (methyl alcohol \( 100 \mathrm{ml} \), acetic acid \(100 \mathrm{ml}\), \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 800 \mathrm{ml} \) )를 사용해서 염색과 탈색을 하였다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>시료 \( 30 \mathrm{mg} \)을 \( 300 \mu l \)의 \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)에 녹인 후 \( 10 \% \) TCA solution을 \( 1: 1 \)의 비율로 첨가하고 10분간 원심분리 \( (12,000 \times g) \)하여 단백질을 침전 시켰다. 지방을 제거하기 위해 hexane을 \( 1: 1 \)의 비율로 첨가하여 지방을 녹인 후 5분간 원심분리 \( (12,000 \times g) \)를 하고 침전된 침전물을 아미노산 분석시료로 사용하였다. Sample은 \( 0.4 \mu \mathrm{m} \)의 filter로 여과한 후 Amino Acid Analyzer (Hitachi L-8900, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험은 3회 이상 반복 측정하고 SAS V8.02 (SAS Institute, Inc. 2002)를 사용하여 분산 분석 및 Duncan 다범위 검증(Duncan's multiple range test)을 실시하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>쌀 시럽박</h2> <p>본 실험에 사용된 쌀 시럽박은(주)동희(Yongin, Korea)에서 물엿을 제조 후 생성된 부산물을 수거하여 \( -19^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉동 보관하면서 해동하여 사용하였다.</p> <h2>효소</h2> <p>이 실험에 사용된 효소들은 상업적으로 널리 사용되는 Protamex (Novozyme, Bagsvaerd, Denmark), Neutrase (Novozyme), Flavourzyme (Novozyme), Alcalase (Novozyme), Protease M (Amino, Nagoya, Japan), Protease N (Amino), Protease A (Amino) 그리고 Molsin F (Seishin, Noda, Japan) 등 총 8가지의 효소를 구입하여 사용하였다.</p> <h2>시료의 수용성 성분 제거</h2> <p>쌀 시럽박에 존재하는 수용성 단백질을 제거하기 위해 쌀 시럽박 \( 100 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( 400 \mathrm{ml} \)를 가하여 5분간 교반 후 이를 20분간 원심분리\( (3,000 \times g) \)를 하여 얻어진 침전물을 dry oven에 24시간 동안 건조하여 무게를 측정하였다. 증류수를 가하여 수세하는 횟수에 따라 각각 무게를 측정한 후 그 무게의 변화가 없을 때의 시료를 수용성 성분이 완전히 제거된 시료로 결정하여 마쇄한 후 \(40 \mathrm{mesh}\)의 표준체를 통과시켜 이후 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>단일효소 처리</h2> <p>수용성 성분이 완전히 제거된 쌀 시럽박 \( 5 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( (28.3 \mathrm{ml}) \)를 첨가하여 \( 15 \% \) 현탁액 형태로 제조한 후 \(1\ \mathrm{N}\ \mathrm{HCl} \) 혹은 \(1\ \mathrm{N}\ \mathrm{NaOH}\)를 사용하여 기존에 알려진 효소들의 최적 \( \mathrm{pH} \)를 조절하고, 시료의 고형분 대비 \( 0.1 \% \)의 효소를 첨가한 후 각 효소들의 최적 온도에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 현탁액을 20분간 원심분리\( (3,000 \times g) \)하고 이때 얻어진 상등액과 침전물, 그리고 침전물의 건조 후 무게변화를 통하여 생성된 단백질의 양을 비교하였다.</p> <h2>혼합효소 처리</h2> <p>단일효소 처리로 얻어진 결과를 토대로 가장 효과가 좋은 효소인 Protease M (M), Protease N (N) 그리고 Protease A (A)를 각각 다음과 같이 2개 또는 3개의 효소를 4가지의 방법 (M+N, M+A, N+A, M+N+A)으로 흔합하여 단일처리와 같은 방법으로 최적 \( \mathrm{pH} \)와 최적 온도에서 4시간 동안 반응한 후 20분 동안 원심분리\( (3,000 \times \mathrm{g}\))하여 상등액과 침전물을 분리, 분석하였다.</p> <h2>단백질 분석</h2> <p>단백질분석은 총 3가지의 방법으로 분석하였다. 원심분리하여 얻어진 상등액 중의 수용성 단백질은 TP0300- 1KT Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 Lowry protein assay를 통하여 측정하였다. 또한 침전물은 Digester (MBCM12, Raypa, Barcelona, Spain), Distiller (DNP1500, Raypa, Barcelona, Spain)와 Titrater (Akku-drive, Hirschmann Laborgerate, Eberstadtt, Germany)를 사용하여 semimicro-Kjeldahl 법으로 측정하였으며, 무게변화를 통한 불용성 단백질의 변화량을 알아보기 위해 원심분리를 하여 얻어진 침전물을 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)의 Dry oven에서 24시간 건조한 후 처음 시료의 무게와 건조된 침전물의 무게 차이를 이용하여 단백질 변화량을 계산하고 3가지 방법의 값을 비교, 분석 하였다. 이때 각각의 분석방법에 대한 계산식은 다음과 같다.</p> <h3>-Lowry protein assay (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{P \times(28.3+E+C)}{S} \)</p> <ul> <li>P: Protein contents \( (\mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)</li> <li>E: Amounts of enzyme \( (\mathrm{ml}) \)</li> <li>C: Amounts of 1 N NaOH or HCl (\(\mathrm{ml} \))</li> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{~g}) \)</li></ul> <h3>-Semimicro-Kjeldahl (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{1.4 \times T}{S} \times 5.95 \)</p> <ul> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{g}) \)</li> <li>T: Amounts of 0.1 N HCl (\(\mathrm{ml}) \)</li></ul> <h3>-Gravimetric method (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{(S-W)}{S} \times 1,000 \)</p> <ul> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{g}) \)</li> <li>W: Weight of sample after drying (g)</li></ul> <h2>수분함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 시료 \( 2 \mathrm{~g} \)을 Forced convection dry oven (HB-502M, Hanbaek scientific co., Gyeonggi-do, Korea)을 이용하여 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 처리한 후 무게를 측정하여 수분함량을 계산하였다.</p> <h2>조회분 함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)을 Electric muffle furnace (LMF 1200, Carbolite/Sheffield, Hope, England)를 사용하여 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 처리한 후 무게를 측정하여 조회분 함량을 계산하였다.</p> <h2>조지방 함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 Refrigerated circulator (Isotemp 1006p, Pittsburgh, PA, Fisher Scientific, USA)를 사용하여 ether 추출을 하는 Soxhlet extraction을 하여 조지방 함량을 계산하였다.</p> <h2>혼합효소 처리</h2><p>단일 효소처리를 하여 가장 높은 분해율을 나타낸 Protease M, Protease N 및 Protease A 세가지 효소 중 두가지 혹은 세가지 모두를 혼합하여 쌀 시럽박의 단백질을 분해한 결과 단일에서 가장 효과가 좋았던 Protease N과 3가지 효소 모두 혼합한 것을 비교하였을 때 Lowry protein assay의 경우 단일처리 한 것은 \( 59.02 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, 혼합의 경우 \( 75.96 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이며, Gravity method는 단일처리 한 것은 \( 85.36 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, 혼합의 경우 \( 147.51 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이다. Kjeldahl 의 경우는 단일처리 한 것은 \( 70.43 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이고, 혼합의 경우 \( 93.80 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM 으로 모든 방법에서 효소를 혼합하였을 때 상승효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 단일 처리에서 가장 분해능력이 높았던 Protease N에 비하여 효소들을 두 개씩 혼합하여 단백질을 분해하여도 이들 간의 유의적인 차이가 인정되어 상승효과가 뚜렷했음을 알수 있었다. 이는 쌀 시럽박의 불용성 단백질 중 분해가 가능한 부분이 Protease N에 의해 완전히 분해되지 못하고 남은 단백질들이 다른 효소들에 의해 분해가 일어나기 때문으로 판단된다. 특히 상업적으로 사용되는 protease의 경우 크게 endo- 혹은 exo- 형태이며 서로 분해할 수 있는 아미노산이 틀리므로 Protease N이나 Protease M 혹은 Protease A가 각각 분해를 하지 못했던 아미노산을 분해하여 상승효과가 생긴 것으로 생각된다. Treimo 등의 실험에서도 쌀 시럽박과 유사한 부산물인 맥주박에 carbohydrase를 혼합하여 처리하였는데 protease와 마찬가지로 단일 처리하였을 때 보다 상승효과가 있는 것으로 나타났다. 이는 곡물의 탄수화물의 경우 당뿐만 아니라 cellulose, hemicellulose, lignin 등이 존재하여 carbohydrase가 혼합이 될수록 cellulose 혹은 lignin 등이 분해되어 상대적으로 단백질의 노출부분이 증가되고 효소가 반응할 수 있는 표면적이 증가하여 이런 상승효과를 나타낼 수 있는 것으로 알려졌다. 또한 protease는 각각 가수분해 할 수 있는 고유의 특정 아미노산이 있는데 이러한 특정 아미노산이 곡물에 풍부하면 protease의 가수분해 효과가 증가하는 것으로 알려져 있다.</p><h2>효소에 의해 분해된 단백질의 특성</h2><p>효소를 이용하여 분리한 단백질의 특성을 확인하기 위하여 단일효소를 사용한 경우 수용성 단백질을 가장 많이 생성한 Protease M, Protease N, Protease A와 혼합효소에서 가장 효과가 좋았던 Protease M+Protease N+Protease A를 선택하여 SDS-PAGE를 하였다. 효소처리를 한 모든 시료에는 어떠한 밴드도 형성이 되지 않는 것을 확인할 수 있었는데(data not shown), 이것은 쌀 시럽박에 존재하는 단백질이 \( 15\ \mathrm{kDa} \) 이하의 작은 크기의 polypeptide 혹은 amino acid의 형태로 분해가 된 것을 의미한다. Treimo 등이 연구한 맥주박의 경우도 protease를 맥주박에 처리 하였을 경우 분자량이 \( 10\ \mathrm{kDa} \) 미만의 polypeptide와 같은 물질들이 나타났고 대부분의 단백질은 \( 1\ \mathrm{kDa} \) 미만의 작은 peptide나 amino acid의 형태로 분해가 되는 것을 알 수 있었다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>단백질 분해 효소로 처리한 쌀 시럽박의 수용성 성분에 존재하는 아미노산의 조성을 분석한 결과를 Table 2에 나타내었다. 효소를 단일 혹은 혼합처리 하였을 때의 아미노산 조성은 특정 패턴을 보이지 않았으며 쓴맛을 유발하는 아미노산인 Leucine, Isoleucine, Valine, Phenylalanine, Arginine의 함량이 높은 것으로 보아 샘플의 쓴맛이 강할 것이라고 예상된다. 필수 아미노산인 Phenylalanine, Valine, Leucine, Isoleucine 등의 함량은 일반 쌀에 비해 높게 나타내었으며 특히 곡물의 제 1 제한 아미노산인 Lysine의 경우 효소의 종류에 따라 그 값의 차이가 있었지만 Protease M의 경우 일반 쌀에 비해 높은 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히 총 아미노산 함량의 경우 Protease M을 단일 처리하였을 때와 3가지 효소를 혼합하였을 때의 값이 비슷함을 확인 할 수 있었는데, 이는 Protease M의 경우 단백질을 분해할 때 peptide와 amino acid를 동시에 생성하고 자신이 생성한 peptide를 또다시 amino acid로 분해하는 특성을 가지고 있으므로 이러한 특징으로 인해서 효소를 혼합하였을때와 그 값이 비슷한 것으로 판단된다. 한편 효소처리 후 생성된 총 단백질 함량은 효소를 혼합할수록 증가하였지만 아미노산 함량은 단일과 비교하였을 때 비슷한 결과를 나타내었는데 이것 또한 Protease M의 특성으로 인해서 기인된 것으로 판단되며 상대적으로 효소를 혼합할수록 아미노산으로 분해되지 못한 polypeptide가 단일 처리에 비해 다량 존재할 것으로 생각된다.</p>	생명
CoCl2 처리로 유도된 hypoxia상태에서 세포자살과 ER stress에 관련된 인자의 발현	<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양</h2><p>PC12 cell를 \( 10 \% \) 마혈청과 \( 5 \% \) 우혈청(GIBCO)을 포함하고 있는 RPMI 1640 (JBI)배지 내에서 배양하였다. 배양조에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 이산화탄소, 그리고 충분한 습한 조건으로 \(2-3\)일 간격으로 배지를 교체하며 배양하였고, 1주일에 한번씩 계대배양하였다. 실험에 사용한 세포는 현미경하에서 \( 70-80 \% \) 정도의 세포 충실도를 보이는 것을 사용하였다.</p><h2>Hypoxia 및 ER stress 유도</h2><p>Hypoxia 유도약물 처리는 각각의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) (0.1 mM, Sigma), DFA \( (0.4 \mathrm{mM} \), Sigma)를 12시간 배양세포에 처리하였으며, ER stress 유도약물은 3시간 동안 tunicamycin ( \( 2 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} ; N \) 당 쇄형성 억제, Sigma)을 배양세포에 처리함으로써 유도하였다.</p><h2>Total RNA 분리</h2><p>각각의 실험별로 처리된 PC12 세포를 cold PBS로 한번 세척해 낸 후, RNA isolation reagent (TRI-REAGENT)을 \( 500 \mu l \) 넣고 2~3분 지난 후 scrapper로 긁어 모아 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 넣고 \( 100 \mu l \)의 chloroform을 첨가하여 충분히 섞어준 다음 \( 12,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 동안 원심분리 하였다. \( 500 \mu l \)의 상등액을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropanol 넣고 상온에서 10분 정도 처리한 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 10분 동안 원심분리하고 tube의 바닥에 얻어진 pellet에 \( 75 \% \) ethanol을 초기 RNA isolation reagent 양과 동일한 \( 500 \mu l \) 넣고 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 5분 동안 원심분리하여 최종적으로 total RNA를 얻었다. Total RNA는 DEPC가 처리된 sterilized distilled water에 녹여서 자외선 분광계로 정량하여 이후의 실험에 사용할때까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보존하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>Total RNA \( (3 \mu g) \)를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 가열하여 변성시킨후, ice에서 5분 이상 급랭하였다. \( 3 \mu l \)의 \( 5 \times \) RT buffer, \( 2.5 \mu l \)의 dNTP mixture (\( 2.5 \mathrm{mM} \) each), \( 0.6 \mu l \)의 oligo-dT (300ng), 1.6 U의 RNase inhibitor, 200 U의 reverse transcriptase(M-MLV)를 가하고, 총 반응액이 \( 15 \mu l \)가 되도록 조절한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 그리고 \( 30 \mu l \)의 DEPC가 처리된 증류수를 첨가하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 반응하여 spin down하였다. 이렇게 얻은 cDNA에 \( 35 \mu l \)의 DEPC가 처리된 증류수를 가하여 최종 \( 50 \mu l \)를 만들고, cDNA를 증폭하기 위하여 \(2 \times \) Dyemix (Enztnomics)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 denaturation, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초 ex-tension한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 final extension하여 30회 반복시키는 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR을 수행한 primer는 table 1로 정리하였다. PCR 산물 \( 3 \sim 5 \mu l \)를 \( 2 \% \) agar-ose gel 상에서 전기영동시킨 후 밴드를 확인한 후, TOMOROScopeEye 3.5 프로그램을 이용하여 PCR band를 정량화하여 그래프로 나타내었다. XBP1의 PCR 증폭 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 denaturation, \( 68^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 ex-tension한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 final extension하여 35회 반복시켰다. 이 후 PCR 산물 중에 \( 5 \mu l \)를 취하여 \( 1 \mu l \)의 \(10 \times \) restriction buffer와 5 U의 PstI 제한효소(Takara, Japan)를 가하여 총 반응액 \( 10 \mu l \)가 되도록 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후, \( 2 \% \) agarose gel에서 전기영동 시키고 UV 상에서 밴드를 확인하였다.</p><h2>Westem blot</h2><p>Protein electrophoresis kit (ATTO Co., Japan)를 사용하여 \( 12 \% \) SDS-PAGE에 준비된 sample을 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 transfer kit (Bio-RAD, USA)를 사용하여 gel의 protein을 PVDF cell membrane (PALL corporation, USA)에 transfer buffer (\( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( 150 \mathrm{mM} \) glycine, \( 20 \% \) meth-anol, \( \mathrm{pH} \) 8.3))를 사용하여 transfer하였다. Transfer가 끝난 후membrane을 PBST (PBS, \( 0.0.5 \% \) Tween 20)와 \( 5 \% \) skim milk를 사용하여 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. Blocking이 끝난 후 1차 반응 시킬 때에는 PBST와 \( 5 \% \) skim milk에 \(1:500\sim1:2,000\)의 비율로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 membrane을 PBST로 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 2차 항체를 반응 시킬 때에는 PBST에 \( 1: 2,000 \)의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응 시켰으며, 반응이 끝난 후 mem-brane을 PBST로 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 West save (Lab Frontier, Korea)을 사용하여 발색반응을 유도한 후 X-ray film에 감광하여 결과를 분석하였다.</p><h2>Hoechst 33342 staining</h2><p>각각의 실험별로 처리된 PC12 세포를 찬 PBS로 세 번 세척해 낸 후, \( 4 \% \) paraformaldehyde로 실온에서 30분간 고정하였다. 다시 PBS로 10분씩 세 번 세척해 낸 후, \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 Hoechst 33342 solution (Invitrogen)을 PBS에 \(1:1,000\)으로 희석하여 실온에서 10분간 암처리하여 염색하였다. 염색이 끝난후 PBS로 10분씩 세 번 세척한 후에 형광현미경(OlympusIX71)을 이용하여 핵의 파편화를 관찰하였다.</p>	생명
양식장 배출수 퇴적층에서 분리된 미생물의 다당분해효소 활성 및 특성	<h1>요 약</h1> <p>제주도 양식장 배출수 퇴적층에서 다당 분해효소를 생산하는 세균을 분리되었으며, 각각 ST-63, ST-140라고 명명하였다. 분리균주 ST-63의 16S rDNA의 염기서열 분석 결과 Bacillus amyloliquefaciens와 Bacillus velezensis의 염기서열과 \(99 \% \)의 상동성을 보였으며, BIOLOG를 이용한 생화학적 분석에서도 Bacillus amyloliquefaciens와 가장 유사한 특성을 보여 최종적으로 분리균주 ST-63을 Bacillus sp. ST-63으로 명명하였다. 또한 분리균주 ST-140의 16S rDNA의 염기서열 분석 결과 Pseudoalteromonas marina와 Pseudoalteromonas agarivorans의 염기서열과 \(99 \% \)의 상동성을 보였으며, BIOLOG를 이용한 생화학적 분석에서도 Pseudoalteromonas 종과 유사한 특성을 보여 최종적으로 분리균주 ST-140을 Pseudoalteromonas sp. ST-140이라고 명명하였다. 다당 분해효소 생산 균주인 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 증식을 위한 최적 배양온도를 확인하고 증식온도에 따른 다당 분해효소 활성의 변화를 조사하였다. 그 결과 균주 Bacillus sp. ST-63 는 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구 보다 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구에서 가장 높은 균 생육도를 보였으며, 효소활성에 대한 영향을 확인해본 결과 \( 20 \) ~ \(40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 모든 실험구에서 24시간 이후 매우 높은 활성을 보이는 것으로 나타나서 본 균주는 효소활성의 생산에 있어서 온도에 매우 민감하게 작용하지 않는 것으로 나타났다. 또한 Pseudoalteromonas sp. ST-140 균주는 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구보다 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구에서 가장 높은 균 생육도를 보였으며, 효소활성에 대한 영향을 확인해본 결과 \( 20 \sim 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양실험구 모두에서 24시간을 기준으로 효소활성이 계속적으로 증가하였으며, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양 실험구에서는 배양 시간 96시간에도 높은 효소활성을 보이는 것으로 나타났다. 그리고 분리균주가 배지의 초기 \( \mathrm { pH } \)에 따른 효소활성의 변화를 확인하기 위하여 \( \mathrm { pH } 4 \sim 10 \)범위의 배지를 사용하여 조사하였다. 그 결과 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140 균주 모두다 비슷한 결과를 보였으며, \( \mathrm { pH } \)6을 기준으로 효소활성이 급격히 증가하다가 7~8에서 최고 활성을 보였다. 차후 분리균주의 효소생산을 위한 최적배양조건 및 물질분리 방법을 통하여 미생물 유래의 효과적인 효소를 생산하는 기술을 개발할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>다당분해 효소 생산 미생물의 분리 및 동정</h2> <p>다당분해 효소를 생산 하는 미생물을 분리하기 위하여 총 200여 균주를 대상으로 실험해본 결과 colony 주변위에 \( 0.2 \% \)\((\mathrm{W}/\mathrm{V})\) KI-I2용액으로 염색하여 clear zone이 생기는 균주만을 amylase 분해능이 있는 균주로 확인되어, 총 10균주를 선별하 였으며, 이들 중 가장 amylase 활성이 좋은 균주를 선정하여 각각 ST-63, ST-140라 명명하였다.</p> <p>분리된 효소생산 균주의 생화학 특성을 조사한 결과를 Table 1, Table 2에 나타내었다. 분리균주 ST-63은 \( \beta \)-cyclodextrin, dextrin, tween 40, glycogen, arbutin, D-cellobiose, D-fructose, genfiobiose, maltose, maltotriose, D-mannitol, D-mannose, palatinose, D-psicose, salicin, D-sorbitol, sucrose 및 turanose, 등의 탄수화물이 대사됨을 확인하였다. 또한 분리균주 ST-140은 dextrin, glycogen, arbutin, D-cellobiose, D-fructose, gentiobiose, \(\alpha\)-D-glucose, palatinose, D-sorbitol, thymidine 등의 탄수화물이 대사됨을 확인하였다. 최종적으로 분리균주 ST-63은 BIOLOG 분석 결과에서 Bacuillus amyloiquefaciens 균주와 가장 유사한 생화학적 특성 을 보이는 것으로 나타났으며,분리균주 ST-140은 Alteromonas sp. 종들과 Pseudoalteromonas marina의 생화학적 특성이 가장 유사하게 나타났다. 분리균주의 확실한 동정을 위해서 16S ribosomal DNA 염기서열 분석을 실시하였으며, 분리균주 ST-63, ST-140의 계통학적 분석결과를 Fig. 2, Fig. 3에 나타내 었다. 일반적으로 리보솜 RNA (rRNA)는 전 생물에 보편적으로 존재하는 보존성이 높은 핵산분자이며, 미생물의 진화계 통의 연구에 가장 유용한 분자마커로 이용되고 있다. 특히 범용성이 높은 분자는 small subunit rRNA (AAU rRNA)로서 분류에 이용되는 16S 및 16S유사(18S) rRNA가 이에 속한다. 현재 미생물의 분류체계는 SSU rRNA의 정보를 근거로 재구축되어 있으며, 이 방법은 미생물 분류학에 필수적인 것으로 인식되기에 이르렀다. 특히 미지의 분리균주의 계통학적 위치를 알기위한 최초의 실험단계에서 SSU rRNA 분석은 필수적이다.</p> <p>분리균주 ST-63, ST-140의 16S rRNA PCR 증폭을 통해 얻은 염기서열을 National Center Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 수행한 결과 균주 ST-63은 Bacillus velezensis FJ426275, Bacillus amyloliquefaciens NC009725 균주와 유전적 \(99\%\) 상동성을 보였으며, 분리균주 ST-63을 BIOLOG의 생화학적 분석 결과 및 염기서열 분석결과를 종합했을 때 Bacillus sp.로 동정 되었으며, 최종적으로 Bacillus sp. ST-63으로 명명하였다. 또한 분리균주 ST-140의 염기서열 분석결과 Pseudoalteromonas marina FJ200648, Pseudoalteromonas agarivorans FJ200640 균주와 \( 99 \% \)의 상동성을 보였으며, 최종적으로 BIOLOG의 생화학적 특성 및 염기서열 분석결과를 기초로하여 Pseudoalteromonas sp. ST-140으로 명명하였다. 또한 분석된 염기서열 데이터들은 Genbank에 각각 등록한 후, 분리균주 Bacillus sp. ST-63는 FJ595989, Pseudoalteromonas sp. ST-140은 FJ595990으로 Accession number를 부여받았다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주의 선별</h2> <p>본 연구에 사용된 균주는 제주도 양식장(표선, 성산) 배출수연안에 형성된 퇴적층으로부터 분리되었으며, 멸균된 모종삽을 이용하여 멸균 위생팩에 시료를 넣고 채집 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하면서 실험실로 운반하여 실험에 이용하였다. 채집된 퇴적층 \( 1 \mathrm{g} \)를 멸균해수 \( 9 \mathrm{ml} \)에 넣고 충분히 섞어준 후, 이 시료를 원액으로 10의 지수로 희석한 후, 각각의 멸균된 배지에 \( 100 \mu \mathrm{l}\)씩 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 배양하였다.</p> <p>종속영양세균의 분리 및 배양은 marine agar (MA; Difco. Co. USA)배지, 성장속도가 느린 세균의 배양은 R2A agar (Difco. Co. USA) 배지, 영양이 풍부한 일반적인 배지로 일반 세균의 배양을 nutrient agar (NA; Difco. Co. USA)배지, 효모, 곰팡이 또는 내산균의 배양은 YM agar (Difco. Co. USA) 배지를 사용하여 균주를 분리하였다.</p> <h2>Amylase 생산 미생물 분리</h2> <p>높은 다당 분해효소를 생산하는 균종을 분리할 목적으로 연안 퇴적층에서 분리된 200 균주를 이용하여 다당 분해능 측정 실험에 이용하였다.</p> <p>본 실험의 경우 soluble starch (Difco. Co. USA) \( 1 \% \)를 첨가한 NA (nutrient agar)배지를 멸균해수를 이용하여 제조한 후, 각각의 분리된 균종을 백금이를 이용하여 도말하고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)배양기에서 48시간 동안 배양한 후, 배지에 \( 1 \mathrm{M} \) 요오드용액을 떨어뜨려 전분이 가수분해 되어 투명환(clear zone or halo)을 보이는 균주를 분리하여 본 연구에 이용하였다. 또한 본 균주 의 보관을 위하여 멸균된 glycerol stock solution을 사용하여 냉동 보관하였으며, 실험은 전분분해능의 활성유지를 위해 \( 1 \% \) soluble starch가 첨가된 NA배지에서 계대 배양하면서 실험에 이용하였다.</p> <h2>분리균주의 생화학적 특성 분석</h2> <p>분리균주의 생화학적 특성 분석은 \(3\%\)로 \( \mathrm{KOH} \)를 이용하여 간이그람동정을 한 후, Biolog사(BIOLOG Inc., USA)의 GN2, GP2 plate를 이용하여 95가지의 기질이용 특이성을 시험하였 으며, 분석은 MicroLog \(^{TM}\) system (release 4.05) program을 이용하였다.</p> <p>순수 분리된 균주를 BUGM (Biolog Inc., USA) 사면배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양 한 후, 현탁하여 탁도계(Biolog 21907, USA)를 이용하여 균주 현탁액을 각각 GP의 경우 \( 20 \% \), GN의 경우 \(52 \sim 59\%\)가 되도록 조절한 후 GP2와 GN2 micro olate의 각 well에 \( 150 \mu \mathrm{l} \)씩 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양 후, 보라색을 발색되는 well을 양성으로 판정하였다.</p> <p>이때 현탁액은 \( \mathrm{NaCl} ~150 \mathrm{g}\), \(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 51 \mathrm{g}\), \(\mathrm{KCl} 3.7 \mathrm{g} \)을 증류수 \( 912 \mathrm{ml} \)에 녹인 MCS stock solution 을 증류수로 10 배 희석한 후, 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>16S ribosomal DNA 염기서열 분석</h2> <p>분리 균주의 동정을 위해 16S ribosomal DNA 염기서열을 이용하였으며, 16S rDNA 유전자 단편을 PCR 반응으로 증폭하여 염기 서열을 결정하였다. PCR 반응에 사용된 primer는 27F (forward primer; AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)와 1492R (reverse priver; GGTTACCTTGTTACGACTT)을 사용 하였고, ABI 3730XL capillary DNA sequencer를 이용하여 sequencing 분석을 하였으며, 염기조성, 상호비교(pairwise comparisons)를 위한 염기치환 양상, codon usage 및 각 개체 - 개체군의 유전자 차이는 MEGA 3.0 프로그램으로 계산되었으며, 미생물 군집 분석에 이용된 계통수는 distance 방법으로 MEGA 3.0 프로그램의 pair-distance를 이용하여 작성하였다. 결정된 염기서열을 NCBI BLAST를 이용하여 Genbank에 보고된 균주와의 상동성을 조사하였으며, Genbank에 분리균주의 유전자 염기서열을 등록한 후, Accession number를 각각 부여 받았다.</p> <h2>다당분해 효소 생산 미생물의 온도별 생육도 및 amylase 활성 측정</h2> <p>Amylase 활성이 확인된 균주를 MB broth (Difco. Co. USA) 에 배양 후, 각각의 시간대별로 균주 배양액을 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 취하여 분광광도계를 이용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 각각의 성장도를 측정하였으며, 분리균주의 증식과 amylase 생산의 최적 조건을 알기 위하여 증식 온도와 초기 배지의 \( \mathrm{pH} \)에 변화를 주면서 효소활성을 조사하였다. 기본배지로 MB broth를 사용하였으며, 배양온도를 \( 20 \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 각각 액체 배양하였다. 초기 배지의 \( \mathrm{pH} \)는 4~10 까지 조성하여 실험을 수행하였다.</p> <p>선별된 균주는 MB broth(Difco, USA)에 배양 후, 시간대별로 배양액을 \(9,600 \times \mathrm{g}\)에서 3분간 원심분리하여, 상등액을 조효소액으로 사용하였다.</p> <p>분리된 균주의 amylase 활성은 \( 1 \% \) soluble starch \( 0.1 \mathrm{ml} \)에 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시킨 후, 생성된 환원당을 DNS법을 변형하여 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도에서 당 분해능을 측정하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>일반적인 육상 양식시설은 넓은 부지와 다량의 해수를 이용 한 사육방식이기 때문에 유지 관리 차원에서 비경제적이며, 배출수는 그 수량이 막대하고, 오염물질 배출농도의 변화폭이 대단히 크다는 점 등의 제한요인들에 의하여 기존의 통상적인 물리·화학적, 생물학적인 폐수처리공법의 도입이 거의 불가능한 특성을 가지고 있다. 또한 양식장이 해안가를 중심으로 넓게 분포하고 있다는 점은 국내외를 불문하고 많은 연구자들의 표준적인 처리법 개발에 걸림돌이 되고 있어 이에 대한 방안이 시급한 실정이다. 이러한 취지에서 이들 배출수의 관리 방안 연구는 절실히 요구된다.</p> <p>또한 배출물 오염을 저감시키기 위한 별도의 처리 방법이 확립되어있지 않을 뿐만 아니라 이러한 배출물을 이용한 사료 등의 재활용에 있어, 아직 안전성에 대한 검토가 전무한 실정이다. 따라서 양식장 배출수에 존재하고 있는 유기물 성분들은 일차적인 해안에 퇴적층을 이루며 환경적인 문제점을 일으키고 있기 때문에 이에 대한 환경친화적인 처리 방안이 절실하다. 미생물을 이용한 오폐수처리는 일본에서 처음 시도되었으며, 국내에서는 양식장 베출물의 제거를 위한 여과장치의 개발 및 순환여과식 양식법 개발에 따른 수질관리기술 확립과 관련된 연구들이 보고되고 있다. 일반적으로 육상 양식장의 대부분의 배출물은 양식어류가 섭이하고 남은 잔류 생사료이며, 탄수화물, 지방, 단백질 함량이 높은 것이 특징이다. 따라서 이러한 유기물들을 효과적 및 친환경적으로 분해할 수 있는 미생물 자원의 개발이 필요하다.</p> <p>Glucose 중합체인 starch는 가장 널리 이용되는 식물체의 탄수화물로서 amylase는 이러한 starch를 분해하는 효소이다. Amylase는 \( \alpha \)-amylase, \( \beta \)-amylase, glucoamylase와 isoamylase 로 크게 구분할 수 있는데 \( \alpha\)-amylase (endo- amylase) 는 amylose나 amylopectin의 \( \alpha \)-1,4결합을 무작위로 가수분해 하여 dextrin을 형성하고 \( \alpha \)-amylase의 계속적인 작용에 의해 maltose, maltotriose, maltotetraose 등의 oligosaccharide를 형성한 뒤 glucose와 maltose로 분해하는 효소이다. \( \beta \)-amylase (exo-amylase)는 starch의 비환원성 말단으로부터 maltose 단위로 가수분해하는 효소로서 \( \alpha\)-1,6결합을 포함하는 dextrin을 형성한다.</p> <p>Gluconamylase는 starch에 작용하여 amylose와 amylopectin의 \(\alpha\)-1,4, \(\alpha\)-1,6결합을 가수분해하여 glucose를 생성하는 당화효소이며, isoamylase는 starch의 \( \alpha\)-1,6 결합에만 작용하는 효소이다. 이러한 전분의 분해에 관련하는 효소는 효모, 곰팡이, 세균, 맥아 및 동물체내에 널리 존재한다.</p> <p>본 연구에서는 제주도 육상수조양식장의 밀집지역의 배출 수 배출 지역을 중심으로 퇴적층 분해에 관련된 미생물을 탐색하여 amylase 활성을 측정하였으며, 활성이 강한 균주를 선별하여 amylase의 생산을 위한 조건을 검토하였다. 또한 차후 미생물의 생태적 지위를 파악하여 환경적 및 산업적인 이용가능성을 확인하고자 본 연구를 수행하였다.</p> <h2>배양 온도 및 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 균체증식 및 효소 활성의 영향</h2> <p>분리 균주 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 증식을 위한 최적 배양온도를 확인하고 증식온도에 따른 다당분해 효소 활성의 변화를 조사하였으며, 이를 위하여 배양 온도를 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 배양하여 균체의 증식과 분비되는 다당분해 효소의 활성을 조사하였다.</p> <p>Bacillus sp. ST-63은 초기 배양온도가 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 10시간의 유도기를 거친 후, 대수기로 접어들어 24시간대에 가장 높은 미생물 성장을 보였으며, 24시간 이후에는 정체기를 거쳐 사멸기에 접어드는 것으로 나타났다. 하지만, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 유도기가 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 6시간 지속된 반면, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 이보다 짧은 3시간으로 나타났다. 대수증식기의 경우 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)배양에서는 24시간대에 가장 높은 증식을 보인 후, 바로 정체기와 사멸기를 거친 것으로 나타난 반면, \(30^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우, 30시간대에 최대의 증식을 보였으며, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 다른 온도의 배양보다는 더욱 빠른 대수기를 진행하였으나, 결론적으로 최대 증식량은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양보다 떨어지고 대수기는 길게 나타났다.</p> <p>Pseudoalteromonas sp. ST-140은 배양온도가 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 36시간의 유도기를 거친 후 대수기로 접어들어 48시간대에 최대 증식량을 보인 후 바로 정체기 없이 사멸기로 접어들었다.</p> <p>\( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우, 6시간의 유도기를 거친후 대수증식기로 접어들고 48시간대에 최대 증식량을 보였다. 반면, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양과 비슷한 시간대에 대수증식기에 접어들었으나 최대 증식량은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양에 비하여 현저히 낮은 증식량을보였다.</p> <p>분리균주 Bacillus sp. ST-63과 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 각각의 온도별 증식 속도 및 증식에 따른 효소활성의 변화를 Fig, 6~7에 나타내었다.</p> <p>균주 Bacillus sp. ST-63의 경우 Fig. 6와 같이 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양에서는 시간의 흐름에 따라 amylase 활성이 시간이 흐름에 따라 점차적으로 증가하는 양상을 나타내었으나, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 최초 3시간에도 amylase 활성이 나타남을 확인 할 수 있었다. 이는 Bacillus sp. ST-63균주의 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 유도기가 거의 없이 바로 대수 증식기로 접어드는 양상을 보였기 때문인 것으로 사료된다. 또한 전체적으로 배양온도에 따라서 \( 20 \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \) 모든 실험구에서 24시간 배양 후, 최대 효소활성을 보였으며, 배양일수가 길어저도 효소활성이 거의 떨어지지 않는 것으로 확인되어, 본 균주가 온도에 대한 효소활성에 크게 민감하게 작용하지는 않는 것으로 사료 된다. 그리고 균주가 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \)에 따른 효소활성을 조사하기 위하여 \( \mathrm{pH} 4 \sim 10 \)범위의 배지를 사용하여 조사하였다. 초기 \(\mathrm{pH} 4 \)인 배지에서는 균체의 증식을 관찰 할 수 없었으며, \( \mathrm{pH} \)6인 배지에서부터 왕성하게 증식이 이루어져 \( \mathrm{pH} 7 \) 배지에서 가장 높은 효소활성을 보였다.</p> <p>또한 균주 Pseudoalteromonas sp. ST-140의 경우 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 시간의 흐름에 따라 amylase 활성의 차이는 있었으나, 활성의 점진적으로 증가하는 양상을 보인 반면, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양의 경우 12시간 까지는 효소활성의 거의 없다가 24시간대에 들면서 급격한 효소활성을 보이면서 96시간까지 지속적인 높은 활성을 보였다. 이는 대수증식기를 거쳐 최대 증식시간과 비슷한 양상으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 그리고 모든 실험구에서 배양시간 24시간을 기준으로 효소활성이 증가하는 것을 보였으며, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \(40^{\circ} \mathrm{C} \)실험구에서는 배양시간 96시간에도 높은 효소활성을 보이는 것으로 나타났다. 그리고 Pseudoalteromonas sp. ST-140균주 또한 배지의 초기\( \mathrm{pH} \)에 따른 효소활성을 조사하기 위하여 \( \mathrm{pH} 4 \sim 10 \)범위의 배지를 사용하여 조사하였으며, 초기 \( \mathrm{pH} 4 \)인 배지에서는 균체의 증식 및 효소활성을 거의 관찰 할 수 없었으며, \( \mathrm{pH} \)6인 배지에서부터 왕성하게 증식이 이루어져 \( \mathrm{pH} 8 \)배지에서 가장 높은 효소활성을 보였다.</p>	생명
인진쑥 첨가사료를 급여한 흑우육의 이화학적 품질특성	<h2>관능 특성 및 통계처리</h2> <p>관능 특성은 전공 교과목을 이수한 식품전공 대학 및 대학원생 남 3명, 여 7명의 20 27세 10 명을 평가원으로 하였다. 평가원은 개인용 검사대에서 각각의 관능특성 평가를 평가원 1인이 무작위로 배치된 2개의 시료를 평가하도록 하였다. 평가원들은 실험 시작 전 5 회 물로 입을 가시도록 하였고, 시료를 평가하는 사이마다 정수된 물로 입을 가시도록 하였다. 생육은 색깔 및 냄새를, 가열육은 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 종합적인 기호도에 대하여 가장 좋다(like ex-tremely)를 7점, 가장 나쁘다(dislike extremely)를 1점으로 하는 7점 채점시험으로 하였다. 각 실험은 3 회 이상 반복 측정한 후 SPSS 14.0 (statistical package for social sci-ence, SPSS Inc., Chicago II., USA)을 사용하여 통계처리 하였으며, 각각의 시료에 대하여 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다. 각 시료에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 \( p<0.05 \) 수준에서 Student's t-test를 실시하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>흑우육의 catechin 함량</h2> <p>인진쑥 첨가 사료를 급여한 흑우육(treatment)과 첨가하지 않고 급여한 흑우육(control)의 카테킨 함량을 실험한 결과는 Table 2와 같다. 흑우육의 총 cathechin 함량은 대조군 및 급여 군이 각각 \( 0.262 \) 및 \( 0.379 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 이고, epicatechin 함량은 각각 \( 0.042 \) 및 \( 0.059 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 으로 급여군의 catechin 및 epicatechin 함량이 대조군보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \).</p> <h2>흑우육의 \( \mathrm { pH } ,VBN 함량, TBARS, 전자공여능 및 총균수</h2> <p>인진쑥 첨가사료 급여가 도축 후 3일 저장한 흑우육의 \( \mathrm { pH } \), VBN함량, TBARS, 전자공여능 및 총균수에 미치는 영향을 실험하고 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 대조군 및 급여군의 \( \mathrm { pH } \), VBN 함량 및 총균수는 인진쑥의 급여에 의한 유의한 차이가 없었다. 그러나 TBARS는 대조군 및 급여군이 각각 \( 0.132 및 0.117 \mathrm { mg } \mathrm { MA } / \mathrm { kg } \) 이고, 전자공여능이 각각 \( 34.40 \% 및 36.57 \% \) 로 TBARS는 대조군이 높았고, 전자공여능은 급여군이 유의하게 높았다 \( (p \times 0.05) \).</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>인진숙 TMR사료 제조 및 흑우 사육조건</h2> <p>인진쑥은 수분함량이 \( 40 ~ 50 \% \) 되도록 자연건조한 후 \( 10 \sim \) \( 12 \% \) 까지 열풍 건조하여 얻어진 건초를 사용하였다. 건조한 인진쑥은 수분 \( 10.70 \% \), 조단백 질 \( 9.48 \% \), 조지방 \( 2.05 \% \), 조회분 \( 4.89 \% \), 조섬유 \( 38.04 \% \), 총 열량이 \( 8,188 \mathrm { kcal } / \mathrm { kg } \), 그리고 cat-echin 함량은 \( 1.257 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 함유하였다. 인진쑥 TMR사료는 비 육한우 영양 요구량에 맞도록 제조하였으며, 인진쑥 첨가량은 예비 사양시험에서 우수한 결과를 얻은 배합비율로 하였는데, 대조군(control)은 인진쑥을 첨가하지 않았으며, 급여군 (treatment)은 인진쑥을 비육중기에 \( 4.6 \% \), 비육후기에 \( 6.5 \% \) 를첨가 급여하였다. 흑우는 24-25개월 사육된 평균체중 \( 350 \mathrm { kg } \) 의 거세흑우 10 두 (대조군과 급여군 각각 5 두)를 공시하였다. 예비사양 1 개월과 본 사양 12 개월(비육중기 6개월, 비육 후기 6개월)로 총 13 개월간 사양시험을 하였다. 도축할 때의 평균 생체중은 대조군 \( 660 \mathrm { ~kg } \), 급여군 \( 670 \mathrm { kg } \) 이었고, 평균 도체중은 대조군 \( 365 \mathrm { kg } \), 급여군 \( 375 \mathrm { kg } \) 이었다. 사양관리는 서귀포의 \( \mathrm { S } \) 흑우 시험목장의 사육방법에 의하였다. 육질분석용 시료의 채취는 도축 후 12 시간, \( 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 예비 냉각한 지육에서 등심부위 전체를 분할하여 진공 포장한 것을 제주동물산업연구기술센타에서 공급 받아 실험실로 이동하고, 도축 후 3 일이 될 때까지 \( 3 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 냉장한 후 실험에 이용하였다.</p> <h2>카테킨 함량</h2> <p>플라스크에 흑우육 \( 5 \mathrm { g } \) 과 더운물 \( 80 \mathrm { ml } \) 를 가한 다음 \( 85 ^ {\circ } \mathrm { C } \) water bath에서 3 시간 가온 추출하였다. 플라스크를 실온에서 식히고 물로 나머지 표선을 맞춘 용액을 감압농축하여 HPLC (HPLC 1100 series, Agilent, California, USA)로 분석하였다. 분석조건은 mobile phase \( 0.05 \% \) acetonitrile, flow rate \( 1.5 \mathrm { ml } \), detector는 UV detector (280 nm), column temp. \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 그리고 column은 C18이었다.</p> <p>고기의 보수력은 근원섬유, 세포막, 근속 사이에 수분을 저장할 수 있는 능력을 말하며 연도와 관련이 있다. 고기의 보수력에 영향을 미치는 요인으로서는 동결, 근내지방도 및 성숙도, 도체등급, pH 등이 있다. 보수력은 감량에 영향을 미치는데, 보수력이 높으면 감량이 낮아지는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서 대조군과 급여군의 보수력에 차이가 없어서 감량의 차이도 없었으며, 급여 사료가 보수력과 감량에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 감귤부산물의 급여가 한우육의 보수력에 영향을 미치지 않았다는 Yang 등의 결과와 무화과 발효물의 급여가 가열감량에 영향을 미치지 않았다는 Kook과 Kim 의 결과와 일치하는 경향이었다.</p> <p>기계적 조직감으로 표현되는 경도(hardness)는 물질을 \( 50 \% \) 변형에 도달하기 위하여 필요한 힘을, 탄성(springiness)은 외부의 힘으로 형성된 변형이 힘을 제거하였을 때 원상 복구하는데 필요한 힘을, 응집성(cohesiveness)은 식품의 몸체를 이루는데 필요한 내부의 결합 정도를, 검성(gumminess)은 삼킬수 있을 정도로 단단한 상태의 것을 반고체 상태로 분해하기 위하여 필요한 에너지를, 저작성(chewiness)은 단단한 상태의 것을 삼킬 수 있을 정도로 분쇄하는데 필요한 힘을 나타낸다. 본 연구에서 대조군의 탄성이 급여군보다 높은 것은 Moon과 Jung 의 결과와 유사하였다. 그리고 대조군과 급여군의 전단력에 차이가 없는 것은 Kim 의 티머시 건초조사료의 급여가 전단력에 영향을 미치지 않았다는 결과와 유사하였다. 기계적 조직감이나 전단력은 근내지방도, 성숙도, 육질등급 등에 따라서 달라진다는 Kang 등 및 Lee 등의 결과를 볼 때 인진쑥의 급여가 흑우육의 기계적 조직감이나 전단력에 영향을 미치지 않으며, 흑우의 유전적 조건,사양방법, 성별, 연령, 등급 등이 복합적으로 작용하여 나타난 결과로 사료된다.</p> <p>본 연구에서 인진쑥을 급여한 급여군과 대조군의 생육 및 가열육의 관능특성에 유의한 차이가 없었는데, 이것은 쑥을 급여한 한우육의 생육 색깔 및 향이 대조군보다 우수했다는 Moon과 Jung 의 결과와 쑥의 급여가 가열육의 맛과 전체적인 기호도를 향상시켰다는 Moon 등의 결과와는 다르게 나타났다. 고기의 기호성은 근육 내에 존재하는 ATP 관련 화합물, 유리아미노산, 유리지방산, 유산, 당, peptide 등이 복합적으로 작용하여 나타나며, 향기는 휘발성 물질들이 영향을 미치며 이러한 현상들은 품종, 연령, 성별, 사료 등에 영향을 받는다.</p> <p>이상의 결과에서 알 수 있었던 것은 인진쑥의 급여가 근육내 catechin류의 축적으로 흑우육의 지방산화를 억제하고 적색도를 향상시키면서 전단력이나 관능특성에 나쁜 영향을 미치지 않는 것이었다. 따라서 흑우는 그 자체만의 희귀성으로 브랜드화가 가능하지만 여기에 인진쑥의 급여로 고품질의 기능성 흑우육의 생산이 가능하며, 우리나라 산야 어느 곳에서나 쉽게 구할 수 있는 인진쑥이 천연사료로서의 가능성이 있는 것으로 생각된다.</p> <h2>보수력 및 감량측정</h2> <p>보수력은 Hoffman 등의 방법에 따라 데시케이터에서 습기를 제거한 여과지 위에 시료 \( 0.3 \mathrm { g } \) 을 올려놓고, planimeter (X-plan, Ushikata 360d II, Yokohama, Japan)로 눌러 여과지 위에 나타난 수분의 면적을 구하고 육의 표면적을 수분의 면적으로 나눈 값으로 표시하였다. 흑우육의 동결감량은 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(30 \) 일 동안 동결하였을 때 동결 전후의 무게 차이, 해동감량은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(20 \) 시간 동안 해동하였을 때 해동 전후의 무게 차이, 열탕 가열감량은 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 끓는 물속에서 고기의 중심온도 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 가 되게 가열하였을 때, 팬 가열감량은 \( 150 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 프라이팬 위에서 중심온도 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 가 되게 가열하였을 때 가열 전후의 차이를 각각 백분율로 나타내었다.</p> <h2>조직감 profile측정</h2> <p>조직감은 근섬유와 평행하게 가로, 세로, 높이를 각각 \(40 \) , \(15 \) 및 \( 5 \mathrm { ~mm } \) 로 자르고 rheometer (CR-200D, SUN Scientific Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 경도(hardness), 탄성(springiness), 응집성(cohesiveness)은 round adapter 25번을 이용하여 table speed \( 120 \mathrm { ~mm } / \mathrm { min } \), graph interval 30 \( \mathrm { m } / \mathrm { sec } \), load cell (Max) \( 2 \mathrm { kg } \) 의 조건으로 측정하였다. 검성 (gumminess)은 peak max \( \times \) cohesiveness 값으로, 저작성 (chewiness)은 (peak max \( \div \) distance) \( \times \) cohesiveness \( \times \) spring-iness값으로 나타내었다. 전단력(shear force)은 전단력용 칼날 (angle adapter 10 번)을 이용하여 table speed \( 120 \mathrm { ~mm } / \mathrm { min } \), graph interval \( 30 \mathrm { ~m } / \mathrm { sec } \), load cell (Max) \( 10 \mathrm { kg } \) 의 조건에서 측정하였다.</p> <h1>서 론</h1> <p>우리나라에서 사육되고 있는 한우는 털의 색을 기준으로 황갈색의 한우, 황색바탕에 흑색 호반 무늬를 띄는 칡소(호반우), 그리고 흑색의 흑우로 구분하고 있다[. 이중 제주도에서 사육되고 있는 흑우는 외형은 황우와 비슷하지만 체형이 작고 털의 색깔이 전반적으로 흑색을 나타낸다. 세종실록 기록에 의하면 흑우는 고려시대부터 왕실에 진상될 만큼 우수하였으나 현대에 와서 양질의 고기를 생산할 목적으로 오랫동안 반복된 개량으로 잡종화되어 순수 흑우의 사육두수가 현저하게 줄면서 멸종위기에 처하자 1992년 이후 엄격하게 제주도외의 반출을 통제하고 혈통보전 및 복원사업을 추진하고 있다. 이러한 사업의 일환으로 흑우의 대량 증식을 위한 연구들이 일부 이루어지고 있지만 흑우의 육질분석을 통한고급화 및 브랜드화에 대한 연구는 찾아 볼 수 없다. 최근 우리나라는 농축산물 수입개방 시대를 맞아 가격 경쟁력을 갖춘 고품질의 축산물을 생산해야 한다. 흑우의 경우 국내 소비자들에게는 물론 국제 경쟁력을 갖춘 상품으로 개발될 수 있는가능성이 있다. 따라서 사양관리 방법 개선과 기능성 부여 등 흑우고기의 고급화를 위한 많은 연구가 이루어져 흑우고기에 대한 많은 정보들이 축적되어야 한다.</p> <p>한우는 식이를 통한 고품질의 식육을 얻기 위하여 다양한 연구들이 수행되고 있으며, 그 중에서도 천연의 식물 도는 그 부산물을 급여함으로서 고품질의 기능성 식육 생산 가능성을 모색하고 있다. Lee는 마쇄보리를 배합사료에 \( 10 \% \) 첨가한 경우 한우 등심의 근내지방도, 등심 단면적, 육질등급 및 명도가 높아진다고 하였고, Kang 등은 옻나무 \( 4 \% \) 를 급여한 경우 보수력 및 색택이 향상되었다고 하였으며, Kook과 Kim은 무화과 발효물 \( 10 \% \) 를 급여한 경우 연도 및 맛 개선효과가 있었다고 보고하였다. 그리고 Kim 등은 두충 잎을 \( 5 \sim 10 \% \) 급여한 경우 육질개선 효과가 있었으며, Yang 등은 감귤박을 비육중기 \( 6 \% \),비육후기 \( 2 \% \) 급여한 경우 육질, 저장성, 기호성 등이 개선된다고 하였다.</p> <p>인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.)은 우리나라 산야에 자생하는 다년생 초본식물로 어디에서든 쉽게 구할 수 있는 흔한 약용식물이며, scopoletin, 6,7-dimethylesculetin, phenol, ca-pillarisin, caffeic acid, chlorogenic acid, cresols, eugenol, eth-ylphenols 등 다양한 종류의 생리활성 물질을 함유하고 있다 . 인진쑥은 독성이 없어서 가공식품의 주원료 및 기능성 식품의 원료로 사용이 가능하며, 한우의 사료에 첨가하여 이화학적 품질 특성에 대한 연구도 일부 시도되고 있다. Kim과 Jung은 인진쑥의 첨가급여로 비육한우의 육질등급이 높아졌다고 하였으며, Moon과 Jung은 인진쑥의 급여로 지방산화 억제 및 보수력 개선으로 고품질 한우 생산의 가능성을 제시하였다. 따라서 본 연구는 인진쑥에 함유된 쓴 맛의 alkaloid 성분으로 인하여 흑우의 기호성을 저하시키는 원인을 제거하기 위하여 완전 흔합 사료인 TMR (total mixed ration) 사료를 개발하였다. 그리고 인진쑥 TMR사료를 흑우에게 급여하고 그 고기의 이화학학적 품질특성을 검토하였으며, 아울러 인진쑥을 급여하지 않고 배합사료로 사육한 흑우와 품질을 비교하여 차별화된 고품질의 기능성 흑우육생산의 기초자료로 이용하고자 하였다.</p> <h2>흑우육의 표면색깔</h2> <p>Table 4 는 흑우육 표면의 명도( \( \left ( \mathrm { L } ^ { * } \right ) \), 적색도(a) 및 황색도(b)를 나타낸 결과이다. 혹우육의 \( \mathrm { L } ^ { * } \) 및 \( \mathrm { b } ^ { * } \) 값은 두 시료 사이에 유의한 차이가 없었다. 그러나 a은 급여군이 대조군보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \)</p> <h2>흑우육의 보수력 및 감량</h2> <p>인진쑥 첨가사료 급여가 흑우육의 보수력, 동결감량, 해동 감량 및 가열감량에 미치는 영향을 검토하고 그 결과를 Table 5 에 나타내었다. 대조군 및 급여군의 보수력, 동결감량, 해동 감량 및 가열감량은 유의한 차이가 없었다.</p> <h2>흑우육의 조직감 profile</h2> <p>흑우육의 기계적 조직감으로 측정한 경도, 탄성, 응집성, 검성, 저작성 그리고 연도를 측정하기 위한 전단력의 결과는 Table 6 과 같다. 대조구 및 급여군의 경도는 각각 \( 5.02 및 6.18 \) \( \mathrm { g } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \), 검성은 \( 316.63 및 450.05 \mathrm { ~kg } \) 으로 급여군의 경도 및 검성이 대조군 보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \). 탄성은 대조군 및 급여군이 각각 \( 80.02 \% \) 및 \( 72.37 \% \) 로 대조군이 급여군보다 유의하게 높았다 \( (p<0.05) \). 그러나 응집성, 저작성 및 전단력은 대조군과 급여군 사이에 유의한 차이가 없었다.</p> <h2>흑우육의 관능특성</h2> <p>인진쑥 첨가사료가 흑우육의 관능특성에 미치는 영향을 파악하고자 생육의 색 및 향, 그리고 가열육의 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 전체적인 기호성을 실험하고 그 결과를 Table 7에 나타내었다. 생육의 색 및 향은 대조군 및 급여군 사이에 유의한 차이가 없었으며, 열탕 가열육 및 가열 팬 위에서 가열한 대조군 및 급여군 사이에도 관능특성의 유의한 차이가 없었다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>우리나라는 오래 전부터 축산물 시장의 전면적인 개방에 대응하기 위하여 다각적인 준비를 해왔다. 그 중 한 가지가 특별한 사료 급여체계에 의한 표준모델을 정하고, 표준모델에 따라 소를 사육하여 균일한 품질의 소고기를 생산하기 위한 브랜드화다. 이를 위하여 많은 연구자들이 식이에 다양한 천연자원을 첨가 급여하는 연구를 수행하고 있으며, 우리나라 제주도에서 사육하고 있는 흑우도 모색이 특이하여 브랜드화의 대상이 되고 있다. 특히 본 연구는 흑우에게 인진쑥 TMR사료를 급여하고 이화학적인 품질특성을 파악하여 고품질의 브랜드육을 생산하기 위한 기초자료를 얻기 위하여 수행하였다. 인진쑥은 쓴맛의 alkaloid 가 있어서 소에게 인진쑥만 급여할 경우 잘 먹지 않는 경우가 있다. 따라서 배합사료와 함께 섞은 TMR 사료를 급여하여 인진쑥만 선택적으로 거절할 수 없도록 하였다.</p> <h2>\( \mathrm { pH } \) 측정</h2> <p>흑우육의 \( \mathrm { pH } \) 측정은 대기온도에서 \( \mathrm { pH } 4.0 \) 과 7.0 buffer로 보정한 유리전극이 부착된 \( \mathrm { pH } \) meter (ATI Orion 370, Pennsylvania, USA)를 이용하여 측정하였으며, 시료는 분쇄한 후 \( 10 \mathrm { g } \) 을 취하여 증류수 \( 40 \mathrm { ml } \) 와 함께 균질한 후 측정하였다.</p> <h2>VBN 함량</h2> <p>흑우육의 VBN (volatile basic nitrogen) 함량은 Conway unit를 이용한 미량확산법에 의하여 측정하였다. 즉 시료 \( 2 \mathrm { g } \) 에 증류수 \( 16 \mathrm { ml } \) 와 \( 20 \% \) perchloric acid \( 2 \mathrm { ml } \) 를 넣고 균질화 한 후 \( 3,000 \mathrm { rpm } \) 에서 15 분 동안 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 상층액 \( 1 \mathrm { ml } \) 와 \( 50 \% \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 1 \mathrm { ml } \) 를 Conway unit 외실에 넣고, 내실에는 \( 10 \% \) 봉산흡수제 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 80분 동안 방치한 다음 \( 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 로 적정하고 다음 식에 의하여 구하였다.</p> <p>VBN \( ( \mathrm { mg } \%) = 0.14 \times \frac { ( \mathrm { b } - \mathrm { a } ) \times \mathrm { f } } {\mathrm { W } } \times 100 \times \mathrm { d } \) a: 공시험 \( 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 적정량 \( ( \mathrm { ml } ) \) \( \mathrm { b } \) : 시료의 \( 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 적정량 \( ( \mathrm { ml } ) \) \( \mathrm { W } : \) 시료 채취량 \( ( \mathrm { g } ) \) \( \mathrm { f } : 0.01 \mathrm { N } - \mathrm { NaOH } \) 역가 \( \mathrm { d } \) : 희석배수</p> <h2>TBARS 측정</h2> <p>TBARS (2-thiobarbituric acid reactive substances)는 흑우육 \( 5 \mathrm { g } \) 을 3 배의 증류수로 균질한 다음 여과하여 얻은 여액 \( 1 \mathrm { ml } \)에 \( 7.2 \% \) BHT (dibutylhydroxy toluene) 50 씨를 넣고 산화반응을 정지시켰다. 반응 혼합물 \( 2 \mathrm { ml } \) 에 TBA \( 2 \mathrm { ml } \)를 가하여 혼합한 후 꿇는 물에서 15 분간 가열하고 냉수에 식힌 다음 \( 2,000 \times g \) 로 원심분리시켜 상층액을 \( 531 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 공시료는 시료 대신 증류수를 이용하여 같은 방법으로 측정하였다. TBARS는 홉광도 수치에 \( 5.88 \) 을 곱하여 계산한 후 시료 \( \mathrm { kg } \) 당 반응물 \( \mathrm { mg } \) malonalde-hyde로 계산하였다.</p> <h2>DPPH radical에 대한 전자공여능 측정</h2> <p>흑우육의 항산화력은 DPPH (1,1-dephenyl-2-picrylhy-drazyl) free radical에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA \%)으로 나타내었다. 즉 시료 \( 5 \mathrm { g } \) 을 취한 후 \( 0.1 \) \( \mathrm { M } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } 7.4 \) )를 \( 4 \) 배 첨가하여 homo-genate 분획으로 하고, \( 13,000 \times g \) 로 \( 15 \) 분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 DPPH free radical 활성측정의 시료 추출물로 사용하였다. DPPH free radical에 대한 전자공여능 측정에 사용된 DPPH 시약은 \( 59 \mathrm { mg } \) 을 정확히 취하여 ethanol 11 에 녹여 사용하였다. 일정 농도의 시료에 DPPH를 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 넣어 혼합하고 실온에서 \(30 \) 분 방치한 다음 ice bath 상에서 반응을 종료시키고 \( 520 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>\( \begin {array} { l } \mathrm { EDA } \% \text { (electron } \\ \text { donating ability) } \end {array} = \frac {\text { 대조군 흡광도-Sample 흡광도 } } {\text { 대조군 흡광도 } } \times 100 \)</p> <p>인진쑥을 첨가한 흑우육의 총 catechin과 epicatechin 함량이 대조군보다 유의하게 높았는데, 이것은 Moon과 Jung 이 한우에게 인진쑥을 급여하였을 경우 대조군보다 급여군의 총 catechin과 epicatechin 함량이 높았다는 결과와 일치하는 경향이었다. 특히 catechin류는 epicatechin, epi-catechin gallate, epigallocatechin, epigallocatechin gallate 등 이 있으며, 이들은 강한 항산화 작용이 있어서 인진쑥을 급여하여 생산된 소고기는 catechin류들이 가지고 있는 항산화 효과를 나타낼 수 있기 때문에 매우 의미가 있는 결과이다.</p> <p>흑우의 \( \mathrm { pH } \) 측정은 인진쑥의 급여로 인하여 근육의 사후변화에 영향을 미치는 가를 알아보기 위하여 실시하였다. 그 결과 대조군과 급여군 사이에는 \( \mathrm { pH } \) 의 차이가 없었으며, Kim 등이 쑥을 급여한 한우육의 저장 3일 후 \( \mathrm { pH } \) 가 \( 5.36 \sim 5.40 \)이 고, 쑥의 급여가 \( \mathrm { pH } \) 에 영향을 미치지 않았다는 결과와 일치하는 경향이었다. 그러나 Moon과 Jung 은 쑥을 급여한 한우육의 대조군과 급여군의 \( mathrm { pH } \) 가 각각 \( 5.67 및 5.85 \) 이고, 쑥의 급여로 \( \mathrm { pH } \) 가 높아졌다는 결과와는 차이가 있었다. VBN함량 에 대한 결과에서 Moon 등은 쑥 급여에 의한 대조군 및 급여군이 각각 \( 6.59 및 5.18 \mathrm { mg } \) \%로 쑥 급여에 의하여VBN 함량이 낮아졌다는 결과와는 상이하였으나 Moon과 Jung 이 쑥의 급여가 VBN함량에 영향을 미치지 않았다는 결과와 유사하였다. 그리고 총균수도 대조군과 급여군 사이에 차이가 없었다. 따라서 인진쑥의 급여가 단백질 부패와 미생물의 성장에 대하여 영향을 미치지 않았다. 한편 인진쑥의 급여로 TBARS가 낮고, 전자공여능이 높은 것은 Table 2 의 인진쑥에 함유된 catechin류가 근육에 축적되어서 항산화 작용을 나타낸 결과로 예측된다. 이러한 결과는 인진쑥의 급여가 전자공여능을 높게 하였다는 Moon 등의 결과와 감귤 부산물을 급여한 한우육의 TBARS가 대조군보다 낮았다는 Moon 등의 결과와 유사한 경향이었다.</p> <p>고기의 색깔은 관능적인 품질평가 수단으로 중요하게 인식되고 있다. 고기의 색깔인 적색은 myoglobin의 화학적 상태 즉, deoxymyoglobin, oxymyoglobin, metmyoglobin의 비율에 따라 선호도가 결정되고, 이들의 비율이 명도 \( ( \mathrm { L } ) \) ), 적색도 \( ( \mathrm { a } ) \) ), 황색도 \( ( \mathrm { b } ) \) )에 영향을 미친다. 그리고 고기의 적색은 산화에 의하여 변색이 되면 metmyoglobin의 농도가 높아져서 암갈색을 띄게 되는데, 적색의 산화는 지방의 산화와 함께 진행하게 된다. 따라서 인진쑥을 급여한 흑우육의 적색도가 대조군보다 높은 것은 Table 2 및 3 의 결과에서 인진쑥의 catechin이 근육에 축적되고, 이로 인하여 산화가 억제되어 나타난 결과로 사료된다.</p>	생명
Multiplex PCR을 이용한 생물방제균 Bacillus subilis AH18의 토양내 Genetic Monitoring	<h2>Multiplex PCR의 template DNA 준비.</h2><p>B. subtilis AH18의 chromosomal DNA 분리는 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN Inc., U.S.A.)를 사용하였다. Colony-PCR시 주형은 본 균주를 nutrient broth에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양 후 원심분리하여 균체만 모아 멸균 증류수로 2회 세척 하여 멸균증류수로 일정량 희석하여 사용하였다. 토양권역별 monitoring을 위한 template DNA는 토양 내에서 PowerSoil \( ^{\text {TM }} \) DNA Kit(Mo Bio Laboratories, Inc., U.S.A.)를 이용하여 DNA를 분리하여 사용하였다. Rhizosphere구는 근권, 즉 식물뿌리에 묻어있는 흙에서 DNA를 분리하였으 며, non-rhizosphere구는 hizosphere 이외의 식물뿌리로부터 근권영역의 2배 가량 떨어져 있는 상부와 뿌리 하부위치의 훍에서, endophytic구는 식물뿌리에 묻은 흙(rhizosphere)을 멸균 증류수로 2회 수세 후 식물뿌리를 마쇄한 후 동일한 kit를 이용하여 template DNA를 분리하였다.</p><h2>Monitoring을 위한 PCR primer 및 multiplex PCR 조건</h2><p>PCR용 primers는 Table 2에 나타내었으며, B. subtilis의 genomic sequences들을 기초로 제작하였다. 각 primer들 은 B. subtilis AH18이 생산하는 것으로 확인된 auxin의 방출에 관여하는 auxin efflux carrier (aec), siderophore의 생합성에 관여하는 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy benzoate dehydrogenase[EC:1. 3. 1. 28] gene (sid) 그리고 cellulase structure gene (cel)의 유전자를 포함하게 제작하였다. Multiplex PCR 용 Taq DNA polymerase는 Prime Taq DNA polymerase(Genet Bio Co., Ltd., Korea)를 사용하였으며, PCR 조성은 template DNA \( 2 \mu \mathrm{L} \)에 \( 10 \times \) reaction buffer \( 5 \mu \mathrm{L} \), 각각의 \( 10 \mathrm{pM} \) primer \( 1 \mu \mathrm{L} \), dNTP \( (10 \mathrm{mM}) 3 \mu \mathrm{L} \), Taq DNA polymerase \( (5 \mathrm{unit} / \mu \mathrm{L}) 0.5 \mu \mathrm{L} \)와 멸균증류수 \( 33.5 \mu \mathrm{L} \) 를 가하여 총 final volume \( 50 \mu \mathrm{L} \) 가 되도록 하였다. PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 5분(pre-denaturation) 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 60초(denaturation), \( 60^{\circ} \mathrm{C}\) 60초(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 90초(polymerization), 29 cycle를 수행 한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 5분(post-polymerization)을 행하였다.</p><h2>Gene cloning, DNA sequencing 그리고 상동성 확인</h2><p>각각의 PCR fragment들의 cloning방법은 우 등의 방법과 동일하게 실시하였다. 형질전환 후 선별배지에 도말하여 white-colony를 분리하였으며, 분리된 균주를 colony PCR을 통해 형질전환 균주를 선발하였나. 형질전환 균주에서recombinant plasmid를 정제 후 Solgent Co., Ltd. Korea 사에 의뢰하여 sequencing 하였으며 sequencing 결과는 NCBI의 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 에서 blast 및 blastx를 통해 비교 확인하였다. 그 결과는 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)에 등록하였다.</p> <h2>Bacillus spp.에서의 primers 특이성 확인</h2><p>Bacillus spp. 에 해당되는 11 종의 균주를 한국농업미생물 생물자원센터 (KACC, http://kacc.rda.go.kr/)에서 분양받아 제작된 3종의 primers를 대상으로 PCR 및 mutiplex PCR을 수행하였다. 11종의 균주에서 chromosomal DNA 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 위와 동일한 방법으로 수행하였다. 뿐만 아니라 11종의 균주를 대상으로 auxin, siderophore, 그리고 cellulase의 생산을 확인하였다. Auxin 생산은 정 등의 방법 즉, L-tryptophan \( 0.1 \% \) 를 첨가한 King's B broth( \( 2 \% \) proteose peptone No.3, \( 0.15 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.15 \% \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1.5 \% \) glycerol, \( \mathrm{pH}~ 7.2 \))에 전배양액을 \( 1 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3일간 배양한 후 배양상등액 \( 1 \mathrm{~mL} \)에 Salkowski시약 \( \left(0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~1 \mathrm{~mL}\right. \) in \( 35 \% \mathrm{~HClO}_{4} \) \( 50 \mathrm{~mL})\) \(2 \mathrm{~mL}\)를 첨가하고 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 \( 535 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 확인하였다. Siderophore는 CAS(chrome azurol S) blue agar와 CAS liquid assay로 확인하였으며, cellulase는 위와 동일한 방법인 Congo red plate방법과 DNS 방법으로 확인하였다.</p><h2>일반토양에서 multiplex PCR을 통한 B. subtilis AH18의 monitoring</h2><p>일반토양 \( 200 \mathrm{~mL} \)를 이용해 pot에 고추를 이식 후 B. subtilis AH18의 균체를 멸균증류수에 현탁하여 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \) 관주하였으며, 대조구는 B. subtilis AH18을 처리하지 않았다. 7일간 매일 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 멸균증류수를 주면서 관찰하였으며, 그 후 식물체를 뽑아 rhizosphere과 non-rhizosphere을 \( 125 \mathrm{mg} \)씩 혼합하여 PowerSoil \( { }^{\mathrm{TM}} \) DNA Kit(Mo Bio Laboratories, Inc., U.S.A.)를 사용해 total DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 template DNA로 사용하여 PCR 및 multiplex PCR을 수행 후 B. subtilis AH18을 확인하였다.</p><h2>B. subtilis AH18의 처리 농도별 monitoring 민감도 확인</h2><p>B. subtilis AH18의 토양내 monitoring 민감도 확인을 위하여 일반토양 \( 250 \mathrm{mg} \)에 B. subtilis AH18의 균체 \( \left(1.8 \times 10^{7}\right. \) cfu)를 10배씩 희석하여 접종하였으며, 이를 24시간 후 위와 동일한 방법으로 토양내 total DNA를 분리하였다. 그리고 이를 대상으로 PCR 및 multiplex PCR을 수행하여 monitoring을 위한 민감성을 확인하였다. B. subtilis AH18 의 균체 수 확인은 접종하여 남은 균체를 nutrient agar에 희석 도말하여 확인하였다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 분포확인</h2><p>토양내 B. subtilis AH18의 분포를 확인하기위해 뿌리내 부 내생부위(endophytic), 근권(rhizosphere), 그리고 비근권 (non-rhizosphere)로 구분하여 확인하였다. 고추를 일반토양을 이용하여 위와 동일한 방법으로 이식하였으며, B. subtilis AH18을 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \)로 관주처리 하였으며, 20일간 매일 \(10 \mathrm{mL} \)의 멸균증류수를 주면서 관찰하였다. 그 후 endophytic, rhizosphere, 그리고 non-rhizosphere로 구분하여 DNA를 분리하였으며, 이를 template DNA로 PCR 및 multiplex PCR 을 수행하여 B. subtilis AH18의 토양내 분포위치를 확인하였다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 기간별 monitoring</h2><p>일반토양에 처리된 B. subtilis AH18의 우점능 기간을 확인하기위해 위와 동일한 방법으로 고추를 이식하였으며, B.subtilis AH18를 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \)를 처리하여 7일 주기로 5주간 rhizosphere의 토양을 분리하여, total DNA를 분리 후 PCR 및 multiplex PCR을 통해 B. subtilis AH18의 우점능 기간을 확인하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 유전자</h2><p>본 연구에 사용된 균주는 정 등에 의해 분리, 선발된 식물성장촉진호르몬인 auxin과 식물병원성진균의 생육을 억제하는 siderophore 그리고 식물병원성 진균의 세포벽을 융 해하는 cellulase를 동시에 생산하는 plant growth promoting rhizobacterium(PGPR)인 Bacillus subtilis AH18을 사용하였다. PCR로 증폭된 유전자의 cloning용 host cello은 Escherichia coli DH5를 사용하였으며, 유전자 cloning 및 DNA sequencing용 vector는 pUC 18,19 vector를 이용하였다. 사용한 균주 및 plasmid는 Table 1과 같다.</p><h2>균주의 배양 및 배지</h2><p>B. subtilis AH18의 배양조건 확인은 nutrient medium (Difco Co. U.S.A.)을 사용하였으며, 액체배양은 전배양액을 \( 0.1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 160 \mathrm{rpm} \)으로 24시간 진탕배양 하였고, 균주 보존용 고체배양은 nutrient agar에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 24시간 배양하였다. E. coli의 배양은 LB(LuriaBertani) medium(Difco Co. U.S.A.)을 사용하였으며, 형질 전환 시 heat shock 후 유도배양에 사용한 배지는 SOC medium(tryptone \( 2 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 0.5 \mathrm{~g}, 1 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} 1 \mathrm{~mL} \), \( 1 \mathrm{~M} \mathrm{~KCl}~0.25 \mathrm{~mL} \), filter-sterilized \( \mathrm{Mg}^{2+} \) stock( \( 1\mathrm{M} \mathrm{~MgCl}_{2} \)\( \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1 \mathrm{M} \mathrm{~MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) ) \( 1 \mathrm{~mL} \), filter-sterilized \( 2 \mathrm{M} \) glucose \( 1 \mathrm{~mL} \), total \( 1 \mathrm{~L} \) )을 사용하였다. 액체배양은 전배양액을 \( 0.1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 160 \mathrm{rpm} \) 으로 24시간 진탕배양 하였고, 균주 보존용 고체배양은 LB agar에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 24시간 배양하였다. 형질전환 균주의 배양 및 보관은 LB agar에 ampicillin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)이 첨가된 배지를 사용 하였다.</p><h2>식물 및 토양</h2><p>본 연구에 사용한 식물로는 고추(Capsicum annuum L., 부촌-Seminis Korea Co., 오륜-Seoul Seed Co.)을 이용하였으며, 고추 이식용 pot는 흥농 3공 컵 포트 \( (90.0 \times 90.0 \times 70.0 \) \( \mathrm{mm} \))를 사용하였다. 생물방제력 확인을 위한 식물이식용 토양은 TKS2(Floragard, Germany)를 autoclave( \( 121^{\circ} \mathrm{C}, 30\)분) 하여 사용하였으며, monitoring을 위한 식물이식용 토양은 경산지역의 경작지 밭 토양을 그대로 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>B. subtilis AH18의 PCR fragment 및 sequencing</h2><p>B. subtilis AH18의 chromosomal DNA를 정제하여 이를 주형으로 Pfu DNA polymerase를 이용해서 PCR을 수행하였으며, 그 결과 약 \( 800 \mathrm{bp}\)(sid), \(1.0 \mathrm{~kb}\(aec),\( 1.6 \mathrm{~kb}\)(cel)의 fragment를 확인하였고, 각 fragment를 insert로 pUC 18,19 vector를 이용해서 host cell인 E. coli DH5a에 cloning하였으며, 그 결과 recombanant DNA pSH \(7\)(pUC \( 19+ \) sid product), pAL \(5\)(pUC \( 18+ \)aec product), pCM \(4\)1(pUC \( 18+\) cel product)를 획득하였다.</p><p>각각의 recombinant plasmid를 정제하여 sequencing한 결과 sid\((794 \mathrm{bp}\)), ae\((1,062 \mathrm{bp})\), cel\((1,582 \mathrm{bp}) \)의 sequences를 확인하였으며 NCBI의 Genbank에 등록하였다(Genbank accession sid: No. EF408238, aec: No. EF408239, cel: No. blastx를 통해 비교한 결과 sid gene는 B. subtilis의 siderophore의 생합성 key enzyme인 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy benzoate dehydrogenase [EC:1. 3. 1. 28]에 \( 97 \% \)의 상동성을 나타내었으며(data not shown), aec gene는 B. subtilis의 auxin efflux carrier와 \(99\%\), B. licheniformis ATCC 14580의 auxin efflux carrier와 \( 77 \% \)의 상동성을 나타내었고(data not shown), cel gene는 Bacillis spp. 들이 생산하는 cellulase와 \( 98 \% \)이상 일치하였다. 본 연구에 사용된 primer들을 이용하여 PCR을 수행 후 agarose gel 상에서 확인하면, \( 794 \mathrm{bp}\), \(1,062 \mathrm{bp} \) 및 \( 1,582 \mathrm{bp} \)의 PCR products를 확인할 수 있으며, 이는 siderophore, auxin 및 cellulase의 생산하는 B. subtilis AH18이 존재함을 토양 내에서 그 고유의 특정유전자들을 확인함으로써, 미생물제제로 투여한 미생물의 토양내 존재를 간접적으로 나타내는 결과이다.</p><h2>Multiplex PCR을 통한 B. subtilis AH18의 확인</h2><p>B. subtilis AH18의 PCR을 통한 monitoring을 위해 합성된 primers들로 PCR을 수행하여 확인하였으며, 이들 3종의 primer들을 동시에 넣은 multiplex PCR법으로 3종의 유전자와 동일한 위치의 triplex band를 확인하였다. 이는 별개의 유전자를 각각 PCR하는 대신에 동일시간 동일 공간 내에서 동시에 PCR 함으로써 한번의 PCR로 간편하고 정확하게 B.subtilis AH18과 같이 토양 내 투입된 특정미생물을 손쉅게 확인가능하다는 것을 의미한다. 뿐만 아니라 B. subtilis AH18을 cell 그대로 PCR의 template로 사용 시 multiplex PCR을 통해 비교한 결과 DNA를 template로 사용한 PCR 경우와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 이 방법은 미생물의 template DNA를 정제하는 비용과 시간을 많이 줄여 효율적으로 PCR을 이용해 환경내 미생물을 신속하고 간편하게 검출하는데 많은 활용될 것이다. Multiplex PCR은 PCR에 비해 특정 유전자를 동시에 증폭함으로써 다른 미생물로 인한 비 특이적 증폭을 배제할 수 있으며, triplex band의 동시 증폭만이 토양내 B. subtilis AH18의 존재를 확인 할 수 있었다.</p><p>지금까지 많은 종의 PGPR균주들이 보고되었고, 이중에서 Bacillus sp. 균주들만 수십 종에 달한다. 그리하여 본 연구에 사용된 B. subtilis AH18균의 monitoring용으로 제작된 3쌍의 primers를 이용하여 11종의 Bacillus spp.의 chromosomal DNA를 대상으로 PCR 및 multiplex PCR 수행 결과 우리가 원하는 size의 band를 확인할 수 없었다. 뿐만 아니라 phenotype에서 auxin, siderophore, 그리고 cellulase의 생산능이 확인된 3종의 Bacillus subtilis에 대해서도 어떠한 증폭도 확인되지 않았다. 이로보아 본 연구에 사용된 3쌍의 primer는 B. subtilis AH18균주의 monitoring에 사용되며, 본 균주와 동일한 phenotype 및 genotype을 나타내는 균주 즉, auxin, siderophore, 그리고 cellulase를 생산하는 균주의 monitoring에도 활용될 것이다.</p> <h2>미 살균 일반경작지 토양에서의 B. subtilis AH18의 확인 및 민감성 확인</h2><p>일반경작지토양에는 많은 종류의 미생물들이 존재하며 그 중에서 특정 유전자를 소유하고 있는 B. subtilis AH18을 확인하기위해 토양에서 DNA를 각각 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 수행하였다. 그 결과 B. subtilis AH18을 투여한 토양에서만 B. subtilis AH18의 각각의 특정 고유유전자 band만 확인할 수 있었다(data not shown). 그리하여 multiplex PCR 실시결과 B. subtilis AH18을 투여한 토양에서는 3종의 특정 고유유전자의 triple band가 확인되었고, 균주를 투여하지 않은 토양에서는 primer dimer만 관찰되었다. 이는 B. subtilis AH18을 투여 후 7일이 지난 후에도 토양내에서 사멸되지 않고 존재함을 의미하여, 3종의 primers들을 이용해 PCR 및 multiplex PCR을 하면 타 유사 토양미생물과 구분하여 B. subtilis AH18의 존재를 확인할 수 있었다. 이 방법은 향후 경작지 토양내에서 생물방제를 위해 처리된 미생물제제의 존재유무와 토양내 우점능력을 확인하는데 널리 활용될 것으로 사료된다.</p><p>또한 토양내에서 B. subtilis AH18의 민감성 확인을 위하여 PCR 및 multiplex PCR 수행 결과, 두 PCR 모두 동일하게 B. subtilis AH18가 토양내 \( 1.8 \pm 0.3 \times 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 이상 존재시 monitoring이 가능하였다. 이는 지금까지 보고된 토양내 rhizobacteria의 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) of root 농도 이상이 존재시 유도저항성 및 방제능을 나타낸다는 보고처럼, 본 균주의 PCR 및 multiplex PCR을 통한 monitoring 농도가 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 임을 생각할 때, 위의 primers를 이용한 monitoring 방법을 이용하면 경작지 토양내에서 유효농도의 미생물제제를 monitoring 할 수 있는 새로운 방법이라고 생각한다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 분포확인 및 우점기간 확인</h2><p>고추 식물체의 endophytic과 rhizosphere, 그리고 nonrhizosphere에서 DNA를 분리하여 PCR 및 multiplex-PCR를 수행하였다. 그 결과 rhizosphere와 non-rhizosphere에서 우점한 B. subtilis AH18의 triple band는 뚜렷이 확인할 수 있었지만, non-rhizosphere에서는 triple band 이외에 여러 다른 band도 확인할 수 있었다. 이는 토양 내 수많은 미생물들의 존재를 나타내고 있으며 non-rhizosphere에서는 B. subtilis AH18이 우점을 하지 못하고 있는 것으로 사료된다. 즉, B. subtilis AH18은 식물체의 rhizosphere와 non-rhizosphere에서 모두 triple band를 확인할 수 있으며, 이는 B. subtilis 종들의 토양내에 널리 분포한다는 보고와 동일하였다. 또한 B. subtilis AH18의 처리 기간별 monitoring을 위해 PCR 및 multiplex PCR 결과, 3주동안은 토양내에서 유효미생물제제 농도인 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 이상이 확인됨으로 영양형 세포 이외에 포자형으로 변형된 세포수까지 감안한다면 충분한 밀도 이상으로 3주 이상 토양내 우점할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 균주를 이용해서 미생물제제를 개발 사용한다면 영양형 세포의 기준으로 3주 간격으로 미생물제제의 처리 시 식물성장촉진능과 생물방제능을 유지 할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>최근 환경오염으로 인한 피해사례가 급증하면서 환경문제가 세계적인 관심사로 떠오르게 되었다. 특히 농업의 경우에는 유기합성 농약과 화학비료 사용량의 증가로 농업생태계가 파괴되고, 농산물의 잔류농약 과다 검출로 소비자의 건강을 위협하고 있다. 최근 농업분야에서도 환경에 친화적이며 지속 가능한 농업방식이 절실히 요구되고 있으며, 우리 나라를 비롯한 전 세계적으로 많은 종류의 환경친화적 농법이 성행하고 있고, 그 중에서 미생물제제롤 이용한 미생물 농법이 최근 연구, 개발되어 활용되어지고 있다.</p><p>미생물농법이란 화학농약과 합성비료를 대신하여 식물의 생육이나 질병방제에 직·간접적으로 좋은 영향을 끼칠 수 있는 미생물제제를 개발하여 농업에 이용하는 친환경 농법을 말하여, 지금까지 연구되어진 미생물제제의 특성은 식물 생장을 촉진하는 물질을 생산하거나, 식물의 저항성을 유도 또는 항생물질, siderophore 그리고 식물병원성 진균의 세포벽을 분해하는 가수분해효소 등의 작용으로 식물병원성 미생물을 직접적으로 저해 및 억제함으로 식물병원성 미생물을 방제하는 특성이 있다. 그리하여 많은 과학자들이 유용 토착길항미생물을 분리, 선발, 제제화 하여 실제 농업에 활용을 시도하고 있다. 하지만, 토양이라는 많은 미생물이 살아가는 환경에서 사용한 미생물제제가 어떻게 우점하는지, 어디에 어느 정도로 분포하는지에 대한 신속하고 간편한 추적, 확인하는 monitoring 방법은 Green Fluorescent Protein (GFP) 유전자를 이용한 monitoring 방법 이외에 거의 찾아 볼 수 없다.</p><p>최근 polymerase chain reaction (PCR) 및 Real-Time PCR을 이용해 인간의 삶에 해로운 영향을 미치는 B. anthracis, B. cereus, C. botulinum, C. jejuni, F. nucleatum, Vibrio spp., Y. enterocolitica 등과 이로운 영향을 미치는 B. thuringiensis 등의 미생물들과 병원성 virus 뿐만 아니라 유전자재 조합 콩도 신속하고 간편하게 monitoring하는 방법이 개발, 널리 활용되고 있다.</p><p>지금까지 토양 내에 처리된 미생물제제의 사용주기 및 사용농도의 적합성에 대해 확인할 수 있는 방법이 없었다. 그리하여 토양 내에 처리된 미생물제제균을 신속하고 간편하게 monitoring하는 새로운 방법을 개발하고자 PCR 및 multiplex PCR을 활용하여 개발하고자 하였다. 본 방법은 유전자 조작을 하지 않고 미생물제제군이 생산하는 특유의 물질을 조사하여 그 생산물질에 해당하는 유전자 중 key enzyme이 되는 유전자를 기초로 primers를 합성하고, 토양내 DNA를 주형으로 PCR 및 multiplex PCR을 수행하면 key enzyme의 유전자가 중폭됨으로, 증폭여부에 따라 미생물제제균의 존재여부를 확인할 수 있는 방법이다. 따라서 본 연구는 식물성장 촉진능과 생물방제능을 동시에 지닌 B. subtilis AH18을 토양내에서 monitoring하기 위해 primers를 제작하였으며, 이를 토대로 PCR 및 multiplex PCR을 수행 하였다. 그리고 고추를 이식한 토양에서 PCR 및 multiplex PCR를 이용해 B. subtilis AH18을 monitoring하여, 민감성과 토양내 분포 등을 조사하여 보고하는 바이다.</p>	생명
1년간의 복합 운동프로그램이 남성 치매환자의 운동능력과 인지기능에 미치는 영향	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>연구대상</h2> <p>본 연구는 치매센터에 거주하는 환자들 가운데 초\(\cdot\)중등학교 이상 교육을 받았고 평소 운동습관은 없으나 기본적인 일상생활이 가능하며, 병력조사, 신경심리검사 및 CT (Computer Tomography) 검사 결과 혈관성 치매로 진단을 받은 남성 치매 환자 24명을 연구 대상으로 선정하였다. 무작위로 각각 12명씩 운동군과 통제군으로 분류하였고, 연구 대상자의 신체적 특성은 다음과 같다.</p> <h2>운동프로그램</h2> <p>본 연구에 앞서 병력청취를 통해 운동시 주의해야 할 사항들을 기록하였고, 4명씩 오전 또는 오후 컨디션이 좋은 시간대에 맞춰 그룹운동을 수행하였다. 1년간의 운동프로그램은 3개월씩 총 4단계(초기단계, 적응단계, 발달단계, 유지단계)로 구분하였고, 각 단계별로 10분간 의자 운동(chair exercise)으로 준비운동을 실시한 다음 바로 본 운동에 들어갔으며, 마지막 5분간 스트레칭으로 정리운동을 하였다. 본 운동은 15분부터 시작하여 마지막 45분까지 단계별로 10분씩 점증적으로 증가시켰으며, 어깨회전운동(shoulder wheel), 탄력밴드운동(thera-band), 어깨신전운동(overhead pulley), 상지재활운동(wall bar), 공운동(swiss ball), 아령운동(dumb bell)을 이용한 상체운동과 페달운동(restorator), 평행봉걷기운동(parallel bar), 다리진동운동(vibrator), 계단오르기운동(staircase), 공운동(swiss ball)을 이용한 하체운동을 복합적으로 구성하여 수행하였다. 운동강도의 경우 \( \mathrm{ VO_2max } \) \(30 \sim 60 \%\), 운동빈도는 주 2~3회, 운동시간은 일 30~60분 실시하였다.</p> <h2>운동능력 및 인지기능 측정</h2> <p>모든 피험자는 전(0개월), 중(6개월), 후(12개월) 총 3회에 걸쳐 운동능력과 인지기능을 측정하였다. 운동능력은 심폐지구력(6분걷기: 6분 동안 걸은 거리 측정), 근력(악력: 악력계를 이용하여 양손 평균치 측정), 근지구력(앉았다 일어서기: 30초 동안 앉았다 일어서기 횟수 측정), 유연성(좌전굴: 다리 앞으로 뻗고 앉아서 앞쪽으로 손을 뻗어 손끝과 발끝 사이 거리측정), 평형성(눈뜨고 외발서기: 눈뜨고 선 채로 양손을 옆으로 뻗어 외발로 서있는 시간측정), 민첩성(누웠다 일어서기: 누운 상태에서 최대한 빨리 일어서기까지 시간측정) 등 6종목을 측정하여 분석하였고, 치매환자의 인지기능을 평가하기 위해 MMSE(Mini-mental state examination) 검사를 실시하였는데, 이 검사는 지남력(시간, 장소), 3단어 기억등록, 집중력과 계산, 3단어 기억회상, 언어 및 공간 구성 등으로 이루어져 있으며 30점 만점에 9점 이하는 말기(severe), 10~20점은 중기(moderate), 21~26점은 초기(mild), 그리고 27이상은 정상(normal)으로 평가한다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>본 연구의 자료처리는 SPSS/PC package (10.0)를 이용하여 분석하였고 가설검중의 유의수준은 \( \alpha \leq .05 \)로 설정하였다. 자료의 기술통계량으로 평균과 표준편차를 산출하였고, 그룹별 시기간(전 \( \&\) 중, 전 \(\&\) 후)에 따른 종속변인(운동능력, 인지기능)의 차이를 알아보기 위해 paired samples \( t \) test를 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>운동능력의 변화</h2><p>치매환자에 대한 운동의 목적은 삶의 질 향상에 있다. 즉, 혼자 이동할 수 있고 일상생활을 영위할 근력을 강화시키며 넘어지거나 다치는 것을 예방하는데 있다. 장기간의 규칙적인 운동은 치매환자의 뇌혈류와 신경전달물질의 분비를 증가시켜 뇌를 지속적으로 자극함으로써 뇌의 노화를 방어하는데 최선의 처방으로 사용될 수 있다. 본 연구에서는 1년간의 운동에 따른 운동능력의 변화를 알아보고자 체력의 6대 요소로 알려져 있는 심폐지구력, 근력, 근지구력, 유연성, 평형성, 및 민첩성을 분석하였으며, 그 결과는 다음과 같다.</p><p>심폐지구력은 운동군의 경우 전 \( 148.33 \pm 80.15 \mathrm{~m} \), 중 \( 175.50 \pm \)\( 84.48 \mathrm{~m} \), 후 \( 202.34 \pm 96.26 \mathrm{~m} \)로 나타나 운동전에 비해 운동중\( (\mathrm{p}<0.01)\)과 운동후\( (\mathrm{p}<0.01) \)유의하게 증가한 반면, 통제군에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이와같은 결과는 운동이 남성 치매환자의 심폐지구력을 향상시키고 시간이 경과할수록 그 효과 또한 크게 나타남을 명백히 보여주고 있다. 근력과 근지구력은 서로 유사한 결과를 보였는데, 운동군의 근력은 전 \( 16.15 \pm 2.40 \mathrm{~kgW} \), 중 \( 19.64 \pm 2.53 \mathrm{~kgW} \), 후 \( 24.05 \pm 4.42 \mathrm{~kgW} \), 운동군의 근지구력은 전 \( 12.22 \pm 4.32 \mathrm{~times} \), 중 \( 15.25 \pm 5.44 \mathrm{~times} \), 후 \( 18.10 \pm 3.26 \mathrm{~times} \)로 나타나 운동전에 비해 운동중\( (\mathrm{p}<0.05) \)과 운동후\( (\mathrm{p}<0.01) \) 유의하게 증가하였으나, 통제군의 경우에는 모두 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 치매 노인들을 대상으로 근력운동을 실시한 결과 하지근력과 근지구력이 증가하였다는 Dvorak과 Poehlman의 연구와 일치하고 있다. 유연성은 다른 결과들과는 달리 운동군, 통제군 모두 유의한 차이가 없는 것으로 나타났는데, 이는 아마도 남성 치매 환자들의 뼈가 이미 상당히 경직되어 있는 상태이고 근육의 탄력성 또한 저하되어 관절의 가동범위가 현저히 감소되었기 때문인 것으로 보여진다. 평형성과 민첩성도 유사한 결과를 보였는데, 운동군의 평형성은 전 \( 1.27 \pm 2.33 \mathrm{~sec} \), 중 \( 2.37 \pm 1.78 \mathrm{~sec} \), 후 \( 3.41 \pm 1.29 \mathrm{~sec} \), 운동군의 민첩성은 전 \( 18.55 \pm 20.17 \mathrm{~sec} \), 중 \( 17.36 \pm 10.15 \mathrm{~sec} \), 후 \( 14.66 \pm 3.76 \mathrm{~sec} \)로 나타나 운동전에 비해 운동후\( (\mathrm{p}<0.05) \)만이 유의하게 증가하였고, 통제군의 경우에는 모두 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 남성 치매환자의 평형성과 민첩성을 향상시키기 위해서는 최소한 12개월 이상은 운동을 해야 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다. Thomas와 Hageman은 치매환자들을 대상으로 근력 트레이닝을 실시한 후 무릎과 고관절 신전검사, 악력 및 걷기검사 등 신체능력을 평가하였는데 이 중에서도 걷기 능력이 현저히 증가하여 치매환자의 근육상해를 감소시키고 골절의 위험성을 줄이는데 효과적이었다고 보고하였다. 또한, Naso 등은 너싱홈(nursing home) 치매환자들에 게 있어 낮은 강도의 근지구력 트레이닝은 향후 발병률을 낮추고 심장질환을 예방할 뿐만 아니라 치매의 진행속도를 지연시켰다고 보고한 바 있다. 이렇듯 가벼운 근력 \(\cdot\) 근지구력 트레이닝 프로그램은 초기 치매환자에게 적용이 가능하고 효과를 기대해 볼 수 있다.</p><h2>인지기능의 변화</h2><p>MMSE는 노인이나 치매환자의 인지기능을 평가하는 도구로서 현재 임상적으로 가장 널리 사용되고 있는 선별적 신경심리 검사이다. 이 검사는 특히, 중증 이상의 치매에 매우 예민하고 감별력이 높으며 이미 많은 연구에 사용되어 타당도와 신뢰도가 검증되었다는 장점이 있는 반면, 저 학력(illiteracy)인 경우 검사가 어렵고 초기 인지기능 선별이 어려우며, 전두엽 기능장애에 예민하지 못하다는 단점이 있다. 본 연구에서는 MMSE 측정시 매회 같은 문항을 이용하였으며, 이에 따른 운동군과 통제군의 MMSE 변화는 다음과 같다.</p><p>MMSE는 운동군의 경우 전 \( 13.42 \pm 3.14 \mathrm{~pt} \), 중 \( 16.59 \pm 5.80 \) \( \mathrm{~pt} \), 후 \( 18.74 \pm 6.51 \mathrm{~pt} \)로 나타나 운동전에 비해 운동중\( (\mathrm{p}<0.05) \)과 운동후\( (\mathrm{p}<0.01) \) 유의하게 증가하였고, 통제군에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이러한 연구결과는 일반 치매환자의 경우 MMSE가 연간 평균 3점씩 감소한다는 사실에 비추어 볼 때, 비록 중기(10~20점) 내에서의 변화이지만 유의하게 향상되었다는 사실만으로도 운동과 치매치료에 있어 의미있는 연구결과라 사료된다. 이는 단기간 운동보다 장기간 운동이 치매환자의 인지기능을 유지하고 향상시키는데 더 효과적이었다고 보고한 Netz와 Jacob의 연구결과와 일치하였고, 규칙적인 중강도의 유산소 운동이 뇌에 많은 산소를 제공하여 치매환자의 인지기능 향상에 크게 기여하였다고 주장한 Brinton의 연구를 뒷받침하고 있다.</p><p>그러나 이와 같은 결과들은 연령, 유전, 병력, 학력, 생활 및 식습관 등에 따라 차이가 나타날 수도 있기 때문에 운동능력과 인지기능에 관한 운동의 효과에 대해 확정지어 단언하기에는 다소 무리가 있을 수 있다.</p>	생명
v22n2	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료 및 조직 추출액의 준비</h2> <p>경골어류 농어목 파랑볼우럭(Lepomis macrochirus, \( 10 \pm 3 \) \( \mathrm{cm} \) )은 4, 5, 9월에, 큰입우럭(Micropterus salmoides, \( 35 \pm 5 \mathrm{~cm} \) )은 9월에 채집하여 얼음에 채워 운반하였고, 눈조직에 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH} 6.85,4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)를 3배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 glass homogenizer로 파쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times g \) 에서 1시간씩 2회 원심분리(Mega 21R, Hanil)하였으며 상등액을 시료로 사용하였다.</p> <h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동(native-PAGE): Western blotting 및 면역침강반응</h2> <p>파랑볼우럭 눈조직의 LDH 동위효소를 확인하기위해서 Western blotting 및 면역침강반응 후 native-PAGE를 실시하였다. Native PAGE는 polyacrylamide vertical slab system (SE250, Hoefer)으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시키면서 실시하였다. Slab gel은 \( 7.5 \% \) acrylamide separation gel 및 \( 2.67 \% \) acrylamide stacking gel로 만들었고, 시료에는 sucrose와 bromo phenol blue 용액을 1: 1\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가한 후 \( 5 \mathrm{mM} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 20분간, \( 200 \mathrm{~V} \)에서 2시간 10분간 전기영동하였다. LDH는 DL-lactate, NBT, PMS 및 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 혼합한 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색한 후, \( 15 \% \) 초산 용액에서 고정하였다. Western blotting 실험은 LDH eye-specific \( C_{4} \) 동위효소를 native-PAGE한 후 semi-dry transfer systems (Trans-blot SD, Bio-Rad)에서 \( 0.015 \mathrm{M} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 25 \mathrm{~V} \)에서 30분간 nitrocellulose 막에 전이시켰다. 막을 \(5\%\) skim milk/TBS \( (0.01 \mathrm{M} \) Tris buffered saline, \( \mathrm{pH} 7.5 \) ) 용액에 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후 TBS 용액으로 10분간 3회 세척하였다. \( 1 \% \) skim milk/TBS로 희석한 조피볼락(Sebastes schlegeli) LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4}\)(1: 1,000)에 대한 항혈청 용액에 막을 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후 TBS 용액으로 10 분간 2회 세척하였다. \(1\%\) skim milk/TBS를 사용하여 희석시킨 2차 항체 (anti-rabbit \( \mathrm{IgG}\), 1: 1,000) 용액에서 1시간 반응시키고 TBS 용액으로 10분간 3회 세척하였다. 전개용액(chloronaphtol, methanol, TBS, 30\% \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) )으로 반응시키고 증류수로 세척 후 밴드를 확인하였다.</p> <p>눈조직 추출액에 꺽지(Coreoperca herz) LDH \( \mathrm{A}_{4} \), 소(Bos taurus) LDH \( \mathrm{B}_{4} \), 및 조피볼락 LDH \( \mathrm{B}_{4} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대한 항혈청을 각각 1: 0.5, 1: 4, 1: 0.5\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 면역침강반응 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times \mathrm{g} \)에서 원심분리하였으며, 상등액을 native-PAGE하여 항원-항체 복합체를 이루지 않은 LDH 동위효소를 확인하였다.</p> <h2>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2> <p>LDH 활성을 Whitt의 방법에 따라 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 측정하여 최대활성을 기준으로 상대활성 \( (\%, \mathrm{~V} / \mathrm{Vmax}) \)을 구한 결과 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( \mathrm{pH} \) 4.0에서 81.9 \(\%\), \(\mathrm{pH} \) 7.5에서 최대 활성을 나타냈으며, \( \mathrm{pH} \) 8.5까지 \( 80 \% \) 이상의 활성을 나타냈다. 따라서 최적 \( \mathrm{pH} \)는 7.5였고, \( \mathrm{pH} 4.0 \)과 \( \mathrm{pH} \) 7.5~8.5에서 안정적이었다. 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 4.0에서 최대 활성을 나타내고, \( \mathrm{pH} \) 4.5에서 \( 95.3 \%, \mathrm{pH} 8.0 \)에서 \( 86 \% \) 활성을 나타내므로 최적 \( \mathrm{pH} \)는 4.0이었고, \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 4.5 \)와 \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서 안정적이었다. 그리고 Whitt 방법에 따른 \( \mathrm{pH} 6.85 \) 완충액, \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 LDH 활성을 측정하는 경우, 큰입우럭과 파랑볼우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 각각 \( 33 \% \)와 \( 60 \% \) 활성이 측정되었다. 고등어 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 8.5에서 최대 활성을 나타내고, \( \mathrm{pH} \) 6.5~10.0에서 \( 75 \% \) 활성을 나타냈으며, 풀망둑 눈조직은 \( \mathrm{pH} \) 6.5에서 최대 활성을 나타내지만 \( \mathrm{pH} 7.5 \) 부터 활성이 급격히 감소되었다. 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 8.5에서 최대 활성을 나타냈으나 \( \mathrm{pH} \) 7.0~8.0에서 80~97 \( \% \), \( \mathrm{pH} \) 6.5~7.0에서 23~35\( \% \) 활성이 측정되었다. 또한 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} \) 5.5에서 최대 활성을 나타내지만, \( \mathrm{pH} \) 7.0에서 \( 37 \% \) 활성이 측정되어 큰입우럭과 파랑볼우럭과 같이 중성에서 활성이 낮게 측정되었다.</p> <p>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산으로 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따라 LDH 활성을 측정한 후 상대 활성을 구한 결과 파랑볼우럭은 \( \mathrm{pH} 4.5 \sim 5.0 \)에서 \( 79 \%, \mathrm{pH} 7.5 \sim 8.5 \)에서 \( 80 \% \) 이상 활성을 나타내 산성과 약알카리에서 활성이 강했으며, \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서 최대 활성을 보였고, \( \mathrm{pH} \) 6.8에서는 \( 70 \% \) 활성을 나타냈다. 그리고 큰입우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( \mathrm{pH} 4.0 \)에서 최대 활성을 나타낸 후 감소하여 \( \mathrm{pH} 4.5 \)에서 \( 65 \%, \mathrm{pH} 7.5 \)에서 \( 50 \% \) 활성을 나타냈다. 또한 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 경우 최대 활성을 나타내는 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 측정한 결과 \( \mathrm{pH} 4.0 \)에서 최대 활성을 나타내고, \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 5.0 \)에서 \( 74 \% \) 이상의 활성과 \( \mathrm{pH} \) 6.0~7.0에서 \( 58 \sim 60 \% \) 활성을 보였으며 \( \mathrm{pH} 7.5 \)에서 \( 48 \% \) 활성을 나타내지만 \( \mathrm{pH} 8.0 \) 이상에서는 활성이 낮게 나타났다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동: Western blotting 및 면역침강반응</h2> <p>눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( C_{4} \) 동위효소에 대해 연구하기위해 눈조직에서 발현되는 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~B}_{4} \) 및 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 확인하였다. 파랑볼우럭 눈조직 추출물을 native-PAGE한 후 Western blotting하여 양극 쪽에 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 확인하였다. 또한 눈조직에 LDH \(\mathrm{A}_{4} \)에 대한 항혈청을 반응시켜 면역침강반응 후 native-PAGE를 실시한 결과 \( \mathrm{A}_{4} \) 밴드는 확인되지 않고 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 는 흐리게 나타났으며, LDH \(\mathrm{B}_{4} \)에 대한 항혈청을 반응시킨 경우 \( \mathrm{B}_{4} \) 밴드가 나타나지 않았고 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 활성이 흐려졌으며, LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대한 항혈청을 사용하여 반응시킨 결과 \( \mathrm{A}_{4} \)와 이질동위효소, \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 나타나지 않고 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소만 확인되어 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 \( \mathrm{B}_{4} \)보다 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소에 유사한 것으로 확인되었다.</p> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직의 LDH 전기영동상은 음극 쪽으로 부터 \( \mathrm{B}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{~A}_{4}, \mathrm{~A}_{3} \mathrm{C}, \mathrm{C} \) hybrid 및 양극 쪽의 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 나타났고, \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B} \)와 \( \mathrm{AB}_{3} \) 동위효소가 나타나지 않은 것이 유사하였으나, 파랑볼우럭의 LDH \(\mathrm{C} \) hybrid의 발현이 큰입우럭보다 약하게 나타나 차이를 보였다. 그리고 풀망둑과 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 역학적 성질이 \( \mathrm{B}_{4} \)보다 \( \mathrm{A}_{4} \)에 유사하다는 보고와도 일치하였다. 쥐노래미 LDH는 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 가장 음극에 나타나 차이를 보였으나 \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B}, \mathrm{AB}_{3} \)가 나타나지 않은 것은 동일하여, 5가지 동위효소가 나타나는 가물치에 비해 저산소에 적응된 것으로 보였다. 그리고 파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직의 미토콘드리아 LDH도 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{~B}_{4}, \mathrm{C} \) hybrid, \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 모두 확인되었으므로 미토콘드리아에서 LDH에 의한 에너지 대사가 활발하게 이루어지는 것으로 사료된다.</p> <h2>세포기질 LDH, 미토콘드리아 LDH 및 CS의 활성</h2> <p>4, 5, 9월에 채집한 파랑볼우럭 눈조직의 LDH 활성을 측정하였다. 9월에 채집한 파랑볼우럭 눈조직의 LDH 활성은 30.4 \( \mathrm{units} \)로 4월의 9.45 \( \mathrm{units} \)에 비해 크게 증가되었다. CS의 활성은 5월에 0.53 \( \mathrm{units} \)로 4월의 활성보다 감소되었지만 9월에 0.9 \( \mathrm{units} \)로 4월의 활성과 유사하였다. 따라서 LDH 가 CS 보다 증가폭이 컸으므로 LDH CS는 9월에 33.78로 증가되어 혐기적 대사가 증가된 것으로 확인되었다. 또한 단백질양이 9월에 \( 48.3 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)이므로 가장 많이 증가되었다. 파랑볼우럭(9월)의 눈조직 추출액의 MAOX 활성은 0.35 \( \mathrm{units} \)였으나, 미토콘드리아 분획 추출액에서는 MAOX가 0.43 \( \mathrm{units} \)였으므로 미토콘드리아가 분리되었음이 확인되었으며, 눈조직 미토콘드리아 분획의 LDH 활성이 1.38 \( \mathrm{units} \)였고, LDH 의 비활성은 1.29 \( \mathrm{units} / \mathrm{mg} \)였다. 그리고 큰입우럭 눈조직의 미토콘드리아 LDH 활성은 0.55 \( \mathrm{units} \)였고, LDH의 비활성은 5.00 \( \mathrm{units} / \mathrm{mg} \)였다. 따라서 파랑볼우럭 미토콘드리아 LDH 활성은 세포기질 LDH 활성의 \( 4.54 \% \)였고, 큰입우럭의 경우는 \( 4.7 \% \)로 나타났으므로 미토콘드리아에서 LDH 에 의한 젖산의 대사가 이루어지는 것이 확인되었다. 파랑볼우럭(9월)의 눈조직 추출액의 활성은 풀망둑 눈조직 LDH 53.25 \( \mathrm{units} \), CS 8.35 \( \mathrm{units} \) 가물치 눈조직 LDH3.5 \( \mathrm{units} \), CS10.9 \( \mathrm{units} \), 쥐노래미 눈조직 LDH 10.90 \( \mathrm{units} \)와 비교하면 풀망둑 LDH 활성 보다 낮지만 쥐노래미와 가물치의 LDH 활성보다 높게 확인되었고, CS는 풀망둑과 가물치보다 낮아 파랑볼 우럭과 큰입우럭 눈조직의 경우 혐기적 대사 비율이 높은 것으로 확인되었다.</p> <h2>Preparative native-PAGE에 의한 LDH eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 동위효소의 분리</h2> <p>Eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소를 분리하기 위해서 Preparative native-PAGE을 실시하였다. 파랑볼우럭의 경우, \( 5 \% \) acrylamide gel로 실시한 결과 10 32번(4.5~16 \( \mathrm { ml } \)) 분획에서 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)가 분리되었으며, 시료의 LDH 활성 38.58 units로부터 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 17.11 \( \mathrm { units } \)를 얻어 수득률이 \( 44.35 \% \)이었고. 208~211번에서 \( \mathrm { A } _ { 4 } \), 270 번에서 \( \mathrm { A } _ { 2 } \mathrm { ~B } _ { 2 } \) 350번에서 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위 효소가 확인되었다. 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)와 같이 \( 4 \% \) acrylamide gel로 분리한 경우 bromophenol blue와 eye-specific \( C_ { 4 } \) 가 동일 분획에서 함께 용출되어 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 동위효소를 분리하기가 어려웠으므로 \( 5 \% \) gel에서 분리하였다. 큰입우럭 eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소는 \(5 \% \) acrylamide gel로 분리한 경우 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 동위효소와 인접하게 위치한 동위효소가 함께 용출되므로 \(6 \% \) acrylamide gel로 분리하였으며, 35~65번(17~32.5 \( \mathrm { ml } \)) 분획에서 분리되었다. 정제 후 분획을 native-PAGE하여 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } , \mathrm { ~A } _ { 4 } \) 및 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위 효소를 확인하였으며. 큰입우럭 눈조직의 LDH 활성 9.16 units로부터 eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소 0.46 \( \mathrm { units } \)를 얻어 수득률은 \( 5.05 \% \)로 파랑볼우럭의 수득률에 비해 낮았으며, 이는 인접하여 위치된 \( \mathrm { AC } _ { 3 } \) 동위효소로 인해 분리가 어려웠기 때문이다. 가물치 eye-specific \( C_ { 4 } \) 동위효소의 경우 \( 4 \% \) acrylamide gel로 Prep cell을 실시하여 \( 2 \mathrm { ml } \)씩 분획할 때 9~15번 분획(16~30 \( \mathrm { ml } \))에서 얻어 수득률이 \( 0.7 \% \)였고, 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)는 \( 4 \% \) acrylamide gel에서 10~12번(18~24 \( \mathrm { ml } \))에서 용출되어 수득률이 \(2.4 \% \)라는 보고와 비교하면 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm { C } _ { 4 } \)의 경우 LDH 활성도 높고 acrylamide gel의 농도도 잘 조절되어 수득률이 높은 것으로 사료 된다.</p> <h1>서 론</h1> <p>젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, LDH)는 Ldh - A, B, C에 의해 만들어진 사량체로 \( \mathrm{NAD}^{+} / \mathrm{NADH} \) 존재 하에 피루브산과 젖산의 상호 전환을 촉매하며, Ldh-A는 골격근과 같이 혐기적 대사가 우세한 조직에서 발현되고, Ldh-B는 심장조직과 같이 호기적 대사가 우세한 조직에서 발현되나, 종에 따라, 조직에 따라 대사적으로 필요한 정도가 다르므로, 진화를 통해 LDH 동위효소의 발현, 전하 및 역학적 특성이 최적화 되어있다. Ldh-C는 경골어류의 간이나 눈조직에서 나타나며, 역학적 특성과 전하도 다르고 다른 유전자에 의해 발현되며 농어목의 눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \), 잉어목과 대구목의 간조직에서 발현되는 LDH liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 및 포유류와 조류의 정소와 정자에서 발현되는 LDH tes-tis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 보고되었다. 따라서 왜 Ldh-C를 특정 조직에서만 필요로 하는지에 대해 확실하지 않지만, LDH C는 유전적 이점이 있으므로 진화를 통해 보존되어 있는 것으로 받아 들여져 정소의 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대해서만 활발히 연구가 진행되고 있다.</p> <p>LDH testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 정소와 정자에서 포도당 대신 젖산과 피루브산을 우세하게 사용하여 에너지를 생성하고 정자가 운동하는데 사용되므로, 생쥐 정자의 LDH 활성의 \( 80 \% \) 이상을 차지한다고 보고되었다. 따라서 Ldh-C가 결손된 정자는 미토콘드리아의 활성은 변화되지 않지만 해당과정이 억제되어 \( \mathrm{NAD}^{+} \)가 부족해지고 피루브산이 축적되어 ATP가 빠르게 감소되었다. 그 결과 운동성이 떨어져 불임을 이끌었으므로 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 경우 정자의 ATP 항상성에 포함되는 복합물로서 에너지 대사에 직접 작용한다고 보고되었지만 여전히 Ldh-C의 기능에 대해서는 해결되지 않은 상태다. Liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 퍼옥시솜에서 \( \mathrm{NAD}^{+} / \mathrm{NADH}^{2} \)를 조절하고 대사와 관련되어진다는 것이 보고되었다.</p> <p>그리고 눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 망막의 광수용기 세포에 존재하여 광색소 재생성에 필요한 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 생성할 수 있다고 제시되어[33,46], 농어목 어류에서 보고되었고, cichlidae 어류의 눈 및 뇌조직에서 eye-specific Ldh-C가 확인되었으며, 송어에서 피루브산에 대해 친화성이 크게 자연 선택되었다고 보고되었다. 그리고 lactate shuttle에 의한 젖산의 중요성이 인식되면서 망막에서의 젖산 대사와 monocarboxylate 수송체(monocarboxylate transporters, MCT)에 대한 연구가 진행되고 있으나 LDH와 관련된 연구는 이루어지고 있지 않다. 눈조직에서의 Ldh-C에 대한 연구는 국내산 농어목 어류에서 Ldh-C의 발현이 확인되었고, Ldh-C가 발현되는 꺽지의 DO와 온도를 급격히 변화시킨 경우 초기에 Ldh-C가 Ldh-B 보다 먼저 발현되는 것으로 나타나 에너지 대사에서의 Ldh-C의 기능에 대한 관심을 불러 일으켰다. 또한 풀망둑과 얼룩동사리 눈조직의 LDH 활성이 높게 확인되어 농어목의 육식성어류에서 먹이 포획시 눈조직의 LDH 활성이 기능을 할 것으로 예상하였다. 그러나 가물치, 쥐노래미에서는 LDH 활성이 비교적 낮고 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR}} \)이 낮아 피루브산에 대한 친화성이 크게 나타났으므로, 에너지 대사에서의 역할이 중요함이 인식되었고, 종들의 서식환경, 먹이 포획 방법을 포함한 행동 양상 및 운동성에 따라 눈 및 뇌조직에서 Ldh-C가 다르게 발현됨을 알 수 있었다. 그리고 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 활성에 대한 \( \mathrm{pH} \) 안정성 실험에서 약산성에서 최대 활성이 나타나고, LDH 활성을 측정하는 중성 \( \mathrm{pH} \)에서 활성이 약해, eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 활성을 측정하는 조건이 재검토 되어야 할 필요가 있는 것으로 나타났다.</p> <p>따라서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 특성을 확인하기 위해 농어목 어류 중 피식자와 포식자 관계의 파랑볼우럭과 활동성이 큰 큰입우럭을 선택하였다. 포식자가 먹이를 찾는데 시간이 소모되고, 다가가서 추적하고 먹이를 잡아먹는 행동을 하므로, 먹이를 잡는 행동은 시간의 소비와 관련된다. 추격행동은 혐기적 대사에 의해 생성된 에너지로 급격하게 수영하여 포획하는 행동으로 비교적 시간은 적게 소요되나 에너지 소모가 크다. 어류가 먹이를 포획하는데 근육 LDH 의 혐기적 대사에 의해 에너지를 빠르게 생성하여 사용한다고 보고하였다. 또한 밀집 식생의 경우 먹이를 찾는데 많은 시간이 소요되고 포획율도 감소하므로 밀집 식생군에서 에너지 비용을 줄이는 추적행동으로 매복행동이 나타나 에너지를 보존하는 방향으로 행동한다. 따라서 LDH는 단시간 에너지 소모와 관련된 혐기적 에너지 비용을 담당하므로 어류 활동의 방식과 사용되는 에너지의 양을 연관 지을 수 있는 수단이고 표지자로 사용될 수 있다. 큰입우럭은 골격근의 LDH 를 사용하는 혐기적 대사에 의해 포획 활동을 하며, 먹이의 크기가 증가함에 따라 LDH 활성이 증가하고, 큰입우럭의 활동이 증가하여 포획 활동 정도에도 영향을 미치게 된다. 그러나 포식자인 큰입우럭이 먹이를 포획하는 순간과 피식자인 파랑볼우럭이 먹이를 얻고, 방어하는 기능에 눈조직이 관여하고 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 가 중요한 역할을 할 것으로 예상되어 연구하였다.</p> <p>본 연구에서 농어목에 속하는 열대산 광온성 어류로서 피식자와 포식자 관계를 갖는 종인 파랑볼우럭과 큰입우럭을 선택하여 눈조직에서 발현되는 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 특성을 비교하고, LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성을 측정하는 조건을 제시하고자 하였다.</p> <h2>Preparative native-PAGE에 의한 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 분리</h2> <p>Preparative native-PAGE (Model 491 Prep cell, Bio-Rad)는 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 정제하기위해서 \( 5 \% \) acrylamide separation gel과 stacking gel을 5:1로 만들었고, 큰입우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 분리하기 위해 \( 6 \% \) acrylamide separation gel \( (28 \times 50 \mathrm{~mm}) \)을 만들었다. Buffer (0.025 M Tris-Glycine, \(\mathrm{pH} \) 8.3)를 upper chamber에 \( 400 \mathrm{ml} \), lower chamber에 2 l, elution chamber에 \( 800 \mathrm{ml} \) 채운 후 시료 \( 3 \mathrm{ml} \) 와 sample buffer (0.0625 M Tris-HCl, \(\mathrm{pH} \) 6.8, \( 10 \% \) glycerol, \( 0.025 \% \) bromophenol blue)를 \( 1: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 섞은 용액을 gel의 상부에 가하고, \( 460 \mathrm{~V}, 40 \mathrm{~mA} \)에서 전기영동 하였으며, bromophenol blue가 separation gel을 빠져나갈 때 elution buffer를 \( 0.75 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 유속으로 유입시키면서 용출액을 \( 0.5 \mathrm{ml} \)씩 분획 하였다. 각 분획의 LDH 활성을 측정하고, native-PAGE하여 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)만 존재하는 분획을 모아 농축시킨 후 기질의존성 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 기질의존성 측정 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2> <p>\( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH 를 함유하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (pH 6.85)에 피루브산 \( 0.01 \sim 10 \mathrm{mM} \)을 가하고 파랑볼우럭 눈조직 추출액 및 파랑볼우럭과 큰입우럭의 정제한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성을 측정하여 최대 활성을 기준으로 상대 활성(\(\%, V/Vmax\))을 구하여 기질농도에 의해 저해되는 정도를 확인하였다. 그리고 Lineweaver-Burk plot에 의해 \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\text {PYR}} \)를 얻었다. \( 0.7 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NAD}{ }^{+} \)를 함유하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85)에 L-lactate \( 0.1 \sim 200 \mathrm{mM} \)을 가하고 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 LDH 활성을 측정하였고, 최대 활성에 대한 상대 활성 (\( \%\), \( \mathrm{V} / \mathrm{Vmax}) \)을 확인하였다. 또한 \( \alpha \)-ketobutyric acid, \( \alpha \)-ketovaleric acid, \( \alpha \)-ketoglutaric aicids, \( \alpha \)-ketocaproic acid, DL-d-keto- 3 -methyl-n-valeric acid, \( \alpha \)-ketoisocaproic acid, 및 \( \alpha \)-ketoisovaleric acid 등의 \( \alpha \)-ketoacids 기질에 대한 활성을 측정하여 기질 특이성을 확인하였다.</p> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭의 정제한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH}\) 4.0,4.5,5.0), 0.1 \( \mathrm{M} \) sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH} \) 5.5), \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH}\) 6.0, 6.5, 7.0), \(0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH}\) 7.5, 8.0 , 8.5), 0.1 M Tris-glycine buffer ( \( \mathrm{pH} \) 9.0) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 9.5, 10.0, 10.5) 에 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 피루브산, \( 0.5 \) \( \mathrm{mM} \) 피루브산 및 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 LDH 활성을 측정하여 비교하였고, 또한 최대 활성에 대한 상대 활성(\%)을 구하여 \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)를 확인하여, 눈 조직 LDH 및 LDH eye-specific \( C_{4} \) 활성을 측정하는 조건으로 제시하였다.</p> <p>피루브산 \( 10 \mathrm{mM} \)에서 풀망둑 눈조직의 LDH는 \( 35.22 \% \), LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 36.53\% 활성을 나타냈고[49], Scombo japonicus LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( 30 \% \) 활성을 나타냈으며, 가물치 \( \mathrm{LDH} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( 16.87 \% \) 활성을 나타낸다고 보고되었으므로 본 실험의 큰입우럭 \( 15.8 \% \), 파랑볼우럭 \( 5.2 \% \) 보다 저해정도가 낮았으며, 쥐노래미는 \( 6.5 \% \) 활성을 나타내는 것으로 보고되어 파랑볼우럭이 가장 저산소에 적응된 것으로 확인되었다. Whitt의 방법에 따라 LDH 활성은 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 파랑볼우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} 20.9 \% \), 큰입우럭 \( \mathrm{C}_{4} 31.6 \% \), 눈조직 LDH \( 61.6 \% \)로 측정되었고, 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} 40 \% \), 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} 73 \% \), 풀망둑 눈조직 LDH \( 100 \% \)로 측정되었다. 그리고 \( 0.5 \mathrm{mM} \)에서는 파랑볼우럭 eye-specifc \( \mathrm{C}_{4}\) \( 72.2 \% \), 큰입우럭 eye-specifc \( \mathrm{C}_{4} \) \( 78.9 \% \) 활성이 남아, 조직의 LDH 및 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 활성을 측정할 수 있는 조건으로 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 보다는 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 농도를 선택하여야 할 것으로 사료된다. 그리고 꺽지 \( \mathrm{A}_{4} \), 쏘가리 \( \mathrm{A}_{4} \), 가물치 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{~B}_{4} \), 소 \( \mathrm{B}_{4} \), 풀망둑, 칠성장어 및 메기류 조직들 LDH 의 활성이 피루브산 농도에 따라 변화되는 정도를 종합하면 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 95 \%, 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 84 \% \)의 활성이 측정되었으므로 다른 조직들의 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소 및 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소에서는 활성의 차이를 크게 보이지 않았다.</p> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직의 LDH 동위효소가 젖산에 의해 저해되는 정도를 측정한 결과 파랑볼우럭의 LDH 활성이 낮은 농도의 젖산에서 큰입우럭의 LDH 활성보다 조금 더 크고 파랑볼우럭LDH 가 \( 22 \mathrm{mM} \), 큰입우럭 LDH가 \( 24 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타내고, 이후 농도에서 활성이 급격히 저해되었다. 따라서 큰입우럭 눈조직 LDH 동위효소의 젖산에 대한 친화성이 파랑볼우럭보다 조금 낮고, 좀 더 많은 양의 젖산에 내성이 있으므로, 해당과정에 의해 에너지를 더 많이 생성할 수 있는 것으로 볼 수 있다. Channa punctatus 심장조직 LDH는 \( 12.5 \mathrm{mM} \), 골격근의 LDH는 \( 175 \mathrm{mM} \), 아마존에 서식하는 Mylossoma duriventris 심 장조직 \( 14 \mathrm{mM} \), 골격근 \( 20 \mathrm{mM} \), C. macropomum 심장조직 \( 20 \mathrm{mM} \), 골격근 \( 25 \mathrm{mM} \) 및 토끼 골격근 LDH가 \( 25 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타냈다는 보고와 비교해 보면 eye-specific \( C_{4} \)의 경우 M. duriventris 심장조직과 골격근 보다는 젖산에 대한 내성이 강하고, C macropomum 골격근의 LDH와 파랑볼우럭의 \( \mathrm{C}_{4} \)와 유사하지만 C. punctatus 골격근의 LDH는 젖산의 농도가 특히 높아 골격근에서 해당과정에 의해 많은 에너지를 생성할 수 있다는 것을 나타내므로 이와 비교해 볼 때 눈조직에서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 에너지의 양은 적지만 빠르게 생성하는 것으로 사료된다. 따라서 포식자인 큰입우럭의 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 저농도 피루브산에서 파랑볼우럭 \( \mathrm{C}_{4} \) 활성보다 크고 최대 활성에 빨리 도달하지만, 저 농도의 젖산에서는 파랑볼우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 가 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 보다 활성이 조금 크고, 최대활성에도 빨리 도달하고 이후 농도에서 저해되므로, 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 젖산에 대한 내성이 커서 피식자인 파랑볼우럭에 비해 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 의해 순간 에너지를 좀 더 빠르고 크게 생성하는 것으로 볼 수 있다.</p> <p>\( \alpha \)-ketoacids 기질에 대한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성을 측정하여 피루브산에 의한 LDH 활성에 대해 상대 활성(\(\%\))을 측정한 결과 파랑볼우럭은 \( \alpha \)-ketobutyric acid가 \( 72.90 \% \)였고, 큰입우럭은 \( \alpha \)-ketobutyric acid가 \( 114.58 \%, \alpha \)-ketovaleric acids가 \( 83.3 \% \)로 높았으며, 모든 기질에서 활성이 41.67~114.58 \( \% \)로 나타나 기질에 대한 특이성이 넓게 확인되었다. 파랑볼우럭 눈조직의 미토콘드리아 내 LDH 는 \( \alpha \)-ketobutyric acid가 \(52.77\%\), 큰입우럭 미토콘드리아 내 LDH는 \( \alpha \)-ketoglutaric aicids가 \( 35.12 \% \)로 가장 높게 측정되었고, 나머지 기질에서는 모두 낮게 확인되었다. 세포기질과 미토콘드리아에서 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 피루브산 다음으로 \( \alpha \)-ketobu-tyric acid가 활성이 가장 크게 나타나, \( \alpha \)-ketoacids에 대한 상대 활성도는 탄소 사슬의 길이가 길어질수록 감소하여 \( \alpha \)-ketobutyric acid \( \rightarrow \alpha \)-ketovaleric acid \( \rightarrow \alpha \)-ketoglutaric acid 순으로 감소한다는 결과와 일치하였다. 생쥐 정소의 LDH testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 결과와 고등어 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 a-ketobutyric acid에 반응하였다는 결과와 일치하였다. 그리고 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 \( \alpha \)-hydroxyvalerate에 대사하는 등 기질에 대한 특이성이 넓다는 결과와도 유사하였다.</p> <h2>LDH와 CS의 활성 측정 및 단백질 정량</h2> <p>LDH의 활성은 \( 1.50 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH 를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \(\mathrm{pH} \) 6.85) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 다음 NADH로 부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 산화되는 정도를 분광광도계(UV-160A, Shimadzu)를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Citrate synthase (CS, EC 4.1.3.7)의 활성은 \( 0.2 \mathrm{mM} \) acetyl-CoA, \( 0.1 \mathrm{mM} \) DTNB[5,5'-dithiobis(2-nitro-benzoic acid)], \( 0.5 \mathrm{mM} \) oxaloacetic acid를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer ( \(\mathrm{pH} \) 7.5) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 후, DTNB가 전환되는 정도를 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 412 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였으며 LDH / CS를 구하였다. 활성의 단위(unit)는 1 분 동안 기질 \( 1 \mu \mathrm{M} \)을 전환시키는 효소의 양으로, LDH 경우 millimolar extinction co-efficient 6.22를, CS 경우 13.6을 사용하여 계산하였으며, 단백질은 BSA를 표준단백질로 사용하여 분광광도계로 595 \( \mathrm{nm} \)에서 Bradford의 방법에 따라 정량하였고, LDH의 비활성은 단백질 양에 대한 효소의 활성 (\( \mathrm{units/mg} \))으로 나타냈다.</p> <h2>미토콘드리아 분리 및 LDH 추출</h2> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직을 적출하여 혈액을 제거한 후 \( 0.25 \mathrm{M} \) sucrose를 함유한 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85)를 3배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하고 glass homogenizer로 조심스럽게 파쇄하였다. 조직 추출액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 270 \times \mathrm{g} \)에서 7 분간 원심분리하였고, 상등액을 동일 조건에서 다시 원심분리하였다. 상등액을 \( 1,500 \times \mathrm{g} \)에서 10 분간 원심분리한 뒤 상등액을 \( 10,000 \times \mathrm{g} \)에서 1시간 동안 원심분리 한 후 미토콘드리아 침전물을 얻었다. Monoamine oxidase (MAOX)의 활성을 측정하여 미토콘드리아의 분리를 확인하였으며, 분리된 미토콘드리아를 3분 간격으로 30초간 초음파로 파쇄한 후 LDH 활성을 측정하고 native-PAGE로 mitochondrial LDH 동위효소를 확인하였다. MAOX 활성은 Tabor 등의 방법을 변형하여 측정하였다. \( 2.5 \mathrm{mM} \) benzylamine을 함유하는 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer (\(\mathrm{pH} \) 7.2) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 후 benzylamine이 감소되는 정도를 분광광도계로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 활성의 단위는 1분 동안 \( 1 \mu \) mole benzylamine을 분해하는 효소의 양으로 millimolar extinction coefficient 13.8을 사용하여 계산하였다.</p> <h2>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 피루브산, 젖산 및 \( \alpha \)-keto acids에 대한 기질의존성</h2> <p>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 기질에 대한 저해 정도를 확인하기위해서 피루브산 농도를 \( 10 \mathrm{mM} \)까지 증가시키며 LDH 활성을 측정하였다. 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 활성은 피루브산이 증가됨에 따라 증가되어 \( 0.1 \mathrm{mM} \)에서 \( 97 \% \) 활성을, \( 0.2 \mathrm{mM} \)에서 최대활성을 나타내고 \( 0.2 \mathrm{mM} \) 이상의 농도에서 급격히 감소되었다. 큰입우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 \( 0.01 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 37 \% \) 활성을 보여 파랑볼우럭 LDH 의 \( 10 \% \) 활성보다 컸으며, \( 0.1 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타내고 \( 0.3 \mathrm{mM} \)까지 \( 97 \% \) 활성을 보이고, 이후 감소 되었다. 파랑볼우럭과 큰입우럭 LDH 활성이 최대활성 이후부터 급격히 저하되어 피루브산 \( 1 \mathrm{mM} \) 에서 각각 \( 50.4 \%, 59.2 \% \) 활성이 남았고, \( 1.5 \mathrm{mM} \)에서는 \( 20.9 \%, 31.6 \%, 10 \mathrm{mM} \)에서 \(5.2\%\), \( 15.8 \% \) 활성이 남아 저해 정도가 컸으며 파랑볼우럭이 저해 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 파랑볼우럭 눈조직의 경우도 \( 0.3 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 최대 활성을 나타내고 \( 1 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 74.1 \%, 1.5 \mathrm{mM} \)에서 \( 61.6 \% \) 및 \( 10 \mathrm{mM} \)에서 \( 22.1 \% \) 활성을 나타냈다. 따라서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 눈조직 LDH 보다 더 낮은 피루브산 농도에서 최대 활성에 이르고, 이후 급격히 저하되어 피루브산에 대해 더욱 민감하게 저해되었으며, 피루브산 \( 4.3 \mathrm{mM} \) 이후부터 저해되기 시작하는 토끼 근육 LDH 보다 낮은 농도에서 저해하는 것으로 보였다. 가물치 경우 저농도의 피루브산에서 심장조직의 LDH 활성이 더 크나 피루브산 농도가 증가됨에 따라 골격근의 LDH 활성이 증가하여 \( 26 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 최대 활성을 나타내고, 심장조직은 \( 60 \mathrm{mM} \)에서 최대 활성을 나타낸다는 보고와 비교하면 골격근과 심장조직의 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 와 \( \mathrm{B}_{4} \)에 비해 눈조직의 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 상당히 낮은 농도의 피루브산에서 저해되는 것으로 확인되었다. Cichlid fish의 LDH 활성이 피루브산 \( 0.33 \mathrm{mM} \)에서 측정되었고, Fundulus heteroclitus LDH 활성은 피루브산 \( 0.667 \mathrm{mM} \)에서 측정되었으며, Amazonian cichlids 경우 환경에 적응되어 대사회로를 조절하고 효소 양을 조정하여 혐기적 대사를 하므로 LDH 활성을 \( 1 \mathrm{mM} \) 피루브산, \( 0.15 \mathrm{mM} \) NADH 및 \( \mathrm{pH} \) 7.4의 완충액에서 측정하였다고 보고되었지만 본 실험에서는 LDH 활성이 \( 0.33 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 높고 \( 0.667 \mathrm{mM} \)과 \( 1 \mathrm{mM} \) 피루브산에서는 낮게 측정되었다. 그리고 Lineweaver-Burk 식에 의해 측정한 결과 파랑볼우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)는 \( 0.088 \) \( \mathrm{mM} \), 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)는 \( 0.033 \mathrm{mM} \)로 확인되었다. 따라서 큰입우럭의 경우 저농도의 피루브산에 의한 \( \mathrm{LDH} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 활성이 크고, \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} \)이 낮아 피루브산에 대한 친화력이 큰 것으로 나타났다. 또한 최대 활성에 이르는 피루브산의 농도가 비교적 낮아 에너지가 더 빠르게 생성되므로, 눈조직에서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위 효소에 의해 생성된 에너지가 포식 행동의 초기반응에 빠르게 사용되는 것으로 사료된다. 또한 고농도 피루브산에서 파랑볼우럭이 큰입우럭보다 저해정도가 크므로 더욱 저산소 조건에 적응되어 진화된 것으로 볼 수 있다. 큰입우럭의 경우 돌 또는 수풀 사이에 숨어있다가 먹이를 발견하고 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)로 급격히 에너지를 생성하여 먹이를 추적한 후 즉시 골격근의 LDH \( \mathrm{A}_{4} \)에 의해 에너지를 생성하여 먹이를 포획하는 것으로 보이므로, 행동의 정도에 따라 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 활성이 차이를 나타내는 것으로 보인다. Eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 이러한 기능은 정자에서 testis-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 ATP 생성과 밀접한 관련이 있다는 보고와 유사한 것으로 사료된다. 그리고 파랑볼우럭과 큰입우럭 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)는 cichlid fish, Oreochromis mossambicus의 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} 0.0323 \) \( \mathrm{mM} \)과 \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 \( 0.0141 \mathrm{mM} \) 및 쥐노래미 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} 0.0188 \mathrm{mM} \) 보다 친화력이 낮은 것으로 나타났지만, 가물치 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} 0.133 \mathrm{mM} \), 잉어 골격근의 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} 0.173 \mathrm{mM} \) 및 송어 골격근의 \( K_{\mathrm{m}}^{\text {PYR }} 0.209 \mathrm{mM} \)에 비해 친화력이 상당히 높게 확인되었으며, 풀망둑 눈조직 \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\text {PYR }} 0.089 \mathrm{mM} \)과 비교하면 파랑볼우럭의 \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소와 유사하였다. 특히 눈조직이 골격근과 심장조직보다 \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\mathrm{PYR}} \)도 낮아 친화력이 크므로 만성적인 저산소에 적응되어 LDH 활성은 낮지만 대사속도가 빠르게 최적화된 것으로 생각된다.</p> <p>피루브산 \( 0.1 \mathrm{mM}, 0.5 \mathrm{mM} \) 및 \( 1.5 \mathrm{mM} \)에서 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따라 측정한 두 종의 LDH 활성을 비교하였다. 파랑볼우럭 LDH는 피루브산 \( 1.5 \mathrm{mM} \)에서 활성을 측정한 경우 보다 \( 0.5 \mathrm{mM} \)에서 측정한 경우의 활성이 높았고, \( \mathrm{pH} 4.5 \sim 5.0\), \( \mathrm{pH} \) 7.5~8.5에서 활성이 높았으며 최대 활성은 \( \mathrm{pH} 8.0 \)이었다. 큰입우럭 LDH는 피루브산 농도에 따라 활성이 높은 \( \mathrm{pH} \)가 다르게 나타났지만 \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 5.0 \)까지 비교적 모두 높게 나타났고, \( 0.1 \mathrm{mM} \) 경우 \( \mathrm{pH} 6.0 \sim 7.5,0.5 \mathrm{mM} \) 경우 \( \mathrm{pH} 7.0 \sim 8.0,1.5 \) \( \mathrm{mM} \) 경우 \( \mathrm{pH} \) 7.5~8.5에서 높게 나타났으므로 \( \mathrm{pH} \) 4.0~5.0와 \( \mathrm{pH} 7.5 \)가 안정적이었다. 또한 LDH \(\mathrm{A}_{4} \)와 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소도 최적 \( \mathrm{pH} \) 가 6.5~7.5에서 보고 되었으므로 두 종의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 상대적 활성 및 LDH 활성과 세포 내 \( \mathrm{pH} \)를 고려하여 피루브산 \( 0.5 \mathrm{mM} \)과 \( \mathrm{pH} \) 7.5를 측정조건으로 선택하였다.</p> <p>따라서 파랑볼우럭과 큰입우럭의 LDH 활성을 Whitt 방법에 따라 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( \mathrm{pH} \) 6.85에서 측정한 경우 활성이 저해되어 낮게 나타났으므로 본 실험 결과에서 LDH 활성을 측정하는 조건으로 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산 농도와 Tris-HCl buffer, \( \mathrm{pH} \) 7.5를 제시하였다. 어류의 경우 종에 따라 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 LDH 활성이 저해되는 정도가 다양하고, 특히 저산소 환경에 적응된 어류 종의 눈조직 LDH 와 LDH eye-specific \( C_{4} \) 동위효소의 경우 일반적으로 피루브산에 대한 저해 정도가 크게 나타나므로 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 피루브산 농도 및 \( \mathrm{pH} \) 7.5에서 측정해야할 것으로 사료된다.</p> <p>실험 결과 파랑볼우럭과 큰입우럭은 저산소 조건에 적응되어 있는 종으로써 눈조직에서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 발현되고, 혐기적 대사 비율이 높게 확인되었으며, 피식자인 파랑볼우럭의 눈조직 LDH 활성이 더 큰 것으로 확인되었다. LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 눈조직 LDH 보다 더욱 낮은 피루브산 농도에서 최대 활성에 이르러 에너지를 더욱 빠르게 생성하는 것으로 나타났다. 파랑볼우럭 눈조직 LDH 와 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 큰입우럭의 LDH 에 비해 고농도 피루브산에 의해 저해되는 정도가 조금 더 크므로 저산소 조건에 더욱 적응되어 진화된 것으로 사료된다. 그리고 큰입우럭의 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 파랑볼우럭의 \( \mathrm{C}_{4} \) 동위 효소보다 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \)이 낮아 친화력이 크고 저농도의 피루브산에서 활성이 더 크며, 고농도 피루브산에 의해 LDH 활성이 저해되는 정도가 낮고 젖산에 대한 내성이 크므로 해당과정에 의해 에너지를 좀 더 많이 생성할 수 있는 것으로 보인다. 따라서 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 의해 크기는 작지만 빠르게 생성된 에너지를 포식 행동의 초기반응에 사용하여 먹이를 추적한 후 골격근의 LDH에 의해 생성된 에너지를 사용하는 것으로 사료된다.</p>	생명
장수상황버섯 균사체를 이용한 고체 발효한약재의 대장암 세포성장 억제 활성	<h2>한약재 추출물 및 발효 한약재 추출물의 인간 적혈구 용혈활성</h2> <p>36 종 한약재 추출물과 발효 한약재 추출물을 대상으로 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 평가하였다. 먼저 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 10 \% \) 이상의 용혈을 나타낸 한약재는 감국 \( (11 \%) \)과 견우자 \( (67 \%) \) 2종이었으며, 발효 한약재중에는 골쇄보에서 \( 11 \% \) 의 용혈현상을 나타내었다(result not shown). 그러나 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 12 종의 한약재가 \( 20 \% \) 이상의 용혈활성을 나타내었으며, 특히 백과, 신이 및 견우자 추출물은 각각 \( 80.8,93.4 \) 및 \( 99.4 \% \) 의 강력한 용혈활성을 보였다. 한편, 발효에 이용된 장수상황버섯 균사체 추출물은 \( 150 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 3.56 \% \) 의 무시할 만한 용혈활성을 나타내었음에도 불구하고, 고체발효 한약재의 경우에는 거의 모든 한약재에서 용혈활성이 증가되었다. 발효에 의해 용혈활성이 감소된 경우는 백렴, 삼칠, 행인 및 괄루근의 4 종이었다. 일반적으로 한약재의 경우 찌거나 발효에 의해 saponin성분들이 증가되고, 이에 따라 항암활성 및 용혈활성이 증가됨을 고려할 때, 이러한 결과는 한약재의 고체발효 동안 사포닌 성분의 급격한 증가 때문에 나타나는 현상으로 이해되며, 향후 관련성분의 탐색이 필요하다. 따라서 한약재 고체발효과정을 통해 한약재의 다양한 성분 변화와 이에 따른 생리활성의 변화가 나타남을 확인하였으며, 본 실험에서는 고체발효에 의해 대장암세포 성장억제능이 의미있게 증가된 골쇄보, 구기자 및 패모를 대상으로 항암활성 및 정상세포에 대한 독성정도를 추가적으로 조사하였다.</p> <h2>고체발효 골쇄보, 구기자, 패모의 정상세포 및 대장암세포 생육억제 활성</h2> <p>HCT116 대장암세포에 대한 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 농도별 생육억제능을 평가하였으며, 그 결과 \( 50 \% \) 생육억제능을 나타내는 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \)는 각각 394, 917 및 \( 149 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 로 계산되었다. 그러나 고체 발효시킨 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 경우에는 각각 28, 85 및 \( 80 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 를 나타내었다. 이는 골쇄보, 구기자 및 패모의 고체발효 과정 중 암세포 성장억제 활성물질이 생산되었음을 의미하며, 발효 골쇄보가 가장 강력한 암세포 성장억제능을 가짐을 알 수 있었다. 반면 인간 및 마우스 유래의 정상세포 HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1에 대해 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물을 처리한 경우 \( 200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도까지 세포독성은 나타나지 않았으며, 오히려 \( 200 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 의 고농도에서는 이들 세포들의 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. 또한 고체발효한 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물 역시 정상세포들에 대해 심각한 세포독성을 나타내지 않았으며, 골쇄보 \( (200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 의 경우 HEK-293 세포에서 35 \%, 구기자 \( (200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 의 경우 MC3T3-E1세포에서 \(30 \% \)의 세포성장 억제를 나타내었다. 그러나 대장암 세포에 대한 발효 골쇄보 및 구기자의 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 가 \(28 \) 및 \( 85 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)임을 고려할 때(Table 3), \( 100 \sim 200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리농도 범위에서는 정상세포에 대한 세포독성은 미미하여 대장암세포에 우선적으로 세포독성을 나타낼 것으로 예상된다.</p> <h2>한약재의 methano추출물의 조제</h2> <p>준비된 36 종의 한약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 각각 \(1 \mathrm { l } \) 플라스크에 넣고, 이를 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 멸간한 후 상온에서 냉각하였으며, 이후 10 배 부피의 methanol을 첨가하여 상온에서 24 시간 동안 3회 반복 추출하였다. 추출액은 filter paper (Whatman No.2)로. 거른 후 감압 하에서 농축하여 한약재 추출물을 조제하였다.</p> <h2>균사체를 이용한 한약재의 고체발효 및 발효 한약재의 추출물 조제</h2> <p>준비된 36종의 한약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 각각 \( 850 \mathrm { ml } \) polypropylene bottle (Namsan Eng., Korea)에 넣고 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20분간 멸균한 후 냉각하였으며, PDB 배지에서 \( 25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } , 130 \mathrm { rpm } \) 으로 10일간 배양한 장수상황버섯 균사체 액체 종균 \( 20 \mathrm { ml } \) 씩을 한약재에 각각 무균적으로 접종하였다. 이후 멸균마개를 이용하여 오염을 방지하고, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 90 \% \) 의 배양기에서 20일간 발효시켰다. 발효 한약재의 methanol 추출물은 한약재 추출물 조제와 동일한 방법으로 조제하였다. 접종에 사용된 액체 종균 균사체는 원심 집균한 후 멸균수로 2회 수세하고 2일간 동결건조 후, 상기와 동일한 방법으로 균사체의 methanol 추출물을 조제하였다.</p> <h2>세포주 배양 및 생존율 조사</h2> <p>본 실험의 HCT116, HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1 세포주의 배양 및 계대에는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco-BRL Inc., USA)를 사용하였으며, \( 10 \% \) Fetal Bovine Serum (Gibco-BRL Inc., USA), 1 \% penicillin 및 streptomycin(WelGene Inc., Korea)을 첨가하여 사용하였다. 한편 조제된 다양한 추출물들이 HCT116, HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1 세포주의 세포 생육에 미치는 영향은 One solution cell proliferation assay kit (Promega, USA)을 이용하여 평가하였다. 즉, 96 well plate에 well당 \( 3 \times 10 ^ { 3 } \) 개의 세포를 접종하고 24 시간 배양한 후 다양한 농도의 한약재 추출물, 발효한 약재 추출물 및 균사체 추출물을 처리하였다. 각 추출물을 각각 24시간 동안 반응시킨 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 \( \mathrm { H } \)-tetrazolium (MTS; Promega, USA) 용액을 각 well 당 \( 20 \mathrm {\mu l } \)씩넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 4 시간 동안 반응 시켰으며, 반응 종료 후 96 well plate reader (Expert 96 UV ASYS Hitech, Austria)를 이용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 성장률을 계산하였다. 결과 수치는 4 개의 독립적인 well 에서 수행한 값을 mean \( \pm \)SD 값으로 나타내었으며, \( 50 \% \) 성장억제를 나타내는 농도를 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) (Inhibitory Concentration 50)로 표시하였다.</p> <h2>인간 적혈구 용혈 활성 평가</h2> <p>제조된 추출물의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구 \( (4 \%) \)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다. 기존의 보고한 방법과 동일하게, PBS로 3회 수세한 인간 적혈구에 추출물 시료용액을 가하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응한 다음, 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 \( 414 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. 용매 대조구로 DMSO ( \(2 \% \)), 적혈구의 \( 100 \% \) 용혈을 위한 실험 대조구로 triton X-100 ( \( \ 0.1 \% \))을 사용하였으며, 다음의 수식을 이용하여 용혈활성을 계산하였다.</p> <p>( \( \% \)) Hemolysis \( = [( \mathrm { S } - \mathrm { C } ) /( \mathrm { T } - \mathrm { C } )] \times 100 \) \( \mathrm { S } \) : 시료 첨가구의 흡광도, \( \mathrm { C } \): DMSO 첨가구의 흡광도, \( \mathrm { T } \): triton X-100 첨가구의 흡광도.</p> <h2>통계분석</h2> <p>실험 결과는 SPSS 17.0 버전을 사용하여 mean \( \pm \)SD로. 나타내었으며, ANOVA Tukey LSD 통계처리방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 \( \mathrm { p }<0.05 \) 로 하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>한약재 추출물 및 발효한약재 추출물의 대장암세포 성장억제 활성</h2> <p>36 종 한약재 추출물이 대장암세포 성장에 미치는 영향을 평가하고자 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 HCT116 배양액에 첨가하고 24 시간 배양한 후 각각의 성장률을 측정하였다. 그 결과, 사인, 천궁, 석곡, 백선피, 시체, 두충, 백과, 신이, 와송, 삼칠, 견우자, 원지 및 괄루인의 13 종에서 암세포 성장률이 \( 50 \% \) 이하를 나타내어 이들 한약재가 대장암세포 성장억제능을 가짐을 알 수 있었다. 특히 사인, 와송, 삼칠, 견우자 및 원지 추출물은 무첨가구에 비해 각각 \(29.3,29.5,17.5 \), 및 \( 20.6 \% \) 의 성장률을 나타내어 우수한 암세포 성장억제능을 나타내었다. 한편 한약재 고체발효의 경우, 백부자, 감국, 신이, 황정 및 대추의 경우 정상적인 균사체 성장이 이루어지지 않아 대장암세포 성장억제능을 평가하지 못하였다. 발효에 이용된 장수상황버섯 균사체 추출물의 경우 \( 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 46.3 \% \) 의 성장률을 나타내어 대장암세포 성장억제능을 확인할 수 있었다. 고체발효 한약재 추출물에서는 사인, 천궁, 석곡, 시체, 두충, 와송, 삼칠, 견우자, 원지 및 괄루인의 10 종은 발효전과 거의 동일한 성장억제 활성을 나타내었으나, 백선피, 백과 및 신이의 경우에는 고체발효에 의해 대장암세포 성장억제능이 부분적으로 감소하였다. 반면 도인, 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 경우에는 발효에 의해 대장암세포 성장억제능이 오히려 증가되어 암세포 성장률이 무첨가구에 비해 각각 \( 26.6, 29.1, 23.4 \) 및 \( 26.3 \% \) 를 나타내었다(Table 2). 최종적으로 한약재 고체발효에 의해 대장암세포 증식억제능이 증가된 경우는 도인, 골쇄보, 구기자 및 패모의 4 종이었으며, 증식억제능이 감소된 경우에는 백선피, 백과, 신이, 황부자, 산약, 현삼 및 괄루인의 7종이었다.</p> <h2>고체발효 골쇄보, 구기자, 패모의 인간 적혈구 용혈활성</h2> <p>고체발효 골쇄보, 구기자, 패모의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 평가한 결과는 Table 4에 나타내었다. 먼저 장수상황버섯 균사체 추출물의 경우 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도까지는 거의 용혈이 나타나지 않았으며, \( 250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 15.5 \%, 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \( 84 \% \) 의 용혈을 나타내었다. 선정 한약재 중 골쇄보 추출물은 \( 125 \sim 250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \(13 \sim 17 \% \)의 용혈을 나타내었으나, 발효 후 추출물에서는 \( 50 \sim 125 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \(11 \sim 18 \% \)의 용혈을 나타내었다. 특히 \( 150 \sim 250 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \(74 \sim 88 \% \) 의 매우 강력한 용혈현상을 확인하였다. 구기자의 경우에도 이러한 현상은 유사하게 나타났으며, 구기자 추출물 \( 250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 11.2 \% \) 의 용혈이 나타났으나 발효. 후 추출물에서는 \( 125 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 10 \%, 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 \( 69.2 \% \) 의 용혈을 나타내어 발효과정 중 용혈활성 물질이 생성되었음을 알 수 있었다. 패모 추출물의 경우에는 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 36.6 \% \), 발효 후 추출물 \( 150 \mathrm { lg } / \mathrm { ml } \) 농도에서 \( 85.7 \% \) 의 용혈 활성을 발효 골쇄보와 거의 유사한 용혈독성을 확인하였다. 이러한 결과는, 골쇄보, 구기자, 패모의 고체발효 중 암세포 성장억제물질 및 용혈 활성물질이 동시에 매우 강력하게 생성됨을 시사하고 있으나, 발효 골쇄보, 구기자 및 패모 추출물의 대장암 세포에 대한 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) 농도범위(28 \( 85 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 에서는 용혈현상이 심각하게 나타나지는 않을 것으로 예상된다. 따라서, 향후 고체발효 최적화 및 대량발효를 통한 대장암세포 성장억제 활성물질 및 용혈활성 물질의 각각의 분리연구가 필요하다고 판단된다. 본 연구 결과는 장수상황버섯 균사체를 이용한 한약재 고체발효가 새로운 항암 활성물질 개발 및 신규의 생리활성물질 생산에 이용될 수 있음을 제시하고 있다.</p> <h1>서 론</h1> <p>버섯은 전 세계적으로 약용 및 식용으로 널리 이용되고 있으며 다양한 생리기능 조절작용과 항암 활성이 알려져 있다. 그 중에서도 상황버섯은 항암 활성 및 면역기능 증강 활성이 우수한 것으로 보고되어 있다. 뽕나무 줄기 등에 자생하는 진휽버섯속 백색 부후균인 상황버섯은, 갓 표면을 제외하고는 모두 황색을 나타내어 상황이라 불리며 전 세계적으로는 약 220 여종이 존재한다. 이 중 국내에서는 Phellinus linteus, P. baumuii, P. gilvus, P. igniarius 등의 7종이 존재하며 P. baumii와 P. linteus가 가장 일반적으로 재배, 유통되고 있다. 상황버섯 자실체는 독성이 없어 식품 원재료로 사용 가능하며, 면역력 강화, 급성알러지 억제, 항산화, 항혈전, 항고혈압, 항돌연변이 활성 및 암, 심장병 등의 성인병 예방과 개선효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는, 자실체 이외에 상황버섯 균사체에서도 항혈전 활성, 항산화 및 항암작용, 위궤양 완화효과 및 항염증 작용, 치매 관련 \( \beta \)-secretase저해 활성 등의 생리활성이 보고되면서, 경제적이면서도 배양이 용이한 상황버섯 균사체 이용에 관한 연구가 집중되고 있는 실정이다. 이와 더불어, 버섯의 강력한 섬유소 분해능 및 고체발효 능력을 이용하여 새로운 기능성 생물소재를 개발하고자 하는 시도가 있으며, 특히 생리활성이 우수한 다양한 한약재에 유용 버섯균 사체를 접종하여 새로운 생리활성물질 개발 및 기존 한약재의 생리활성을 강화하려는 연구가 진행되고 있다.</p> <p>본 연구팀에서도 최근 항산화 및 항혈전 활성이 우수하다고 알려진 36 종의 한약재를 대상으로 P. baumii 균사체를 접종하여 고체발효를 성공하였으며, 고체발효에 의해 골쇄보, 천련자, 도엽, 와송의 경우 항혈전 활성이 발효전에 비하여 \( 14 \sim 32 \% \) 증가되었고, 원지, 현삼, 백지, 향부자, 골쇄보 및 육종용에서는 항산화 활성이 발효전에 비해 \( 20 \sim 60 \% \) 정도 증가됨을 보고한 바 있다. 본 연구에서는, P. baumii 균사체를 이용한 한약재 고체발효 추출물의 암세포 성장억제 효과를 확인하고자, 36 종의 한약재 및 이들의 고체발효 한약재 추출물을 대상으로 인간 대장암세포 성장억제능과 인간 적혈구 용혈활성을 각각 평가하였다. 그 결과 일부의 고체발효 한약재 추출물이 정상세포에는 독성이 거의 나타나지 않으면서 대장암세포의 성장을 특이적으로 억제함을 확인하였다. 본 연구는 유용버섯을 이용한 한약재 고체발효가 새로운 생물자원 개발에 이용될 수 있음을 제시하고 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, 배지, 종균, 한약재 및 세포주</h2> <p>Phellinus baumii (장수상황버섯)는 (주)바이온에서 보관중인 균주를 Potato dextrose agar (Difco Co., USA) 배지에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 일 배양하여 사용하였고 4 주 간격으로 계대배양 하였다. 36종의 한약재는 2007년 및 2009년 대구 한약재시장에서 구입하여 사용하였으며, 사용부위 및 이들의 고체발효. 정도는 Table 1에 나타내었다. 한약재는 사용 전 흐르는물에 30초간 수세하여 불순물을 제거한 후 탈수하여 사용하였으며, 한약재에 접종할 종균은 이미 보고한 방법과 동일하게 준비하였다. 암세포 성장억제능 평가에는 인간 대장암 세포주 HCT116를 이용하였고, 정상세포에 대한 독성평가를 위해서는 인간 embryonic kidney 유래의HEK-293 세포, 마우스 지방 전구세포인3T3-L1 및 조골 전구세포 MC3T3-E1을 이용하였으며, 이들은 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p>	생명
초피 과피의 성숙정도에 따른 향기성분의 변화	"<h1>결과 및 고찰</h1> <p>초피 과육의 성숙 시기별 향기성분의 변화를 관찰하(...TRUNCATED)	생명

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